$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Badanie przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską i zatwierdzono przez Komitet Etyki Instytucjonalnej Centralnego Szpitala Ludowego w Huizhou (nr Zatwierdzenia 2022-015). Badanie to nie zostało zarejestrowane jako badanie kliniczne ze względu na retrospektywny charakter. Świadoma zgoda została zniesiona ze względu na retrospektywny charakter analizy, a wszystkie dane pacjentów zostały zdeidentyfikowane. Regentowie oraz używany sprzęt są wymienieni w Tabeli Materiałów.
1. Projekt badania i wybór pacjentów
Jako retrospektywne badanie wielocentryczne uznajemy potencjał błędu selekcyjnego. Aby temu zapobiec, identyfikacja pacjentów stosowała się według protokołu kolejnych zapisów z prospektywnych rejestrów udarów w każdym uczestniczącym ośrodku. Wszyscy pacjenci z ostrym zawałem mózgu w okresie badania (styczeń 2022–styczeń 2025) byli przesiewani pod kątem kwalifikacji, a ci spełniający kryteria włączenia byli włączani kolejno. Dane zostały zebrane z trzech instytucji: Shaoxin Shangyu People's Hospital, Run Run Shaw Hospital oraz Huizhou Central People's Hospital. Zawarto umowy o wymianie danych między wszystkimi uczestniczącymi ośrodkami, aby zapewnić właściwy nadzór i dostęp do danych.
Aby obsłużyć brakujące dane, zastosowano podejście wielokrotnej imputacji z wykorzystaniem równań łańcuchowych dla zmiennych z brakiem <5%. Dla zmiennych, w których brakowało >5% danych, zastosowano analizę pełnej sprawy, z przejrzystym raportowaniem wzorców braków. Zmienne krytyczne, w tym CYP2C19 genotyp, wyjściowy NIHSS oraz 3-miesięczne mRS, zawierały pełne dane dla wszystkich uczestników. Potencjalne zakłócenia zostały rozwiązane poprzez wielowymiarową korektę w naszych modelach statystycznych, w tym znane czynniki prognostyczne, takie jak wiek, początkowa ciężkość udaru, czynniki ryzyka naczyniowego oraz leki towarzyszące. Konkretnie zebrano i uwzględniono dane dotyczące równoległych leków (przeciwpłytkowe, statyny, leki przeciwnadciśnieniowe) i dostosowane do analizy w analizach.
- Kryteria włączenia
Kryteria włączenia były następujące: (1) Rozpoznanie ostrego zawału mózgu potwierdzone obrazowaniem i kryteriami klinicznymi zgodnie z chińskimi wytycznymi dotyczącymi diagnozy i leczenia ostrego udaru niedokrwiennego; (2) Pierwszy udar z czasem od początku do przyjęcia <72 godziny; (3) Leczenie butylftalidem (0,1 g w kapsułkę) w dawce 0,2 g trzy razy dziennie na pusty żołądek, rozpoczęte w ciągu 24 godzin od przyjęcia; (4) Brak wcześniejszej terapii trombolitycznej ani antykoagulacyjnej.
- Kryteria wykluczenia
Kryteria wykluczenia były następujące: (1) współistniejące zaburzenia psychiatryczne lub zaburzenia poznawcze; (2) Ciężka dysfunkcja wątroby, nerek lub serca; (3) nadwrażliwość na badany lek; (4) Układowe choroby zapalne lub autoimmunologiczne. Pacjenci byli podzieleni na grupy o dobrej prognozie (mRS ≤2) i słabe rokowanie (mRS ≥3) na podstawie 3-miesięcznych zmodyfikowanych wyników Skali Rankina7. Proces włączania pacjentów przedstawiono na Rysunku 1.
Przestrzeganie terapii butyloftalidem przez pacjentów monitorowano poprzez bezpośrednią obserwację podawania leków podczas hospitalizacji, liczenia tabletek i przeglądów dziennika leków podczas wizyt kontrolnych, ustrukturyzowane rozmowy telefoniczne co 2 tygodnie w celu oceny zgodności i skutków niepożądanych oraz przegląd dokumentacji uzupełnień recepty dla pacjentów ambulatoryjnych. Pacjenci z <80% przestrzegania zostały wykluczone z analizy (n=7). Punkt końcowy obserwacji po 3 miesiącach został wybrany na podstawie ustalonych standardów badań wyników udaru, ponieważ mRS po 90 dniach po udarze jest powszechnie akceptowany jako główny punkt końcowy obejmujący krytyczny okres rekonwalescencji.
2. Zbieranie danych klinicznych
Dane były systematycznie zbierane za pomocą elektronicznych formularzy opisu przypadku obejmujących pięć dziedzin: cechy demograficzne (wiek, płeć, wskaźnik masy ciała, Tabela 1), czynniki ryzyka naczyniowego (nadciśnienie, cukrzyca, historia palenia, historia picia), obraz kliniczny (miejsce zawału, wyjściowy wynik NIHSS), parametry laboratoryjne oraz szczegóły leczenia. Biomarkery krwi mierzono w następujący sposób:
- Profil lipidowy (TC, TG, LDL-C, HDL-C)
Analizowano za pomocą automatycznego analizatora biochemicznego, z zakresem testu 0–20 mmol/L dla TC, 0–10 mmol/L dla TG, 0–15 mmol/L dla LDL-C oraz 0,5–2,0 mmol/L dla HDL-C.
- Homocysteina w surowicy (Hcy)
Mierzone metodą ELISA (zakres detekcji 5–50 μmol/L, współczynnik zmienności <5%). Próbki przechowywano w temperaturze -80 °C w ciągu 2 godzin od pobrania, aby uniknąć degradacji.
3. CYP2C19 genotypowanie
- Pobieranie próbek i ekstrakcja DNA
Rano pobrano krew żylną na czczo (5 mL) z żyły pośrodkowej łokciowej. Po 30 minutach krzepnięcia w temperaturze pokojowej próbki były wirowane w 1 600 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, używając wirówki wysokiej prędkości do izolacji surowicy. DNA genomowe zostało wyodrębnione z 300 μL surowicy zgodnie z protokołem producenta. Krótko mówiąc, próbki były inkubowane z buforem lizyzowym 300 μL w temperaturze 56 °C przez 10 minut, po czym dodano 100 μL etanolu absolutnego. Mieszanka była przelewana do kolumn oczyszczających i wirowana w temperaturze 12 000 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. DNA było eluowane za pomocą 50 μL wcześniej podgrzanego (70 °C) bufora elucijnego po dwóch etapach płukania, każdy z buforem 500 μL, z wirowaniem przy 12 000 × g przez 1 minutę po każdym płukaniu. Końcowe stężenie DNA zostało dostosowane do 50–100 ng/μL za pomocą spektrofotometru i przechowywane w temperaturze -20 °C.
- Genotypowanie PCR w czasie rzeczywistym
CYP2C19 genotypowanie przeprowadzono za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Mieszanina reakcyjna o pojemności 20 μL składała się z 10 μL 2× TaqMan Master Mix, 1 μL mieszanki zapalnicz-sonda, 2 μL matrycy DNA oraz 7 μL wody wolnej od nukleazy. Warunki cyklu termicznego ustalono: początkowa denaturacja w 95 °C przez 30 s, następnie 40 cykli denaturacji w 95 °C przez 5 s oraz łączne wyżarzanie/przedłużanie w 60 °C przez 34 s. Dane fluorescencji zbierano podczas etapu wyżarzania/przedłużania.
- Potwierdzenie genotypu i kontrola jakości
Sygnały genotypowe zostały potwierdzone za pomocą sekwencjonowania Hi-SNP drugiej generacji z pokryciem 100×. Dla wyników dysonansowych (n=3) zastosowano analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych jako metodę zapasową: produkt PCR o stężeniu 20 μL był inkubowany enzymem restrykcyjnym HpyCH4V oraz odpowiadającym mu buforem 4 μL w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie separacją za pomocą elektroforezy żelu 2% agarozowego przy napięciu 100 V przez 45 minut.
Wprowadzono rygorystyczne środki kontroli jakości. Wszystkie próbki były przetwarzane w duplikacie za pomocą testów z oślepianym replikowaniem; w każdym testie PCR uwzględniano wewnętrzne kontrole (znane genotypy); zgodność między wynikami PCR w czasie rzeczywistym a sekwencjonowaniem Hi-SNP wynosiła 100%; losowo wybrane próbki (10%) zostały wysłane do niezależnego laboratorium w celu weryfikacji, osiągając 100% zgodności; wskaźniki połączeń przekroczyły 99,5% przy minimalnym wyniku jakości genotypu Q30.
- Klasyfikacja fenotypów metabolicznych
Fenotypy metaboliczne kategoryzowano na podstawie CYP2C19 genotypu następująco: słabi metabolizatorzy (*2/*2, *2/*3, *3/*3); Metabolizatory pośrednie (*3/*17, *2/*17, *1/*2, *1/*3); Szybkie metabolizatory (*1/*1). Ten trzypoziomowy schemat klasyfikacji został wykorzystany dla zgodności z regionalnymi praktykami laboratoryjnymi klinicznymi. Częstość występowania allelu *17 oraz rozkład genotypów w grupie IM są szczegółowo opisane w sekcji Wyników.
4. Analiza statystyczna
Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu wersji SPSS 25.0. Dane kategoryczne wyrażono jako [n (%)] i porównano za pomocą testów χ2 (z korektą Yatesa dla małych prób). Zmienne ciągłe testowano pod kątem normalności za pomocą testu Shapiro-Wilka; dane o normalnym rozkładzie przedstawiono jako średnią ± odchyleniu standardowym i analizowano niezależnymi testami T, natomiast dane nienormalne analizowano testami Mann-Whitney U.
Wielokoliniearność oceniono za pomocą współczynnika tolerancji (≥0,1) i wariancji inflacyjnej (VIF <10). Analiza regresji logistycznej (z wykorzystaniem ścieżki menu Analyze → Regression → Binary Logistic w SPSS) została użyta do identyfikacji niezależnych czynników prognostycznych, z kryteriami wejścia i wyjścia ustalonymi odpowiednio na P <0,05 i P >0,10. Zmienne wprowadzone do modelu obejmowały poziomy Hcy (ciągłe), bazowy wynik NIHSS (ciągły), nadciśnienie (kategoryczny) oraz fenotyp CYP2C19 metaboliczny (kategoryczny, z szybkim metabolizmem jako punktem odniesienia). Test dopasowania Hosmera-Lemeshowa został przeprowadzony w celu oceny kalibracji modelu. Statystycznie uznano dwustronne P <0,05.
Rozmiary efektów obliczono następująco: dla zmiennych ciągłych wartość d Cohena obliczono za pomocą funkcji testowej Analyze < Compare MeansIndependent-Samples T Test z dodatkowym uwzględnieniem rozmiaru efektu; dla zmiennych kategorycznych współczynnik phi uzyskano na podstawie testu χ2 w zakładkach krzyżowych Analizuj Statystykę Opisową, gdzie w opcjach statystyki wybrano Phi i V Cramera.