Artykuł metodologiczny

Innowacyjna metoda izolacji endosomów z tkanek serca myszy i kohodowla z kardiomiocytami

DOI:

10.3791/69146

⸱

10 października 2025

 ,  ,  , 
1Pharmacological and Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Houston

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endosomy to zbiór wewnątrzkomórkowych organelli sortujących wchodzących w skład szlaku transportu błony endocytarnej. Opracowaliśmy nową metodę izolowania endosomów z tkanki serca za pomocą automatycznego sprzętu do nanofiltracji i zbadaliśmy wychwyt komórkowy endosomów poprzez ich kohodowlę z pierwotnymi kardiomiocytami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endosomy to organelle związane z błoną, odgrywające istotną rolę w transporcie wewnątrzkomórkowym, transdukcji sygnału i recyklingu błony. Chociaż ich funkcje w biologii sercowo-naczyniowej zyskują coraz większe uznanie, skuteczna izolacja endosomów z tkanki serca pozostaje poważnym wyzwaniem technicznym. Opracowaliśmy szybki i wysokowydajny protokół izolowania endosomów z tkanki serca myszy poprzez połączenie frakcjonowania subkomórkowego z ultraszybką platformą izolacyjną nanofiltracji. Metoda ta obejmuje sekwencyjne wirowanie, nanofiltrację i nanoporowate pobieranie pęcherzyków za pomocą membrany. Izolowane endosomy charakteryzowano za pomocą western blot, dynamicznego rozpraszania światła (DLS) i analizy za pomocą cytometrii nanoprzepływowej (NanoFCM). Aby ocenić bioaktywność, oczyszczone endosomy hodowano wspólnie z pierwotnymi kardiomiocytami noworodków. Markery endosomalne EEA1 i Rab7 były silnie wzbogacone w izolowane pęcherzyki. Analiza DLS wykazała średnią średnicę pęcherzyka 187,30 ± 23,42 nm i potencjał zeta -26,60 ± 5,79 mV (n = 12). Kwantyfikacja NanoFCM dała około 1,07 ± 0,31 ×10 12 cząstek/ml (n = 12) ze 100 mg tkanki serca. Funkcjonalny wychwyt endosomów przez kardiomiocyty obserwowano po kohodowli in vitro , co wskazuje na zachowanie integralności i aktywności pęcherzyków. Ta zintegrowana platforma izolacyjna zapewnia powtarzalną i wydajną metodę ekstrakcji endosomów o wysokiej czystości z tkanek serca. Protokół ułatwia dalsze badania biochemiczne i funkcjonalne, oferując cenne narzędzie do badania roli endosomów w fizjologii i chorobach układu krążenia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endosomy są niezbędnymi organellami wewnątrzkomórkowymi, które regulują endocytozę, sortowanie ładunku i szlaki sygnałowe 1,2. Aktywowane receptory sygnałowe i inne białka regulowane w dół są początkowo sortowane do pęcherzyków śródświetlnych (ILV) we wczesnych endosomach (EE), które następnie dojrzewają do ciał wielopęcherzykowych (MVB) lub endosomalnych pęcherzyków nośnikowych (ECV). Pęcherzyki te następnie łączą się z późnymi endosomami (LE), które służą jako wtórne węzły sortowania do kierowania ładunku w kierunku degradacji lizosomalnej lub alternatywnych szlaków. ILV mogą być również wydzielane jako egzosomy po fuzji endosomu z błoną plazmatyczną 3,4 . Równolegle szlak autofagii dostarcza materiał cytozolowy do LE za pośrednictwem autofagosomów, które uzyskują zdolność degradacji po fuzji z późnymi przedziałami endocytarnymi5. Endosomy są obecnie uznawane za krytyczne regulatory recyklingu receptora6, lokalizacji kanału jonowego7, biogenezy egzosomów8 i komunikacji międzykomórkowej9 - procesów, które są szczególnie istotne w wyspecjalizowanych komórkach, takich jak neurony i kardiomiocyty.

Pojawiające się dowody podkreśliły kluczową rolę szlaków endosomalnych w funkcjonowaniu układu sercowo-naczyniowego. Białko Eps15 Homology Domain 3 (EHD3) reguluje endosomalny recykling kluczowych transporterów jonów serca, w tym wymiennika Na+/Ca2+ i kanałów Ca2+ typu L. Niedobór EHD3 u myszy prowadzi do bradykardii, anomalii przewodzenia i zmienionego obchodzenia się z Ca2 + 10. Funkcjonalny transport endosomów i lizosomów w komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych zapobiega zwapnieniu przyśrodkowemu wywołanemu fosforanami, które jest istotne w przypadku przewlekłej choroby nerek i miażdżycy11. Niemniej jednak funkcjonalna rola endosomów w chorobach sercowo-naczyniowych i ich potencjał jako celów terapeutycznych pozostają nie w pełni poznane, co uzasadnia dalsze badania.

Wiele metod umożliwiło biochemiczną izolację funkcjonalnie nienaruszonych endosomów. Marsh i współpracownicy po raz pierwszy połączyli wirowanie w gradiencie gęstości z elektroforezą swobodnego przepływu w celu odzyskania wczesnych i późnych endosomów, zachowując ich zakwaszenie i integralność strukturalną12. Najnowsze metodologie, takie jak podejście oparte na gradiencie sacharozy, oferują ustandaryzowaną drogę oddzielania wczesnych i późnych populacji endosomalnych, niezbędną do dalszych badań proteomicznych i lipidomicznych13. Zestawy komercyjne oparte na kolumnach obrotowych zostały opracowane z myślą o zastosowaniach o wysokiej przepustowości.

Izolacja egzosomów za pomocą automatycznego systemu ultraszybkiej izolacji wykorzystuje innowacyjną technologię nanofiltracji ultradźwiękowej, która ma dwumembranowy system nanofiltracji zintegrowany z okresowymi oscylacjami podciśnienia i podwójnie sprzężonymi oscylacjami harmonicznymi, aby umożliwić izolację egzosomów o wysokiej czystości z biopłynów14. W tym przypadku połączyliśmy frakcjonowanie subkomórkowe z izolacją endosomów przy użyciu automatycznego systemu ultraszybkiej izolacji, aby uzyskać nową metodę szybkiej izolacji endosomów z wysoką wydajnością i wysoką czystością z tkanki serca myszy.

Ponadto przeprowadziliśmy wspólną hodowlę wyekstrahowanych endosomów z pierwotnymi kardiomiocytami (CM) in vitro i stwierdziliśmy, że egzogenne endosomy pomyślnie weszły do CM. Za pomocą reportera endosomu, w którym zlokalizowane w endosomach białko Numb zostało połączone z czerwonym białkiem fluorescencyjnym mCherry15,16, zaobserwowaliśmy fluorescencję mCherry zlokalizowaną wewnątrz CM ze wzorem puncta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie w Houston.

UWAGA: Przed rozpoczęciem procedury izolacji należy upewnić się, że wszystkie wymagane zostały świeżo przygotowane i schłodzone do temperatury 4 °C. Wysterylizowane narzędzia, płytki do hodowli tkankowych i odpowiednie probówki należy umieścić na wyznaczonych stanowiskach pracy, przy czym wszystkie materiały powinny być utrzymywane na lodzie lub w temperaturze 4 °C, chyba że określono inaczej. Wirówki i wirniki muszą być wstępnie zrównoważone do 4 °C przez co najmniej 2-3 godziny przed użyciem. Bufor frakcjonujący powinien być przygotowany przed dniem doświadczenia i przechowywany w temperaturze 4 °C, a następnie przechowywany na lodzie podczas doświadczenia do czasu, gdy będzie potrzebny. O ile nie wskazano inaczej, wszystkie etapy inkubacji i wirowania powinny być przeprowadzane w temperaturze 4 °C.

1. Przygotowanie lizatu serca

  1. Zdezynfekuj obszar operacyjny przy użyciu 70% etanolu, a następnie umieść sterylną podkładkę chłonną na powierzchni roboczej, na której układane są wysterylizowane narzędzia chirurgiczne.
  2. Eutanazja myszy (C57BL/6 samców, 8-12 tygodni, 20-25 g i mCherry: samce NumbKI, 8-12 tygodni, 20-25 g) poprzez inhalację CO2 (10-30% CO2 przez 3-5 min) lub alternatywną metodą zatwierdzoną przez odpowiedni instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania.
    UWAGA: Proszę pracować na otwartej przestrzeni i upewnić się, że butla CO2 zamyka się na czas, aby zapobiec wyciekom. Myszy powinny być monitorowane podczas eutanazji w celu potwierdzenia utraty przytomności i prawidłowego postępowania. Po utracie przytomności użyj metody wtórnej, takiej jak zwichnięcie szyjki macicy, torakotomia lub wykrwawienie, aby zapewnić śmierć.
  3. Ustaw mysz w pozycji leżącej na plecach i oczyść klatkę piersiową 70% etanolem.
    1. Szybko otwórz klatkę piersiową, aby pobrać serce i przenieś je do lodowatego roztworu soli Hanka (HBSS) w naczyniu o średnicy 60 mm umieszczonym na lodzie.
    2. Delikatnie usuń resztki krwi z komór serca za pomocą pęsety i bardzo dobrze umyj serce, aż w komorach nie pozostanie już krew. Trzymaj serce na lodzie przez cały czas przetwarzania.
      UWAGA: Zachowaj 50-100 mg tkanki serca do analizy western blot (WB) jako kontrola pozytywna. Serce można zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.
  4. Dodać 8 ml buforu frakcjonującego (Tabela 1) do probówki o pojemności 50 ml na lodzie. Przenieść 100-120 mg świeżej lub mrożonej tkanki serca myszy do probówki zawierającej bufor frakcjonujący.
    UWAGA: Do ekstrakcji endosomów można użyć dowolnej części tkanki serca myszy. Wymagane jest co najmniej 100 mg tkanki serca, aby uzyskać wystarczającą ilość endosomów do kolejnych analiz. Aby zapewnić spójność we wszystkich grupach doświadczalnych, tkanka powinna być dokładnie zważona przed dodaniem do buforu frakcjonującego.
    UWAGA: Podczas obsługi bufora frakcjonującego należy nosić odpowiednie środki ochrony indywidualnej, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z ciałem.
  5. Tkankę rozdrobnić na około 1 mm3 kawałki za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych w buforze frakcjonacyjnym na lodzie cały czas.
  6. Homogenizować za pomocą homogenizatora elektrycznego ze średnią prędkością, w cyklu 40 s pracy 30 s. zatrzymania. Homogenizować przez 5-7 cykli (rysunek 1A).
    UWAGA: Dokładny proces homogenizacji jest niezbędny i pomoże zwiększyć końcowe stężenie endosomów.
  7. Sonikować homogenizowany lizat serca przez 10 minut w lodowatej łaźni wodnej za pomocą kąpieli ultradźwiękowej (ryc. 1A).

2. Frakcjonowanie subkomórkowe

  1. Umieść sitko o wielkości 40 μm na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i przefiltruj homogenizowany lizat serca przez sitko (rysunek 1A).
  2. W przypadku osadu jądrowego: odwirować lizat sercowy o stężeniu 1 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant i umieścić go w świeżo oznakowanej probówce.
    UWAGA: Zbierz osad, który jest frakcją jądrową, i ponownie zawieś pastylkę jądrową w 200 μl buforu do lizy WB, jeśli frakcja jądrowa jest potrzebna do WB. Delikatnie odpipetować pastylkę jądrową za pomocą testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA), buforować w górę iw dół 20 razy i poddać soniku przez 10 minut. Odwirować lizat jądrowy o stężeniu 14 000 × g przez 10 minut. Zebrać supernatant i przechowywać go w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania. Krok 2.2 jest opcjonalny; Można go pominąć, jeśli wymagane są tylko pęcherzyki.
  3. Dla frakcji mitochondrialnej: ponownie odwirować supernatant w temperaturze 10 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Osad zawiera frakcję mitochondrialną. Przenieść supernatant i umieścić go w świeżej ultrawirówkowej probówce.
    UWAGA: Jeśli frakcja mitochondrialna jest pożądana dla WB, zachowaj osad jako krok 2.2, jak opisano w poprzedniej UWAGA.
  4. Ostrożnie wyważ rurki. Zważyć każdą probówkę i dodać dodatkowy bufor do frakcjonowania na zimno do lżejszej probówki, aby zapewnić równą wagę. Schłodzić wirnik i adaptery ultrawirówki przez 2-3 godziny w temperaturze 4 °C. Ultraodwirować supernatant w temperaturze 160 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Na etapie ultrawirowania należy upewnić się, że wszystkie probówki ultrawirówki są odpowiednio wyważone i wypełnione buforem do około 0,5-1 cm poniżej krawędzi. Nieodpowiednie wypełnienie może spowodować deformację lub zapadnięcie się rury z powodu przyłożonych dużych sił odśrodkowych.
  5. Usunąć supernatant do świeżej probówki. Supernatant zawiera endosomy. Ustawić strzykawkę o pojemności 10 ml podłączoną do filtra strzykawkowego 0,45 μm na górze probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i przefiltrować supernatant do probówki. Dodać 5 ml wysterylizowanego buforu PBS, aby rozcieńczyć roztwór i uniknąć zatkania filtra.
    UWAGA: Etap filtrowania zapewnia, że wszystkie endosomy w supernatancie mają <450 nm podczas rozpoczynania etapów izolacji.
  6. Zawiesić osad za pomocą 5 ml wysterylizowanego buforu PBS z kroku 2.4 i pipetować w górę i w dół co najmniej 20 razy, aby dobrze wymieszać osad. Osad zawiera inne pęcherzyki wewnątrzkomórkowe. Ustaw strzykawkę o pojemności 10 ml podłączoną do filtra strzykawkowego 0,45 μm na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i przefiltruj roztwór granulek do probówki. Dodaj dodatkowe 5 ml wysterylizowanego buforu PBS, aby rozcieńczyć roztwór i uniknąć zatkania filtra.
    UWAGA: Etap filtracji zapewnia, że wszystkie pęcherzyki z osadu mają <450 nm podczas rozpoczynania etapów izolacji.

3. Proces izolacji endosomów i innych pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

  1. Rozcieńczyć przefiltrowany supernatant z kroku 2.5 i przefiltrowany roztwór osadu z kroku 2.6 wysterylizowanym buforem PBS do końcowej objętości 30 ml odpowiednio w probówkach o pojemności 50 ml. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C (rysunek 1A).
    UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Jeśli nie ma wystarczająco dużo czasu na wykonanie poniższych kroków tego samego dnia, można je przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C, a następnie poczekać do następnego dnia, aby kontynuować eksperyment.
  2. Włącz instrument i rozpocznij codzienny program czyszczenia, który zwykle trwa 20 minut.
  3. Wybierz urządzenie izolujące Medium EXODUS (M EID) do izolacji. Zainstaluj adapter probówki o pojemności 50 ml i umieść probówkę o pojemności 50 ml z próbką w pozycji próbki. Stuknij EID na ekranie i załaduj M EID.
    UWAGA: Średni EID jest przeznaczony dla próbki o pojemności 20-50 ml, zalecając 30 ml.
  4. Skonfiguruj program:
    1. Wprowadź nazwę próbki i objętość próbki.
    2. Wybierz typ próbki: Plazma.
    3. Wybierz program: Plazma. Silny-MA. A03.
    4. Wybierz probówkę wirówkową: 50 ml.
    5. Włącz tryb wysokiej czystości.
    6. Wybierz opcję programu 3000.
    7. Stuknij OK , aby rozpocząć.
      UWAGA: Cały proces izolacji trwa 1-2 godziny. Wyższe stężenie próbek zajmie więcej czasu.
  5. Odzyskaj endosomy i inne pęcherzyki wewnątrzkomórkowe:
    1. Wyjmij EID i przynieś go do maski, aby wykonać kolejne kroki.
    2. Przenieść 200 μl wysterylizowanego buforu PBS do EID za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Opłucz obie strony membrany nanoporowatej odpowiednio 20 razy.
    3. Zebrać endosomy lub inne pęcherzyki wewnątrzkomórkowe, ponownie zawiesić w 200 μl w probówce o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku stosowania przez 24-48 godzin lub w temperaturze -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.
      UWAGA: Eluat zawiera endosomy lub inne pęcherzyki wewnątrzkomórkowe i jest używany do dalszej analizy i kohodowli z kardiomiocytami. Próbka endosomów jest stabilna, gdy jest przechowywana w temperaturze -80 °C przez 5 miesięcy, w oparciu o uzyskane dane.
  6. Elute endosomy i inne pęcherzyki wewnątrzkomórkowe dla WB:
    1. Pobierz identyfikator EID. Przenieść 80 μl buforu do lizy WB do EID. Opłucz obie strony membrany nanoporowatej odpowiednio 20 razy.
    2. Inkubować EID na lodzie przez 30 minut, aby zapewnić całkowitą soludyzację, pipetować bufor wewnątrz EID co 10 minut. Zebrać endosomy lub inne pęcherzyki wewnątrzkomórkowe w lizatach 1,5 ml probówek. Wirować przez 10 minut w temperaturze 14 000 × g w temperaturze 4°C. Zebrać i przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania. Wyrzuć granulkę, jeśli w tubie pozostała jakakolwiek osadka.

4. Kwantyfikacja białek endosomów i charakterystyka pęcherzyków

  1. Analiza Western blot
    1. Zaoszczędź 5 μl z każdej próbki, aby określić ilościowo stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA).
    2. Rozcieńczyć próbki w 4× buforze Laemmliego i dokładnie wymieszać przez wirowanie. Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut w celu denaturacji białek.
    3. Odwirować zdenaturowane próbki o masie 14 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać otrzymany supernatant do analizy.
    4. Zbierz żele poliakryloamidowe w aparacie do elektroforezy i napełnij komorę buforem do pracy z dodecylosiarczanem sodu (SDS).
    5. Załadować marker masy cząsteczkowej i przygotowane próbki białka do żelu, wybierając odpowiednią zawartość procentową akrylamidu na podstawie masy cząsteczkowej docelowych białek.
      UWAGA: Zazwyczaj 20 μg białka jest ładowane na studzienkę zarówno dla lizatów tkanki serca, jak i lizatów endosomów.
    6. Uruchom żel pod napięciem 6 V przez około 120 minut lub do momentu, gdy przód barwnika dotrze do dna żelu.
    7. Przenieś białka z żelu do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) za pomocą systemu transferu western blotting.
      UWAGA: Dobrze sprawdza się również metoda mokrego transferu.
    8. Krótko przepłukać membranę PVDF solą fizjologiczną buforowaną Tris zawierającą 0,05% Tween-20 (TBST).
    9. Zablokować błonę za pomocą TBST uzupełnionego 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    10. Inkubować błonę przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem pierwszorzędowym (tabela materiałów) specyficznym dla wybranego markera endosomalnego, stosując delikatne kołysanie.
    11. Następnego dnia umyj membranę trzykrotnie TBST, każde pranie trwa 10 minut w temperaturze pokojowej na bujaku.
      UWAGA: Prawidłowe mycie jest niezbędne, aby zredukować niespecyficzne tło; Upewnij się, że membrana pozostaje w pełni nawodniona przez cały proces.
    12. Inkubować błonę z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym (tabela materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    13. Umyj membranę trzykrotnie TBST, każde pranie trwa 10 minut na bujaku w temperaturze pokojowej.
    14. Nałożyć substrat chemiluminescencyjny na błonę w celu wykrycia białek związanych z przeciwciałami.
    15. Za pomocą żelowego systemu obrazowania w celu naświetlenia błony i wykonania zdjęć białek.
  2. Analiza dynamicznego rozpraszania światła (DLS)
    1. Wielkość cząstek i potencjał zeta endosomów mierzy się za pomocą techniki dynamicznego rozpraszania światła (DLS)17. przy użyciu Litesizer 500 (Anton Paar) wyposażonego w oprogramowanie Kalliope w wersji 2.10.4. Pomiary DLS wykonywane są w trzech egzemplarzach przy użyciu lasera o długości fali 658 nm i kącie detekcji 90° w temperaturze 25 °C.
    2. Rozcieńczyć "nanosfery o standardowej wielkości" w ultraczystej wodzie, dodać 1 ml objętości do jednorazowej kuwety i umieścić w komorze.
      UWAGA: Użyj standardowych nanosfer (małych lub dużych) zgodnie z oczekiwaną wielkością nieznanej próbki.
    3. Otwórz oprogramowanie DLS i kliknij nową zakładkę pomiaru . Wybierz wielkość cząstek w trybie pomiaru. Nazwij plik w polu Bez tytułu i wprowadź parametry wejściowe (rozpuszczalnik, temperatura itp.), a następnie kliknij start. Po określeniu wielkości cząstek wzorcowych wyjmij kuwetę z komory.
    4. Rozcieńczyć "materiał odniesienia potencjału zeta" w ultraczystej wodzie, umieścić go w kuwecie potencjału zeta omega i umieścić w komorze kuwety. Kliknij zakładkę nowy pomiar w oprogramowaniu. Wybierz potencjał zeta z trybu pomiaru. Nazwij plik w polu Bez tytułu i wprowadź parametry wejściowe (rozpuszczalnik, temperatura itp.), a następnie kliknij start.
    5. W celu określenia wielkości cząstek i potencjału zeta endosomów, należy rozcieńczyć próbkę endosomu w ultraczystej wodzie, umieścić ją w odpowiednich kuwetach i umieścić je w komorze kuwety. Pomiary należy wykonywać w taki sam sposób, jak opisano dla norm.
      UWAGA: Wykonać rozcieńczenie nieznanych próbek zgodnie ze stężeniem próbek w wodzie ultraczystej.
  3. Analiza NanoFCM
    UWAGA: Stężenia cząstek endosomów są oznaczane za pomocą NanoFCM Flow NanoAnalyzer z oprogramowaniem Professional Suite V2.318. Akwizycja sygnału cząstek odbywa się przez 2 minuty za pomocą niebieskiego lasera 488 nm ustawionego na 20 mW z 0,2% zanikiem SS i/lub czerwonego lasera 638 nm ustawionego na 8 mW z 10% zanikiem SS, przy ciśnieniu próbkowania 1,0 kPa modulowanym i utrzymywanym przez powietrzny moduł ciśnieniowy. Próbka jest ogniskowana na 1,4 μm przy użyciu wody ultrapur jako płynu osłonowego za pośrednictwem zasilania grawitacyjnego. Optymalne ustawienie lasera jest testowane i kalibrowane przy użyciu koralików QC z koktajlu nanosfery krzemionki (S16M-Exo). Pomiary kalibracji wielkości są wykonywane przed analizą przy użyciu standardowych kulek o rozmiarze S16M-Exo (koktajl nanocząstek krzemionki zawierający cząstki o średnicach 68, 91, 113 i 155 nm o znanym stężeniu 2,17 ×10 10/ml).
    1. Akwizycja wzorca stężenia:
      1. Uruchom i zainicjuj fluidykę nanoFCM. Rozcieńczyć kulki QC (1:100) w ultraczystej wodzie filtrowanej membranowo o grubości 0,22 μm, dodać do probówki o pojemności 0,5 ml i umieścić w doku załadowczym. Wybierz QC FL SiNPs z menu rozwijanego Sample Inf i wprowadź współczynnik rozcieńczenia próbki kulek QC.
      2. Z menu rozwijanego Sample Flow (Przepływ próbki ) wybierz opcję boosting (Zwiększanie przepływu), aby wprowadzić próbkę kontroli jakości z dużą prędkością i usunąć roztwór czyszczący z systemu na 45 sekund. Podczas wzmacniania ustaw moc lasera na 20/50 mV dla niebieskiego lasera 488 nm i 20/100 mW dla czerwonego lasera 638 nm, z 0,2% zanikiem SS.
      3. Wybierz próbkowanie z menu rozwijanego Sample Flow i dokonaj regulacji progu dla dużego sygnału. Podczas próbkowania należy ręcznie wyregulować wyrównanie soczewki kondensacyjnej sygnału i wyrównanie soczewki skupiającej laser z oprogramowania, jeśli to konieczne. Automatyczna regulacja progu dla dużego sygnału musi pozostać w zakresie 50-120 dla bocznego kanału rozpraszającego i mniej niż 75 dla obu kanałów fluorescencyjnych.
      4. Kliknij opcję Czas nagrywania , aby uzyskać dane z 120 s. Upewnij się, że obszar zainteresowania (ROI) mieści się w zakresie od 1500 do 15000 podczas pozyskiwania danych. Zapisz plik wynikowy w folderze pop-up z rozszerzeniem "nfa" i rozładuj probówkę z próbką.
        UWAGA: Po każdym przebiegu próbki użyj roztworu czyszczącego (1x), aby usunąć przetworzoną próbkę z rurki, zwiększając ją przez 45 sekund. Następnie zanurz końcówkę kapilary w doskonałej wodzie, aby usunąć resztki roztworu czyszczącego z zewnątrz kapilary przed załadowaniem następnej próbki.
    2. Standardowy rozmiar akwizycji:
      1. Rozcieńczyć "kulki o wzorcu wielkości" (1:100) w przefiltrowanej membranowo wodzie zbiorczej o wielkości 0,22 μm i umieścić w doku załadowczym. Wybierz 68-155 S16M-Exo z menu rozwijanego Sample Inf i wprowadź współczynnik rozcieńczenia próbki kulek o standardowym rozmiarze.
      2. Z menu rozwijanego Sample Flow (Przepływ próbki ) wybierz opcję boosting (Zwiększanie wydajności), aby wprowadzić standardowe kulki o rozmiarze i usunąć roztwór czyszczący z systemu na czas 45 sekund. Podczas zwiększania ustaw moc lasera na 8/50 mV dla niebieskiego lasera 488 nm i 20/100 mW dla czerwonego lasera 638 nm, z 10% zanikiem SS.
      3. Wybierz opcję Sampling (Próbkowanie ) z menu rozwijanego Sample Flow (Przepływ próbki ) i dokonaj regulacji progu dla małego sygnału. W okienku powinny być widoczne cztery wyraźne piki (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm). Kliknij opcję Czas nagrywania , aby uzyskać dane z 120 s. Zapisz plik wynikowy w folderze pop-up z rozszerzeniem "nfa" i rozładuj probówkę z próbką.
    3. Ślepa akwizycja standardowa:
      1. Użyj ultraczystej wody lub (bufora/rozcieńczalnika próbki), aby wykonać pomiar w tym samym procesie, jak opisano powyżej, zapisz plik o nazwie "blank" w folderze z rozszerzeniem "nfa" i rozładuj probówkę z próbką.
    4. Oznaczanie stężenia cząstek w endosomach
      1. Rozcieńczyć próbkę endosomu w ultraczystej wodzie i umieścić ją w doku załadowczym.
      2. Po wzmocnieniu i pobraniu próbki kliknij przycisk Czas do nagrywania , aby rozpocząć pomiary. Jeśli próg nie mieści się w zakresie 50-120 dla bocznego kanału rozproszonego lub zwrot z inwestycji jest większy niż 15 000, rozważ rozcieńczenie próbki.
    5. Analiza danych:
      1. Przełącz się z zakładki Akwizycja na zakładkę Analiza w oprogramowaniu i otwórz zapisane pliki "nfa". Ustaw normę stężenia, otwierając zapisany plik z wynikami kontroli jakości date__QC FL SnNPs.nfa, ustaw próg na dużym sygnale, klikając narzędzie do ustawiania progu.
      2. Wybierz stężenie cząstek za pomocą narzędzia do bramkowania okręgu. Kliknij Policz choroby przenoszone drogą płciową i sprawdź stężenie kulek QC (2,17 ×10 10/ml) przed zamknięciem okna.
      3. Aby ustawić standard rozmiaru, otwórz plik date_68-155 S16M-Exo.nfa. Kliknij narzędzie Rozmiar , aby otworzyć okno generowania krzywej standardowej i ustaw próg dla małego sygnału, klikając narzędzie do ustawiania progu.
      4. Wybierz S16 exo 68-155 nm z menu rozwijanego Zdefiniowane przez użytkownika . Kliknij przycisk Znajdź szczyty , aby określić szczytowe intensywności SS w populacjach o czterech rozmiarach.
      5. Wybierz pusty plik i kliknij przycisk Ustaw puste , aby określić liczbę wyników fałszywie dodatnich do usunięcia próbki. Aby przeanalizować stężenie endosomu, najpierw wybierz próbkę i ustaw próg na małym sygnale, klikając narzędzie do ustawiania progu. Przedstaw dane ilościowe w postaci raportu wielkości (nm) i stężenia (cząstki/ml).

5. Pierwotna hodowla kardiomiocytów

UWAGA: Wyizoluj kardiomiocyty za pomocą podstawowego zestawu do izolacji kardiomiocytów, który zapewnia wystarczającą ilość odczynników do izolacji kardiomiocytów z maksymalnie 50 nowonarodzonych serc myszy lub szczurów. W zestawie znajdują się również komponenty, które są odpowiednie do wspomagania pierwotnej hodowli kardiomiocytów. Wszystkie pożywki i należy usunąć z ostrożnością, aby uniknąć zakłócania komórek. Zaleca się ręczne pipetowanie przy użyciu końcówki do pipet o pojemności 1000 μl, należy unikać zasysania próżniowego. Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) należy wstępnie schłodzić do 4 °C przed rozpoczęciem zabiegu.

  1. Rozpuść Cardiomyocyte Isolation Enzyme 1 (zawierający papainę), dostępny w zestawie, dodając 2. ml schłodzonego HBSS do jednej fiolki. Mieszaj delikatnie przez około 5 minut lub do momentu, gdy enzym całkowicie się rozpuści. Utrzymuj roztwór enzymu na lodzie przez cały czas trwania zabiegu.
    UWAGA: Pojedyncza fiolka odtworzonego enzymu 1 wystarcza do wyizolowania kardiomiocytów z 10 serc noworodków. Może być przechowywany w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy i jest stabilny przez dwa cykle zamrażania i rozmrażania. W przypadku przechowywania w temperaturze 4 °C, roztwór należy zużyć w ciągu 1 tygodnia w celu zapewnienia aktywności enzymatycznej.
  2. Umieść świeżo wypreparowane serca noworodków w indywidualnym sterylnym 1. ml probówek do mikrowirówek i natychmiast dodać 500 μl lodowatego HBSS do każdej probówki.
    UWAGA: Zaleca się przetwarzanie jednego serca na probówkę, aby zmaksymalizować wydajność i odtwarzalność.
  3. Tkankę serca rozdrobnić na fragmenty o pojemności 1 mm³ za pomocą sterylnych nożyczek do rozwarstwiania. Przemyć każdą próbkę dwukrotnie 500 μl lodowatego HBSS w celu usunięcia resztek krwi.
  4. Do każdej probówki dodać 200 μl przygotowanego enzymu izolującego kardiomiocyty 1 (papaina) i 10 μl enzymu izolującego kardiomiocyty 2 (zawierającego termolizynę), dostępnego w zestawie. Delikatnie wymieszać i inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 30-35 minut.
    UWAGA: Enzym izolujący kardiomiocyty 2 jest dostępny w postaci zawiesiny w HBSS i przed użyciem należy go rozmrozić na lodzie. Homogenizować enzym, pipetując w górę i w dół, aby zapewnić jednolitą zawiesinę przed dodaniem do próbek.
  5. Po mineralizacji enzymatycznej ostrożnie odessać roztwór enzymu i przemyć każdą próbkę dwukrotnie 500 μl lodowatego HBSS.
  6. Dodaj ml kompletnego DMEM do pierwotnej izolacji komórek do każdej probówki. Delikatnie rozcieraj tkankę, pipetując w górę i w dół 25-30 razy za pomocą sterylnej końcówki do pipety o pojemności 1,0 ml. Na tym etapie zminimalizuj tworzenie się pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Rozbijanie tkanki przez pipetowanie poprawia wydajność komórek. Jednak nadmierne pipetowanie może prowadzić do uszkodzenia komórek.
  7. Odwirować supernatant o masie 300 × g przez 5 minut.
  8. Ostrożnie wyjmij Complete DMEM za pomocą pipety. Dodaj 1 ml świeżego Complete DMEM do probówki i pipetuj w górę i w dół 25-30 razy, używając sterylnej końcówki do pipety o pojemności 1,0 ml. Podczas pipetowania należy unikać pęcherzyków powietrza.
  9. Po tym, jak tkanka jest głównie zawiesiną jednokomórkową, dodaj 0,5 ml Complete DMEM do pierwotnej izolacji komórek do każdej probówki, aby uzyskać całkowitą objętość do 1,5 ml. Połącz zawiesiny poszczególnych komórek w celu określenia stężenia komórek i żywotności komórek.

6. Endosom do kohodowli z kardiomiocytami

  1. Wysiew kardiomiocyty w naczyniu o średnicy 60 mm i dodaj Complete DMEM do całkowitej objętości.
    UWAGA: Oczekuje się, że każde serce nowonarodzonej myszy zostanie wysiane w jednym naczyniu, a całkowita objętość każdej studzienki ma wynosić 5 ml (ryc. 1B).
  2. Inkubować szalkę o średnicy 60 mm w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniemCO2 przez 24 godziny. Po 24 godzinach zastąp pożywkę równoważną objętością świeżego kompletnego DMEM do pierwotnej izolacji komórek zawierającego suplement wzrostu kardiomiocytów rozcieńczony 1000x.
  3. Przenieść eluat endosomu wytworzony w kroku 3 z temperatury -80 °C do temperatury -20 °C na 1 godzinę. Następnie umieść endosomy na lodzie i stopniowo je rozmrażaj.
    UWAGA: Stopniowe rozmrażanie na lodzie może sprawić, że błona endosomów będzie bardziej nienaruszona i zmniejszy degradację.
  4. Po 48 godzinach wymieszaj każde 100 μl eluatu endosomu z 5 ml świeżego Complete DMEM i zastąp starą pożywkę w każdym naczyniu. Endosomy do wspólnej hodowli z kardiomiocytami przez 24 godziny.
  5. Umyj kardiomiocyty 2 ml zimnego, sterylnego PBS. Dodaj lodowaty bufor do lizy do każdego naczynia z 80-100 μl buforu do lizy. Zeskrob komórki za pomocą zimnego plastikowego skrobaka do komórek i zbierz komórki do probówek o pojemności 1,5 ml.
  6. Wykonaj protokół WB opisany w kroku 4.1.
  7. W przypadku barwienia immunologicznego (IF) postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
    1. Kardiomiocyty nasienne w szkiełku z 8-dołkową komorą. Rozcieńczyć zawiesinę jednokomórkową wypełnionym DMEM od 1,5 ml do 3 ml.
    2. Wysiewać 300 μl zawiesiny do każdej komory. Powtórz kroki 6.2-6.4.
    3. Utrwalić kardiomiocyty 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej i trzykrotnie przemyć 200 μl sterylnego PBS. Szkiełko z 8-dołkową komorą jest gotowe do IF.
      UWAGA: Podczas obchodzenia się z 4% PFA należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Po użyciu należy wyrzucić 4% PFA do odpowiedniego pojemnika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zbadaliśmy poziomy ekspresji markerów dla wczesnych endosomów, późnych endosomów, lizosomów i autofagosomów w pięciu grupach: lizat tkanki serca, frakcja jądrowa, frakcja mitochondrialna, inne pęcherzyki wewnątrzkomórkowe z kroku 2.6 i kroku 3.6 oraz endosomy z kroku 2.5 i kroku 3.6. Wynik Western blot wykazał, że EEA1 (Early Endosome Antigen 1) miał najwyższy poziom ekspresji w endosomach i był prawie niewyrażony w innych grupach (ryc. 2A, B). Rab7 był również wyrażany na n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu przedstawiamy szybką i powtarzalną metodę izolowania endosomów o wysokiej czystości z tkanek serca myszy poprzez połączenie frakcjonowania subkomórkowego z ultraszybką platformą izolacyjną14. Tradycyjne metody izolacji endosomów, takie jak wirowanie w gradionym gradionym gęstości12 lub izolacja immunologiczna, są często czasochłonne i pracochłonne oraz wymagają dużych ilości tkanek lub wyspecjalizowanych przeciwciał. Integrując protokół homogenizacji mechanicz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez następujące granty: grant National Heart, Lung, and Blood Institute 2R01HL121700-06A1 i R01HL172834-01 dla M.W., grant American Heart Association 24TPA1303770 i grant 25EIA1422015 dla M.W. US EPA84045701 dla X.L.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
&mikro;-Zjeżdżalnia 8 Studnia wysokaibidi80806-90
Probówka wirówkowa z podziałką 1,5 mlUSA Naukowe1615-5500
10x Bufor Tris/GlicynyBio Rad1610734
4x bufor do próbek LaemmliBio Rad1610747
Wirówka stołowaEppendorf powiedział:Wirówka Eppendorf 5810R
Surowica bydlęca SigmaNr kat. A9418
sitko komórkoweCorningCLS431750Wielkość porów 40  μ m, sterylne
CELLSTAR Naczynia do hodowli tkankowychFirma VWR82050-546Polistyren, Sterylny, 60 mm i ostry; Grubość 15 mm
System obrazowania ChemiDocBio RadChemiDoc XRS+
Roztwór czyszczącyNanoFCM (NanoFCM)17159
DMEM do zestawów do izolacji komórek pierwotnych PierceFisher NaukowyPI88287
Naziemna telewizja cyfrowaFisher NaukowyZobacz materiał BP172
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Scientific10010023
Odczynnik do wykrywania e-western blot ECLBio Rad1705061
EDTASigmaE4884 powiedział:
Obszar EO1Sygnalizacja komórkowaZobacz materiał 3288SKąt obrotu (1:1000)
EGTA (EGTA)SigmaE-4378-25
Identyfikator EID (IdentyfikacjEXODUSMA03 EID
ERp72 powiedział:Sygnalizacja komórkowa5033SKąt obrotu (1:1000)
EtanolSklep badawczy UH200 proof, 5 galonów
EXODUS H-600EXODUSH-600
GAPDHTechnologia białkowa10494-1-APKąt bieli (1:5000)
Hank' s zrównoważony roztwór soli (HBSS)Thermo Scientific14175095
HEPESYSigmaH3375 powiedział:
HomogenizatorFisher Naukowy15340167
KclSigmaZobacz materiał P3911 powiedział:
Lampa1Księga Abcamab320851 powiedział:WB (1:2000)
PO3Sygnalizacja komórkowa2775SKąt obrotu (1:1000)
Litesizer 500 Anton PaarLitesizer 500Inne urządzenia, takie jak Zetasizer (Malvern) lub DLS  (Wyatt) może być używany
mWiśniaBiorbytorb66657 powiedział: powiedział:Balans bieli (1:500)
MgCl2 powiedział:Fisher NaukowyZobacz materiał BP214-500
Zawartość NaClSigmaZobacz materiał S7653
NanoFCM (NanoFCM)NanoFCM (NanoFCM)Nanoanalizator przepływu
Wzorce wielkości nanosferThermo ScientificZobacz materiał 3020A
Mikroskop konfokalny AXR firmy NikonNikonAXR (Skrzynia Ras
Roztwór paraformaldehydu 4% w PBSBiotechnologia Santa CruzSC-281692 powiedział:
Sondy do etykietowania falloidynyInvitrogenA22284JEŻELI (1:500)
Zestawy do oznaczania białek Pierce BCAThermo Scientific23227
Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation KitThermo Scientific88028
Filtr strzykawkowy z polieterosulfonuMiliporySLHPR33RSWielkość porów 0,45  μ m, sterylne
Prefabrykowane żele białkoweBio Rad4561093
Koraliki QCNanoFCM (NanoFCM)Zobacz materiał QS2503
Rab7 powiedział:Sygnalizacja komórkowaZobacz materiał 9367SKąt obrotu (1:1000)
Bufor do lizy i ekstrakcji RIPAThermo Scientific89900
Roche PhosSTOP (Koktajl PI)Roche4906837001
Nanosfery krzemionkoweNanoFCM (NanoFCM)S16M-Egzo
SacharozaSigma84097
Wirnik wahliwy łyżkiBeckman CoulterZobacz materiał SW55Ti
System Trans-Blot Turbo Transfer Zestawy transferowe RTABio Rad1704270
Animacja 20Bio Rad1662404
UltrawirówkaBeckman CoulterOptima XE-90
Probówki do ultrawirówek Beckman Coulter326819
Kąpiel do czyszczenia ultradźwiękowegoUltradźwięki BransonaCPX952238R
Cent rurki VWR 50 mlFirma VWR89039-656
Wirówka probówkowa VWR 15 mlFirma VWR89039-666
Potencjalny materiał referencyjny ZetaAnton Paar175108

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 679-696 (2018).
  2. Gould, G. W., Lippincott-Schwartz, J. New roles for endosomes: from vesicular carriers to multi-purpose platforms. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (4), 287-292 (2009).
  3. Bissig, C., Gruenberg, J. Lipid sorting and multivesicular endosome biogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (10), a016816(2013).
  4. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
  5. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: origins unknown, biogenesis complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 759-774 (2013).
  6. Singh, J., et al. Endosome transcriptomics reveal trafficking of Cajal bodies into multivesicular bodies. bioRxiv. , (2025).
  7. Scott, C. C., Gruenberg, J. Ion flux and the function of endosomes and lysosomes: pH is just the start: the flux of ions across endosomal membranes influences endosome function not only through regulation of the luminal pH. Bioessays. 33 (2), 103-110 (2011).
  8. Lopez-Verrilli, M. A. Exosomes: mediators of communication in eukaryotes. Biol Res. 46 (1), 5-11 (2013).
  9. Corbeil, D., et al. Uptake and fate of extracellular membrane vesicles: nucleoplasmic reticulum-associated late endosomes as a new gate to intercellular communication. Cells. 9 (9), 1931(1931).
  10. Curran, J., et al. EHD3-dependent endosome pathway regulates cardiac membrane excitability and physiology. Circ Res. 115 (1), 68-78 (2014).
  11. Kapustin, A. N., et al. Vascular smooth muscle cell calcification is mediated by regulated exosome secretion. Circ Res. 116 (8), 1312-1323 (2015).
  12. Marsh, M., et al. Rapid analytical and preparative isolation of functional endosomes by free flow electrophoresis. J Cell Biol. 104 (4), 875-886 (1987).
  13. de Araújo, M. E., Lamberti, G., Huber, L. A. Isolation of early and late endosomes by density gradient centrifugation. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (11), 1013-1016 (2015).
  14. Chen, Y., et al. Exosome detection via the ultrafast-isolation system: EXODUS. Nat Methods. 18 (2), 212-218 (2021).
  15. Miao, L., et al. Cardiomyocyte orientation modulated by the Numb family proteins-N-cadherin axis is essential for ventricular wall morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (31), 15560-15569 (2019).
  16. Miao, L., et al. The spatiotemporal expression of Notch1 and Numb and their functional interaction during cardiac morphogenesis. Cells. 10 (9), 2192(2021).
  17. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-what they are and what they are not. J Control Release. 235, 337-351 (2016).
  18. Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Rev Rep. 18 (3), 1067-1077 (2022).
  19. Wilson, J. M., et al. EEA1, a tethering protein of the early sorting endosome, shows a polarized distribution in hippocampal neurons, epithelial cells, and fibroblasts. Mol Biol Cell. 11 (8), 2657-2671 (2000).
  20. Dumas, J. J., et al. Multivalent endosome targeting by homodimeric EEA1. Mol Cell. 8 (5), 947-958 (2001).
  21. Bucci, C., et al. Rab7: a key to lysosome biogenesis. Mol Biol Cell. 11 (2), 467-480 (2000).
  22. Langemeyer, L., Fröhlich, F., Ungermann, C. Rab GTPase function in endosome and lysosome biogenesis. Trends Cell Biol. 28 (11), 957-970 (2018).
  23. Wang, C., et al. Investigation of endosome and lysosome biology by ultra pH-sensitive nanoprobes. Adv Drug Deliv Rev. 113, 87-96 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tkanka serca myszyfrakcjonowanie subkom rkoweplatforma nanofiltracyjnasekwencyjne wirowanienano cytometria przep ywowadynamiczne rozpraszanie wiat akokultura kardiomiocyt wmarkery endosomalnecharakterystyka p cherzyk w

Powiązane artykuły