Artykuł metodologiczny

Przestrzenne obrazowanie molekularne glikomu za pomocą spektrometrii mas

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69154

⸱

28 listopada 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR), University of Florida, Gainesville, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida, Gainesville, 3Markey Cancer Center, University of Kentucky, 4Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Kentucky

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje kluczowe kroki umożliwiające rygorystyczne i powtarzalne pomiary zarówno glikogenu, jak i glikanów powiązanych z N za pomocą spektrometrii masowej.

Streszczenie

Przestrzenna organizacja glikomu w tkankach jest kluczowa dla molekularnych podstaw funkcjonowania fizjologicznego. Różnorodny i dynamiczny glikom jest kluczowy dla podstawowych procesów komórkowych, takich jak metabolizm, sygnalizacja i adhezja. Innowacje w biologii przestrzennej otworzyły nowe możliwości przestrzennego obrazowania molekularnego różnych klas glikomów. Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół przestrzennego obrazowania biomolekularnego glikomu w świeżo zamrożonej wątrobie myszy. Workflow obejmuje (1) szybkie pobieranie i zamrożenie, (2) sekcjonowanie kriostatu w optymalnej grubości i pozycji, (3) przygotowanie tkanek i trawienie enzymów na tkankach przy użyciu enzymów aktywnych węglowodanów, (4) aplikację matrycy i pozyskiwanie danych za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji spektrometrii mas wspomaganej matrycą (MALDI-MSI) oraz (5) przetwarzanie i wizualizację danych w celu umieszczenia wyników w kontekście biologicznym. Zastosowanie tego podejścia pozwala na pozyskiwanie szczegółowych map przestrzennych glikanów i glikogenów związanych z azotem, ujawniających kluczowe cechy fizjologiczne i komórkowe. Dane te pozwalają zdefiniować kluczową przestrzenną heterogeniczność glikomową związaną z funkcjonowaniem i dysfunkcją wątroby. Ten sposób pracy umożliwia wysoce powtarzalną i czułą glikomię przestrzenną wątroby myszy. Dodatkowo jest łatwo adaptowalny do innych tkanek lub gatunków, co umożliwia nowatorskie wglądy przestrzenne w biologię glikomu w zdrowiu i chorobie.

Wprowadzenie

Dziedzina biologii przestrzennej szybko się rozwija, dostarczając kluczowych wglądów w dynamiczną przestrzenną złożoność biomolekularną organizmów żywych. Stosuje się wiele podejść do badania odrębnych biomolekuł w kontekście biologicznym. Chociaż niektóre są wysoce wyspecjalizowanymi technikami, spektrometria mas (MS) stała się ważną ogólną techniką do ilościowego określania szerokiego zakresu biomolekuł w kontekście komórek, tkanek lub organizmów.

Matrix-Assisted Laser Desorption/Jonization Mass Spectrometry Imaging (MALDI-MSI) jest jedną z rozwijających się ogólnych technik wieloprzestrzennego obrazowania biomolekuł. Początkowo został opracowany do wizualizacji białek i peptydów w przekrojach tkanki1. Od tego czasu rozszerzono ją na wiele różnorodnych próbek biologicznych i cząsteczek2. Technikę tę można zastosować do próbek komórkowych3, organoidów4, zwierząt modelowych5 oraz próbek pacjentów 6,7. Niektóre klasy molekularne można bezpośrednio mierzyć metodami opartymi na MSI, w tym wiele metabolitów i lipidów, podczas gdy inne bardziej złożone biocząsteczki, takie jak białka i glikany, wymagają obróbki enzymatycznej lub chemicznej, aby nadawały się do wykrywania opartego na MSI 2,8.

MALDI-MSI został również zastosowany do analizy przestrzennej glikanów i glikogenów powiązanych z azotem, wykorzystując procesy wymagające przetwarzania enzymatycznego do produkcji fragmentów glikanów odpowiednich do wykrywania MSI 9,10,11,12,13,14,15 . N-glikany są rozszczepiane z reszty asparaginy białek z PNGazą F, a łańcuchy glukozy glikogenu są rozszczepiane izoamylazą. Kluczowymi zaletami analizy glikogenu MALDI jest zapewnienie przestrzennego zdefiniowania rozkładu glikogenu w próbce biologicznej, względnej ilościowej analizy oraz informacji o rozgałęzieniu łańcuchów glukozowych. Ponieważ zarówno procesy N-glikanu, jak i glikogenu wymagają enzymatycznego przetwarzania próbki do analizy MSI, zostały połączone w zintegrowany proces analizy glikomu (Rysunek 1A). Ten proces wymaga starannego przygotowania próbek biologicznych oraz specjalistycznego przetwarzania, aby umożliwić analizę glikomu w rozsianym skleściu skleistymowym, a następnie pobieranie i przetwarzanie danych. Chociaż workflow wymaga serii specjalistycznych kroków, generuje bogate, wysokiej jakości dane glikomu przestrzennego, które są wysoce powtarzalne i można je dostosować do wielu różnych typów próbek16. Dodatkowo proces jest modułowy, dzięki czemu etapy przetwarzania próbek mogą być wykonywane przez niezależne laboratoria badawcze przed przekazaniem próbek do specjalistycznych placówek wykonujących późniejsze etapy pozyskiwania i analizy danych MALDI-MSI.

Protokół

Badania te zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. opieki i użytkowania zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Florydy. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Pobór wątroby

  1. Eutanazja i sekcja zwierząt
    1. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy i dekapitację w celu uśpienia myszy (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).
      UWAGA: W tym przykładzie użyto 6-miesięcznej myszy typu dzikiego typu C57BL/6J. W tym wieku myszy ważą ~25-33 g. Do tej analizy doskonale nadaje się szeroki zakres wieku, rozmiarów i szczepów.
    2. Natychmiast umieść zwierzę na chłonnym podkładzie i odsłonij jamę brzuszną sterylnym skalpelem.
    3. Używając sterylnych kleszczy i nożyczek, izoluj wątrobę przy minimalnej manipulacji i uszkodzeniach tkanek.
      UWAGA: Zmiany metaboliczne zachodzą szybko. Unikaj perfuzji lub sedacji, jeśli to możliwe, i upewnij się, że etapy sekcji są wykonywane jak najszybciej17.
  2. Szybko umyj i wyczyść tkankę.
    1. Delikatnie zanurz wątrobę w 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby usunąć krew.
    2. Zanurz tkankę w wodzie dejonizowanej (DI) dwa razy.
    3. Nadmiar wody delikatnie dotykając chusteczki czystą wycieraczką.
      UWAGA: Próbki większe niż te, które zmieścią się na standardowym szkiełku mikroskopowym, należy pociąć na kawałki przed zamrożeniem.
  3. Zamrożenie próbki
    1. Umieść oczyszczoną wątrobę bezpośrednio w schłodzonej jednorazowej łodzi polistyrenowej pływającej na ciekłym azocie.
    2. Gdy tkanka zmieni kolor na błyszczącą, nieprzezroczystą, około 3 minut, następnie umieść ją w gotowych i oznakowanych opakowaniach z folii aluminiowej na suchym lodzie.
    3. Umieść paczki folii aluminiowej wraz z próbkami do zamrażarki o temperaturze -80 °C do przechowywania. Próbki można przechowywać długoterminowo w temperaturze -80 °C.

2: Przygotowanie próbki biologicznej

  1. Przygotowanie do kriosekcji
    1. Upewnij się, że kriostat jest włączony i wyrównany do temperatury odpowiedniej dla tkanki, między -16 °C a -20 °C. Dokładna temperatura zależy od rodzaju tkanki. Wątroba powinna być przecinana w nieco wyższej temperaturze, około -16 °C do -17 °C, aby zapobiec pęknięciom tkanek, podczas gdy inne tkanki powinny być przecięte w temperaturze -20 °C.
    2. Upewnij się, że są tam co najmniej dwa uchwyty, dwa cienkie pędzle, para cienkich pęset oraz szklana wkładka o średnicy 70 mm w temperaturze w kriostacie. Dodatkowo, przed umieszczeniem w kriostacie wsuwa się ołówkiem do etykiety, aby się zaaklimatyzowały.
    3. Przenieś tkankę z zamrażarki o temperaturze -80 °C do kriostatu na suchym lodzie.
    4. Pozwól tkankom przyzwyczaić się do temperatury w kriostatie przez co najmniej 30 minut.
    5. Upewnij się, że krawędź szklanej wkładki nie jest uszkodzona i że jest gładka tam, gdzie tkanka styka się z prowadnicą antytoczkową, przesuwając palcem w rękawiczce po krawędzi.
    6. Włóż wkładkę szklaną do prowadnicy antytołu.
    7. Weź niskoprofilowe ostrze i ostrożnie wsuń je do otwartego uchwytu na ostrze, zamykając uchwyt na ostrze. Połóż czerwoną osłonę ostrza na ostrze aż do podziału na sekcje.
    8. Zamontuj tkankę na uchwytie za pomocą nośnika montażowego M1, który jest kompatybilny z MS. Załóż nośnik montażowy M1 w temperaturze pokojowej na uchwyt wewnątrz kriostatu, zakrywając co najmniej dwa pierścienie na uchwytie, aby chusteczka była mocno zamocowana.
      UWAGA: Związek o idealnej temperaturze cięcia (OCT) jest często stosowany w kriosekcji; jednak powoduje ona tłumienie jonów w aplikacjach MS i należy jej unikać. Jeśli musi być użyty OCT, należy zastosować dodatkowy protokół wieloetapowy, aby zminimalizować lub usunąć OCT. Dodatkowo niektóre centra zasobów MS nie będą analizować próbek osadzonych w OCT.
    9. Weź schłodzoną pęsetę i usuń chusteczkę z folii aluminiowej. Użyj pęsety, aby ustawić chusteczkę na oklepie w pożądanej orientacji.
    10. Włóż uchwyt do kriostatu, aby materiał montażowy mógł zamarznąć, około 2 minut. Po zamrożeniu będzie twardy i będzie wyglądał na nieprzezroczysty.
  2. Kriosekcja tkanki wątroby
    1. Włóż uchwyt z zamontowaną chusteczką do uchwytu na uchwyt. Ustaw uchwyt tak, aby tkanka tła pod kątem 90° względem ostrza.
    2. Wycofaj uchwyt na uchwyt, aż tkanka nie będzie miała kontaktu z ostrzem. Powoli wprowadzaj oklep, aż tkanka będzie tuż obok ostrza, aby rozpocząć sekcjonowanie.
    3. Rozpocznij cięcie od przekroju o grubości 30 μm, aby usunąć niepożądaną tkankę.
    4. Upewnij się, że głębokość płyty rolkowej tworzy gładki przekrój, a chusteczka nie toczy się po niej na powierzchni. Jeśli tak jest, poluzuj lekko płytkę rolkową. Jeśli tkanka przesuwa płytę rolkową i uderza ją po raz drugi podczas resetu obrotu, należy lekko dokręcić płytę rolkową.
    5. W miarę zbliżania się do pożądanego przekroju, należy zmniejszyć zamierzoną grubość przekroju do 10 μm lub innej pożądanej grubości odpowiedniej do konkretnego zastosowania.
    6. Wykonaj 10 obrotów, aby uchwyt miał odpowiednią grubość, aby zapobiec zacięciom i nierównym przekrojom.
    7. Użyj schłodzonego pędzla, aby oczyścić scenę w przygotowaniu do podziału. Zamknij płytkę rolkową nad ostrzem i powoli zdejmij fragment tkanki.
    8. Podnieś płytę rolkową i użyj dwóch schłodzonych, cienkich pędzli, aby delikatnie odsunąć fragment od ostrza. Przesuń tę sekcję na bok sceny, aby ułatwić montaż na suwaku.
    9. Weź schłodzony preparat z nosiciela w kriostatie i umieść palec wskazujący po przeciwnej stronie preparatu niż tam, gdzie będzie umieszczona tkanka, przez 10 sekund.
    10. Delikatnie połóż szkiełko na chusteczce i podnieś ją z powrotem. Nie naciskaj mocno, bo to rozerwie tkankę. Tkanka powinna stopić się na szkiełku i stać się przezroczysta.
    11. Szybko przełóż szkiełki do suszarki do suszenia. Susz zamk w osuszarce przez 1 godzinę.
    12. Po wyschnięciu preparaty mogą być bezpośrednio przetwarzane do MS lub pakowane próżniowo i przechowywane w temperaturze -80 °C.

3. Przygotowanie szkiełek do MSI glikomiki

  1. Przygotowanie enzymów
    UWAGA: Można kupić i bezpośrednio stosować liofilizowaną PNGazę F gotową do rozsianej rozsianej subsolnej rozsianej.
    1. Izoamylaza wymaga dializ, aby usunąć nadmiar soli w aplikacjach SM. Przygotuj jeden lub więcej kubków dializ, wstawiając je do wody HPLC na 15 minut.
    2. Dializuj 200 μL izoamylazy z bazy za pomocą kubka dializacyjnego o pojemności 500 μL w 14,3 ml wody HPLC przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, bez mieszania. Zamień 14,3 mL wody HPLC na świeżą wodę HPLC i dializuj przez dodatkowe 16 godzin (w nocy) w temperaturze 4 °C. Zamień 14,3 mL wody HPLC na świeżą wodę HPLC i dializuj przez dodatkowe 8 godzin w temperaturze 4 °C.
    3. Delikatnie usuń izoamylazę z kubka pipetą i umieść ją w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 sekundy. Zmierz całkowitą objętość roztworu izoamylazy po dializie (w μL). Na podstawie początkowej aktywności zapasu, zazwyczaj 200 jednostek/mL, oraz końcowej objętości, oblicz całkowitą objętość potrzebną na 3 jednostki izoamylazy.
    4. Pipeta aliquotuje 3 jednostki izoamylazy do cienkościennych rurek PCR. Zmień rurki zamrażające w ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Do każdego protokołu natrysku można użyć jednej rurki roztworu dializowanej izoamylazy, co wystarcza na cztery preparaty. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania, aby utrzymać aktywność enzymów.
  2. Utrwalanie i płukanie tkanek
    1. Włóż szkiełka do uchwytu na preparaty i zanurz w szklanym pojemniku wypełnionym 10% neutralną formaliną buforowaną (NBF) na 1 godzinę.
    2. Usuń slajdy z NBF. Zanurz szkiełki w 70% etanolu na 2 godziny.
    3. Przygotuj cztery słoiki Coplin zawierające 70%, 80%, 90% i 100% etanolu. Oznacz każdy słoik wyraźnie, aby uniknąć pomyłek podczas sekwencyjnego mycia.
    4. Kolejno przekładaj preparaty następująco: 70% etanolu przez 5 minut, 80% etanolu przez 5 minut, 90% etanolu przez 5 minut, 100% etanolu przez 5 minut.
    5. Przełóż szkiełka do szklanej szalki Petriego wypełnionej świeżym 100% ksylenem. Upewnij się, że zjeżdżalnie są całkowicie zanurzone. Inkubuj preparaty na shakerze z prędkością 70 obr./min przez 1 godzinę, w zależności od zawartości lipidów w tkance. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, używając świeżego ksylenu przy każdym myciu.
      UWAGA: Protokół ten został zaprojektowany tak, aby umożliwić maksymalną delipidację, ponieważ wiadomo, że lipidy powodują supresję jonów, a tym samym maksymalną powtarzalność. Jednak skutkuje to delokalizacją sygnałów, co zmniejsza rozdzielczość, którą można uzyskać. Skrócone ilości kroków mycia, ograniczenie czasu przetwarzania oraz staranna kontrola wilgotności mogą zmniejszyć delokalizację, a tym samym poprawić rozdzielczość danych.
    6. Włóż szkiełka do suszarki na noc, żeby wyschły.
    7. Umieść szkiełka w 70% etanolu na 1 minutę, żeby się nawodnić. Umieść szkiełka w wodzie DI na 3 minuty. Powtórz mycie wodą DI ze świeżą wodą DI.
    8. Susz szkiełki w suszarce przez 10 minut lub aż całkowicie wyschną.
  3. Przygotowanie preparatów do zastosowania enzymów
    1. Przygotuj komorę wilgotności HTX do inkubacji, umieszczając ręcznik papierowy nasączony wodą DI pod metalową półką. Umieść komorę w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
    2. Przygotuj parownik do jedzenia, napełniając zbiornik wodą z kranu aż do góry. Ustaw timer na 60 minut, żeby włączyć urządzenie.
    3. Przygotuj bufor cytrakonowy, dodając 50 mL wody klasy HPLC, 25 μL bezwodnika cytrakonowego oraz 2 μL 12 M HCl do rurki Falcon o pojemności 50 mL. Roztwór zatłuj przez 10 sekund, żeby dokładnie wymieszać. Każda rurka wirówki o pojemności 50 mL buforu cytrakonowego wystarcza na cztery preparaty. Sprawdź, czy pH roztworu wynosi 3,0 (dopuszczalny zakres: 2,5-3,5).
    4. Każdą przesyłkę wypełnij przygotowanym buforem cytrakonowym. Umieść szkiełko tak, aby tkanka była skierowana do środka, aby zapobiec dotykowi boków i umożliwić skuteczne pobranie antygenów. Na jedną pałkę można użyć dwóch preparatów, wykorzystując dwa pozycje krawędzi, przy czym oba preparaty mają chusteczki skierowane do środka.
    5. Sprawdź, czy parownik do jedzenia emituje parę. Włóż koperki do parownika i inkubuj przez 30 minut.
    6. Przenieś ulotki do kąpieli DI na 5 minut. Wymień połowę bufora cytrakonowego w korczucie wodą DI i odstaw na kolejne 5 minut. Powtórz to rozcieńczenie jeszcze dwa razy.
    7. Usuń cały rozpuszczalnik i umyj szkiełka, dodając 100% wodę DI do paczki, a następnie usuwając wodę DI. Używając chusteczki laboratoryjnej, wysusz miejscami wokół miejsc, w których nie ma tkanek.
    8. Narysuj na odwrocie każdego slajdu okrąg i trójkąt, aby zaznaczyć wewnętrzne standardowe lokalizacje. Nałóż 1 μL nadoksydazy chrzanowej 1 mg/mL (HRP; okrąg) oraz 1 μL glikogenu wątroby króliczego królika (trójkąt) o stężeniu 10 mg/mL na przód preparatu.
    9. Włóż szkiełka do osuszacza na 15 minut, żeby całkowicie wyschły.
  4. Opryskiwanie enzymami i trawienie
    1. Usuń jedną rurkę z 100 μg liofilizowaną PNGazę F (500 jednostek/μg) oraz jedną rurkę z 3 jednostkami izoamylazy i odmroź przez 10 minut. Rurki wirujące z ciśnieniem ~2000 x g przez 5 sekund w rurce mikrowirówki. To wystarczająca ilość enzymu, by spryskać 4 preparaty.
    2. Pipeta 50 μL DI wody do każdej liofilizowanej rurki PNGase F, delikatnie wiruj przez 10 sekund i wiruj w mikrofugu o ~2000 x g przez 5 sekund. Pipetować roztwór 50 μL PNGazy F bezpośrednio do rurki izoamylazowej. Dodaj wodę HPLC do końcowej objętości 1 mL.
    3. Vortex do rurki mikrowirówki z dwoma enzymami na 10 s i obróć się z ciśnieniem ~2000 x g przez 5 s.
    4. Włącz sprzątacz HTX M5 i otwórz oprogramowanie HTX M5. Upewnij się, że typ tacki jest ustawiony na Ambient w zakładce System .
    5. Wyłącz pompę Knauer, naciskając przycisk stop po prawej stronie z przodu. Włączaj zewnętrzną pompę strzykawkową za pomocą przełącznika na tylnym panelu.
    6. W oprogramowaniu HTX, w zakładce Metody , wybierz odpowiednią metodę opryskiwania podwójnym enzymem. Parametry muszą być ustawione na temperaturę dyszy 45 °C, 15 przejść, przepływ 0,025 mL/min, prędkość 1200 mm/min, odstęp gąsienicy 3 mm, wzór CC, ciśnienie ustawione na 10 psi, przepływ gazu 3 L/min oraz wysokość dyszy 40 mm.
    7. Przejdź do zakładki Temperatura i ustaw temperaturę dyszy natryskowej na 45 °C. Użyj klucza kluczowego, aby przesunąć przewód spryskiwacza do górnego złącza.
    8. Otwórz zawór gazu azotu o ultrawysokiej czystości i upewnij się, że ciśnienie w spryskiwaczu wynosi 10 psi. W pompie strzykawkowej ustaw przepływ na 95 μL/min.
    9. Używając świeżej strzykawki i igły, napełnij 4 mL wody HPLC. Usuń wszystkie bąbelki. Przepuść 2 mL wody przez ~6-calowy odcinek linii sprzańca do zlewki na odpady.
    10. Podłącz strzykawkę do przewodu stryskowego i przepuszczaj wodę przez pompę, uruchamiając i pracując z 95 μL/min przez 5 minut.
    11. Podczas płukania pompki strzykawkowej przyklej szkiełka do lewego dolnego rogu podgrzewanej tacy, używając metalowej prowadnicy, aby upewnić się, że tkanka znajduje się w obszarze natrysku. W zakładce Sample zdefiniuj parametry X i Y dla regionu natrysku, co pozwala na lekkie przetryskiwanie i zapewnienie pełnego pokrycia szkiełem.
    12. Po 5 minutach zatrzymaj pompę, odłącz strzykawkę, wciągnie do niej powietrze, a następnie przepchni powietrze przez linię spryskiwacza, aby usunąć resztki wody. Powtarzaj w razie potrzeby.
    13. Załaduj roztwór podwójnego enzymu do nowej strzykawki i podłącz do pompy, upewniając się, że nie pozostaną żadne pęcherzyki.
    14. Podłącz strzykawkę do przewodu sprzepiacza. W pompie strzykawkowej dostosuj przepływ do 25 μL/min.
    15. Gdy dysza natryskowa osiągnie 45 °C, naciśnij Start pod zakładką Cykl. Kliknij Nie , gdy pojawi się poproszenie o włączenie pompy Knauer. Naciśnij Start na pompce strzykawki, aby rozpocząć sprysk.
    16. Umieść pusty szkiełko pod dyszą natryskową, aby potwierdzić widoczne osadzanie enzymów w sprayu. Po zauważeniu kliknij Kontynuowaj w oprogramowaniu, załóż szklaną pokrywę na spryskiwacz i monitoruj równomierne naniesienie, co wskazuje równomierne zwilżenie.
    17. Po zakończeniu cyklu natrysku naciśnij stop na pompie, wyłącz gaz azotowy i kliknij Potwierdź obciążenie zaworu. Wyczyść przewód i stopień spryskiwacza oraz zakręć zrzut, upewniając się, że pompa Knauera jest ponownie włączona.
    18. Inkubuj preparaty w komorze wilgotności HTX w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, ustawiając je skierowane do góry. Po zakończeniu umieść preparaty w osuszacu na 15 minut. Preparaty mogą pozostać w osuszaczu przez całą noc lub można kontynuować procedurę.
  5. Przygotowanie macierzy MALDI i zastosowanie
    1. Przed zastosowaniem macierzy wykonaj optyczny obraz preparatu za pomocą skanera.
    2. Zważ 40 mg stałego CHCA do stożkowej probówki o pojemności 15 mL. Proszek CHCA rozpuścić w roztworze 0,1% kwasu trifluoroctowego i 50% acetonitrylu (ACN) w stężeniu 7mg/mL.
    3. Sonikuj roztwór macierzowy przez 10 minut, stosując cykle 90 sekund włączone i 30 sekund wyłączone. Powtórz te kroki 5 razy, aby zapewnić pełne rozpuszczenie i jednorodność.
    4. Włącz sprzątacz HTX M5 i otwórz oprogramowanie HTX M5. Otwórz zawór gazu azotowego i ustaw ciśnienie układowe na 10 psi.
    5. W oprogramowaniu HTX, w zakładce Metody , wybierz odpowiednią metodę natrysku macierzowego CHCA. Parametry ustawione na temperaturę dyszy 79 °C, 10 przejść, przepływ 0,1 mL/min, prędkość 1300 mm/min, odstęp gąsienicy 3 mm, wzór CC, ciśnienie ustawione na 10 psi, przepływ gazu 3 L/min oraz wysokość dyszy 40 mm.
    6. Przejdź do zakładki Temperatura , ustaw temperaturę dyszy natryskowej na 79 °C. Pod zakładką pompy ustaw przepływ na 100 μL/min.
    7. Przyklej zamki do lewego dolnego rogu podgrzewanej tacy za pomocą metalowej prowadnicy, aby zapewnić prawidłowe wyrównanie w obszarze natrysku. W zakładce Sample zdefiniuj parametry X i Y dla regionu natrysku, co pozwala na lekkie przetryskiwanie i zapewnienie pełnego pokrycia szkiełem.
    8. Użyj jednorazowej strzykawki i igły, aby pobrać 5,5 mL 50% ACN (usuwając pęcherzyki).
    9. Ustaw sprzakujący w trybie LOAD . Włóż strzykawkę ACN i wstrzyknij ACN. Wyjmij strzykawkę ACN i natychmiast zamień ją na nową strzykawkę zawierającą 5,5 mL przefiltrowanego roztworu CHCA, wstrzykując się, starając się uniknąć powstawania pęcherzyków. Ustaw strysk na tryb SPRAY .
    10. Gdy dysza natryskowa osiągnie 79 °C, naciśnij Start pod zakładką Cykl. Kliknij na Tak , gdy pojawi się poproszona.
    11. Użyj pustego zamka testowego i umieść go pod dyszą sprzańca. Aby potwierdzić widoczne naniesienie matrycy natryskowej, na preparatie znajdziemy żółtą macierzystą depozycję. Po zaostrzeniu kliknij Kontynuowaj, załóż szklaną pokrywę na przyrząd i monitoruj konsystencję sprayu. Jednolity natrysk da zsuwanie o jednolitej nieprzezroczystości.
    12. Po zakończeniu cyklu natrysku ustaw sprzelnik na tryb LOAD i kliknij Valve load confirm (Potwierdź zawór load over).
    13. Wyczyść sprzak, ustawiając pompę na 300 psi i obniżając temperaturę do 30 °C. Wychłanij i przepchnij przez linię 5 mL 50% acetonitrylu dwa razy i 5 mL 50% metanolu dwa razy. Wyczyść scenę 100% metanolem. Gdy temperatura osiągnie 30 °C, przełącz na LOAD, wyłącz gaz, wyłącz strysk i upewnij się, że pompa Knauera jest ponownie włączona.
    14. Umieść preparaty w osuszacu na 15 minut, aż matryca całkowicie wyschnie. Preparaty powinny być uruchamiane jak najszybciej po natrysku, maksymalnie w ciągu 14 dni, aby zapewnić niezawodne zbieranie danych z odpowiednim stosunkiem sygnału do szumu.

4. Zbieranie danych glikomicznych MALDI-MSI

  1. Przygotowania do zbierania danych
    1. Zabezpiecz suwak w uchwycie próbki instrumentu MALDI za pomocą adaptera suwaka. Włóż uchwyt na próbkę do MS i upewnij się, że jest prawidłowo osadzony do badania obrazowego.
    2. Otwórz oprogramowanie flexImaging i zaimportuj wcześniej zarejestrowany obraz optycznego slajdu, zobacz krok 3.4.1. W razie potrzeby skalibruj wyrównanie obrazu ze stopniem instrumentu, aby przekroje tkanek i standardowe plamy były prawidłowo ustawione do wyboru regionu.
    3. Zdefiniuj obszary obrazowania dla przekrojów tkanek, standard HRP, standard glikogenu oraz kwadrat macierzy kontrolnej w oprogramowaniu. Określ każdy jako osobny region.
    4. Ustaw rozmiar kroku rastrowego na 50 μm, co daje rozdzielczość pikseli 50 × 50 μm.
    5. W oprogramowaniu sterowania instrumentów wybierz tryb MS z jonami dodatnimi i ustaw zakres skanowania na m/z 500 - 4000 z niskim odcięciem masy 700,00 m/z.
    6. Załaduj wstępnie zoptymalizowany parametr strojenia obrazowania MALDI w oprogramowaniu sterowania instrumentem (lub wprowadź wartości ręcznie, jeśli jest to potrzebne). Sprawdź, czy napięcia optyczne źródła i jonów są ustawione na określone wartości: Przesunięcie płyty MALDI 50,0 V; Ugięcie 1 Delta 70,0 V; Komin 1 RF 500.0 Vpp; Komin 2 RF 500.0 Vpp; Wielobiegunowy RF 500.0 Vpp; Energia jonowa 5,0 eV. Potwierdź ustawienia komórki kolizyjnej i TOF: Energia kolizji 10,0 eV; Collision RF 4000.0 Vpp; Czas transferu 180,0 μs; Przechowywanie przed impulsami 25,0 μs.
    7. Potwierdź ustawienia lasera w zakładce Laser. Wybierz Imaging 50 μm jako domyślną aplikację.
    8. Skalibruj spektrometr masowy za pomocą zewnętrznej mieszanki kaliberantowej, takiej jak tune mix. Wprowadź kalibrant i uruchom rutynę kalibracji instrumentu. Dostosuj kalibrację tak, aby błąd dokładności masy mieścił się w granicach 0,001%, a wskaźnik dokładności kalibracji 100%.
    9. Ustaw akwizję tak, aby wykonała serię 320 strzałów laserowych z częstotliwością 10 000 Hz. Tłumienie lasera powinno być regulowane do 37%, aby utrzymać intensywność sygnału w optymalnym zakresie dynamicznym. Dostosowuj strzały laserowe i tłumienie w razie potrzeby.
    10. Korzystaj z automatycznej funkcji wyrównania wiązki, regulacji profilu celu oraz ostrości, aby upewnić się, że laser jest prawidłowo skierowany na próbkę. W obszarze poza tkanką wykonaj automatyczne dostosowanie wiązki w zakładce Laser w oprogramowaniu sterującym, aby wyrównać laser z optyką jonową. Zapewni to, że laser i stopień zostaną dostosowane do optymalnego zbierania danych. Na koniec wykonaj generowanie profilu celu i regulacje strojenia ostrości w zakładce nośnej próbki.
    11. Potwierdź, że wewnętrzne punkty standardowe generują oczekiwane szczyty jonów, co wskazuje na gotowość do zbierania danych. HRP powinien mieć wyraźny szczyt glikanu na poziomie 1211,42. Glikogen powinien występować w regularnych miejscach na wyraźnych szczytach, z najwyższymi szczytami intensywności na poziomie 1013,32, 1175,37 i 1337,43.
      UWAGA: Jeśli wykryto problemy z intensywnością, ponownie przejrzyj konfigurację lasera. Jeśli wykryto problemy z dokładnością masy, ponownie sprawdź kalibrację.
  2. Zbieranie danych MALDI-MSI
    1. Rozpocznij akwizycję obrazowania MALDI-MS dla zdefiniowanych obszarów, klikając przycisk Start w oprogramowaniu obrazującym. Instrument automatycznie rastruje laser na każdym zdefiniowanym obszarze w odstępach 50 μm, uzyskując dodatnie widmo MS1 (m/z 500-4000) na każdym pikselu. Typowy czas zbierania danych dla cięcia wątroby przy tej rozdzielczości wynosi 135 minut.
      UWAGA: Po uruchomieniu instrument automatycznie zapisuje widma dla każdego pozyskanego piksela, tworząc folder .d z surowymi danymi.

5. Analiza danych MALDI-MSI

  1. Import i eksport danych
    1. Zaimportuj zestaw danych do SCiLS Lab lub odpowiedniego oprogramowania do analizy MSI, aby zwizualizować mapy intensywności jonów glikomu na przekrojach tkanek.
    2. Otwórz laboratorium SCiLS. Wybierz Nowe. Wybierz plik .mis z uruchomienia MALDI.
    3. Gdy plik .mis się otworzy w SCiLS, kliknij Dalej. Wybierz Automatyczny zakres dla zakresu m/z. Wybierz automatyczną oś dla parametrów osi. Wybierz absolutny rozmiar kosza. Kliknij Dalej, a następnie Import. Wybierz folder, w którym plik zostanie zapisany.
    4. Po zakończeniu importu otwórz nowy plik .slx.
    5. Kliknij plik, Importuj i wybierz listę funkcji w opcji pliku. Importuj adnotacje glikomowe i tworz obrazy jonów, przechodząc do panelu listy funkcji, wybierając właściwą listę i klikając przycisk tworzenia obrazów jonowych.
      UWAGA: Dostępne są solidne listy cech dla N-glikanów16, 18, 19 oraz glikogenu13.
    6. Normalizuj dane, w zależności od potrzeby. Całkowita liczba jonów (TIC) jest najczęściej stosowaną normalizacją.
    7. Po załadowaniu obrazów jonów przejdź przez listę funkcji i upewnij się, że integracja szczytów jest poprawna, ręcznie dostosowując te cechy, w których szczyt nie jest w pełni zintegrowany. Aby dostosować, kliknij lewym przyciskiem na szczyt, trzymając shift. Gdy peak zostanie zintegrowany, naciśnij control i spację na klawiaturze. To wygeneruje nowy obraz jonów dla skorygowanego piku.
    8. Po powtórzeniu przez resztę listy funkcji, w panelu obrazu ion wybierz listę funkcji Zapisz, nazwij ją i kliknij Zapisz.
    9. Przejdź do pliku, tabeli cech i otwórz tabelę z listą cech, która właśnie została zapisana. Sortuj według m/z. Dostosowane cechy pojawią się z pustą komórką w kolumnie nazw. Zmieniaj nazwę zmodyfikowanych szczytów, kopiując i wklejając nazwę, a oryginalny szczyt usuwaj, wybierając przycisk usuwania wybranego wiersza z listy cech, znajdującego się na górze środka tabeli cech.
    10. Po dostosowaniu wszystkich nazw otrzymuje się ostateczną listę pików z adnotacjami. Kliknij przycisk Dodaj intensywność znajdujący się obok przycisku usuń. Następnie wybierz interesujące próbki, aby wyeksportować średnią intensywność dla cech oznaczonych adnotacjami dla każdego obszaru na obrazie.
    11. Upewnij się, że wyznacz tryb przetwarzania interwałowego obszaru szczytowego oraz całkowitą liczbę jonów dla normalizacji. Kliknij OK. Pojawią się nowe kolumny z odpowiadającymi danymi. Aby wyeksportować dane, wybierz strzałkę wskazującą na zewnątrz i zapisz jako .csv.

Wyniki

Ostrożne przetwarzanie wątroby z dzikiej myszy, w tym wycięcie pełnego przekroju poprzecznego (Rysunek 1A), pozwoliło zdefiniować glikom za pomocą MALDI-MSI, z użyciem różnych oligosacharydów pochodzących z glikogenu oraz glikanów powiązanych z N w zakresie m/z (Rysunek 1B). Glikogen był szeroko zlokalizowany w celach wątrobowych hepatocytów i brakowało mu naczyń oraz tkanki łącznej w drogach wrotnych, zgodnie z oczekiwaniami (rysunek 1C,D). Co istotne, dane MALDI-MSI umożliwiły pomiar zarówno przestrzennego rozkładu glikogenu, jak i rozkładu długości łańcuchów, co jest kluczową cechą glikogenu w normalnym metabolizmie i stanach chorobowych (Rysunek 1D). Dodatkowo, różnorodne glikany związane z azotem wykazują zróżnicowane organizacje. Obserwowane rozmieszczenie przestrzenne obejmuje obszary od szeroko rozmieszczonych w hepatocytach (rysunek 1E) przez ogniska regionalne, zgodne z organizacją sinusoidalną wątroby (rysunek 1F), oraz specyficzne oznakowanie elementów dróg wrotnych (rysunek 1G-I).

figure-results-1
Rysunek 1: Analiza glikomu MALDI-MSI wątroby myszy. (A) Schemat krytycznych metod w przygotowywaniu próbek, pozyskiwaniu i analizie danych. (B) Próbki widm mas uzyskanych z tego podejścia. Strzałki na czerwono pokazują regularnie rozmieszczone oligosacharydy pochodzące z glikogenu, różniące się o jeden monosacharyd glukozy. Strzałki na niebiesko oznaczają N-glikany, które występują w całym spektre. W wątrobie szczyty glikogenu są zazwyczaj bardziej widoczne, zwłaszcza przy wyższych wartościach m/z. (C) Przestrzenny rozkład maltoheksaozy (DP6) pochodzącej z glikogenu w wątrobie. (D) Rozkład długości łańcuchów glikogenowych w wątrobie. (E-G) Przestrzenne rozmieszczenie różnych gatunków glikanów związanych z azotem w wątrobie. (H) barwienie hematoksylyną i eozyną (H&E) dla skupionego obszaru centralnego, wraz z annotacjami anatomicznymi. (I) Odpowiadająca skupiona wstawka pokazująca przestrzenną lokalizację dodatkowego glikanu sprzężonego z N (Hex5dHex1HexNAc5) w elementach drogi wrotnej. Skala: 500 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Dyskusja

MALDI-MSI to nowe narzędzie w biologii przestrzennej glikomu. Co ważne, choć protokół ten koncentruje się na zbieraniu danych przy użyciu konkretnego sprzętu, można go łatwo dostosować do platform MALDI-MSI od wieludostawców. Obróbka próbek jest identyczna aż do metody 4, choć niektórzy dostawcy mogą wymagać użycia specjalistycznych preparatów. Modyfikacje zbierania danych, wykorzystujące parametry specyficzne dla platformy MALDI-MSI, umożliwiają szybkie dostosowanie tego protokołu. Można wykorzystać oprogramowanie specyficzne dla dostawców do przetwarzania danych, jak opisano w kroku 5, lub alternatywnie platformy do rygorystycznego i powtarzalnego przetwarzania danych MALDI-MSI19.

MALDI-MSI jest szczególnie przydatnym narzędziem do zrozumienia biologii, ponieważ różne narządy, tkanki i komórki mają różne wzory glikomu. Wątroba doskonale nadaje się do analizy glikomu, ponieważ zawiera wysoki poziom glikogenu oraz różnorodne glikany związane z azotem13. Inne narządy mają wyższy poziom i różnorodność glikanów związanych z azotem oraz niższe poziomy glikogenu13. Co ważne, glikom różni się w zależności od narządów w zależności od stanu metabolicznego i chorobowego organizmu, dlatego glikom dostarcza bogatego źródła informacji biologicznych 5,14,15,20. Kontynuacja rozwoju unikalnych enzymów aktywnych węglowodanami do analizy MALDI-MSI zapowiada rozszerzenie analizy glikomu na dodatkowe ortogonalne biomolekuły w glikomie.

Mimo wielu zalet, MALDI-MSI jest obecnie ograniczony pod względem rozdzielczości w porównaniu z innymi narzędziami wykorzystywanymi w biologii przestrzennej. Protokół ten wykorzystywał zbieranie danych o rozdzielczości 50 μm. Choć doskonałe do analizy fizjologicznej, dane w rozdzielczości pojedynczej komórki znacząco posunęłyby pole do przodu21. W szczególności delokalizacja może stanowić istotną barierę dla zwiększenia rozdzielczości w metodach wykorzystujących opryskiwanie enzymami i inkubację w wilgotnych warunkach. Najnowsze postępy w sprzęcie do przetwarzania próbek, metodach obsługi próbek, sprzęcie do akwizycji danych, zastosowaniu selektywnego oznaczania oraz przetwarzaniu danych pozwalają zbieraniu danych MALDI-MSI zbliżyć się do rozdzielczości komórkowej22,23. Jednak istnieją kompromisy między rozdzielczością a stosunkiem sygnał-szum oraz inherentne ograniczenia wynikające z obecnych metod przygotowania próbek dla MALDI, które należy wziąć pod uwagę. Bardzo konkretne zastosowania już osiągają cel MALDI-MSI z rozdzielczością pojedynczych komórek, wykorzystując innowacje zarówno w przetwarzaniu próbek24, jak i nowatorskie algorytmy, co sugeruje, że ogólne rozwiązania tych problemów są w zasięgu 25,26,27.

Po zebraniu danych preparat można barwić metodą H&E w celu adnotacji histologicznej. Jednak uszkodzenia komórek i tkanek są związane ze zbieraniem danych MALDI-MSI, dlatego ta strategia ogranicza zakres adnotacji komórkowej. Alternatywnie, sekwencyjne cięcia tkanki mogą być wykorzystywane do H&E. Ta strategia dostarcza wysokiej jakości danych, ale wymaga dopasowania i integracji dyskretnych wycięć próbek.

Warto zauważyć, że tkanki z formaliną utrwaloną w parafinę (FFPE) są bardzo dobrze nadane do analizy glikomu przeprowadzonej przez MALDI-MSI, z niewielkimi zmianami w protokole przygotowania próbki13. Jednak tkanki FFPE nie mogą być skutecznie wykorzystywane do analiz metabolomicznych i innych podobnych, dlatego dla podejść multiomicznych28 preferowane są próbki świeżo zamrożone, jak opisano tutaj. Przygotowanie próbek jest kluczowym elementem każdego procesu MSI dotyczącego niestabilnych biomolekuł, co wymaga specjalnych metod do pobierania i obsługi próbek 17,29,30.

Metodologie rozszerzające ogólność i szerokie zastosowanie podejść opartych na MALDI-MSI szybko się rozwijają, z ogromną poprawą sprzętu i oprogramowania19. Dodatkowo, najnowsze nowoczesne podejścia multiomic28 imultimodal 21 połączone z uczeniem maszynowym i sztuczną inteligencją są szczególnie obiecujące w obsłudze tych wysoce złożonych zbiorów danych31.

Oświadczenia

R.C.S., M.S.G. i C.W.V.K. są współdyrektorami Centrum Zaawansowanych Badań Biomolekuł Przestrzennych (CASBR) na Uniwersytecie Florydy oraz współzałożycielami Sugar3 LLC. R.C.S. otrzymał wsparcie badawcze i/lub honoraria konsultingowe od Maze Therapeutics. M.S.G. otrzymał wsparcie badawcze, związki badawcze lub honoraria konsultingowe od Maze Therapeutics, Valerion Therapeutics, Ionis Pharmaceuticals, PTC Therapeutics oraz Aro Biotherapeutics. M.S.G. jest członkiem rady doradczej naukowej Chelsea's Hope, Glut1-Deficiency Syndrome Foundation oraz Adult Polyglucosan Body Disease Foundation.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratoriów Vander Kooi, Sun i Gentry za owocne dyskusje. Badanie to zostało wsparte grantami National Institutes of Health (NIH) dla Biospecimen Procurement & Translational Pathology Shared Resource Facility Uniwersytetu Kentucky Markey Cancer Center, P30CA177558 dla D.B.A., R01AG066653, R01CA266004, R01AG078702, R01CA288696, RM1NS133593 dla R.C.S., R35NS116824 dla M.S.G., R01DC019054 dla C.W.V.K. oraz University of Florida College of Medicine.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chłonna podkładkaDenville ScientificB1623
Acetonitryl (ACN)Sigma-Aldrich34851-4X4L
Folia aluminiowaFisher Scientific  15078292
Bezwodnik cytrakonowySigma-Aldrich125318
Stożkowa rurka (15mL)Alkali ScientificCW5600
Słoje CoplinDWK Nauki o Życiu900570
Kriostat  LeicaCM1860
Zacisk kriostatowyLeica14041926491
SuszarkaBel ArtF424004131
Kubek dializowyThermo Fisher88400
EtanolFisher Scientific  22032601
Parownik do żywnościRival CKRVSTLM21   
Szklana wkładka (70 mm)Firma ŻelowaLGI50
GlikogenSigma-AldrichG8876Standard
Peroksydaza chrzanowa (HRP)Sigma-AldrichP8125Standard
Woda HPLCSigma-Aldrich270733-4X4L
Stryskiwacz HTXHTX TechnologiesM5
Kwas solnyFisher Scientific  A144-500
IzoamylazaMegazymeE-ISAMY
Pompa KnaueraKnauerP 4.1 S
Niskoprofilowe łopatkiNauki o mikroskopii elektronowej63059-01
Nośnik montażowy M1Epredia1310
Spektrometr masBruker DaltonicstimsTOF fleX
Mikrofuge-rurka (1,5 mL)Alkali ScientificCN3016
IgłaBD305109
Neutralna formalina buforowana NBFMillipore sigmaHT501128-4L
Gaz azotowyAirgasNIUHP300
PBSFisher Scientific  SH30256. FS
Lampy PCRPartnerzy MedSupply62-1091-1
PNGase F PRIME-LY ULTRA Biografia BulldogaNZPULT10LY
Laboratorium SCiLSBruker Daltonics1889000
ShakerThermo Scientific88882007
Slide   Nauki o mikroskopie elektronowym71873-02
Listka slajdowaProdukty RPI212620A
Sonicater (Bioruptor Pico)DiagenodaB01080010
Sterylne kleszczeDR InstrumentsS08098
Skalpel sterylnyWPIWPI-500240
Nożyczki sterylneNarzędzia Nauki Ścisłej14084-08
Strzykawka    Grainger19G342
Pompa strzykawkowaNowa EraNE-300
TaśmaFisher Scientific  15-901-R
Cienki pędzelAnezus#00
Kwas trójfluoroctowySigma-AldrichT6508-1L
Mieszanka stroju, ESI o niskim stężeniuAgilentG1969-85000
Łodzie wagoweSigma-AldrichHS120882
KsylenSigma-Aldrich534056
&alfa;-cyjano-4-hydroksycynaminowy kwas (CHCA)Cayman Chemical Company15254

Bibliografia

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Buchberger, A. R., Delaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: A review of emerging advancements and future insights. Anal Chem. 90 (1), 240-265 (2018).
  3. Ouedraogo, R., Daumas, A., Capo, C., Mege, J. L., Textoris, J. Whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry is an accurate and rapid method to analyze different modes of macrophage activation. J Vis Exp. 82, e50926(2013).
  4. Khalil, S. M., Cappuccio, G., Li, F., Maletic-Savatic, M. Molecular imaging of human brain organoids using mass spectrometry. J Vis Exp. 211, e66997(2024).
  5. Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metab. 33 (7), 1404-1417 (2021).
  6. Aichler, M., Walch, A. Maldi imaging mass spectrometry: Current frontiers and perspectives in pathology research and practice. Lab Invest. 95 (4), 422-431 (2015).
  7. Conroy, L. R., et al. High-dimensionality reduction clustering of complex carbohydrates to study lung cancer metabolic heterogeneity. Adv Cancer Res. 154, 227-251 (2022).
  8. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
  9. Powers, T. W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry workflow for spatial profiling analysis of N-linked glycan expression in tissues. Anal Chem. 85 (20), 9799-9806 (2013).
  10. Drake, R. R., Powers, T. W., Norris-Caneda, K., Mehta, A. S., Angel, P. M. In situ imaging of N-glycans by MALDI imaging mass spectrometry of fresh or formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Curr Protoc Protein Sci. 94 (1), e68(2018).
  11. Stanback, A. E., et al. Regional n-glycan and lipid analysis from tissues using MALDI-MS imaging. STAR Protoc. 2 (1), 100304(2021).
  12. Hawkinson, T. R., Sun, R. C. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging of glycogen in situ. Methods Mol Biol. 2437, 215-228 (2022).
  13. Young, L. E. A., et al. In situ mass spectrometry imaging reveals heterogeneous glycogen stores in human normal and cancerous tissues. EMBO Mol Med. 14 (11), e16029(2022).
  14. Conroy, L. R., et al. Spatial metabolomics reveals glycogen as an actionable target for pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 2759(2023).
  15. Clarke, H. A., et al. Glycogen drives tumor initiation and progression in lung adenocarcinoma. Nat Metab. 7 (5), 952-965 (2025).
  16. Wallace, E. N., et al. An N-glycome tissue atlas of 15 human normal and cancer tissue types determined by MALDI imaging mass spectrometry. Sci Rep. 14 (1), 489(2024).
  17. Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. J Vis Exp. 166, e62008(2020).
  18. Mcdowell, C. T., et al. Imaging mass spectrometry and lectin analysis of N-linked glycans in carbohydrate antigen-defined pancreatic cancer tissues. Mol Cell Proteomics. 20, 100012(2021).
  19. Palmer, A., et al. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry. Nat Methods. 14 (1), 57-60 (2017).
  20. Colpaert, M., et al. Neurological glycogen storage diseases and emerging therapeutics. Neurotherapeutics. 21 (5), e00446(2024).
  21. Taylor, M. J., Lukowski, J. K., Anderton, C. R. Spatially resolved mass spectrometry at the single cell: Recent innovations in proteomics and metabolomics. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 872-894 (2021).
  22. Chan, Y. H., et al. Gel-assisted mass spectrometry imaging enables sub-micrometer spatial lipidomics. Nat Commun. 15 (1), 5036(2024).
  23. Lim, M. J., et al. Maldi Hiplex-IC: Multiomic and multimodal imaging of targeted intact proteins in tissues. Front Chem. 11, 1182404(2023).
  24. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J Am Soc Mass Spectrom. 18 (9), 1646-1652 (2007).
  25. Rappez, L., et al. Spacem reveals metabolic states of single cells. Nat Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  26. Grgic, A., Cuypers, E., Dubois, L. J., Ellis, S. R., Heeren, R. M. A. Maldi MSI protocol for spatial bottom-up proteomics at single-cell resolution. J Proteome Res. 23 (12), 5372-5379 (2024).
  27. Dressman, J. W., Bayram, M. F., Angel, P. M., Drake, R. R., Mehta, A. S. Single-cell multiomic MALDI-MSI analysis of lipids and N-glycans through affinity array capture. Anal Chem. 97 (24), 12493-12502 (2025).
  28. Clarke, H. A., et al. Spatial mapping of the brain metabolome, lipidome, and glycome. Nat Commun. 16 (1), 4373(2025).
  29. Juras, J. A., et al. In situ microwave fixation provides an instantaneous snapshot of the brain metabolome. Cell Rep Methods. 3 (4), 100455(2023).
  30. Cantrell, A. R., et al. Protocol for high-power, brain-focused microwave fixation to define rodent metabolism. STAR Protoc. 6 (2), 103794(2025).
  31. Ma, X., et al. An AI-driven framework to map the brain metabolome in three dimensions. Nat Metab. 7 (4), 842-853 (2025).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mapowanie glikomuobrazowanie spektrometrią masMALDI MSIglikany N-stowarzyszonelokalizacja glikogenutrawienie enzymatyczne tkanekglikomika wątroby mysiejenzymy aktywne wobec węglowodanówprzestrzenna heterogeniczność glikomiczna
Przestrzenne obrazowanie molekularne glikomu za pomocą spektrometrii mas
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.