Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Protokół miokinowy wywołany wysiłkiem fizycznym do badania mechanizmów ochrony kości RANKL/OPG w osteoporozie po menopauzie

593 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69172

⸱

7 listopada 2025

 ,  , 
1Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł przedstawia kompleksowy protokół badania czynnika cytokinowego przypominającego kardiotrofynę 1 (CLCF1) jako mediatora ochrony kości wywołanego wysiłkiem poprzez modulację osi RANKL/OPG w osteoporozie po menopauzie.

Streszczenie

Najnowsze badania zidentyfikowały czynnik cytokinowy podobny do kardiotrofiny 1 (CLCF1) jako "cząsteczkę młodości" wywołaną przez ćwiczenia, która przynosi korzyści dla układu mięśniowo-szkieletowego, ale maleje wraz z wiekiem. Protokół ten opisuje systematyczne podejście do badania regulacyjnej roli CLCF1 w ochronie kości pośredniczonej ćwiczeniami poprzez mechanizmy przenikania układu immuno-kostnego. Metodologia obejmuje analizę próbek klinicznych, techniki charakteryzacji molekularnej oraz testy funkcjonalne w celu wyjaśnienia wpływu CLCF1 na aktywator receptorów osi sygnalizacji czynnika jądrowego – ligandu κB (RANKL) i osteoprotegeriny (OPG). Dzięki ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), western blottingowi, edycji genów CRISPR/Cas9 oraz systemom ko-hodowli, protokół ten demonstruje podwójne działanie CLCF1 chroniące kości poprzez hamowanie osteoklastu za pośrednictwem STAT1 oraz promowanie osteoklasów za pomocą STAT3. Opisane metody umożliwiają kompleksową ocenę wzorców ekspresji CLCF1, analizę korelacji z parametrami gęstości mineralnej kości oraz mechanistyczną ocenę potencjalnych interwencji naśladowań ćwiczeniowo-mimetycznych. W przeciwieństwie do tradycyjnych terapii antyresorpcyjnych, które koncentrują się głównie na osteoklascie, interwencje oparte na CLCF1 mogą oferować unikalną zaletę jednoczesnego promowania tworzenia kości i hamowania resorpcji. Protokół ten dostarcza naukowcom ustandaryzowanych procedur do badania regulacji metabolizmu kości wywołanej przez wysiłki fizycznej, pośredniczonej przez cytokiny, oraz ułatwia opracowywanie ukierunkowanych interwencji terapeutycznych w leczeniu chorób kości związanych z wiekiem.

Wprowadzenie

Osteoporoza pomenopauzalna (PMOP) stanowi paradygmatyczny przykład związanego z wiekiem spadku układu mięśniowo-szkieletowego, w którym zaburzenia układu odpornościowego powodują patologiczną utratę masy masowej 1,2,3. Chociaż ćwiczenia są powszechnie uznawane za najskuteczniejszą niefarmakologiczną interwencję zapobiegającą pogorszeniu kości związanemu z wiekiem, precyzyjne molekularne mechanizmy leżące u podstaw ochrony kości wywołanej wysiłkiem były nieuchwytne ażdo niedawna. Współczesne rozumienie metabolizmu kości wykraczało poza tradycyjne ramy endokrynologiczne, obejmując złożone interakcje osteoimmunologiczne oraz mięśnie wywołane wysiłkiem, które regulują homeostazę szkieletu5.

Niedawne zidentyfikowanie czynnika cytokinowego przypominającego kardiotrofinę 1 (CLCF1) jako czynnika wywołanego wysiłkiem, który zwalcza związany z wiekiem spadek układu mięśniowo-szkieletowego stanowi zmianę paradygmatu w rozumieniu przesłuchu kości-mięśnie6. To przełomowe odkrycie wyjaśnia dobrze udokumentowane działanie ćwiczeń ochronnych dla kości poprzez wcześniej nieznany mechanizm molekularny, co czyni CLCF1 kluczowym mediatorem osteoanabolizmu wywołanego wysiłkiem7. Transgeniczne myszy nadekspresyjne CLCF1 wykazały poprawę formowania kości, lepszą tolerancję glukozy oraz lepszą wydajność fizyczną w porównaniu z grupami kontrolnymi typu dzikiego6, co sugeruje, że suplementacja CLCF1 może potencjalnie naśladować korzyści z wysiłku fizycznego w populacjach siedzących lub z zaburzeniami ruchu.

Leczenie mimetyczne ćwiczeń definiuje się jako interwencje farmakologiczne naśladujące kinetykę CLCF1 wywołaną przez ćwiczenia, zapewniając korzyści terapeutyczne podobne do aktywności fizycznej poprzez szlaki molekularne8. Czynnik cytokinowy o charakterze kardiotrofinowym 1 (CLCF1), określany również jako neurotrofina-1 (NNT-1) lub czynnik stymulujący komórki B-3 (BSF-3), należy do nadrodziny cytokin-interleukin-6 (IL-6) i wykazuje plejotropowe funkcje biologiczne8. Początkowo charakteryzowany ze względu na neurotroficzne właściwości w przeżyciu i rozwoju neuronów ruchowych rdzenia kręgowego, rola CLCF1 jako miokiny wywołanej wysiłkiem stała się istotnym obszarem badań. Najnowsze badania kliniczne potwierdziły CLCF1 jako biomarker zdrowia kości, wykazując, że poziom białka CLCF1 w komórkach jednojądrowych krwi obwodowej jest istotnie obniżony u kobiet po menopauzie z osteoporozą w porównaniu do zdrowych grupkontrolnych 9. Badania te wykazały pozytywne korelacje między ekspresją CLCF1 a gęstością mineralną kości w wielu miejscach szkieletowych, dostarczając klinicznej weryfikacji wzmacniającej potencjał translacyjny interwencji terapeutycznych ukierunkowanych na CLCF1.

Cytokiny działają poprzez kompleksy receptorów heteromerycznych, w tym rozpuszczalne receptory czynnika rzęskowego neurotroficznego (sCNTFR) oraz czynnik receptorowy cytokinowy-1 (CRLF-1), aby orkiestrować różnorodne odpowiedzi komórkowe10,11. Najnowsze badania mechanistyczne wyjaśniły paradygmat podwójnej sygnalizacji, w którym CLCF1 jednocześnie hamuje resorpcję kości i wspiera formowanie się kości 2,6,7,9. To podwójne działanie zachodzi poprzez różnicową aktywację szlaku sygnałowego przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji (STAT): fosforylacja STAT1 pośredniczy w hamowaniu osteoklastu poprzez zakłócanie aktywatora receptora sygnalizacji czynnika jądrowego κB (RANKL) indukowanej przez czynnik jądrowy (RANKL), podczas gdy aktywacja STAT3 w osteoblastach sprzyja ekspresji markerów formowania kości, w tym fosfatazy alkalicznej i osteokalcyny.

Zrozumienie, jak ostre reakcje wysiłkowe przekładają się na przewlekłe adaptacje kości, pozostaje kluczowe dla rozwoju terapeutycznego13. Podczas gdy ostre podwyższenie CLCF1 po pojedynczych ćwiczeniach dostarcza mechanistycznych wglądów, powtarzające się ostre reakcje przez tygodnie do miesięcy mogą prowadzić do długotrwałych efektów ochronnych kości poprzez skumulowane sygnalizowanie i adaptacje komórkowe14.

Uzasadnienie badania CLCF1 w osteoimmunologicznej patofizjologii wynika z jego ustalonej roli w regulacji limfocytów B oraz uznania, że komórki B stanowią istotnych producentów zarówno RANKL, jak i osteoprotegeriny (OPG)12,13. Aktywator receptorów osi czynnik-κB ligand (RANKL)/osteoprotegeryna (OPG) pełni rolę centralnego mechanizmu regulacyjnego różnicowania się osteoklastem i resorpcji kości14,15. W przeciwieństwie do innych członków rodziny IL-6, którzy wykazali kontrolę regulacyjną nad homeostazą szkieletu poprzez modulację remodelacji kości, unikalny mechanizm podwójnej ochrony kości CLCF1 oferuje wyższy potencjał terapeutyczny 16,17,18.

Zalety tego protokołu w porównaniu z istniejącymi metodami obejmują kompleksowe podejście do badań osteoimmunologicznych ćwiczeń, obejmujące zarówno analizę korelacji klinicznych, jak i mechanistyczne badania komórkowe, dostarczające translacyjne wgląd w regulację metabolizmu kości podleganą CLCF1. Znaczenie kliniczne tego protokołu dodatkowo wzmacniają pojawiające się dowody, że poziomy CLCF1 mogą być modulowane poprzez interwencje stylu życia, co czyni go praktycznym celem terapeutycznym dla chorób kości związanych z wiekiem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół ten został zatwierdzony przez instytucjonalny komitet etyki badań (Protokół #2024-CHSD-0156) i jest zgodny z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne z wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. opieki i użytkowania zwierząt (Protokół #2024-037). Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę.

1. Zbieranie próbek klinicznych i ocena interwencji ćwiczeniowej

  1. Rekrutacja uczestników i ocena historii ćwiczeń
    1. Rekrutuj kobiety po menopauzie w wieku 55-75 lat z minimalnym rocznym okresem trwania po menopauzie.
    2. Oceń szczegółową historię ćwiczeń, w tym częstotliwość, intensywność, typ i czas trwania aktywności fizycznej w ciągu ostatnich 6 miesięcy, korzystając ze standaryzowanych kwestionariuszy aktywności fizycznej.
    3. Grupy grupowe dzielą się na grupy siedzące (< 150 min/tydzień), umiarkowanie aktywne (150-300 min/tydzień) oraz bardzo aktywne (> 300 min/tydzień) na podstawie wytycznych WHO.
    4. Przeprowadz kompleksową ocenę historii medycznej i badanie fizykalne, w tym przegląd leków i przesiewowe badania współistniejące.
    5. Uzyskaj pomiary dwuenergetycznej absorpcji rentgenowskiej (DXA) za pomocą densytometru Hologic Discovery A z oprogramowaniem APEX v4.5. Wykonuj codzienną kalibrację z fantomem kręgosłupa. Ułóż pacjenta na plecach z nogami uniesionymi na bloku pozycjonującym zgodnie z wytycznymi Międzynarodowego Towarzystwa Denzytometrii Klinicznej (ISCD).
    6. Klasyfikuj uczestników zgodnie z kryteriami osteoporozy Światowej Organizacji Zdrowia (wynik T-≤ -2,5 SD).
    7. Stosuj kryteria wykluczenia: wcześniejsza terapia antyosteoporotyczna w ciągu 12 miesięcy, leczenie immunosupresyjne, choroby metaboliczne kości, wtórna osteoporoza lub przeciwwskazania do testów ćwiczeń.
  2. Ocena odpowiedzi na CLCF1 wywołana wysiłkiem
    1. Pobieraj podstawowe próbki krwi między 8:00 a 10:00 po 12-godzinnym nocnym postzie w probówkach EDTA.
    2. Wdrożenie standardowego protokołu ćwiczeń ostrych: 45-minutowe chodzenie o umiarkowanej intensywności przy maksymalnym tętnie 65-70%. Oblicz maksymalne tętno za pomocą wzoru Karvonena (220 wiek)19. Ćwicz na bieżni zmotoryzowanej z ciągłym monitorowaniem tętna za pomocą monitora na pasie klatkowym. Utrzymuj prędkość chodzenia na poziomie 3,5-4,5 km/h z korektą nachylenia, aby osiągnąć docelowe tętno.
    3. Pobieranie próbek krwi po ćwiczeniach w godzinach 1, 4 i 24 godzin, aby ocenić kinetykę CLCF1, utrzymując stałe warunki pobierania.
    4. Przechowuj alikwoty surowicy w temperaturze -80 °C do dalszej ilościowej analizy CLCF1. Używaj Human CLCF1 ELISA Kit z zakresem detekcji od 31,2 do 2000 pg/mL. Próbki rozcieńczone w proporcji 1:2 w rozcieńczalniku testowym. Przygotuj 7-punktową krzywą standardową z dwukrotnym rozcieńczeniem szeregowym. Uruchom próbki w duplikacie. Odczyt płyt przy 450 nm z korekcją długości fali 540 nm. Akceptuj współczynnik zmienności (CV) < 20% między duplikatami.
  3. Protokół interwencji podłużnej
    1. Zaprojektuj 12-tygodniowy program ćwiczeń progresywnych z trzema sesjami tygodniowo.
    2. Pobieranie próbek krwi na początku 4, 8 i 12 tygodni do analizy trajektorii CLCF1.
    3. Ocena poprawy kondycji za pomocą testów VO2 max na poziomie wyjściowym i końcowym.
    4. Skoreluj zmiany CLCF1 z poprawą BMD mierzoną przez DXA po 12 tygodniach.
    5. Dokumentuj adaptacje treningowe, w tym tolerancję wysiłku i wzorce regeneracji.

2. Zwiększona izolacja i przetwarzanie jednojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC)

  1. Zoptymalizowana izolacja PBMC do analizy CLCF1
    1. Pobierz 20 mL próbek krwi żylnej w probówkach zawierających EDTA (5 mL EDTA na probówkę) w warunkach sterylnych.
    2. Przetwarzaj próbki w ciągu 2 godzin od pobrania dla optymalnej żywotności komórek i zachowania ekspresji CLCF1.
      1. Rozcieńczaj próbki krwi w stosunku 1:1 z fosforanową solą fizjologiczną (PBS) w temperaturze pokojowej. Wymieszaj 20 ml krwi z 20 ml PBS.
      2. Warstwa rozcieńczona krew na nośniku gradientu gęstości w stożkowych rurkach o pojemności 50 mL. Użyj medium gradientowego o gęstości 15 mL na 20 ml rozcieńczonej krwi (stosunek 1:1,33).
    3. Wirówka na 400 × g przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez hamulca.
    4. Ostrożnie aspiruj warstwę PBMC na styku plazma-Ficoll za pomocą sterylnej pipety Pasteura.
    5. Płucz komórki dwukrotnie PBS zawierającym 2% surowicy płodowej bydła (FBS) przez wirowanie w dawce 300 × g przez 10 minut.
  2. Ocena żywotności komórek i pomiar poziomu bazowego CLCF1
    1. Określ żywotność komórek metodą wykluczenia trypanowego niebieskiego (docelowa > 95% żywotności)20.
    2. Oceń ekspresję bazowego wewnątrzkomórkowego CLCF1 bezpośrednio po izolacji.
    3. Dostosuj stężenie komórek do 1× 106 komórek/mL w odpowiednim medium.
    4. Przydziel ogniwa do zastosowań dalszych produkcji lub przechowywał w ciekłym azocie. Zamroź PBMC w medium zamrażającym zawierającym 90% FBS + 10% DMSO. Używaj pojemnika do zamrażania o kontrolowanej szybkości w temperaturze od -1 °C/min do -80 °C. Przechowuj 1 ml aliquotów (5 × 106 komórek /fiolkę) w kriovialach.

3. Kompleksowa ilościowa analiza ekspresji genów

  1. Ekstrakcja i oczyszczanie RNA z uwzględnieniem specyficznych dla CLCF1 względów
    1. Lyz 1 × 106 PBMC w 1 mL odczynnika lizyzującego RNA w ciągu 1 godziny od izolacji.
    2. Dodaj 200 μL chloroformu, intensywnie wiruj i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    3. Wirować w 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać separację fazową.
    4. Przelej fazę wodną do świeżej rurki, dodaj równą objętość izopropanolu.
    5. Wytrącaj RNA przez wirowanie w 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Przemyj pellet RNA 75% etanolem, susz na powietrzu i rozpuszczaj w wodzie wolnej od nukleazy.
    7. Ocena integralności RNA za pomocą elektroforezy lub bioanalizatora agarozowego żelu (docelowy RIN >7.0).
  2. Transkrypcja odwrotna i ilościowa PCR z zaktualizowanymi zestawami primerów
    1. Ilościowo określ stężenie RNA za pomocą analizy spektrofotometrycznej (cel A260/A280 stosunek 1,8-2,2).
    2. Wykonaj transkrypcję odwrotną z użyciem 1 μg całkowitego RNA z zestawem odczynników do transkrypcji odwrotnej.
    3. Przygotuj reakcje qPCR: Przygotuj reakcje 20 μL zawierające 10 μL Master Mix, 0,8 μL każdego startera (10 μM materiału, końcowe 400 nM), 2 μL szablonu cDNA (50 ng), 6,4 μL wody wolnej od nukleazy. Zrób trzykopie. Używaj systemu PCR w czasie rzeczywistym.
    4. Używaj zweryfikowanych sekwencji zapór:
      1. CLCF1 do przodu: 5'-CCTCCTGCTTCTTGCCTACC-3',
        reverse: 5'-TGCCACCATGTGTTTTTTTCCT-3'
      2. CRLF1 do przodu: 5'-TGAAGCTCATCCTGCAGTTC-3',
        wsteczna zmiana: 5'-CAGCATCTCCTCCTTGATGC-3'
      3. STAT1 napastnik: 5'-CAGCTTCAGCAGCTTGACTC-3',
        reverse: 5'-AAGGTCAGCGATGTCTTCAG-3'
      4. STAT3 napastnik: 5'-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3',
        reverse: 5'-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3'
    5. Wykonaj protokół qPCR: 95 °C przez 10 minut, następnie 40 cykli 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę.
    6. Analizuj wyniki metodą 2(-ΔΔCt) z normalizacją β-aktyny21.
  3. Analiza panelu genów reakcja na ćwiczenia
    1. Uwzględnić geny reagujące na ćwiczenia: IL-6, TNF-α, IL-1β, BDNF, IGF-1 oraz miostatynę.
    2. Używaj zweryfikowanych sekwencji zapór:
      1. IL-6 napastnik: 5'-AGCCACTCACCTCTTCAGAAC-3',
        reverse: 5'-GCCTTTGTGCTGTGTTTCACAC-3';
      2. TNF-α napastnik: 5'-CCCAGGGACCTCTCTCTAATC-3',
        rewers: 5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3';
      3. IL-1β do przodu: 5'-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3',
        reverse: 5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3';
      4. BDNF do przodu: 5'-TAACATGGCTGCGGTGTGTGT-3',
        rewers: 5'-CGAGTGGGTCAGCCGGCAG-3';
      5. IGF-1 forward: 5'-GCTCTTCAGTGTGTGTGGA-3',
        rewers: 5'-GCCTCCTTAGATCACAGCTCC-3';
      6. Myostatyna do przodu: 5'-AGTGACGGGCTCTTTGGAAGA-3',
        reverse: 5'-GTTTCAGAGGCCGGTCAAGT-3'.
    3. Koreluj zmiany CLCF1 wywołane wysiłkiem z innymi wzorcami ekspresji miokin.
    4. Oceń współczynniki współekspresji CLCF1/CRLF1 jako wskaźników funkcjonalnego tworzenia kompleksu cytokinowego.

4. Zwiększona analiza ekspresji białek z fokusem szlaku STAT

  1. Ekstrakcja białek i ilościowa analiza do analizy STAT
    1. Lyse PBMC w buforze lizowym (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% deoksycholatu sodu, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0) uzupełnione koktajlami inhibitorów proteazy i fosfatazy.
    2. Dodaj specyficzne inhibitory fosfatazy: ortowanadan sodu (1 mM) i fluorek sodu (50 mM) tuż przed użyciem.
    3. Inkubuj lizaty na lodzie przez 30 minut, z okresowym wirowaniem o średniej prędkości co 10 minut.
    4. Wirówka w 12 000 × g przez 15 minut w 4 °C, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.
    5. Ilościowo określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda lub metody BCA22.
    6. Dostosuj stężenia białek do 2 μg/μL w buforze próbkowym i przechowywaj w temperaturze -80 °C do dalszej analizy do zastosowań western blotting.
  2. Kompleksowa analiza western blot z koncentracją na sygnalizacji STAT
    1. Przygotuj 10 mL żeli SDS-PAGE o stężeniu 10% przy użyciu standardowych roztworów akryloamidu/bisakrylamidu.
    2. Załaduj 20 μg białka na tor wraz z wstępnie barwionymi markerami masy cząsteczkowej i rozwarstwiaj przy napięciu 120 V przez 90 minut.
    3. Przenosi białka do membran PVDF pod napięciem 100 V przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, używając buforu transferowego (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 20% metanolu).
    4. Błony blokowe z 50 mL 5% beztłuszczowego mleka suchego w soli tris-buforowanej z 0,1% Tween-20 (TBST).
    5. Inkubować z przeciwciałami pierwotnymi przez noc w temperaturze 4 °C: Anty-CLCF1 (1:1 000); Anti-CRLF1 (1:1 000); Anty-OPG (1:1 000); Anti-RANKL (1:1 000); Anti-JAK2 (1:1 000); Antyfosfo-JAK2 (Tyr1007/1008, 1:1 000); Anti-STAT1 (1:1 000); Antyfosfo-STAT1 (Tyr701, 1:1 000); Anti-STAT3 (1:1 000); Antyfosfo-STAT3 (Tyr705, 1:1 000); Anty-β-aktyna (1:1 000)
    6. Myj membrany 3 razy przez 10 minut każdy, używając 15 ml TBST. Inkubować odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    7. Wykrywanie pasm białkowych za pomocą podłoża o zwiększonej chemiluminescencji. Obraz za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego z automatyczną optymalizacją ekspozycji. Ilościowo za pomocą analizy densytometrycznej za pomocą narzędzia ImageJ v1.53 do analizy żelowej.
  3. Analiza podwójnej ścieżki STAT1/STAT3
    1. Oblicz stosunki fosfo-STAT1/całkowity STAT1 oraz fosfo-STAT3/całkowity STAT3 za pomocą oprogramowania ImageJ/Fiji w wersji 1.54f.
    2. Oceń równowagę aktywacji STAT1/STAT3 jako wskaźnik aktywności funkcjonalnej CLCF1.
    3. Koreluj wzorce aktywacji STAT z stosunkiem ekspresji RANKL/OPG.
    4. Oceń fosforylację STAT1/STAT3 za pomocą Western blot w 0, 15, 30, 60, 120 i 240 minutach po leczeniu CLCF1. Normalizuj fosfobiałko do całkowitej wartości białka za pomocą densytometrii.

5. Zaawansowany knockout genu pośredniczony przez CRISPR/Cas9 z walidacją

  1. Ulepszona konstrukcja lentiwirusowych wektorów
    1. Projektuj pojedyncze RNA (sgRNA) celujące w sekwencję genu CLCF1:
      TTGAAGTCTGGCTCGTTGAA-3'.
    2. Uwzględnij dodatkowe sekwencje sgRNA dla poprawy efektywności knockoutu:
      GCTTGAACGAGCCAGACTTC-3'.
    3. Klonowanie sgRNA do wektora lentiwirusowego przy użyciu standardowych technik klonowania molekularnego.
    4. Weryfikuj integralność konstruktu poprzez analizę sekwencjonowania DNA.
    5. Oceń efektywność cięcia sgRNA zapomocą testu T7 I I assay.
    6. Uwzględnić walidację specyficzności szlaków za pomocą inhibitorów: AG490 (JAK2, 50 μM), fludarabina (STAT1, 10 μM) oraz Stattic (STAT3, 5 μM).
    7. Przeprowadz eksperymenty ratunkowe z użyciem konstytutywnie aktywnych konstrukcji STAT w celu potwierdzenia konieczności stosowania szlaku.
  2. Zoptymalizowany protokół transdukcji lentiwirusowej
    1. Hodować komórki Raji w podłożu RPMI-1640 (500 mL) z dodatkiem 10% FBS. Wszystkie hodowle komórkowe utrzymuj w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z zawartością 5%CO2. Premia preequilibre hodowla przez co najmniej 30 minut przed użyciem.
    2. Przedzabiegaj komórki polibrenem (8 μg/mL), aby zwiększyć efektywność transdukcji.
    3. Wytwarzaj lentiwirusa za pomocą komórek HEK293T z plazmidami opakowanymi i otoczkowymi za pomocą transfekcji fosforanu wapnia. Określ miano według p24 ELISA (> wymagane 10-8 TU/mL). Postępuj zgodnie z procedurami zabezpieczania BSL-223.
    4. Transdukuj komórki lentiwirusem przy wielokrotności zakażeń (MOI) 100. Zmiana medium 24 godziny po transdukcji. Wybierać transdukowane komórki przy użyciu puromycyny (4 μg/mL) przez 7 dni, następnie amplifikować obszar 500 bp obejmujący docelowe miejsce przy użyciu następujących warunków PCR: początkowa denaturacja w 95 °C przez 3 minuty, następnie 35 cykli denaturacji w 95 °C przez 30 s, wyżarzanie w 60 °C przez 30 s, oraz przedłużenie przy 72 °C przez 30 s, z końcowym wydłużeniem w 72 °C przez 5 minut. W testie endonukleazy T7 należy denaturować i ponownie annealować produkty PCR, trawić z endonukleazą T7E1 przez 30 minut w 37 °C, a następnie analizować produkty na żelu agarozowym o stężeniu 2%.
    5. Zweryfikować skuteczność nokautu genu za pomocą western blottingu i sekwencjonowania Sangera24,25.
    6. Wykonaj analizę poza celem z wykorzystaniem metodologii GUIDE-seq lub podobnejmetody 26.
      UWAGA: Najnowsze dowody wskazują, że efektywność wydzielania CLCF1 wymaga współekspresji z białkiem chaperonu CRLF1. Rozważ podwójne metody nokautu dla pełnej funkcjonalnej ablacji27.

6. Kompleksowy system kokultury z mimetyką ćwiczeń

UWAGA: Do weryfikacji translacyjnej dostosuj się do modeli myszy po ovariektomii, podając rhCLCF1 w dawce 10 μg/kg dożywotnie przez 4 tygodnie, oceniając BMD za pomocą mikro-CT.

  1. Zaawansowany układ kokultury Raji-MG-63
    1. Nasiona komórek osteoblastowych MG-63 w dolnych komorach płyt z 24 dołkami o gęstości 2 × 104 komórek/dołek w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5%CO2 i 95% wilgotności. Przedrównoważony nośnik w inkubatorze na 30 minut przed użyciem. Dla lepszego tłumaczenia zastąpij pierwotnymi ludzkimi osteoblastami (gęstość 1 × 104/well) pochodzące ze źródeł komercyjnych.
    2. Umieść wkłady membranowe o rozmiarze poru 0,4 μm w dołach zawierających komórki MG-63.
    3. Komórki Raji (dzikie typy, CLCF1-knockout lub CLCF1-nadekspresyjne) w górnych komorach z gęstością 1 × 105 komórek/dołek.
    4. Utrzymywanie współhodowli w pełnym medium RPMI-1640 (2 mL w dolnej komorze, 1,5 mL w górnej komorze) przez określone okresy eksperymentalne (7, 14, 21 dni) w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
    5. Włącz grupy leczenia rekombinowanym CLCF1 (5-10 ng/mL) w celu oceny zależności dawka-odpowiedź.
  2. Protokół leczenia ćwiczeń mimetycznych CLCF1
    1. Leczyć systemy współhodowli fizjologicznymi stężeniami rekombinowanego CLCF1 (5-10 ng/mL) na podstawie poziomów wywołanych wysiłkiem.
    2. Zastosuj pulsacyjny schemat leczenia CLCF1: Stosuj CLCF1 przez 2-godzinne impulsy o 0, 8 i 16 godzin pierwszego dnia, następnie nałóż ciągłą ekspozycję przez 24 godziny, a następnie powtórz cykl. Całkowity czas trwania leczenia: 7 dni z 9 impulsami łącznie.
    3. Oceniaj efekty zależne od czasu po 1 godzinie, 4 godzinie, 24 godzinach i 7 dniach po leczeniu.
    4. Monitoruj kinetykę fosforylacji STAT1/STAT3 w obu populacjach komórek za pomocą Western blot w 0, 15, 30, 60 min. Komórki lizy w buforze (500 μL) z inhibitorami normalizują się do całkowitej wartości STAT1/3 i β-aktyny.
  3. Rozszerzona ocena różnicowania osteogennego
    1. Indukować różnicowanie osteogenne za pomocą standardowego pośrodku osteogenowego zawierającego kwas askorbinowy (50 μg/mL), β-glicerofosforan (10 mM) oraz deksametazon (10 nM). Zmieniaj podłoże osteogenne co 3 dni (2 mL dolnej komory, 1,5 mL górnej komory). Przygotuj świeży roztwór kwasu askorbinowego na każdą zmianę; β-glicerofosforan i deksametazon pozostają stabilne.
    2. Ocenić aktywność fosfatazy alkalicznej (ALP) za pomocą testu enzymów kolorymetrycznych w dniach 7, 14 i 21,28. Użyj objętości ekstrakcyjnej 500 μL. Odczyt na 405 nm. Normalizuj do całkowitej zawartości białka. Oczekiwany zakres kolorów: jasnożółty (niski) do ciemnożółty (wysoki).
    3. Oceń depozycji wapnia za pomocą barwienia Alizarin Red S i ilościowego określenia w dniu 21. Ekstrakt zawierający 500 μL chlorku cetylopirydyniu, odczytany na 540 nm, oczekiwany zakres kolorów: jasnoróżowy (niska mineralizacja) do ciemnoczerwony (wysoka mineralizacja).
    4. Ilościowo określ mineralizację, mierząc absorbancję przy 540 nm po ekstrakcji chlorku cetylopirydyniu.
    5. Przeanalizuj ekspresję genów osteogennych: RUNX2, ALP, COL1A1, OCN oraz OPG z protokołami qPCR opisanymi w kroku 3.2.
    6. Ocenić markery związane z osteoklastem: TRAP, katepsinę K i RANKL w komórkach MG-63.

7. Zaawansowana analiza statystyczna i interpretacja danych

  1. Kompleksowa metodologia statystyczna
    1. Wykonaj test normalności za pomocą testu Shapiro-Wilka dla wszystkich zmiennych ciągłych29. Stosuj testy nieparametryczne, gdy założenia normalności są naruszane (p < 0,05).
    2. Zastosuj test Mann-Whitney U dla porównań nieparametrycznych między grupami30.
    3. Przeprowadz analizę korelacji Spearmana dla badań asocjacyjnych między poziomami CLCF1 a parametrami klinicznymi31.
    4. Wykonaj analizę wielokrotnej regresji w celu oceny niezależnych predyktorów BMD.
    5. Stosuj powtarzane pomiary ANOVA do analizy czasu i przebiegu ćwiczeń32.
    6. Zastosuj korekcję Bonferroniego dla wielu porównań33.
    7. Ustaw próg istotności statystycznej na p < 0,05 dla wszystkich analiz.
  2. Ulepszona prezentacja i analiza danych
    1. Dane ciągłe przedstawiamy jako średnią ± odchyleniu standardowym lub medianie z zakresem interkwartylowym.
    2. Stwórz wykresy korelacji ekspresji CLCF1 względem BMD, liczby limfocytów i parametrów ćwiczeń, używając GraphPad Prism v9 do statystyk, ImageJ v1.53 do densytometrii. Nie są potrzebne niestandardowe skrypty. Generuj ROC za pomocą wbudowanego narzędzia Prism; korelacje za pomocą Spearmana w Prism.
    3. Generuj wykresy czasowo-kursowe dla kinetyki odpowiedzi CLCF1 wywołanej przez ćwiczenia.
    4. Opracować krzywe charakterystyki operacyjnej odbiorcy (ROC) dla CLCF1 jako biomarkera osteoporozy.
      UWAGA: Reprezentatywne obrazy western blot zostały stworzone za pomocą ilościowej analizy densytometrycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wdrożenie tego protokołu skutecznie pokazuje rolę regulacyjną CLCF1 w metabolizmie kości podleganym przez immunizm, wykorzystując różne podejścia eksperymentalne. Badania kliniczne wykazały istotne obniżenie ekspresji CLCF1 u pacjentów z PMOP w porównaniu do zdrowych grup kontrolnych, co pokazano na Rysunku 1A, ilościowa analiza PCR komórek monojądrowych krwi obwodowej wykazała, że względne poziomy mRNA CLCF1 były wyraźnie obniżone w grupie PMOP (n = 109) w p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół stanowi kompleksowe ramy metodologiczne do badania roli CLCF1 jako mediatora ochrony kości wywołanego wysiłkiem poprzez systematyczną analizę osi RANKL/OPG. Najnowsze przełomowe badania wskazały CLCF1 jako czynnik wywołany wysiłkiem, który zwalcza związany z wiekiem spadek układu mięśniowo-szkieletowego, stawiając go jako centralnego mediatora ochrony kości wywołanej wysiłkiemfizycznym 34,35,36. Ten rozsze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

Autorzy dziękują uczestnikom, którzy zgłosili się jako wolontariusze do tego badania, oraz personelowi klinicznemu Centralnego Szpitala Afiliowanego przy Shandong First Medical University za pomoc w rekrutacji pacjentów i pobieraniu próbek. Dziękujemy technikom laboratoryjnym za wsparcie przy hodowli komórkowej i eksperymentach z biologii molekularnej. H.Z. wymyślił i zaprojektował badanie, przeprowadził eksperymenty, przeanalizował dane i napisał rękopis. H.L. przyczynił się do projektowania eksperymentów, zbierania danych i rewizji artykułów. Y.S. nadzorował projekt, udzielał krytycznych opinii i redagował rękopis. Wszyscy autorzy przejrzeli i zatwierdzili ostateczny manuskrypt do zgłoszenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
kultury komórkowej media i Odczynniki
Dimetylsulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650Purpose_Application:  Komponent podłoża kriokonserwacyjnego
Specifications_Comments: Klasa biologii molekularnej, filtrowany sterylnie
Medium DMEMThermo Fisher Scientific11965092Purpose_Application:  MG-63 pożywka hodowla
Specifications_Comments: Formułowanie wysokoglukozowe z L-glutaminą
Serum bydła płodu (FBS)Thermo Fisher Scientific16000044Purpose_Application:  Suplement hodowli komórkowej (inaktywowany przez ciepło)
Specifications_Comments: Inaktywowany termicznie w 56Â ° C przez 30 minut
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15140122Purpose_Application:  Suplement antybiotykowy do hodowli sterylnej
Specifications_Comments: 100x zapas, końcowe stężenie 1%
Polibren (bromek heksadymetaryn)Santa Cruz BiotechnologySC-134220Purpose_Application:  Lentiwirusowy wzmacniacz transdukcji
Specifications_Comments: 8 & Icirc; ¼ koncentracja robocza g/mL
Dihydrochlorek puromycynyInvivoGenANT-PR-1Purpose_Application:  Antybiotyk selekcyjny dla komórek transdukcyjnych
Specifications_Comments: 4 & Icirc; ¼ g/mL selekcyjne stężenie przez 7 dni
RPMI-1640 średniThermo Fisher Scientific11875093Purpose_Application:  Raji B-pożywka hodowla
Specifications_Comments: Preferowane z L-glutaminą, bez fenolu czerwonego
Roztwór Trypan BlueThermo Fisher Scientific15250061Purpose_Application:  Ocena żywotności komórek
Specifications_Comments: 0,4% roztwór do testu wykluczającego
Kontener zamrażający o kontrolowanej szybkościThermo Fisher Scientific5100-0001Purpose_Application:  Zamrożenie ogniw o kontrolowanej częstotliwości (-1Â ° C/min)
Specifications_Comments: Mr. Frosty lub odpowiednik dla -1Â ° Chłodzenie w c/min
Probówki do pobierania krwi EDTABD Biosciences366643Purpose_Application:  Pobieranie krwi żylnej z antykoagulantem
Specifications_Comments: pojemność 10-20 mL, fioletowe rurki na górze
Gradient gęstości Ficoll-Paque PLUSCytiva (GE Healthcare)17144003Purpose_Application:  Izolacja PBMC za pomocą wirowania gęstości
Specifications_Comments: Sterylne, endotoksynowe testowane pod kątem separacji komórek
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)Thermo Fisher Scientific14190144Purpose_Application:  Pufor do mycia komórek i rozcieńczania Specifications_Comments: Sterylny, hodowla komórkowa
Ekstrakcja i ekstracja RNA qPCR
Chloroform (klasa ACS)Sigma-AldrichC2432Purpose_Application:  Separacja faz w ekstrakcji RNA
Specifications_Comments: Klasa odczynników ACS, & acirc; ‰ ¥ 99% czystości
Etanol (75%, stopień molekularny)Sigma-AldrichE7023Purpose_Application:  Pranie granulek RNA
Specifications_Comments: Poziom biologii molekularnej, przygotować świeże
Izopropanol (Molecular Grade)Sigma-AldrichI9516Purpose_Application:  Wydzielanie RNA
Specifications_Comments: Stopień biologii molekularnej â ‰ ¥ 99,5% czystości
Woda wolna od nukleazyThermo Fisher ScientificAM9930Purpose_Application:  Przygotowanie reakcji PCR
Specifications_Comments: Wolne od DNazy/RNazy, testowane do zastosowań PCR
Optyczna folia klejącaThermo Fisher Scientific4311971Purpose_Application:  Optyczne uszczelnianie płytek qPCR
Specifications_Comments: Jakość optyczna dla zastosowań qPCR
Płytki PCR (96-dołkowe)Thermo Fisher ScientificN8010560Purpose_Application:  Format 96-dołkowy dla wysokoprzepustowego qPCR
Specifications_Comments: Biały, przezroczysty dno do detekcji optycznej
Taśmy rurkowe PCRThermo Fisher ScientificAB0451Purpose_Application:  Reakcje PCR o małej objętości
Specifications_Comments: Paski 8-rurkowe z indywidualnymi kapslami
PrimeScript RT Reagent KitTakara BioRR037APurpose_Application:  Odwrotna transkrypcja RNA do cDNA
Specifications_Comments: Z gDNA Eraser do usuwania genomowego
SYBR Green Master MixBiosystemy stosowane4309155Purpose_Application:  Amplifikacja i wykrywanie PCR w czasie rzeczywistym
Specifications_Comments: Z barwnikiem referencyjnym ROX do normalizacji
Reagent TRIzol (liza RNA)Thermo Fisher Scientific15596026Purpose_Application:  Liza komórek i ekstrakcja RNA
Specifications_Comments: Przechowywać w 4Â ° C, użyj w ciągu 6 miesięcy
Protein - Western Blot
Akryloamid/bisakrylamid (29:1)Bio-Rad1610146Purpose_Application:  SDS-PAGE polimeryzacja żelowa
Specifications_Comments: 30% roztwór akryloamidowy
Zestaw do testowania białek BCAThermo Fisher Scientific23225Purpose_Application:  Ilościowa analiza stężenia białka
Specifications_Comments: Zgodny z redukcją do dokładnej ilościowej identyfikacji
Podłoże o zwiększonej chemiluminescencji (ECL)Thermo Fisher Scientific32106Purpose_Application:  Wykrywanie białek chemiluminescencyjnych
Specifications_Comments: Wykrywanie wrażliwości femtogramu
Mleko suche bez tłuszczuLaboratorium naukowe170-6404Purpose_Application:  Środek blokujący zachodnią plamę
Specifications_Comments: Stopień blokujący, niskie tło
Koktajl inhibitorów fosfatazyRoche Applied Science4906845001Purpose_Application:  Zapobieganie defosforylacji białek
Specifications_Comments: Zawiera kwas okadainowy i kalikulinę A
Drabinka białkowa z prebarwioną barwąBio-Rad1610394Purpose_Application:  Standardy odniesienia masy cząsteczkowej
Specifications_Comments: zakres 10-250 kDa z 11 pasmami
Koktajl inhibitorów proteazyRoche Applied Science11697498001Purpose_Application:  Zapobieganie degradacji białek podczas lizy
Specifications_Comments: Wolne od EDTA dla fosfataz zależnych od metali
Błony PVDF (0,45 & Icirc; ¼ m)Millipore SigmaIPVH00010Purpose_Application:  Błona transferowa białek (0,45 & Icirc; ¼ m pore) Specifications_Comments: tło o niskiej fluorescencji
Bufor lizy RIPATechnologia sygnalizacji komórkowej9806SPurpose_Application:  Ekstrakcja białek całokomórkowych
Specifications_Comments: gotowy do użycia bufor lizy z detergentami
Bufor ładowania próbek (4X)Bio-Rad1610747Purpose_Application:  Przygotowanie próbki białka do SDS-PAGE
Specifications_Comments: Ładowanie barwnika z Î ²-merkaptoetanol
SDS-PAGE Bufor DziałającyBio-Rad1610732Purpose_Application:  Elektroforeza białek
Specifications_Comments: Układ buforowy Tris-glycine-SDS
Fluorek soduSigma-Aldrich201154Purpose_Application:  Dodatkowe hamowanie fosfatazy
Specifications_Comments: stężenie robocze 50 mM
Ortowanadat soduSigma-AldrichS6508Purpose_Application:  Fosforylacja JAK2/STAT – konserwacja
Specifications_Comments: 1 mM stężenia roboczego, przygotować świeże
Koncentrat buforu transferowegoBio-Rad1704156Purpose_Application:  Półsuchy transfer białka< b/> Specifications_Comments: 10x koncentrat, rozcieńczony przed użyciem
Tris-Buffered Soline z Tween-20 (TBST)Technologia sygnalizacji komórkowej9997SPurpose_Application:  Mycie błony i rozcieńczanie przeciwciał
Specifications_Comments: 0,1% Tween-20, pH 7,6
CRISPR/Edycja genów
Zestaw transfekcyjny z fosforanu wapniaPromegaE1200Purpose_Application:  Transfekcja DNA do komórek opakowań
Specifications_Comments: Wysoka wydajność transfekcji w produkcji lentiwirusów
Zestaw do ekstrakcji żelu DNAQiagen28706Purpose_Application:  Oczyszczanie produktów PCR do sekwencjonowania
Specifications_Comments: System oczyszczania oparty na kolumnach
GV371 Wektor lentiwirusowyGeneChem Co., LtdGV371Purpose_Application:  Ekspresja CRISPR/Cas9 dla knockoutu genu
Specifications_Comments: gotowy do użycia system lentiwirusowy CRISPR/Cas9
HEK293T Linia komórkowaATCCCRL-3216Purpose_Application:  Linia komórek opakowań lentiwirusowych
Specifications_Comments: Wysoce transfektywna linia komórek opakowań
Usługa sekwencjonowania SangeraMacrogen Inc.ZwyczajPurpose_Application:  Walidacja knockout i analiza poza celem
Specifications_Comments: Standardowe sekwencjonowanie z niestandardowymi zapalnikami
T7 Endonukleaza INew England BiolabsM0302SPurpose_Application:  Walidacja efektywności cięcia CRISPR
Specifications_Comments: Specyficzna dla niedopasowania endonukleaza do walidacji CRISPR
ELISA & ELISA & Immunoassay
Tablice ELISA (96-dołkowe, płaskie dno)Corning3590Purpose_Application:  Reakcja podłoża ELISA
Specifications_Comments: Wysoko wiążąca, płaska dno dla ELISA
Human CLCF1 DuoSet ELISAR& D SystemsDY1234Purpose_Application:  Ilościowa ilościowość białka CLCF1 (31,2-2000 pg/mL)
Specifications_Comments: Zakres detekcji: 31,2-2000 pg/mL, CV & 10%
P24 Zestaw ELISA (miano lentiwirusowe)ZeptoMetrix Corporation801111Purpose_Application:  Określanie miarza lentiwirusowego
Specifications_Comments: Do określania miarza lentiwirusowego (>10â ¸ TU/mL)
Testy funkcjonalne
Zestaw do barwienia Alizarin Red SSigma-AldrichA5533Purpose_Application:  Wizualizacja osadzania wapnia
Specifications_Comments: roztwór 2% w wodzie destylowanej, pH 4,1-4,3
Zestaw do aktywności fosfatazy alkalicznejAbcamab83369Purpose_Application:  Pomiar aktywności enzymatycznej ALP
Specifications_Comments: Test kolorymetryczny, odczytany na 405 nm
Kwas askorbinowy (L-askorbinowy)Sigma-AldrichA4544Purpose_Application:  Składnik ośrodka osteogennego
Specifications_Comments: 50 & Icirc; ¼ g/mL końcowe stężenie
Chlorek cetylopyrydyniuSigma-AldrichC9002Purpose_Application:  Ekstrakcja Alizarin Red S do ilościowej
Specifications_Comments: 10% roztwór do ekstrakcji barwnika
DeksametazonSigma-AldrichD4902Purpose_Application:  Składnik ośrodka osteogennego
Specifications_Comments: 10 nM końcowe stężenie
Î ²-GlicerfosforanSigma-AldrichG9422Purpose_Application:  Składnik medium osteogennego
Specifications_Comments: 10 mM końcowe stężenie
Ośrodek różnicowania osteogenicznegoPromoCellC-28010Purpose_Application:  Indukcja różnicowania osteoblastów
Specifications_Comments: gotowe do użycia kompletne ośrodek osteogenny
Wkładki do hodowli komórkowych transwell (0,4 & iric; ¼ m)Corning3470Purpose_Application:  System kokultury z 0.4 & Icirc; ¼ Separacja m
Specifications_Comments: Membrana z polietylen-tereftalianu, sterylna
Equipment - Główne instrumenty
Wirówka (wysokoprędkościowe, chłodzone)Eppendorf5430RPurpose_Application:  Przetwarzanie próbek i separacja komórek
Specifications_Comments: Chłodzona, maksymalnie 30 000 x g
System obrazowania chemiluminescencyjnegoLaboratoria Bio-Rad12003154Purpose_Application:  Obrazowanie Western blot i ilościowość
Specifications_Comments: Dokumentacja żelowa i obrazowanie Western blot
Inkubator CO2 (nawilżany)Thermo Fisher Scientific51030287Purpose_Application:  Utrzymanie hodowli komórkowej (37Â ° C, 5% CO2
Specifications_Comments: Potrójny gaz (CO2/O2/N2), kontrola wilgotności
Monitor tętna (pas na klatkę piersiową)Polar ElectroH10Purpose_Application:  Ciągłe monitorowanie tętna
Specifications_Comments: łączność Bluetooth & Acirc; ± Dokładność 1 bpm
Hologic Discovery Skaner DXAHologic Inc.Discovery APurpose_Application:  Pomiar gęstości mineralnej kości< br/> Specifications_Comments: W oprogramowaniu APEX v4.5 wymagana jest codzienna kontrola jakości
Czytnik mikropłyt (wielomodowy)BioTek InstrumentsSynergia H1Purpose_Application:  Odczyt płytek ELISA i pomiar absorpcji
Specifications_Comments: UV-Vis, fluorescencja, detekcja luminescencji
Bieżnia zmotoryzowanaLife Fitness95TiPurpose_Application:  Standaryzowana interwencja ćwiczeń
Specifications_Comments: Zmienna prędkość 0-16 km/h, nachylenie 0-15%
System PCR w czasie rzeczywistym (CFX96 lub odpowiednik)Laboratoria Bio-Rad1855195Purpose_Application:  Amplifikacja i detekcja PCR w czasie rzeczywistym
Specifications_Comments: blok 96-dołkowy, zdolny do gradientu
Oprogramowanie & Oprogramowanie Narzędzia analityczne
APEX Software v4.5 (Analiza DXA)Hologic Inc.v4.5Purpose_Application:  Analiza skanu DXA i obliczenia BMD
Specifications_Comments: Analiza BMD z bazą referencyjną
Bio-Rad CFX MaestroLaboratoria Bio-RadCFX MaestroPurpose_Application:  analiza danych qPCR i determinacja Ct
Specifications_Comments: Analiza PCR w czasie rzeczywistym i eksport danych
GraphPad Prism v9.0Oprogramowanie GraphPadv9.0Purpose_Application:  Analiza statystyczna i generowanie grafów
Specifications_Comments: Oprogramowanie statystyczne z generowaniem grafów
ImageJ/Fiji v1.53Narodowe Instytuty Zdrowiav1.53Purpose_Application:  Densytometria Western blot i analiza obrazów
Specifications_Comments: Analiza obrazów z użyciem narzędzi pomiarowych
Microsoft Excel 365Microsoft Corporation365Purpose_Application:  Organizacja danych i podstawowe obliczenia
Specifications_Comments: Organizacja danych i podstawowe funkcje statystyczne
przedmioty zużywalne i Plastik
Rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mLEppendorf22363204Purpose_Application:  Przechowywanie i przetwarzanie próbek w małych objętościach
Specifications_Comments: Wolne od DNazy/RNazy, niskie wiązanie
Stożkowe lampy 15 mLCorning430766Purpose_Application:  Przetwarzanie próbek o średniej objętości
Specifications_Comments: polipropylen, stopniowany, z nasadkami
Płytki hodowli komórkowych z 24 dołkamiCorning3524Purpose_Application:  Kohodowla i montaż testu funkcjonalnego
Specifications_Comments: Obróbka posiewką tkankową, płaskie dno
Stożkowe lampy 50 mLCorning430829Purpose_Application:  Pobieranie i przetwarzanie próbek dużych objętości
Specifications_Comments: polipropylen, stopniowany, z kapsułami
Krioviale (1 mL)Thermo Fisher Scientific375418Purpose_Application:  Długoterminowe przechowywanie komórek i próbek w -80 stopniach; ° C
Specifications_Comments: Zewnętrzny gwint, uszczelka O-ring, -196Â ° Ocena C
Pipety Pasteur (sterylne)Fisher Scientific13-678-20APurpose_Application:  Pobieranie i transfer próbek sterylnych
Specifications_Comments: Indywidualnie pakowane, sterylne

Bibliografia

  1. Rachner, T. D., Khosla, S., Hofbauer, L. C. Osteoporosis: now and the future. Lancet. 377 (9773), 1276-1287 (2011).
  2. Chen, X., et al. Association of cardiotrophin-like cytokine factor 1 levels in peripheral blood mononuclear cells with bone mineral density and osteoporosis in postmenopausal women. BMC Musculoskelet Disord. 22 (1), 62(2021).
  3. Ilesanmi-Oyelere, B. L., et al. Inflammatory markers and bone health in postmenopausal women: a cross-sectional overview. Immun Ageing. 16, 15(2019).
  4. Ahn, N., Kim, K. Effects of 12-week exercise training on osteocalcin, high-sensitivity C-reactive protein concentrations, and insulin resistance in elderly females with osteoporosis. J Phys Ther Sci. 28 (8), 2227-2231 (2016).
  5. Graves, D. T., Li, J., Cochran, D. L. Inflammation and uncoupling as mechanisms of periodontal bone loss. J Dent Res. 90 (2), 143-153 (2011).
  6. Kang, J. S., et al. Exercise-induced CLCF1 attenuates age-related muscle and bone decline in mice. Nat Commun. 16 (1), 4743(2025).
  7. Sims, N. A. Cardiotrophin-like cytokine factor 1 (CLCF1) and neuropoietin (NP) signalling and their roles in development, adulthood, cancer and degenerative disorders. Cytokine Growth Factor Rev. 26 (5), 517-522 (2015).
  8. Oliveira, M. C., Vullings, J., van de Loo, F. A. J. Osteoporosis and osteoarthritis are two sides of the same coin paid for obesity. Nutrition. 70, 110486(2020).
  9. Yokota, S., et al. Cardiotrophin-like cytokine factor 1 alleviates bone loss in osteoporosis mouse models by suppressing osteoclast differentiation through activating interferon signaling and repressing the nuclear factor-κB signaling pathway. Bone. 153, 116140(2021).
  10. Ponzetti, M., Rucci, N. Updates on osteoimmunology: what's new on the cross-talk between bone and immune system. Front Endocrinol (Lausanne). 10, 236(2019).
  11. Larsen, J. V., et al. Cytokine-like factor 1, an essential facilitator of cardiotrophin-like cytokine:ciliary neurotrophic factor receptor α signaling and sorLA-mediated turnover. Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).
  12. de Vries, T. J., et al. What are the peripheral blood determinants for increased osteoclast formation in the various inflammatory diseases associated with bone loss. Front Immunol. 10, 505(2019).
  13. Weitzmann, M. N. The role of inflammatory cytokines, the RANKL/OPG axis, and the immunoskeletal interface in physiological bone turnover and osteoporosis. Scientifica (Cairo). 2013, 125705(2013).
  14. Srivastava, R. K., Dar, H. Y., Mishra, P. K. Immunoporosis: immunology of osteoporosis-role of T cells. Front Immunol. 9, 657(2018).
  15. Ming, J., Cronin, S. J. F., Penninger, J. M. Targeting the RANKL/RANK/OPG axis for cancer therapy. Front Oncol. 10, 1283(2020).
  16. Sobacchi, C., Menale, C., Villa, A. The RANKL-RANK axis: a bone to thymus round trip. Front Immunol. 10, 629(2019).
  17. Wang, T., He, C. TNF-α and IL-6: the link between immune and bone system. Curr Drug Targets. 21 (3), 213-227 (2020).
  18. Jones, S. A., Jenkins, B. J. Recent insights into targeting the IL-6 cytokine family in inflammatory diseases and cancer. Nat Rev Immunol. 18 (12), 773-789 (2018).
  19. Villafaina, S., Biehl-Printes, C., Parraca, J. A., de Oliveira Brauner, F., Tomas-Carus, P. What mathematical models are accurate for prescribing aerobic exercise in women with fibromyalgia. Biology (Basel). 11 (5), 704(2022).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  21. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(−ΔΔC(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  22. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (4), 102269(2020).
  23. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Sci Rep. 8 (1), 888(2018).
  24. Mousavi Kahaki, S. A., Ebrahimzadeh, N., Fahimi, H., Moshiri, A. Development of an optimized protocol for generating knockout cancer cell lines using the CRISPR/Cas9 system, with emphasis on transient transfection. PLoS One. 19 (11), e0310368(2024).
  25. Eren, K., Taktakoğlu, N., Pirim, I. DNA sequencing methods: from past to present. Eurasian J Med. 54 (Suppl1), 47-56 (2022).
  26. Wienert, B., Wyman, S. K., Yeh, C. D., Conklin, B. R., Corn, J. E. CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq. Nat Protoc. 15 (5), 1775-1799 (2020).
  27. Crisponi, L., Buers, I., Rutsch, F. CRLF1 and CLCF1 in development, health and disease. Int J Mol Sci. 23 (2), 992(2022).
  28. Ansari, S., Ito, K., Hofmann, S. Alkaline phosphatase activity of serum affects osteogenic differentiation cultures. ACS Omega. 7 (15), 12724-12733 (2022).
  29. Ghasemi, A., Zahediasl, S. Normality tests for statistical analysis: a guide for non-statisticians. Int J Endocrinol Metab. 10 (2), 486-489 (2012).
  30. Rousseaux, C. G., Gad, S. C. Haschek and Rousseaux's handbook of toxicologic pathology. , 3rd ed, Academic Press. (2013).
  31. Spiegelman, D. Commentary: some remarks on the seminal 1904 paper of Charles Spearman: the proof and measurement of association between two things. Int J Epidemiol. 39 (5), 1156-1159 (2010).
  32. Cleophas, T. J., Zwinderman, A. H., van Ouwerkerk, B. M. Methods for analyzing cardiovascular studies with repeated measures. Neth Heart J. 17 (11), 429-433 (2009).
  33. Haynes, W. Encyclopedia of systems biology. , Springer. New York. (2013).
  34. Kang, J. S., et al. Exercise-induced CLCF1 attenuates age-related muscle and bone decline in mice. Nat Commun. 16 (1), 4743(2025).
  35. Zhao, C., Gong, Y., Zheng, L., Zhao, M. Untargeted metabolomic reveals changes in muscle metabolites of mice during exercise recovery and mechanisms of whey protein and whey protein hydrolysate in promoting muscle repair. Food Res Int. 184, 114261(2024).
  36. Koltun, K. J., et al. Effect of acute resistance exercise on bone turnover in young adults before and after concurrent resistance and interval training. Physiol Rep. 12 (3), e15906(2024).
  37. Li, J. JAK-STAT and bone metabolism. JAK-STAT. 2 (3), e23930(2013).
  38. Sims, N. A. The JAK1/STAT3/SOCS3 axis in bone development, physiology, and pathology. Exp Mol Med. 52 (8), 1185-1197 (2020).
  39. Zhao, X., et al. Puerarin alleviates osteoporosis in rats by targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway. Biomol Biomed. 24 (6), 1651-1661 (2024).
  40. Terpos, E., Ntanasis-Stathopoulos, I., Gavriatopoulou, M., Dimopoulos, M. A. Pathogenesis of bone disease in multiple myeloma: from bench to bedside. Blood Cancer J. 8 (1), (2018).
  41. Okamoto, K., et al. Osteoimmunology: the conceptual framework unifying the immune and skeletal systems. Physiol Rev. 97 (4), 1295-1349 (2017).
  42. Sims, N. A. Influences of the IL-6 cytokine family on bone structure and function. Cytokine. 146, 155655(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

miokina CLCF1cytokina indukowana wysi kiem fizycznymsygnalizacja RANKL OPGinterakcja uk adu odporno ciowego z ko mianaliza qPCRwestern blottingedycja gen w CRISPRhamowanie osteoklast w
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.