Niniejszy artykuł demonstruje działanie i wpływ mikroskopii konfokalnej in vivo w diagnozie i leczeniu suchego oka oraz bada zastosowanie i wyniki mikroskopii konfokalnej in vivo , aby stanowić podstawę przyszłych badań.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Niniejszy artykuł demonstruje działanie i wpływ mikroskopii konfokalnej in vivo w diagnozie i leczeniu suchego oka oraz bada zastosowanie i wyniki mikroskopii konfokalnej in vivo , aby stanowić podstawę przyszłych badań.
Mikroskopia konfokalna in vivo (IVCM) zyskała znaczną uwagę ze względu na swoją nieinwazyjną naturę i wysoką rozdzielczość. Umożliwia on in vivo obserwację i obiektywne ilościowe określenie licznych struktur powierzchni oczu związanych z chorobą suchego oka (DED), w tym rogówki, spojówki, marginesu powieki, gruczołów meiboma oraz pasożytów takich jak Demodex, na poziomie komórkowym. Ta zdolność pomaga okulistom w identyfikacji specyficznych etiologii i podtypów DED, co ułatwia precyzyjną diagnozę, leczenie celowane i prognozowanie. Jednak ustandaryzowane protokoły dotyczące pracy i raportowania IVCM nadal pozostają niewystarczające. Biegłość zarówno w wiedzy okulistycznej, jak i w zakresie obsługi technicznej jest niezbędna, aby skutecznie korzystać z tego urządzenia i generować wysokiej jakości raporty. Artykuł ten szczegółowo opisuje proceduralne etapy i niuanse badania IVCM u pacjentów z DED. Jest to pierwszy krok po kroku protokół IVCM JoVE dla DED. Ma na celu służyć jako punkt odniesienia dla klinicystów, pomagając im unikać operacyjnych nieefektywności i konsekwentnie uzyskiwać wysokiej jakości obrazy powierzchni rogówki i oczu, które wspierają zarządzanie kliniczne.
Ze względu na ograniczenia lokalnych zasobów medycznych lub obciążenia finansowe pacjentów, kliniczna diagnoza DED często koncentruje się tylko na podstawowym aspekcie (np. obserwacji pod mikroskopem lampy szczelinowej, skargach na suchość i swędzenie oczu) lub nawet na jednym wskaźniku (np. czas rozbicia inwazyjnej błony łzowej, test wydzieliny łzowej lub inwazja Demodex). Zastosowanie IVCM nie jest powszechnie dostępne, nie mówiąc już o standaryzowaniu protokołów dla niego. Jednak dla placówek okulistycznych wyposażonych w IVCM autor zaleca poddanie pacjentom po raz pierwszy kompleksowe badanie mikroskopowe, aby uniknąć pominięć, w tym rogówki, spojówki i brzegu poddrobiowego. W przypadku niejasnych przypadków DED lub wykrywania Demodexu, IVCM jest szczególnie odpowiednie do udzielenia jednoznacznej odpowiedzi.
Choroba suchego oka (DED) definiowana jest jako przewlekła choroba powierzchni oka spowodowana nieprawidłowościami jakości lub ilością płynu łzowego oraz obniżoną stabilnością filmu łzowego. W Warsztatach Suchego Oka II (DEWS II) DED dzieli się na pięć typów: suche oko z niedoborem wody (ADE), suche oko z niedoborem wody (ADE), suche oko z niedoborem wody (EDE), mieszane suche oko (MDE), predyspozycje do suchości oka oraz stan suchości okaprzedkliniczny 1. Ralene i in. podsumowali ważną praktykę kliniczną IVCM w różnych typach suchego oka, w tym literaturę opublikowaną w latach 2017–20222. Najnowsze badania wykazały, że stan zapalny odgrywa kluczową rolę w patogenezie DED 3,4. Szczególnie gęstość komórek dendrytycznych (DC) może być dobrym wskaźnikiem DED związanego z układowym procesem immunologicznym5.
IVCM wykorzystuje technologię konfokalnej tomografii laserowej. Oferuje rozdzielczość poziomą i pionową 1 μm. Szczegółowe specyfikacje techniczne urządzenia zostały udokumentowane w raporcie Jeremy'ego i in.6. Podczas badania powierzchni oka najpierw stosuje się IVCM do rogówki7, następnie do spojówki i gruczołów Meiboma8. Demodex blepharitis w ostatnich latach wzbudzało coraz większą uwagę kliniczną 9,10. IVCM zapewnia wyraźne obrazy rogówki, spojówki i brzegu poddechowego. Obrazy te pozwalają klinicystom ocenić stan choroby oraz ułatwić obrazowanie i ilościowe określenie komórek zapalnych i układu odpornościowego.
W ocenie DED koncentrujemy się na: komórki nabłonkowe rogówki (CEC); włókna nerwowe podnabłonkowe (SNF); komórki zapalne/immunologiczne śródnabłonkowe i podnabłonkowe; komórki pucharowe spojówki (CGC); komórki zapalne/układowe spojówki; gruczoły Meiboma i otwory; Demodex folliculorum i Demodex brevis; oraz komórki zapalne w otaczających tkankach. Ten nacisk wynika z patofizjologii: dysfunkcja gruczołów Meiboma prowadzi do zmniejszonej wydzieliny lub zmienionego składu warstwy lipidowej filmu łzowego, co skutkuje przyspieszonym parowaniem łez i uszkodzeniem powierzchni oka. Infestacja Demodex przyczynia się do swędzenia i dyskomfortu oczu. CGC wydzielają mucynę, kluczowy składnik filmu łzawiącego; ich wyczerpanie może powodować DED niedoborowy w mucynie. Natomiast DED sam w sobie uszkadza struktury powierzchni oka, w tym CEC i SNF, a następnie podnosi gęstość komórek zapalnych/immunologicznych w tkankach rogówki i spojówek. Po uzyskaniu idealnych obrazów możemy skutecznie wykorzystać wbudowane narzędzia ilościowe oprogramowania do liczenia wielu wymienionych komórek (Rysunek 1). Ale dla morfologicznej różnorodności SNF musimy polegać na oprogramowaniu analitycznym, które pomoże w ilościfikacji11,12.
IVCM jest niezbędne do oceny w czasie rzeczywistym warstw rogówki, włókien nerwowych oraz komórek zapalnych/immunologicznych w tkankach powierzchni oka. Do oceny CGC cytologia odcisków służy jako alternatywna metoda. Technika ta celuje w spojówkę wydzielnicową, gdzie gęstość komórek pucharowych osiąga szczyt, dając wartości zazwyczaj wyższe niż pomiary IVCM13,14. Jednak wyniki podlegają zmienności barwienia i doświadczeniu operatora, podczas gdy czasochłonny protokół ogranicza rutynowe wdrożenie kliniczne. Niedrożność otworu gruczołu Meiboma jest bezpośrednio obserwowalna za pomocą mikroskopii lampowej szczelinowej, jednak ta metoda nie wykrywa blokad wywołanych przez Demodex brevis, które IVCM dokładnie identyfikuje. Aby zdiagnozować infestację Demodex, epilacja rzęs za pomocą mikroskopu świetlnego to niedroga metoda. Choć technicznie proste, podejście to niesie ze sobą istotne ograniczenia: dyskomfort pacjenta ogranicza wielokrotne pobieranie próbek, a roztocza zamieszkujące głęboko w mieszkach rzęsowych lub otworach gruczołów Meiboma pozostają niewykrywalne15. Dla porównania, IVCM umożliwia kompleksowe badanie wielu miejsc na marginesach powiek, w tym mieszków rzęsowych i otworów gruczołów Meiboma, przy minimalnym dyskomfortie pacjenta. To podejście pozwala na znacznie wyższe wskaźniki pozytywności diagnostycznej dzięki wizualizacji pasożytów in vivo w czasie rzeczywistym w ich mikrohabitatach16,17.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Procedura badania została zatwierdzona przez Komisję Etyki Szpitala Okulistycznego Hankou Aier, a wszyscy pacjenci uzyskali świadomą zgodę.
UWAGA: Kryteria włączenia do wyboru pacjentów obejmują pacjentów zgłaszających się z dolegliwościami suchości i swędzącego oczu oraz osoby poszukujące rutynowych badań wzroku. Kryteria wykluczające przy wyborze pacjentów obejmują pacjentów z perforacją rogówki lub nadchodzącą perforacją, osoby uczulone na miejscowe znieczulenie oczne, osoby zbyt młode (np. poniżej 3 roku życia) lub zbyt stare, by współpracować, pacjentów z wąskimi szczelinami popalnymi niezdolnymi do umieszczenia wziernika powieki, kobiety w ciąży oraz osoby niezdolne do współpracy z innych powodów. Krótki diagram przepływu pracy można znaleźć na Rysunku 2. Szczegółowe kroki operacyjne przedstawiają się następująco.
1. Wstępne przesłuchanie
2. Podczas egzaminu
3. Po przesłuchaniu
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie mikroskopowe obrazy IVCM zostały wykonane w rozdzielczości 384 piksele × 384 piksele, pole obserwacyjne 400 μm × 400 μm. Po prawidłowym "zerowaniu" badanie to pokaże tylko trzy możliwe wyniki w ramce obrazu: i) Brak obrazu (nieudany eksperyment): Centralna strefa optyczna nie miała kontaktu z tkanką docelową. ii) Tylko częściowy obraz (rysunek 7) lub inne nieprawidłowe sytuacje (rysunek 8) (nieudany eksperyment): centralna strefa optyczna miała niepełn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyszukiwanie literatury w PubMed za pomocą słów kluczowych "in vivo confocal microscopy" oraz "dry eye disease" (dostęp czerwiec 2025) dało > 300 publikacji. Co istotne, roczne wskaźniki publikacji ustabilizowały się na poziomie około 40 artykułów rocznie od 2021 roku. Szersze zastosowania IVCM w zaburzeniach powierzchni oka zaowocowały > 2000 badań w ciągu ostatnich dwóch dekad (2004-2024). Klinicznie IVCM zrewolucjonizowało ocenę patologii powierzchni oczu na poziomie komórkowym. Technologia ta umożliwia wykry...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Autorzy dziękują Linie Jin z Hankou Aier Eye Hospital oraz Min Chen z Oddziału Okulistyki Wuhan Asia Heart Hospital za pomoc przy kilku zdjęciach oraz wszystkim uczestnikom i pracownikom pracującym przy zabiegu operacyjnym. Badania te zostały wsparte grantem z Projektów Naukowych Komisji Zdrowia Miejskiej Wuhan (WX23A20).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chłonne waciki | JIAN QI, Chiny | http://www.hnjianqi.com | Do robienia małych piłek alkoholowych |
| Żel na bazie alkoholu | Li Kang, Szanghaj, Chiny | 31107904 | Żel bez środków antyseptycznych do płukania rąk, 500ml |
| Krople do oczu Carbomer | Vidisic, Niemcy | 8187195 | Sterylny żel okulistyczny jako środek sprzęgający, 10g |
| Nasadka kontaktowa rogówki (TomoCap) | Heidelberg, Niemcy | 18829 | Ośrodek optyczny i kontakt z rogówką aseptyczny |
| Wziernik powieki | Asicon, Chiny | 6102A | Za otwarcie oczu |
| Oprogramowanie Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg, Niemcy | Wersja 1.5.2.0 | Oprogramowanie dołączone do urządzenia IVCM |
| Urządzenie IVCM | Heidelberg, Niemcy | HRT-?,08398 | Główne wyposażenie egzaminu |
| Medyczne patyczki watowe | Esound Med, Chiny | www.e-soundmed.com | Do czyszczenia oczu pacjentów i wspomagania ich otwarcia, 10 cm |
| 75% alkohol leczniczy | HUICHANG, Chiny | www.huichang888.cn | Do robienia kulek alkoholowych, 75% ± 5% 500ml |
| Krople do oczu z tlenem oksybuprokainy 0,4% | Santen, Japonia | http://www.santen.co.jp | Znieczulenie miejscowe okulistyczne, 0,4% (0,5 ml: 2 mg) |
| Krople do oczu z tobramycyną | TOBREX, Belgia | 8453824 | Krople przeciwzapalne do oczu, 0,3% (5ml: 15mg) |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.