Artykuł metodologiczny

Metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69155

⸱

17 października 2025

 , 
1Department of Biology, Miami University

W tym artykule

Podsumowanie

Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa może ustalić związki przyczynowe między deficytami wyładowania neuronów a dysfunkcją kanału jonowego. Opisujemy metody i protokoły dynamicznego zaciskania w myszowych neuronach Purkinjego w móźku, zwracając uwagę na przydatne zasoby i kwestie techniczne. W badaniu reprezentatywnym dodaliśmy modelowaną przewodność sodu do neuronów Tsc1-/- Purkinje, aby zapobiec powtarzalnemu wyładowaniu.

Streszczenie

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) wynika z szerokiego zakresu czynników genetycznych i środowiskowych. Chociaż liczne mutacje związane z ASD zakłócają rozwój lub plastyczność synaps, coraz więcej z nich zmienia ekspresję i funkcjonowanie kanałów jonowych zależnych od napięcia, co skutkuje deficytami w wewnętrznej pobudliwości neuronów. Nagrania z użyciem zacisków napięciowych całej komórki mogą być użyte do scharakteryzowania, jak mutacje związane z ASD wpływają na funkcjonowanie kanałów jonowych. Jednak eksperymenty te nie pozwalają bezpośrednio ocenić, jak zmieniona przewodność jonowa wpływa na wyładowanie potencjału czynnościowego neuronów. Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa wypełnia tę lukę, umożliwiając wstrzykiwanie w czasie rzeczywistym zdefiniowanych przez użytkownika przewodności jonowych do żywych neuronów. Pozwala to na badania przyczynowe, jak zmiany właściwości kanału jonowego wpływają na aktywność elektryczną danego typu komórki. W tym artykule metodycznym opisujemy, jak wdrożyć dynamiczną elektrofizjologię zaciskową u dorosłych myszowych neuronów Purkinjego zarejestrowanych w warunkach fizjologicznych w ostro przygotowanych przecinkach mózgu móżdżku. Neurony Purkinje'ego są szczególnie istotnym modelem dla tych badań, ponieważ mają wewnętrzną zdolność do wywoływania powtarzalnych, wysokoczęstotliwościowych (20-100 Hz) potencjałów czynnościowych i są konsekwentnie powiązane z dysfunkcją obwodów móżdżku związaną z ASD. Skupiamy się na Tsc1, genie, którego mutacje związane z utratą funkcji należą do najczęstszych monogennych przyczyn ASD. W neuronach myszy Purkinjego delecja Tsc1 została również powiązana ze zmniejszoną ekspresją kanałów sodowych zależnych od napięć (Nav). Wykorzystujemy modele stanów kinetycznych Markowa do symulacji i reprodukcji właściwości przewodności Nav neurona Purkinie, a następnie stosujemy mechanizm dynamiczny do bezpośredniej oceny, jak zmiany przewodności Nav wpływają na wewnętrzne wyładowanie nienaruszonych neuronów Purkiniego w możdżku. Dostarczamy instrukcje i materiały do modyfikowania i strojenia modeli przewodności jonowej. Poprzez integrację modelowania przewodności jonowej, dynamicznego zacisku oraz konwencjonalnych technik patch-clamp, podejście to zapewnia potężne i elastyczne ramy łączące zaburzenia genetyczne z fizjologicznymi wynikami u neuronów istotnych dla ASD.

Wprowadzenie

Wcześniejsze badania nad molekularnymi i komórkowymi czynnikami napędzającymi zaburzenia ze spektrum autyzmu (ASD) często podkreślały dysfunkcje synaptyczne jako kluczowe dla patofizjologii tego zaburzenia 1,2. Liczne badania wykazały wzrost gęstości synaps pobudzających 2,3,4, upośledzone przycinanie synaptyczne5 oraz zmiany w białkach gęstości postsynaptycznej 6,7 w modelach ASD. Jednak najnowsze badania wykazały, że zmiany w wewnętrznej pobudliwości neuronów są również czynnikami napędzającymi patologię ASD. Na przykład transgeniczne modele myszy z ASD oraz linie komórkowe pochodzące od pacjentów wykazały upośledzoną generację potencjału czynnościowego w neuronachPurkinje 8,9,10 i korowych piramidalnych11, a także osłabioną pobudliwość dendrytyczną i integrację synaptyczną w podklasach korowych neuronów piramidalnych12. Channelopatie związane z mutacjami utraty funkcji w SCN2A, kodującym podjednostkę α pory kanału sodowego Nav1.2 tworzącego pory kanału sodowego (Nav), są obecnie dobrze znaną monogenową przyczyną ASD13 i wykazano, że powodują deficyty w wewnętrznej pobudliwości różnych klas neuronów centralnych 14,15,16,17. W miarę postępu tego typu badań ważne jest ustalenie związków przyczynowych między patogennymi zmianami przewodności jonowej a wpływem tych zmian na funkcjonowanie neuronów i obwodów. Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa zapewnia skuteczne podejście do tego zadania. Sharp i in. (1992 i 1993)18,19 wraz z Robinsonem i Kawaiem (1993)20 początkowo opisali metody dynamicznego zacisku, w których symulowana nieliniowa przewodność jonowa, z właściwościami zależnymi od napięcia lub bez, jest wstrzykiwana/dodawana do żywych neuronów, co pozwala badaczom oceniać w czasie rzeczywistym, jak właściwości lub domniemane zmiany w przewodności jonowej zależnej od napięcia wpływają na wyładowanie neuronów21, 22.

Implementację eksperymentów z dynamicznym zaciskiem ułatwiły kilka bezpłatnie dostępnych systemów programowych, takich jak RTXI23, QuB 24,25 i StdpC26; Jednak najnowsze osiągnięcia uprościły dynamiczną implementację clamp w komercyjnych systemach plug-and-play, które umożliwiają opracowywanie, modyfikowanie i stosowanie przewodności modeli na jednym komputerze i w ramach jednego pakietu oprogramowania. Przedstawiamy protokoły umożliwiające wykonanie dynamicznego zacisku z użyciem systemu Sutter dPatch27 oraz przeprowadzamy badanie próbki, w którym testujemy, jak celowane delecje stwardnienia bulwiastego 1 (Tsc1)9, będącego powszechnym miejscem mutacji ASD28, wpływa na wewnętrzne wyładowanie neuronów Purkinieja móżdżku w wyniku zmian w ekspresji przewodności sodowej zależnej od napięcia8.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzano zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Wytyczne Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Miami (Protokół #1044). Eksperymenty wykorzystywały samce i samice dzikich myszy typu C57BL/6J oraz linie transgeniczne z tłem szczepu C57BL/6J. W eksperymentach elektrofizjologicznych zwierzęta miały 6-7 tygodni. Wszystkie nagrania pochodzą z neuronów Purkinjego w płatkach 5, 6 lub 7 w skoczkach móżdżku.

1. Przygotowanie i przygotowanie tkanek do eksperymentów z neuronami patch-clamp Purkinje'ego

  1. Przygotuj 1 L sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) zawierającego: 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 oraz 25 mM dekstrozy przy pH 7,4 (~300 mOsM/L). Przygotuj także 250 mL roztworu tnącego zawierającego: 240 mM sacharozy, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 0,5 mM CaCl2 oraz 7 mMMgCl2. Rozpuszczanie (bąbelk) ACSF i roztwór roztniewający gazem węglowodynowym (95% O2/5%CO2) przez co najmniej 20 minut przed użyciem i nieprzerwanie przez cały czas trwania wszystkich eksperymentów.
  2. Przygotuj komorę do przechowywania cięcia mózgu wypełnioną ACSF na późniejsze użycie. Upewnij się, że cięcia móżdżku (po dodaniu do komory krojowej) są zanurzone z obiem bokami nacięcia móżdżku wystawionym na działanie ACSF. Osiągnij to, umieszczając zanurzone plastry na ciasno rozciągniętej nylonowej siatce, która jest również zanurzona.
  3. Przygotujcie stanowisko operacyjne. Przygotuj cztery kawałki taśmy, które zostaną użyte do przypięcia znieczulonego zwierzęcia. W wiadrze lub misce na lód umieść dolną połowę miski Petriego w lodzie tak, że ściany skierowane w dół, a dno szalki Petriego do góry. Na dnie szalki Petriego połóż papier filtracyjny (≥ 3 cm2) i nasącz 2-3 mL roztworu tnącego.
    UWAGA: W opisanych eksperymentach do cięcia 350 μM przysagitalnych przekrojów móżdżku używa się wibratomu komprestome. W przypadku kompresomu tkanka do krojenia jest przyklejana do plastikowej probówki, która przechodzi przez cienką metalową rurkę. Podczas krojenia probówka jest przepychana przez metalową rurkę, która pozostaje niezmienna. Po przyklejeniu tkanki do probówki tkanka zostaje osadzona w podgrzanej 2% agarozie. Ostrze komprestomu jest przyklejone do stałego uchwytu, który jest przymocowany do ramienia wibratomu. Inne typy wibroatomów nie wymagają osadzania tkanki w podgrzanej agarozie, ale powinny działać podobnie dobrze dla opisanych eksperymentów.
  4. W lodzie umieść także żyletkę o jednym ostrzu i małą (10 mL) zlewkę wypełnioną roztworem tnącym. Zachowaj blok chłodzący, który służy do szybkiego schładzania podgrzanej agarozy po dodaniu do probki próbki, oraz strzykawkę 30 mL wypełnioną roztworem tnącym schłodzoną na lodzie. Upewnij się, że strzykawka 30 mL jest podłączona do 30-60 cm odcinka dożylnej (dożylnie) rurki (za pomocą męskiego stożka Luer lock), która jest połączona (na końcu końcowym) z igłą (≥ 26 G) z podstawą Luer lock female (Luer lock).
  5. Pozostały roztwór krojony umieść w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Gdy ten roztwór nabierze konsystencji lodu rozmytego (20-25 min), wyjmij z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieść na lodzie.
  6. Znieczulenie dorosłej myszy w wieku 5-8 tygodni podaj dootrzewnowej zastrzyk 1 mL/kg z masy zwierzęcej ketaminy (10 mg/mL)/ksylazyny (0,25 mg/mL) koktajlu.
  7. Przygotuj roztwór agarozy 2% przez rozpuszczenie 0,5 g agarozy w 25 mL roztworu tnowego. Po znieczuleniu zwierzęcia (nie reaguje na uszczypnięcie palców) podgrzej 2% roztwór agarozy (~30 sekund w mikrofalówce) i przelej podgrzany roztwór agarozy do kąpieli wodnej o temperaturze 40 °C.
    UWAGA: Kroki o numerach 1.8-1.18 muszą być wykonane pilnie, zanim podgrzana agaroza się zastygnie.
  8. Przypiąć kończyny zwierzęcia do stołu operacyjnego taśmą. Za pomocą nożyczek otwórz jamę piersiową zwierzęcia, upewniając się, że płuca i narządy brzuszne nie zostaną przecięte. Użyj kleszczy blokujących lub hemostatów, aby utrzymać klatkę piersiową otwartą, odsłaniając serce. Aby to osiągnąć, zablokuj kleszcze na mostku i ostrożnie połóż je w kierunku przedniej części ciała zwierzęcia (z otworami na palce narzędziowe obok głowy zwierzęcia).
  9. Włóż igłę podłączoną do 30 mL strzykawki do lewej komory i użyj kleszczy, aby ucisnąć tkankę wokół igły, trzymając igłę w lewej komorze downętrznej. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj małe cięcie w prawym przedsionku i szybko przeperfuzuj zwierzę 25 mL schłodzonego roztworu tnącego.
    UWAGA: Upewnij się, że perfuzjat dostaje się do lewej komory i wychodzi z prawego przedsionka, oczyszczając krew z układu krążenia zwierzęcia.
  10. Po zakończeniu perfuzji szybko odetnij zwierzęciu głowę i przetnij skórę głowy wzdłuż linii środkowej głowy w kierunku bregmy, aby odsłonić powierzchnię czaszki.
  11. Za pomocą nożyczek usuń tkankę łączną z tylnej części czaszki oraz nadmiar tkanki rdzenia kręgowego, upewniając się, że rdzeń kręgowy nie wystaje z otworu wielkiego.
  12. Umieść jedno ostrze nożycowe w otworze magnum i przetnij wzdłuż obwodu czaszki po obu stronach skroniowych w kierunku bregmy, pozostawiając część tkanki czaszki w miejscu bregmy.
  13. Włóż ostrze nożycowe lub połowę cienkich kleszczy do otworu wielkiego i unieś go w górę, oddzielając czaszkę od mózgu. Uważaj, aby nie wcisnąć nożycowego ostrza lub szczypca w mózg podczas podnoszenia czaszki.
  14. Użyj szpatułki chirurgicznej, aby przekopać mózg pod mózg (od przodu) i ostrożnie wyjść do 10 mL zlewki zawierającej schłodzony roztwór tnący, dbając o ochronę móżdżku podczas przenoszenia mózgu. Na tym etapie przebierz się w czyste rękawice.
  15. Ostrożnie wyjmij mózg z zlewki (używając szpatułki) i umieść go na papierze filtracyjnym (na szalce Petriego). Użyj ostrza jednostronnego, aby ciąć wzdłuż osi parasagitalnej kilka milimetrów od linii środkowej. Usuń mniejszą tkankę przeciętą przysagittalną. Zrób drugie cięcie koronne w połowie przedniego mózgu (przed móżdżkiem). Usuń tkankę koronalnie przeciętą przed móżdżkiem.
  16. Włóż jednokrawędkowe ostrze pod przednią część przedniego mózgu i podnieś tak, aby obrócić pozostałą tkankę tak, aby bok początkowego nacięcia przysagitalnego był skierowany do dołu (na papierze filtracyjnym), a nieprzecięta półkula móżdżku skierowana do góry.
  17. Umieść probówkę pionowo w lodzie i nałóż cienką warstwę superglue (klej cyjanoakrylowy) na powierzchnię rurki. Za pomocą narzędzia szpatułowego o zgięciu 90° ostrożnie przenieś tkankę mózgową z papieru filtrującego na powierzchnię probówki, zachowując orientację tkanki. Upewnij się, że nieprzecięta półkula móżdżku nadal jest skierowana do góry. Gdy tkanka zostanie umieszczona/przyklejona na probce próbki, przesuń metalową rurkę w górę, aby otoczyła tkankę mózgową.
  18. Używając zmotoryzowanej pipety 10 mL, napełnij probówkę podgrzaną agarozą (osadzając tkankę mózgową). Szybko schładzaj tkankę (teraz osadzoną w podgrzanej agarozie), zaciskając blok chłodzący wokół metalowej rurki na ~30 sekund.
  19. Włóż probówkę do komory z wibratomem i napełnij ją roztworem tnącym w rozlewie rozlewanym. Podczas cięcia tkanki mózgowej nieustannie wypłukuj roztwór tnący, ale nie wystawiaj bezpośrednio przekrojków móżdżku na pęcherzyki gazu.
  20. Przetnij 300-350 μm plasterki parasagitalne, natychmiast przenosząc każdy kawałek do komory trzymającej plasterki, wypełnionej wypryskanym ACSF w temperaturze pokojowej. Gdy wszystkie plastry są w komorze krojeniowej, inkubuj ją w kąpieli wodnej o temperaturze 33 °C przez 25 minut.
  21. Po 25 minutach w kąpieli wodnej ponownie umieść komorę w temperaturze pokojowej, czekając co najmniej dodatkowe 35 minut przed próbą nagrań patch z dowolnego z przekrojów móżdżku.

2. Konfiguracja modelu przewodności opartego na Markowowie w dynamicznym zacisku

UWAGA: Klamra dynamiczna to zastosowanie w czasie rzeczywistym modelowanej przewodności do komórki żywej. Napięcie membranowe jest rejestrowane/próbkowane za pomocą ostrej lub plastycznej elektrody, a zdigitalizowany sygnał jest przesyłany do oprogramowania dynamicznego zacisku, które oblicza, korzystając z zastosowanego modelu przewodności jonowej, odpowiedni dynamiczny zastrzyk prądu zaciskowego dla próbkowanego napięcia. Obliczony dynamiczny sygnał wtrysku prądu zaciskowego jest wysyłany do wzmacniacza i stopień głowy, aby zostać wstrzykniętym (za pomocą elektrody) do ogniwa. Aby modelowana przewodność mogła być odpowiednio dodana do komórki wystrzeliwującej potencjały czynnościowe, które generują szybkie przejściowe zmiany napięcia membranowego, częstotliwość próbkowania napięcia musi być wystarczająco wysoka, a opóźnienie między próbką napięcia a dynamicznym wtryskiem prądu zaciskowego (czasem nazywane opóźnieniem) powinno być minimalne i niezmienne29.

  1. Przed jakimkolwiek eksperymentem z klamram dynamicznym opracować lub uzyskać matematyczny model przewodności jonów przeznaczonych do wykorzystania w eksperymencie z klamram dynamicznym. Modele te mogą mieć formę modelu stanu kinetycznego Markowa, modelu Hodgkina-Huxleya (HH) lub przewodności pasywnej (liniowej). Upewnij się, że wybrany model przewodności dokładnie odtwarza kinetyczne i zależne od napięcia właściwości zamierzonej przewodności jonowej.
    UWAGA: Eksperymentatorzy mogą potwierdzić właściwości modelowanej przewodności jonowej przed zastosowaniem w eksperymentach z klamrami dynamicznymi, testując modelowaną przewodność (in silico) w badaniach symulacyjnych z użyciem zacisków napięciowych. Ważne właściwości i rozważania dotyczące modeli stanu kinetycznego Markowa i przewodności HH opisane są w sekcji Dyskusja. Poniższe kroki opisują konfigurację modelu przewodności Markowa w oprogramowaniu do dynamicznych zacisków.
  2. Stwórz lub uzyskaj diagram przejścia stanów Markowa dla modelu przewodności do wykorzystania w eksperymentach z dynamicznym zaciskiem. Użyj tego diagramu, aby dokładnie złożyć model przewodności Markowa w oprogramowaniu do dynamicznego zaciskania (opisanego poniżej).
    UWAGA: SutterPatch to oprogramowanie do akwizycji danych wzmacniacza dPatch. Eksperymenty z dynamicznym zaciskiem można przeprowadzać w oprogramowaniu, co umożliwia montaż i zastosowanie modelowanych przewodności za pomocą wstrzykiwania prądu podczas protokołów zacisków prądowych. Diagram przejścia stanów Markowa dla modelowanej przewodności sodu zależnej od napięcia, oparty na pomiarach prądu Nav z neuronów myszy Purkinie, przedstawiono na Rysunku 1A. Model ten został opracowany przez Ransdella i in., 2022,30 , i został wykorzystany do badania roli trwałych i odradzających się składników prądu sodowego w wyładowaniu neuronówPurkinjego 31. Stany bramkowe (C, IC, IF, IS i O) są połączone stałymi szybkości przejścia, oznaczanymi zmiennymi (np. S0, S3, S1, S4). Model ten jest wykorzystywany w reprezentatywnych eksperymentach z dynamicznym zaciskiem i jest dostępny do pobrania na GitHub: https://github.com/morenomdphd/Resurgent_INa.
  3. W oprogramowaniu do akwizycji danych otwórz okno Dynamic Clamp Editor z zakładki SutterPatch > Dynamic Clamp Editor lub klikając odpowiadającą mu ikonę w oknie Dashboard . Fragmenty okna edytora dynamicznego zacisku przedstawiono na rysunku 1B.
    UWAGA: Okno Dynamic Clamp Editor zawiera wszystkie niezbędne ustawienia do zastosowania modelowanej przewodności podczas protokołu rejestracji current-clamp. Interfejs Puli Przewodności (Rysunek 1B, lewy górny róg) pozwala użytkownikom organizować i jednocześnie ładować grupy przewodności modelu.
  4. W interfejsie Poola Przewodności (Rysunek 1B, lewy górny róg) utwórz pulę, klikając New i nadając jej odpowiednią nazwę. Po wybraniu puli przewodności, po prawej stronie okna w interfejsie selektora Headstage (Rysunek 1B, lewy dolny róg) wybierz typ modelu dla odpowiedniej puli przewodności (Model – Markov, Hodgkin-Huxley, zmienna przewodność itd.) oraz kiedy należy zastosować przewodność modelu, na przykład podczas procedury/protokołu (tryb aktywny). Interfejs selektora Headstage umożliwia także wybór dynamicznej częstotliwości aktualizacji zacisku (w kHz) oraz źródła sygnału napięciowego (patrz Rysunek 1B, po prawej). Dla źródła sygnału napięciowego wybierz stopień główny, który rejestruje sygnał napięciowy.
  5. W panelu selektora Headstage , na przykład Model Markova przewodności nawigacyjnej (Rysunek 1A), wybierz Model Markova dla Model, podczas przemiatania dla trybu aktywnego, 200 kHz dla częstotliwości aktualizacji oraz Headstage 1 dla źródła sygnału napięciowego. Sprawdź sygnał Apply i Command do AuxOUT1 , aby rozpocząć obliczenia modelu w odpowiedzi na sygnał napięciowy i dodać dynamiczne wstrzykiwanie prądu zaciskowego odpowiednio do protokołów zaciskowych (Rysunek 1B, lewy dolny).
  6. Pod głównymi panelami Dynamic Clamp Editor znajduje się macierz stanów (Rysunek 1C, dolny). Edytuj macierz stanów, najpierw klikając Edytuj parametry modelu w interfejsie selektora Headstage (Rysunek 1B, lewy dolny rog). Obok edytora pojawi się nowe okno o nazwie Dynamic Clamp Markov Model Parameters. W tym panelu wprowadzamy równania macierzy stanów reprezentujące przewodność modelu Markowa.
  7. W panelu Ustawienia kanału (Rysunek 1B, w prawym górnym rogu) wybierz, które zachowane modele przewodności należy zastosować (w trybie dynamicznym zaciskowym). Alternatywnie, wybierz pusty kanał i rozpocznij tworzenie nowej przewodności modelu. Po prawej stronie tego panelu wejdź w odwrócenie V (modelowany potencjał odwrócenia jonów przewodnictwa). W naszym badaniu z użyciem przewodności sodu wprowadzono 55,0 mV, aby odzwierciedlić potencjał odwrócenia sodu na podstawie ACSF i wewnętrznego roztworu elektrody plastrowej.
  8. W panelu Ustawienia kanału podaj także liczbę stanów kinetycznych wybranej przewodności (patrz Rysunek 1B, w prawym górnym rogu, czerwone pole). Tutaj wpisz 9, aby odzwierciedlić 9 stanów kinetycznych modelowanej przewodności (patrz Rysunek 1A).
  9. Pod panelem Ustawienia kanału znajduje się panel Równań Stanów . Umieść równania o stałej szybkości przejścia stanów odpowiednio w macierzy stanu bramkowania , aby odzwierciedlić topologiczne ułożenie modelu Markowa. Wprowadź równania do panelu Równań Stanu i podaj ID, zaczynając od "S0" (Rysunek 1B, środek).
    UWAGA: Kolejność wprowadzania tych równań nie ma znaczenia, o ile zmienne są odpowiednio wypełnione w macierzy stanu bramkowania , aby odzwierciedlać topologię modelu Markowa.
  10. Aby wypełnić macierz stanu bramkowego zdefiniowanymi teraz zdefiniowanymi zmiennymi o stałej szybkości, kliknij Edytuj macierz stanu po prawej stronie panelu Równań Stanu (Rysunek 1B, środek). Każdy stan kinetyczny otrzymuje swoją liczbę zaczynającą się od 0. Na przykład dla modelu dwukinetycznego, zawierającego stany X i Y, stany te będą nazywane "0" i "1" i będą zawierać dwie stałe szybkości przejścia a1 i b1, gdzie a1 przechodzi z 0 do 1, a b1 z 1 do 0.
  11. Aby właściwie połączyć te równania za pomocą Edytora Macierzy Stanów (Rysunek 1B, dolny), wprowadź stałe szybkości do tabeli zawierającej ponumerowane wiersze i kolumny, oba zaczynające się od 0 (patrz przykład na Rysunku 1C).
    UWAGA: Ruch z jednego stanu do drugiego jest określany przez ich pozycję w tej tabeli w formie "wiersz do kolumny". Na przykład w przykładzie modelu dwustanowego w kroku 2.1 przejście ze stanu 0 do stanu 1 opiera się na stałej szybkości "a1", która następnie umieszcza się w wierszu 0, kolumnie 1. Stała szybkości przejścia "b1" napędza przejścia ze stanu 1 do stanu 0, dlatego stała szybkości powinna być umieszczona w wierszu 1, kolumnie 0. Na Rysunku 1C, przykładowa macierz stanu bramkowego ma stałe szybkości odzwierciedlające topologię modelu przewodności nawigacyjnej pokazaną na Rysunku 1A. Na przykład "S0" to stała szybkości definiująca przejścia ze stanu kinetycznego IC1 do IC2; zatem "S0" umieszcza się w wierszu 0, kolumnie 1 Macierzy stanu bramkowego (Rysunek 1C). Równania stałej szybkości przejścia definiujące zmienną każdej stałej szybkości wypełniają następnie wypełnioną macierz stanów (rysunek 1C, poniżej).
  12. Ponieważ równania o stałej szybkości są połączone przez panel edytora macierzy stanów, połączenia (odpowiadający mu wiersz i kolumna) wypełniają panel Połączeń obok równania (Rysunek 1B, środkowy po prawej). Zwróć uwagę na stan otwarty/przewodzący w reprezentatywnym modelu przewodności sodu (Rysunek 1A), dodany do wiersza i kolumny 7 Rysunku 1C (góra, czerwone ramki), co jest ważne dla następnego kroku.
  13. Na Rysunku 1B (w prawym dolnym rogu) użyj panelu Równań przewodności (nS), aby zdefiniować amplitudę przewodności modelu, która zostanie zastosowana podczas dynamicznego zacisku. Wybierz stany otwarte/przewodzące w modelu Markowa i podaj wartość przewodności (rysunek 1B, dolny, czerwona ramka).
  14. Do tego eksperymentu wprowadź "400 nS" do pola "G7", które dodaje szczytowe wartości prądu nawigacyjnego podobne do szczytowych prądów nawigacyjnych mierzonych w badaniach zaciskowych na myszych neuronach Purkinie.
  15. Po zakończeniu powyższych kroków kliknij Załaduj , aby przygotować model do dynamicznego zastosowania zacisku po uruchomieniu procedury zacisku prądowego.
  16. Podobny proces stosuj do układania modeli HH; jednak dodaj równania, aby zdefiniować niezależne stany bramkowe (w równaniach bramkowych) oraz przewodność względem maksimum G.
  17. Aby zastosować przewodność dynamiczną clamp, najpierw utwórz procedurę current-clamp za pomocą Edytora Rutyn (kliknij zakładkę SutterPatch > Edytor Rutyn) (Rysunek 1D). Aby utworzyć procedurę current-clamp, wybierz kanał wyjściowy nadrzędny (w tym przykładzie jest to StimOut1). To otworzy panel, który pozwala użytkownikowi zdefiniować wyjście bieżącego polecenia podczas procedury. Upewnij się, że Tryb nagrywania jest ustawiony na CC_Mode w Edytorze Rutyn.
    UWAGA: W eksperymentach reprezentatywnych, ponieważ protokół ten działa z ogniwami samoaktywnie uruchamiającymi, stosuje się rutynę/protokół zacisku prądu bez przerw, który nie wtryskuje prądu.
  18. W kanałach wejściowych edytora rutynowego (rysunek 1D, w prawym górnym rogu) zdefiniuj sygnały wejściowe, które podczas eksperymentów wypełniają zarejestrowane okna zakresu. Wejścia te muszą zawierać sygnał napięciowy, a także wtrysk prądu polecenia rutyny oraz dynamiczny wstrzyk prądu zaciskowego, zwany odpowiednio Current1 i AuxIN1 (Rysunek 1D, dolny lewy rog).
  19. W przypadku procedur zaciskowych prądu, które obejmują dodatnie i/lub ujemne polecenia wtrysku prądu, sygnał wstrzyknięcia prądu komendy jest automatycznie łączony z dynamicznym sygnałem zacisku prądu. Utworzenie wirtualnego okna zakresu, aby odejmować sygnał prądu polecenia, tak aby istniał zapis izolowanego dynamicznego wstrzyknięcia prądu zaciskowego. Aby utworzyć nowe okno wirtualnego zakresu, najpierw wybierz dodatkowy kanał wejściowy, wybierając pole Virtual1.
  20. W Edytorze Rutyn, w sekcji Typ Matematyki, wybierz Równanie i wybierz (w Kanale źródłowym) sygnał wejściowy rutyny current-clamp, który w tym przykładzie jest Current1. Wprowadź równanie na otwartym polu, aby odejmować sygnał polecenia prądu zaciskowego od dynamicznego sygnału wtrysku prądu zaciskowego.
    UWAGA: W tym przykładowym eksperymencie wykonuje się to za pomocą równania t[3]-t[2]. Okno zakresu Virtual1 wyświetla teraz dynamiczne wstrzykiwanie prądu zaciskowego (odizolowane od sygnału polecenia bieżącego). Użytkownicy mają możliwość personalizacji etykiet kanałów wejściowych lub wyjściowych, dwuklikając w sekcji Etykieta.

3. Pozyskiwanie nagrań z neuronów Purkinjego myszy w przecięciach móżdżku przysagittalnego

  1. Wyposażcie elektrofizjologiczny zestaw w komorę tkankową, która jest (grawitacyjnie) przepuszczana ACSF ogrzewanym do temperatury bliskiej fizjologicznej (34-36 °C). Ostrożnie umieść przysagittalny przełom móżdżku do komory cięcia i użyj harfy na cięcie, aby utrzymać cięcie móżdżku w zanurzonej i nieruchomej pozycji. Upewnij się, że chlorkowa elektroda uziemiająca i sonda temperaturowa są również zanurzone i stabilne w komorze kroju móżdżku.
  2. Zlokalizuj warstwę neuronów Purkinjego za pomocą obiektywu immersyjnego 40x. Neurony Purkiniego są duże i mają kształt łezki. Błona plazmatyczna zdrowych komórek Purkiniego zazwyczaj wygląda gładko, a jądro nie jest widoczne.
  3. Gdy zdrowy neuron Purkiniego zostanie zidentyfikowany i skierowany do rejestracji za pomocą patch-clamp, należy przesunąć soczewkę mikroskopu do góry. Ustawij i skup na końcówce szklanej mikroelektrody przymocowanej do uchwytu elektrody i sceny głównej. Sterować stopień/mikroelektrodą za pomocą 3-osiowego robotycznego mikromanipulatora.
    UWAGA: W tych eksperymentach należy upewnić się, że mikroelektrody mają rezystancję 2-4 MΩ i są wypełnione odpowiednim wewnętrznym roztworem zacisku prądowego. Roztwór wewnętrzny stosowany w eksperymentach reprezentatywnych zawiera: 144 mM K-glukonianu, 0,2 mM EGTA, 3 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 4 mM Mg-ATP oraz 0,5 mM Na-GTP.
  4. Przed zbliżeniem się do docelowego neuronu Purkinie, należy dodać 2-3 mL dodatniego ciśnienia powietrza do portu ciśnieniowego uchwytu elektrody.
  5. Przełącz się na tryb VC na panelu sterowania wzmacniacza i zastosuj funkcje kompensacji elektrody oraz przesunięcia napięcia elektrody. W przykładzie tutaj zrób to, klikając Auto obok opcji kompensacji elektrod i offset napięcia.
  6. Rozpocznij ciągły protokół testu uszczelnienia membranowego (kliknij Test Membrany). Ustaw parametry testu membranowego na (lub blisko) przebiegach 5 ms z krokiem 5-mV lub 10-mV. Ustaw potencjał utrzymania (V-holding) na 0 mV.
  7. Przesuń mikroelektrodę w kierunku ogniska, regulując płaszczyznę ogniskową, aby utrzymać ostrość na lub nieco poniżej końca elektrody. Umieść elektrodę nieco powyżej błony plazmatycznej celi. Użyj mikromanipulatora i dodatniego ciśnienia z końcówki elektrody, aby odpychać zewnątrzkomórkowe zanieczyszczenia z komórki docelowej, "oczyszczając" błonę powierzchniową.
  8. Gdy komórka docelowa jest wolna od zanieczyszczeń zewnętrznych, powoli umieść elektrodę blisko powierzchni błony na szerokim końcu neuronu Purkinie, z którego akson wychodzi z ciała komórki. Gdy końcówka elektrody jest opuszczana do membrany, na powierzchni błony prawdopodobnie pojawi się wgłębienie (ze względu na dodatnie ciśnienie elektrody). W tym momencie zwolnij dodatnie ciśnienie i użyj ssania ust, aby wyłożyć niewielkie ciśnienie ujemne.
  9. W panelu sterowania wzmacniaczem zmień potencjał V-utrzymujący na -80 mV (z 0 mV). Monitorując test uszczelnienia membrany, gdy rezystancja pipety osiągnie ≥ 1 GΩ, zwiększ ujemne ciśnienie i kliknij funkcję Zap na panelu testowym uszczelnienia membrany , aby przerwać membranę i uzyskać konfigurację patch-clamp na całej komórce.
  10. Użyj krótkiego protokołu zacisku napięciowego, aby zmierzyć właściwości pasywne membrany (pojemność i wartość rezystancji wejściowej) przed przełączeniem się za pomocą panelu sterowania wzmacniacza w tryb zacisku prądowego.
  11. Po przejściu w tryb zacisku prądowego zastosuj kompensację balansu mostka do ≥ 70%.
  12. Przed zastosowaniem dynamicznej przewodności zaciskowej z elektrodą patch należy skorygować błąd potencjału złącza (który oblicza się na podstawie składu wewnętrznej elektrody i roztworów ACSF). Dla rozwiązań w reprezentatywnych eksperymentach należy zastosować korektę potencjału złącza 17,5 mV. W badaniach z dynamicznym zaciskiem precyzyjna korekta potencjału złącza jest kluczowa, aby model przewodności (modele) wykorzystywały precyzyjny sygnał napięcia do obliczania dynamicznych wtrysków prądu zaciskowego.

4. Zastosowanie przewodności zaciskowej dynamicznej

  1. Ponieważ neurony Purkinie'ego wystrzeliwują powtarzalne potencjały czynnościowe spontanicznie, należy zapisać właściwości wyładowania przed dodaniem (lub odejmowaniem) modelowanej przewodności jonowej, aby sprawdzić zdrowie komórek i zmierzyć podstawowe właściwości pobudliwości błony. Zastosuj modelowaną przewodność, klikając Obciążenie w oknie ustawień Dynamicznego Zacisku . Na kontrolerze dPatch będzie teraz widoczna mała etykieta DynC , nakładająca się na CC (patrz Rysunek 1D, czerwone ramki).
  2. Po włączeniu/załadowaniu zacisku dynamicznego, przewodność tego zacisku jest automatycznie przystosowana podczas aktywnej procedury/protokołu zacisku prądowego. Zobacz dynamiczne wstrzykiwanie prądu zaciskowego w oknie teleskopu odpowiadające wybranemu sygnałowi wejściowemu AuxIN1 .
    UWAGA: Naprzemienne nagrania spontanicznego wyładowania z i bez zastosowania dynamicznych przewodności zaciskowych są ważne dla określenia, jak przewodność modelu zastosowana na pobudliwość wpływa oraz czy poziomy pobudliwości są stabilne/spójne przez cały eksperyment.

Wyniki

W prezentowanych eksperymentach stosujemy, za pomocą dynamicznego zacisku, modelowaną przewodność sodu zależną od napięcia (Nav) do dorosłych (6-7 tygodni) myszych neuronów Purkinjego w kształcie móżdżku, które są ostro izolowane w przysagittalnym kawałku móżdżku. Badania prowadzono na myszach typu dzikiego (kontrolnego) oraz myszach transgenicznych, w których rekombinacja Cre-loxP służy do selektywnego usuwania stwardnienia bulwiastego typu 1 (Tsc1) z neuronów Purkiniego w możdżku. Kompleks stwardnienia bulwiastego (TSC) to zaburzenie wielosystemowe spowodowane mutacjami utraty funkcji w TSC1 lub TSC2 32,28,33. Osoby z TSC są często diagnozowane z zaburzeniami padaczki, zaburzeniami poznawczymi oraz zaburzeniami ze spektrum autyzmu34,35. Myszy z neuroneurospecyficzną delecją Tsc1, określaną tutaj jako mut/mut Tsc1, wykazują kilka fenotypów zachowań związanych z ASD, w tym zaburzenia funkcji motorycznych, zachowań interakcji społecznych oraz wokalizacji, a także przesadnie powtarzalne zachowania 9,36. Tsc1mut/mut Wykazano również, że neurony Purkiniego mają osłabione wyładowanie potencjału czynnościowego (Rysunek 2A,B), co wiąże się ze znacząco zmniejszoną amplitudą prądu Nav (Rysunek 2C) oraz ekspresją kanału Nav w początkowych segmentach aksonu neuronów Purkinjego mut/mut Tsc1 8. Prądy nawigacyjne w neuronach Purkinie'ego mut/mut Tsc1 mają podobne właściwości kinetyczne i zależne od napięcia jak neurony Purkinjego typu dzikiego8. W tym transgenicznym modelu myszy mut/mut Tsc1 użyliśmy dynamicznego zacisku, aby sprawdzić, czy dodanie przewodności Nav do neuronów Purkinje mut/mut Tsc1 może uratować powtarzające się wyładowania. Następnie sprawdzamy, czy odejmowanie przewodności nawigacyjnej w dzikich neuronach Purkinjego powoduje podobne tłumienie w wyładowaniu neuronów Purkinie, jak mierzone w neuronach Purkinjego mut/mut Tsc1 (Rysunek 2B). Aby odejmować przewodność Nav wyrażoną natywnie, zastosowaliśmy przewodność Nav za pomocą dynamicznego zacisku; jednak polaryzacja przewodności jest odwrócona.

Model stanu kinetycznego Markowa (Rysunek 1A) używany do symulacji przewodności nawigacyjnej neuronu Purkinie'ego zawiera dziewięć stanów kinetycznych, z których osiem jest nieprzewodzących, oznaczonych jako zamknięte (C1, C2 i C3), inaktywowane-zamknięte (IC1 i IC2), szybko inaktywowane (IF1 i IF2) oraz wolno-inaktywowane (IS). Jest jeden stan kinetyczny otwarty/przewodzący (O)30,31. Stałe szybkości przejścia, pokazane pomiędzy oznaczonymi stanami kinetycznymi (Rysunek 1A), określają proporcję symulowanych kanałów/przewodności w każdym stanie kinetycznym. Napięcie błonowe wpływa na każdą stałą prędkości modelu. Symulowane prądy Nav generowane przez ten model (in silico) w symulowanych eksperymentach z zaciskiem napięciowym są pokazane (na czerwono) po prawej stronie prądów Nav mierzonych od ostro izolowanych neuronów Purkinje, które są pokazane na czarno (Rysunek 1A, poniżej). Komenda napięciowa wywołująca te symulowane (czerwone) i neuronowe (czarne) prądy nawigacyjne jest przedstawiona nad śladami prądu czarno. Należy zauważyć, że w komendzie napięciowym początkowy krok depolaryzacji (do 0 mV) skutkuje szybkim, przejściowym prądem sodowym do środka, który w symulowanym śladzie odbija kanały przechodzące z nieprzewodzących stanów zamkniętych do stanu kinetycznego otwartego, pozwalając na krótki prąd wejściowy przed nagromadzeniem kanałów otwartych w szybko inaktywowanych (IF1 i IF2) stanach kinetycznych. Ten krok napięcia depolaryzującego jest krótki (5 ms), a potencjał membrany jest następnie stopniowo przesuwany do pośredniego napięcia respolaryzowanego -45 mV, przy którym potencjał utrzymuje się przez 80 ms (rysunek 1A, niżej). Podczas tego etapu napięcia repolaryzacyjnego zauważalne jest ponowne wzrastanie prądu sodowego do wewnątrz, czyli składowej zwanej prądem sodowym (INaR). Podczas tego 80 ms kroku do -45 mV, INaR wykazuje powolny (w porównaniu do INaT) spadek amplitudy, ostatecznie osiągając stały stan prądu wewnętrznego, który jest trwałą składową prądu nawigacyjnego (INaP). Aktywacja modelowanego INaR (Rysunek 1A, dolny, czerwony) podczas repolaryzacji błony odzwierciedla symulowane kanały odzyskujące się ze stanów kinetycznych szybko inaktywowanych (IF1 + IF2) do stanu otwartego/przewodzącego. Z czasem (utrzymując się na -45 mV) część symulowanych kanałów zajmujących stan otwarty gromadzi się w pochłaniający wolno-inaktywowany (IS) stan kinetyczny, który jest odzwierciedlany podczas zaniku INaR, a część tych kanałów pozostaje w stanie otwartym/przewodzącym, odzwierciedlonym jako stała składowa prąduI NaP 30,31.

W reprezentatywnych eksperymentach/wynikach model przewodności Nav Markova (Rysunek 1A) został dodany do dorosłych neuronów Purkinjego w ostro izolowanych przecinkach móżdżku. Kreskówkowe przedstawienie tego eksperymentalnego układu przedstawiono na Rysunku 3A. Aby zastosować modelowaną przewodność nawigacji za pomocą dynamicznego wstrzyknięcia prądu zaciskowego, zastosowaliśmy system wzmacniaczy dPatch (pokazany na rysunku 3B), który posiada w pełni zintegrowaną konwersję analogowo-cyfrową (A/D) oraz cyfrowo-analogową (D/A). System ten obsługuje również transformacje sygnałów za pomocą zintegrowanych procesorów rdzeniowych ARM (zewnętrznych od PC) i posiada zintegrowany układ FPGA (field-programmable array), który umożliwia niemal natychmiastowe przetwarzanie sygnałów wejściowych i sprzężenia zwrotnego (wysyłanie sygnałów wyjściowych) do elektrody wtryskującej prąd27. Eksperymenty tutaj polegały na zastosowaniu (w dynamicnym zacisku) złożonego modelu przewodności Markowa, który udało nam się zastosować z aktualnymi częstotliwościami aktualizacji wstrzyknięcia do 500 kHz.

Dodanie symulowanej przewodności nawigacyjnej (400 nS) do neuronów Purkiniego mut/mut Tsc1 podczas nagrań prądowych zacisków bez przerw skutkowało wyraźnym wzrostem częstotliwości powtarzalnych wyładowań komórek (Rysunek 3C1, D1), co wskazuje, że dodanie przewodności Nav w tych komórkach może być wystarczające, by zrekompensować deficyty w pobudliwości neuronów Purkinjego mut/mut Tsc1, choć nie przeanalizowaliśmy pełnego repertuaru deficytów zgłaszanych w Tsc1mut/mut pobudliwość neuronów Purkinje8. Jak wynika z reprezentatywnych śladów pokazanych na Rysunku 3C2 (górny), neurony Purkinie'ego typu dzikiego mają wewnętrzną zdolność do wystrzeliwania powtarzalnych potencjałów czynnościowych z wysokimi częstotliwościami. Za pomocą dynamicznego zacisku odjęliśmy modelowaną przewodność Nav od neuronów Purkinjego typu dzikiego, stosując modelowaną przewodność Nav z odwróconą (ujemną) polaryzacją (-400 nS). Odjęcie modelowanej przewodności Nav skutkowało natychmiastowym i oczywistym zmniejszeniem powtarzalnego wyładowania (rysunek 3C2, poniżej), co jest również zgodne z hipotezą, że zmniejszone prądy Nav mierzone w neuronach Purkinjego mut/mut Tsc1 przyczyniają się do osłabionych właściwości wyładowania mierzonych w tych komórkach8. W kilku neuronach Purkinjego typu mut/mut lub typu dzikiego Tsc1, te eksperymenty z dynamicznym zaciskiem, w których przewodność Nav była dodawana lub odejmowana, przynosiły spójne efekty na częstotliwość wyładowania. Dodanie przewodności Nav istotnie (P = 0,029) zwiększyło częstotliwość wyładowania neuronów Purkinjego mut/mut Tsc1 (Rysunek 3D1), a w neuronach Purkinjego typu dzikiego odejmowanie przewodności Nav znacząco zmniejszało częstotliwość wyładowania (Rysunek 3D2) (test Student w parach).

figure-results-1
Rysunek 1: Konfiguracja modelu Markowa w oprogramowaniu do dynamicznego zaciskania. (A) Przedstawiono diagram przejścia stanów Markowa dla modelu, który odtwarza właściwości przewodności Nav mierzone w neuronach Purkinjego w móżdżku myszy30. Model ten obejmuje dziewięć stanów kinetycznych. Spośród nich 8 to stany nieprzewodzące: trzy zamknięte (C), dwa nieaktywowane-zamknięte (IC), dwa szybko inaktywowane (IF) oraz jeden wolno-inaktywowany (IS). Model obejmuje jeden otwarty (O) stan kinezyczny, który przewodzi. Pomiędzy sąsiednimi stanami kinetycznymi, połączenia/zajętość stanów przechodzące w czasie definiowane są przez stałe szybkości przejścia, pokazane jako S0-S15. Należy zauważyć, że każdemu stanu kinetycznemu przypisuje się również wartość numeryczną (czerwoną), która pozwala użytkownikom definiować model Markova i jego topologię stanu kinetycznego w macierzy stanu bramkowania (pokazanej w panelu C, opisanej poniżej). (B) Przedstawiono panele/interfejsy graficzne, z którymi użytkownicy pracują w SutterPatch Dynamic Clamp Editor. Należy zauważyć, że układ tych paneli Dynamic Clamp Editor nie jest zgodny z układem przedstawionym w oprogramowaniu dynamic clamp. Dodatkowo, nie wszystkie panele związane z Dynamic Clamp Editor są pokazane. (C) (górny panel) Przykład macierzy stanu bramkowania przedstawiono z wprowadzonymi zmiennymi odpowiadającymi topologii diagramu przejść stanów pokazanym w panelu A. Czerwone ramki w wierszu i kolumnie 7 macierzy stanu bramkowania, które odpowiadają otwartemu (O) stanowi kinetycznemu modelu. W kolumnie 7 wymienione są wszystkie stałe szybkości definiujące przejścia do stanu kinetycznego otwartego (O), a w wierszu 7 wymienione są wszystkie stałe prędkości określające przejścia wychodzące ze stanu kinetycznego otwartego (O). W tej organizacji macierz stanu bramkowego opisuje liczbę stanów kinetycznych, zmienne o stałej szybkości oraz topologię (powiązania między stanami kinetycznymi) modelu. W sekcji (D) pokazano panele/interfejsy użytkownika SutterPatch związane z obciążeniem modeli przewodności z dynamicznym klamstwem, wraz z interfejsami odpowiedzialnymi za tworzenie bieżących procedur zaciskowych. Interakcje użytkowników z tymi modelami opisane są w krokach protokołu 2.17-2.20. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Neurony Purkiniego mut/mut Tsc1 wykazują osłabioną pobudliwość błonową w porównaniu do kontrolnych typów dzikich. (A) Rejestry zacisków prądu w całej komórkach z neuronów Purkinjego typu dzikiego (górny,) oraz mut/mut (dolny, niebieski) ujawniają osłabione wyładowanie w komórce mutanta Tsc1. (B) Zmniejszone częstotliwości wyładowania w neuronach Purkiniego mut/mut Tsc1, w porównaniu z kontrolami typu dzikiego, są spójne w różnych komórkach. Średnia (±± SEM) spontaniczna częstotliwość wyładowania neuronów Purkiniego mut/mutTsc1 jest istotnie niższa (P < 0,0001) w porównaniu z dzikimi komórkami typu (niesparowany test t Welcha; kontrola N = 13, n = 32; Tsc1mut/mut N = 6, n = 21). (C) Pomiary prądów Nav za pomocą zacisku napięciowego w dorosłych neuronach Purkinjego wykazują±±, że średni szczyt szybkiego przepływowego prądu nawigacyjnego (INaT) jest znacząco obniżony w komórkach mut/mut Tsc1 w porównaniu do kontrolnych komórek typu dzikiego. (P = 0,007, RM dwukierunkowa ANOVA; kontrola dzikich typów: N = 6, n = 22, ; Tsc1mut/mut: N = 6, n = 16, niebieskie kwadraty). Przykładowe rekordyI NaT, wywołane krokiem depolaryzacji -35 mV, są pokazane jako panel wpuszczony po prawej stronie panelu C. Dane wcześniej opublikowane w Brown i in.8. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Wykorzystanie klamry dynamicznej do określenia wpływu przewodności jonowej na pobudliwość neuronów Purkinie. Zacisk dynamiczny polega na pobieraniu napięcia membranowego (za pomocą elektrody rejestrującej) oraz obliczaniu, na podstawie próbkowanego napięcia, prądu wyjściowego przewodności modelu. Obliczony prąd jest następnie przyprowadzany do komórki biologicznej za pomocą elektrody wstrzykniętej prądem. Panel (A) przedstawia to eksperymentalne ułożenie. Jeśli pobieranie próbki napięciowej jest wykonywane z odpowiednią częstotliwością, a opóźnienie (opóźnienie) między próbkowaniem napięcia a zastosowaniem obliczonego prądu jest minimalne, technika ta może być użyta do oceny, jak dodawanie lub odejmowanie modelowanej przewodności wpływa na wyładowanie neuronów i pobudliwość błon. (B) W eksperymentach reprezentatywnych nagrania dynamiczne z zaciskiem pozyskiwano za pomocą oprogramowania SutterPatch oraz systemu wzmacniaczy dPatch. dPatch to wzmacniacz patch-clamp, wyposażony w zewnętrzne procesory sygnału oraz w pełni zintegrowany cyfrowy procesor, co czyni go dobrze przystosowanym do dynamicznych nagrań zaciskowych (patrz Dyskusja). (C) Reprezentatywne zapisy zacisków prądu spontanicznego wyładowania neuronów Purkinje, przed i po użyciu klamry dynamicznej do dodania lub odejmowania 400 nS z modelowanej przewodności nawigacyjnej (przedstawionej na Rysunku 1A). W C1 (po lewej) zapisy pochodzą z neuronu Purkinje'ego mut/mut Tsc1 z osłabionym wyładowaniem. Dodanie przewodności nawigacyjnej 400 nS skutkuje wyraźnym wzrostem częstotliwości wystrzału tej komórki. Alternatywnie, w C2 zapisy pochodzą z neuronu Purkinje'ego typu dzikiego. W tym eksperymencie modelowana przewodność nawigacji jest stosowana z odwróconą polaryzacją (-400 nS), co skutkuje odejmowaniem przewodności nawigacyjnej i wyraźnym spadkiem częstotliwości powtarzalnego wystrzału. Rekordy dynamicznego wtrysku prądu zaciskowego, pokazane na szaro, są przedstawione poniżej zapisów potencjału czynnościowego (napięcia), pokazanych na czarno. (D) Wyniki tych eksperymentów z dynamicznym klamrem, przedstawione jako zmiany spontanicznej częstotliwości wyładowania po dodaniu przewodności Nav do neuronów Purkinjego mut/mut Tsc1 (D1, n = 3) lub odejmowaniu przewodności Nav od neuronów Purkinjego typu dzikiego (D2, n = 3), ujawniają spójne i istotne efekty dodawania lub odejmowania tej przewodności pomiędzymut/mut Tsc1 (P = 0,029) i typem dzikim (P = 0,029) = 0,031) komórek, odpowiednio (sparowany test t-Studenta). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dyskusja

Obwody móżdżkowe pełnią funkcję w propriocepcji i kontroli motorycznej37,38, ale są również kluczowe dla złożonych zachowań, takich jak interakcje społeczne i przetwarzanie emocjonalne 39,40,41. Patologia struktury i funkcji móżdżku często wiąże się z ASD 42,43,44,45,46. Prosta architektura obwodów móżdżku47 oraz wyraźna rola móżdżku w patologii ASD sprawiają, że jest to atrakcyjny obszar mózgu do badania molekularnych i komórkowych czynników przyczyn deficytów behawioralnych z ASD, a także potencjalnych terapii. Dynamiczna elektrofizjologia zaciskowa stanowi ważne narzędzie w tych badaniach, umożliwiając badaczom bezpośrednie badanie przyczynowych zależności między zmianami właściwości kanałów jonowych/przewodnictwa jonowych związanymi z ASD a wyładowaniem neuronów móżdżku. Chociaż metody dynamicznego zacisku są szczególnie odpowiednie do badań nad zmianami pobudliwości neuronów związanych z ASD, ta technika jest istotna do badania szeregu mechanizmów patologicznych wpływających na komórki z pobudliwymi błonami. Dodatkowo dynamiczny zacisk pozostaje doskonałym narzędziem do analizy złożonych procesów, dzięki którym neurony i komórki mięśniowe regulują i utrzymują odpowiednie wyładowanie potencjału czynnościowego.

Dokładne wykonanie eksperymentów z dynamicznym zaciskiem wymaga starannej kontroli parametrów technicznych. Eksperymentatorzy powinni szczególnie znać i rozumieć konsekwencje zmienności potencjału w opóźnieniu między próbkowaniem napięcia a wstrzykiwaniem prądu, często określanego jako jitter29, a także właściwości pasywne elektrod, ograniczenia zacisków przestrzennych oraz fizjologiczną wierność badanego przygotowania eksperymentalnego. Bettencourt i in. (2008)48 oraz Butera i in. (2001)29 wcześniej wykazali, że osiągnięcie wysokich częstotliwości próbkowania co najmniej 50 kHz jest kluczowe dla dokładnego odchwycenia szybkich przewodności jonowych, przy czym opóźnienia sprzężenia zwrotnego powinny być idealnie utrzymywane poniżej 25% (≤ 5 μs) interwału próbkowania. Nominalne częstotliwości próbkowania zgłaszane przez systemy komercyjne, szczególnie platformy oparte na Windows, mogą być mylące; dlatego często konieczne jest niezależne weryfikowanie wydajności, które jest szczegółowo omawiane przez Milescu i in. (2008)25 oraz Clausen i in. (2012)49. Należy również uwzględnić ograniczenia zacisków przestrzennych, szczególnie przy pracy z nienaruszonymi neuronami o złożonych morfologiach i właściwościach błon nieizopotencjalnych. Na przykład próba zastosowania (lub odjęcia) przewodności elektrodą położoną dalej od miejsca całkującego, takiej jak AIS, skutkuje niedokładnym odwzorowaniem efektów przyłożonej przewodności. Słaba (wysoka) rezystancja elektrod, niewystarczająca kompensacja pojemności i/lub brak korekty błędu potencjału złącza mogą również powodować błędne przedstawienie pomiarów napięcia (sygnału wejściowego), a w konsekwencji nieprawidłowe zastosowanie modelowanych przewodności jonowych50,51.

Tysiące modeli Markowa i HH są bezpłatnie dostępne dla badaczy w internetowych bazach danych takich jak ModelDB52 i Channelpedia53, wspieranych odpowiednio przez Human Brain Project oraz The Laboratory of Neural Microcircuitry. Bazy danych te obejmują modele przewodności synaptycznych, przewodności kanałów jonowych oraz modele neuronów oparte na przewodnością, które są głównie pisane w NEURON, MATLAB lub Python. Pliki baz danych zazwyczaj dostarczają niezbędnych równań modelowych oraz wszelkich drobnych informacji o typach komórek i eksperymentach, które wpłynęły na model.

Zarówno modele przewodności Markowa, jak i HH zawierają stany/zmienne przewodzące (symulujące kanały otwarte/aktywowane) i nieprzewodzące (symulowane kanały zamknięte). Jednak te typy modeli różnią się sposobem obliczania przewodności przy każdym próbkowanym napięciu, przy czym modele Markowa wymagają większej mocy obliczeniowej, ale dostarczają więcej szczegółów dotyczących właściwości bramkowych symulowanych kanałów. Na przykład w modelach HH stany przewodzące i nieprzewodzące są zmiennymi niezależnymi, z których każda jest determinowana przez kinetykę napięcia wejściowego i bramki odpowiedniego stanu54,55. W przeciwieństwie do modeli Markowa, modele HH nie symulują ani nie ograniczają przejść między stanami bramkowymi, takich jak przejście symulowanych kanałów z aktywowanego/otwartego stanu kinetycznego bezpośrednio do szybko inaktywowanego stanu kinetycznego w modelu przewodności sodowej25 z bramką napięciową. Dzięki temu modele HH są mniej złożone obliczeniowo54,55 i umożliwiają badaczom jednoczesne dodawanie wielu modeli HH o szybkim przewodzeniu, przy zachowaniu wysokich częstotliwości próbkowania i aktualizacji.

Modele stanów kinetycznych Markowa składają się z dyskretnych stanów kinetycznych, które mogą przewodzić lub nie przewodzić, a te stany są ze sobą powiązane w ustalonej topologii. W symulacjach modeli Markowa przewodność jest obliczana przy każdym próbkowanym napięciu na podstawie proporcji symulowanych kanałów zajmujących przewodzący stan kinetyczny. Proporcja symulowanych kanałów zajmujących każdy stan kinetyczny (w czasie) jest określana przez stałe szybkości, które są parametrami regulującymi tempo, z jakim zajętość stanu przechodzi z jednego stanu kinetycznego do drugiego. Stałe szybkości mają jednostki odwrotności sekund (s-1), reprezentujące prawdopodobieństwo przejścia na jednostkę czasu. W zależności od modelu, wartości stałej prędkości mogą zależeć od czynników dynamicznych, takich jak napięcie czy temperatura.

W modelach Markowa równania różniczkowe zwyczajne są używane do opisu czasowo zależnego zajęcia każdego stanu kinetycznego. Równania te określają, jak prawdopodobieństwo przebywania w każdym stanie ewoluuje w czasie, w oparciu o stałe tempa przejścia. Jest to reprezentowane przez macierz szybkości Q: figure-discussion-156. Jak omówiono powyżej, stałe szybkości przejścia (r), które określają ruch między stanami, mogą być kształtowane przez napięcie wejściowe (V) oraz parametry α i β, które odzwierciedlają kinetykę przewodności między napięciami. Równania te można opisać jako: figure-discussion-2, i można je wizualnie przedstawić w postaci wykresów zawierających połączenia (stałe szybkości przejścia) do i z każdego stanu kinetycznego modelu 56,57,58. Pomocną dyskusję na temat rozwoju modeli Markowa i ich topologii można znaleźć w pracy Schoeninga i Silvy (2024)56.

Od momentu powstania dynamicznego zacisku w obecnej formie, w którym nieliniowe przewodnictwa jonowe są modelowane i stosowane (za pomocą elektrody wtryskującej prąd) do żywych komórek w czasie rzeczywistym19,59, metody i zasoby tej techniki ewoluowały i stają się coraz bardziej dostępne oraz opłacalne dzięki innowacjom takim jak tanie systemy oparte na mikrokontrolerach60 i darmowe, oprogramowanie open-source 23,25,26. Systemy komercyjne, takie jak dPatch firmy Sutter Instrument czy Cybercyte firmy Cytocybernetics, dodatkowo ułatwiają szybkie wdrażanie eksperymentów z dynamicznym zaciskiem poprzez zintegrowane rozwiązania sprzętowe i programowe27,61.

Wszechstronność dynamicznego zacisku umożliwia różnorodne zastosowania, w tym tworzenie wirtualnych synaps chemicznych i elektrycznych, osadzanie prawdziwych neuronów w sztucznych sieciach (lub odwrotnie) oraz dodawanie wirtualnych kanałów jonowych62. Co ważne, zależność napięcia, właściwości kinetyczne i amplitudy przyłożonej przewodności mogą być szybko regulowane, co pozwala badaczom bezpośrednio sprawdzić, jak skalowanie jednego lub więcej parametrów wpływa na wyładowanie potencjału czynnościowego i pobudliwość membrany31. Dzisiejsze systemy oferują wysokie częstotliwości próbkowania, umożliwiając dokładne stosowanie szybkich przewodności przejściowych i można je łatwo zintegrować z konwencjonalnym sprzętem elektrofizjologicznym60,63, co wzmacnia dynamiczny clamp jako idealną metodę pogłębiania naszej wiedzy o funkcji i zaburzeniach neuronów.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Telly'emu Galiatsatosowi oraz Joshowi Stanfordowi z Sutter Instrument za pomoc w zakresie zapytań technicznych. Dziękujemy również Jan Dolzer za pomoc w inicjowaniu badań dPatch z dPatch z dynamicnym clampem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CaCl2Fisher ChemicalC79-500 Odczynnik
Kapilarne rurki szklane borocylikat o średnicy ściany 1,5 mm średnica 0,86 mm długość 10 cmWarner Instruments64-0793Sprzęt
CleanBenchTMC63-9090ESprzęt
Kompresjom VF-500-Z wibratomi Instrumenty precyzyjnehttps://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/Sprzęt
Dell OptiPlex 7080Dolinahttps://www.dell.com/en-us/shop/desktop-computers/optiplex-7080-tower-and-small-form-factor/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffusSprzęt
DekstrozaFisher ChemicalD16-500 Odczynnik
System wzmacniaczy dPatchSutter InstrumentFG-DPATCHSprzęt
EGTAEMD Millipore324626-25GMOdczynnik
HEPESFisher Chemical7365-45-9Odczynnik
Grzejnik liniowyWarner Instruments64-0102Sprzęt
KclFisher ChemicalP330-500 Odczynnik
KetaminaDechra Veterinary Products193.40620.3 Odczynnik
K-glukonanTCI ChemicalsG0040Odczynnik
Oprogramowanie LinLabScientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2Sprzęt
Kąpiel wodna LSE 6LCorning6783Sprzęt
Mg-ATPSigma-Aldrich74804-12-9Odczynnik
MgCl2Fisher Chemical012288.A9Odczynnik
Model P-1000 PipetaSutter InstrumentFG-P1000Sprzęt
NaClFisher ChemicalS271-500 Odczynnik
Na-GTPMP Biomedicals56001-37-7Odczynnik
NaH2PO4J.T. Baker02-004-220 Odczynnik
NaHCO3Fisher ChemicalS233-500 Odczynnik
Oprogramowanie okulistyczneDigital Optics Limitedhttps://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-softwareSprzęt
ŻyletkaPersonna60-0139-CTNSprzęt
Harfa sliceWarner Instruments64-0255Sprzęt
SliceScope Pro 3000Scientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000Sprzęt
Klej superglueLoctite8040-00-142-9193Sprzęt
Oprogramowanie SutterPatchSutter Instrumenthttps://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatchSprzęt
Regulator temperaturyWarner Instruments64-2400Sprzęt
KsylazynaMP Biomedicals158307Odczynnik

Bibliografia

  1. Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), a009886-a009886 (2012).
  2. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nat Commun. 5 (1), 4742(2014).
  3. Connor, S. A., et al. Altered cortical dynamics and cognitive function upon haploinsufficiency of the autism-linked excitatory synaptic suppressor MDGA2. Neuron. 91 (5), 1052-1068 (2016).
  4. Pagani, M., et al. mTOR-related synaptic pathology causes autism spectrum disorder-associated functional hyperconnectivity. Nat Commun. 12 (1), 6084(2021).
  5. Tang, G., et al. Loss of mTOR-dependent macroautophagy causes autistic-like synaptic pruning deficits. Neuron. 83 (5), 1131-1143 (2014).
  6. Fatemi, S. H., Eschenlauer, A., Aman, J., Folsom, T. D., Chekouo, T. Quantitative proteomics of dorsolateral prefrontal cortex reveals an early pattern of synaptic dysmaturation in children with idiopathic autism. Cereb Cortex. 34 (13), 161-171 (2024).
  7. Deneault, E., et al. Complete disruption of autism-susceptibility genes by gene editing predominantly reduces functional connectivity of isogenic human neurons. Stem Cell Rep. 11 (5), 1211-1225 (2018).
  8. Brown, S. P., Jena, A. K., Osko, J. J., Ransdell, J. L. Tsc1 deletion in Purkinje neurons disrupts the axon initial segment, impairing excitability and cerebellar function. Neurobiol Dis. 207, 106856(2025).
  9. Tsai, P. T., et al. Autistic-like behaviour and cerebellar dysfunction in Purkinje cell Tsc1 mutant mice. Nature. 488, 647-651 (2012).
  10. Sundberg, M., et al. Purkinje cells derived from TSC patients display hypoexcitability and synaptic deficits associated with reduced FMRP levels and reversed by rapamycin. Mol Psychiatry. 23, 2167-2183 (2018).
  11. Brumback, A., Sohal, V. Intrinsic excitability defects in specific subtypes of medial prefrontal cortex pyramidal neurons in a mouse model of autism. Neurology. 82 (10), I4-1.010(2014).
  12. Mitchell, D. E., Miranda-Rottmann, S., Blanchard, M., Araya, R. Altered integration of excitatory inputs onto the basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons in a mouse model of Fragile X syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (2), e2208963120(2023).
  13. Sanders, S. J., et al. De novo mutations revealed by whole-exome sequencing are strongly associated with autism. Nature. 485, 237-241 (2012).
  14. Ben-Shalom, R., Keeshen, C. M., Berrios, K. N., An, J. Y., Sanders, S. J., Bender, K. J. Opposing effects on NaV1.2 function underlie differences between SCN2A variants observed in individuals with autism spectrum disorder or infantile seizures. Biol Psychiatry. 82 (3), 224-232 (2017).
  15. Spratt, P. W. E., et al. The autism-associated gene Scn2a contributes to dendritic excitability and synaptic function in the prefrontal cortex. Neuron. 103 (4), 673-685.e5 (2019).
  16. Nelson, A. D., et al. Physical and functional convergence of the autism risk genes Scn2a and Ank2 in neocortical pyramidal cell dendrites. Neuron. 112 (7), 1133-1149.e6 (2024).
  17. Zhang, J., et al. Severe deficiency of the voltage-gated sodium channel NaV1.2 elevates neuronal excitability in adult mice. Cell Rep. 36 (5), 100858(2021).
  18. Sharp, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. Artificial electrical synapses in oscillatory networks. J Neurophysiol. 67 (6), 1691-1694 (1992).
  19. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16 (10), 389-394 (1993).
  20. Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49 (3), 157-165 (1993).
  21. Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27 (4), 218-224 (2004).
  22. Muñiz, C., Arganda, S., Rodríguez, F. B., De Polavieja, G. G. Realistic stimulation through advanced dynamic-clamp protocols. Computational Methods in Neural Modeling. Mira, J., Álvarez, J. R. , Springer. Berlin. 95-105 (2005).
  23. Ortega, F. A., Butera, R. J., Christini, D. J., White, J. A., Dorval, A. D. Dynamic clamp in cardiac and neuronal systems using RTXI. Methods Mol Biol. 1183, 327-354 (2014).
  24. Milescu, L. S., Tabak, J. Dynamic clamp on a Windows PC. Methods Mol Biol. 2188, 157-177 (2021).
  25. Milescu, L. S., Yamanishi, T., Ptak, K., Mogri, M. Z., Smith, J. C. Real-time kinetic modeling of voltage-gated ion channels using dynamic clamp. Biophys J. 95 (1), 66-87 (2008).
  26. Kemenes, I., et al. Dynamic clamp with StdpC software. Nat Protoc. 6 (3), 405-417 (2011).
  27. Dolzer, J. Patch clamp technology in the twenty-first century. Methods Mol Biol. 2188, 21-49 (2021).
  28. Crino, P. B., Henske, E. P. New developments in the neurobiology of the tuberous sclerosis complex. Neurology. 53 (7), 1384-1390 (1999).
  29. Butera, R. J., Wilson, C. G., DelNegro, C. A., Smith, J. C. A methodology for achieving high-speed rates for artificial conductance injection in electrically excitable biological cells. IEEE Trans Biomed Eng. 48 (12), 1460-1470 (2001).
  30. Ransdell, J. L., Moreno, J. D., Bhagavan, D., Silva, J. R., Nerbonne, J. M. Intrinsic mechanisms in the gating of resurgent Na+ currents. eLife. 11, e70173(2022).
  31. Brown, S. P., Lawson, R. J., Moreno, J. D., Ransdell, J. L. A reinterpretation of the relationship between persistent and resurgent sodium currents. J Neurosci. 44 (29), e2396232024(2024).
  32. European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium. Identification and characterization of the tuberous sclerosis gene on chromosome 16. Cell. 75 (7), 1305-1315 (1993).
  33. Henske, E. P., Jóźwiak, S., Kingswood, J. C., Sampson, J. R., Thiele, E. A. Tuberous sclerosis complex. Nat Rev Dis Primers. 2 (1), 16036(2016).
  34. Wiznitzer, M. Autism and tuberous sclerosis. J Child Neurol. 19 (9), 675-679 (2004).
  35. Jeste, S. S., Sahin, M., Bolton, P., Ploubidis, G. B., Humphrey, A. Characterization of autism in young children with tuberous sclerosis complex. J Child Neurol. 23 (5), 520-525 (2008).
  36. Lawson, R. J., et al. Selective deletion of Tsc1 from mouse cerebellar Purkinje neurons drives sex-specific behavioral impairments linked to autism. Front Behav Neurosci. 18, 1474066(2024).
  37. Sherrington, C. S. The Integrative Action of the Nervous System. , Yale University Press. New Haven. (1911).
  38. Russell, J. S. R., Horsley, V. A. H. II Experimental researches into the functions of the cerebellum. Proc R Soc Lond. 55, 57-60 (1894).
  39. Rudolph, S., et al. Cognitive-affective functions of the cerebellum. J Neurosci. 43 (45), 7554-7564 (2023).
  40. Schmahmann, J. D. The cerebellum and cognition. Neurosci Lett. 688, 62-75 (2019).
  41. Beuriat, P. -A., Cristofori, I., Gordon, B., Grafman, J. The shifting role of the cerebellum in executive, emotional and social processing across the lifespan. Behav Brain Funct. 18 (1), 6(2022).
  42. Stoodley, C. J. Distinct regions of the cerebellum show gray matter decreases in autism, ADHD, and developmental dyslexia. Front Syst Neurosci. 8, 92(2014).
  43. Bruchhage, M. M. K., Bucci, M. -P., Becker, E. B. E. Cerebellar involvement in autism and ADHD. Handb Clin Neurol. 155, 61-72 (2018).
  44. Mosconi, M. W., Wang, Z., Schmitt, L. M., Tsai, P., Sweeney, J. A. The role of cerebellar circuitry alterations in the pathophysiology of autism spectrum disorders. Front Neurosci. 9, 296(2015).
  45. Weber, A. M., Egelhoff, J. C., McKellop, J. M., Franz, D. N. Autism and the cerebellum: evidence from tuberous sclerosis. J Autism Dev Disord. 30 (6), 511-517 (2000).
  46. Wang, S. S. -H., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83 (3), 518-532 (2014).
  47. Ransdell, J. L., Nerbonne, J. M. Voltage-gated sodium currents in cerebellar Purkinje neurons: functional and molecular diversity. Cell Mol Life Sci. 75 (19), 3495-3505 (2018).
  48. Bettencourt, J. C., Lillis, K. P., Stupin, L. R., White, J. A. Effects of imperfect dynamic clamp: computational and experimental results. J Neurosci Methods. 169 (2), 282-289 (2008).
  49. Clausen, C., Valiunas, V., Brink, P. R., Cohen, I. S. MATLAB implementation of a dynamic clamp with bandwidth of >125 kHz capable of generating INa at 37°C. Pflugers Arch. 465 (4), 497-507 (2013).
  50. Preyer, A. J., Butera, R. J. The effect of residual electrode resistance and sampling delay on transient instability in the dynamic clamp system. Annu Int Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2007, 430-433 (2007).
  51. Preyer, A. J., Butera, R. J. Causes of transient instabilities in the dynamic clamp. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17 (2), 190-198 (2009).
  52. McDougal, R. A., et al. Twenty years of ModelDB and beyond: building essential modeling tools for the future of neuroscience. J Comput Neurosci. 42 (1), 1-10 (2017).
  53. Ranjan, R., et al. Channelpedia: an integrative and interactive database for ion channels. Front Neuroinform. 5, 36(2011).
  54. Carbonell-Pascual, B., Godoy, E., Ferrer, A., Romero, L., Ferrero, J. M. Comparison between Hodgkin-Huxley and Markov formulations of cardiac ion channels. J Theor Biol. 399, 92-102 (2016).
  55. Andreozzi, E., Carannante, I., D'Addio, G., Cesarelli, M., Balbi, P. Phenomenological models of NaV1.5. A side by side, procedural, hands-on comparison between Hodgkin-Huxley and kinetic formalisms. Sci Rep. 9 (1), 17493(2019).
  56. Schoening, M. E., Silva, J. R. Creating Computational Models of Ion Channel Dynamics. Potassium Channels: Methods and Protocols. , Springer. New York. (2024).
  57. Mangold, K. E., et al. Identification of structures for ion channel kinetic models. PLoS Comput Biol. 17 (8), e1008932(2021).
  58. Silva, J. R., Cooper, P., Nichols, C. G. Modeling KATP-dependent excitability in pancreatic islets. Biophys J. 107 (9), 2016-2026 (2014).
  59. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69 (3), 992-995 (1993).
  60. Desai, N. S., Gray, R., Johnston, D. A dynamic clamp on every rig. eNeuro. 4 (5), (2017).
  61. Han, L., et al. Reconciling computer models and stem cell models of human cardiac repolarization: reply. Cardiovasc Res. 106 (1), 6-7 (2015).
  62. Wilders, R. Dynamic clamp: a powerful tool in cardiac electrophysiology. J Physiol. 576 (2), 349-359 (2006).
  63. Kullmann, P. H. M., Wheeler, D. W., Beacom, J., Horn, J. P. Implementation of a fast 16-bit dynamic clamp using LabVIEW-RT. J Neurophysiol. 91 (1), 542-554 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zaburzenia widma autyzmumetoda voltage clampneurony Purkinjegofunkcja kana w jonowychmetoda patch clampkana sodowyskrawki m d kumodelowanie przewodnictwa
Metody dynamicznego zacisku do badania upośledzonej pobudliwości neuronów związanych z autyzmem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.