Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hamowanie osteoklastogenezy przez LY90009 poprzez modulację sygnalizacji Notch w modelach chorób osteolitycznych

500 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69178

⸱

7 października 2025

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University, 2Department of Geriatrics, Feicheng People's Hospital, 3Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny hamującego wpływu inhibitora γ-sekretazy LY900009 na osteoklastogenezę indukowaną przez RANKL w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego. Protokół obejmuje ocenę cytotoksyczności, testy funkcjonalne, analizy molekularne oraz walidację in vivo w mysim modelu osteolitycznym, z zastosowaniami w rozwoju terapeutycznym chorób osteolitycznych.

Streszczenie

Rozregulowana aktywność osteoklastów w znacznym stopniu przyczynia się do postępu choroby osteolitycznej, jednak zakres metod interwencji terapeutycznej jest ograniczony przez działania niepożądane. W badaniu tym badano LY900009, inhibitor γ-sekretazy, i jego zdolność do tłumienia osteoklastogenezy indukowanej przez RANKL poprzez modulację sygnalizacji Notch. Korzystając z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego, przeprowadziliśmy kompleksowe oceny in vitro cytotoksyczności, różnicowania i testów funkcjonalnych. Analizy ekspresji genów i białek za pomocą qPCR i western blotting wykorzystano do wyjaśnienia podstawowych mechanizmów molekularnych. Skuteczność in vivo potwierdzono przy użyciu mysiego modelu resorpcji kości indukowanej lipopolisacharydem. LY900009 hamowały powstawanie i funkcję resorpcyjną osteoklastów indukowaną przez RANKL w sposób zależny od dawki bez cytotoksyczności w stężeniach terapeutycznych. Leczenie to znacznie zmniejszyło liczbę osteoklastów TRAP-dodatnich, upośledzało tworzenie pasów aktynowych i hamowało degradację macierzy kostnej. Ekspresja markerów osteoklastów, w tym NFATc1, c-Fos, katepsyny K i TRAP, była znacznie obniżona. Mechanicznie LY900009 zakłócić sygnalizację Notch i dalsze szlaki MAPK/Akt. Podawanie in vivo znacznie zmniejszyło destrukcję kości wywołaną przez LPS, poprawiając parametry kości i zmniejszając obecność osteoklastów. Odkrycia te pokazują, że LY900009 skutecznie hamuje osteoklastogenezę i resorpcję kości poprzez modulację osi sygnalizacyjnej Notch/MAPK/Akt, co czyni go obiecującym kandydatem terapeutycznym w zaburzeniach osteolitycznych.

Wprowadzenie

Homeostaza kości stanowi znakomicie zaaranżowany paradygmat fizjologiczny u kręgowców, zharmonizowany przez delikatną równowagę między tworzeniem kości za pośrednictwem osteoblastów a resorpcją kości napędzaną przez osteoklasty1. Ta skomplikowana równowaga utrzymuje integralność szkieletu, odporność biomechaniczną i wierność metaboliczną przez całe życie, dynamicznie reagując na wymagania mechaniczne, zaburzenia endokrynologiczne i patologiczne wyzwania2. Cykl przebudowy kości obejmuje sekwencyjne fazy aktywacji, resorpcji, przejścia, tworzenia i zakończenia, z których każda jest zarządzana przez skomplikowane kaskady molekularne, które zapewniają czasoprzestrzenną synchronizację aktywności komórkowych3.

Zaburzenie tego mechanizmu homeostatycznego, szczególnie poprzez nadmierną aktywność osteoklastów lub nieodpowiednią funkcję osteoblastów, przyspiesza patologiczny zanik masy kostnej, charakterystyczny dla wielu zaburzeń osteolitycznych 4,5. Stany te obejmują szerokie spektrum chorób, w tym osteoporozę pomenopauzalną i starczą, reumatoidalne zapalenie stawów, zapalne zapalenie stawów, nowotworowe zajęcie kości, chorobę Pageta i zaburzenia przyzębia6. Objawy kliniczne nadmiernej resorpcji kości obejmują zwiększone ryzyko złamań, deformację szkieletu, przewlekły ból, niepełnosprawność funkcjonalną i znaczne obciążenie opieki zdrowotnej 6,7. Współczesne wskaźniki epidemiologiczne wskazują, że sama osteoporoza dotyka ponad 200 milionów osób na całym świecie, a związane z nią złamania skutkują znaczną zachorowalnością, śmiertelnością i kosztami ekonomicznymi przekraczającymi miliardy dolarów rocznie.

Osteoklasty manifestują się jako wysoce wyspecjalizowane wielojądrowe komórki olbrzymie pochodzące z hematopoetycznych prekursorów linii fagocytów jednojądrzastych, w szczególności makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego9. Ich powstawanie stanowi złożony, wieloetapowy proces, który wymaga precyzyjnej koordynacji sygnałów zewnątrzkomórkowych, wewnątrzkomórkowych kaskad sygnalizacyjnych i programów transkrypcyjnych10. Do podstawowych cytokin regulujących osteoklastogenezę należą aktywator receptora ligandu czynnika jądrowego κB (RANKL) i czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF), które wiążą się z odpowiednimi receptorami RANK i c-Fms w celu zainicjowania programów różnicowania11. Interakcja RANKL-RANK wyzwala aktywację wielu dalszych szlaków sygnałowych, w tym kinaz białkowych aktywowanych mitogenem (MAPK), czynnika jądrowego κB (NF-κB), kinazy 3-fosfoinozytolu/kinazy białkowej B (PI3K/Akt) oraz szlaków wapń/kalcyneuryna, które zbiegają się w czynniku jądrowym aktywowanych limfocytów T cytoplazmatycznym 1 (NFATc1), głównym regulatorze transkrypcji osteoklastogenezy 10,11,12.

Wśród różnych mechanizmów regulacyjnych, które kontrolują biologię osteoklastów, sygnalizacja Notch stała się krytycznym modulatorem o złożonych i zależnych od kontekstu funkcjach13. Szlak Notch to ewolucyjnie konserwatywny system komunikacji komórka-komórka, który reguluje określanie, różnicowanie, proliferację i apoptozę komórek w różnych tkankach i stadiach rozwojowych14. U ssaków cztery receptory Notch (Notch1-4) oddziałują z pięcioma kanonicznymi ligandami (podobnymi do Delta 1, 3 i 4 oraz Jagged 1 i 2), aby pośredniczyć w sygnalizacji międzykomórkowej. Aktywacja szlaku obejmuje wiązanie ligandów, zmiany konformacyjne i sekwencyjne rozszczepienie proteolityczne przez metaloproteazy ADAM i kompleks γ-sekretazy, który ostatecznie uwalnia domenę wewnątrzkomórkową Notch (NICD) do translokacji jądrowej i regulacji transkrypcji genów docelowych, w tym rodzin Hes i Hey14,15. Rola sygnalizacji Notch w osteoklastogenezie pozostaje sporna i wydaje się być wysoce zależna od kontekstu, a badania wykazują zarówno efekty stymulujące, jak i hamujące w zależności od określonych podtypów receptorów, dostępności ligandów, mikrośrodowiska komórkowego i warunków eksperymentalnych 16,17,18.

Dominujące podejścia terapeutyczne w chorobach osteolitycznych koncentrują się przede wszystkim na strategiach antyresorpcyjnych, w tym bisfosfonianach, denosumabie (inhibitorze RANKL), selektywnych modulatorach receptora estrogenowego i kalcytoninie 7,8,19. Chociaż zabiegi te skutecznie zmniejszają resorpcję kości i ryzyko złamań, wiążą się ze znacznymi ograniczeniami, w tym toksycznością żołądkowo-jelitową, martwicą kości szczęki, nietypowymi złamaniami, zwiększonym ryzykiem infekcji i obawami o długoterminowe bezpieczeństwo. Ponadto środki te mogą nadmiernie hamować obrót kostny, potencjalnie pogarszając jakość kości i mechanizmy naprawcze. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie kliniczne na nowe środki terapeutyczne, które mogą selektywnie hamować patologiczną aktywność osteoklastów, jednocześnie minimalizując działania niepożądane i zachowując fizjologiczną zdolność koścido przebudowy 8,14.

Inhibitory γ-sekretazy stanowią obiecującą klasę związków o potencjalnych zastosowaniach w chorobach osteolitycznych poprzez modulację sygnalizacji Notch14,20. Środki te zostały szeroko przebadane w onkologii i badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi, a kilka związków awansowało do badań klinicznych w chorobie Alzheimera i różnych nowotworach. LY900009, silny i selektywny inhibitor γ-sekretazy, wykazał korzystne właściwości farmakologiczne, w tym wysoką swoistość, biodostępność i łatwy do opanowania profil bezpieczeństwa we wstępnych badaniach21,22. Jednak jego specyficzny wpływ na osteoklastogenezę indukowaną przez RANKL i potencjalną przydatność terapeutyczną w chorobach osteolitycznych pozostaje niew pełni scharakteryzowany. Badanie to miało na celu ocenę, czy LY900009 może hamować osteoklastogenezę poprzez zakłócenie sygnalizacji Notch, potencjalnie oferując nowatorskie podejście terapeutyczne w chorobach osteolitycznych. Opracowaliśmy kompleksowe protokoły, aby ocenić ich wpływ na tworzenie osteoklastów, aktywność resorpcji kości, szlaki sygnałowe i skuteczność in vivo w modelach zapalnego ubytku kostnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Centralnego afiliowanego przy Pierwszym Uniwersytecie Medycznym w Shandong (numer zatwierdzenia IACUC-2024-015). Badanie było zgodne z ustalonymi zasadami etycznymi dotyczącymi badań na zwierzętach i wytycznymi ARRIVE, w tym trzymaniem zwierząt w standardowych klatkach (5 myszy / klatka, 12-godzinny cykl światła/ciemności, jedzenie ad libitum / woda) i randomizacja do grup

1. Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

  1. Poddaj eutanazji 5-tygodniowe samce myszy C57BL/6 (n = 5 na izolację), umieszczając je w komorze CO2 o natężeniu przepływu 30% objętości komory na minutę przez 5 minut. Potwierdź zgon przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Spryskaj mysz 70% etanolem. Wykonaj nacięcie w linii środkowej od łona do mostka za pomocą sterylnych nożyczek. Usuń kości udowe i piszczelowe aseptycznie. Umieść kości w sterylnym PBS na lodzie.
  3. Oczyść kości tkanek miękkich za pomocą sterylnej gazy. Odetnij oba końce kości sterylnymi nożyczkami. Przepłucz szpik za pomocą igły 25G z 10 ml zimnego α-MEM na mysz. Przepuścić zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 μm.
  4. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w α-MEM zawierającym 10% FBS i 33,3 ng/mL M-CSF. Policz komórki za pomocą hemocytometru z wykluczeniem błękitu trypanowego. Płytka w formacie 2 x 106 komórek/ml w kolbach T75.
  5. Utrzymywać kultury w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 z wymianą pożywki co 48 godzin.
  6. Zbierz 1x 106 komórek. Umyć PBS zawierającym 2% FBS. Inkubować z anty-CD11b-FITC (1:100) i anty-F4/80-PE (1:100) przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu następującej strategii bramkowania: Najpierw komórki bramkowe oparte na rozproszeniu do przodu (FSC) i rozproszeniu bocznym (SSC), aby wykluczyć zanieczyszczenia i wybrać żywe komórki. Po drugie, bramkują komórki CD11b-dodatnie z żywotnej populacji komórek. Po trzecie, z komórek CD11b-dodatnich, bramkują komórki F4 / 80-dodatnie, aby zidentyfikować podwójnie dodatnie makrofagi CD11b + / F4 / 80 + . Ustawianie bramek na podstawie nieskalanych kontrolek i jednokolorowych kontrolek. Kontynuuj tylko wtedy, gdy >95% komórek to CD11b+/F4/80+.

2. Ocena cytotoksyczności

  1. Nasiona makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMM) w ilości 1 x 104 komórek na studzienkę na 96-dołkowych płytkach przy użyciu 100 μl podłoża na dołek. Pozostawić komórki do przylegania przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
  2. Przygotować LY900009 rozcieńczenia w kompletnym podłożu: 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4, 12,8, 25,6 μM. Usunąć stare podłoże. Dodać 100 μl pożywki zabiegowej do dołka. Przygotować trzy egzemplarze dla każdego stężenia.
  3. Inkubować przez 24 godziny, 48 godzin lub 96 godzin. Całkowicie usuń pożywkę hodowlaną. Dodać 100 μl świeżej pożywki zawierającej 10% odczynnik CCK-8 (10 μL CCK-8 w 90 μl pożywki). Inkubować dokładnie przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Za pomocą czytnika mikropłytek zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm z wzorcem przy długości fali 650 nm.
  4. Oblicz IC50 za pomocą GraphPad Prism. Otwarte oprogramowanie, stężenie wejściowe (oś X) i procent żywotności (oś Y). Wybierz opcję Analizuj > Regresja nieliniowa > Dawka-odpowiedź > Hamowanie > logarytmu (inhibitora) w porównaniu z odpowiedzią o zmiennym nachyleniu. Ustaw ograniczenia: Dół=0, Góra=100. Rekord IC50 z 95% przedziałem ufności.

3. Różnicowanie osteoklastów i barwienie TRAP

  1. Nasiona makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMM) w ilości 1 x 104 komórek na studzienkę na płytkach 96-dołkowych. Hodowla przez noc w α-MEM z 10% FBS i 33,3 ng/mL M-CSF.
  2. Zastąp pożywkę 100 μl pożywki różnicującej: α-MEM zawierającej 10% FBS, 33,3 ng/mL M-CSF, 100 ng/mL RANKL i LY900009 (0, 100, 200, 400 nM). Przygotuj poczwórne duplikaty dla każdego warunku.
  3. Pożywkę należy wymieniać co 48 godzin na świeżą pożywkę różnicującą. Kontynuuj przez 6 dni. Monitoruj codziennie za pomocą odwróconego mikroskopu pod kątem 100x pod kątem tworzenia osteoklastów.
  4. Usuń całe podłoże przez aspirację. Przemyć raz 200 μl PBS. Dodać 100 μl 4% paraformaldehydu do PBS. Inkubować dokładnie przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń utrwalacz. Przemyć 3x 200 μL PBS.
  5. Przygotuj roztwór barwiący TRAP: Wymieszaj 50 ml 0,1 M buforu octanu sodu (pH 5,0), 10 ml 50 mM winianu sodu, 1 ml 5 mg/ml fosforanu naftolu AS-MX z dimetyloformamidem i 0,5 ml 11 mg/ml soli Fast Red Violet LB. Przefiltruj przez filtr 0,22 μm. Stosować 200 μl na studzienkę. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w ciemności. Zatrzymaj reakcję, przemywając 3x wodą destylowaną.
  6. Zidentyfikuj osteoklasty jako komórki TRAP-dodatnie (fioletowe/czerwone) zawierające trzy lub więcej jąder. Policz za pomocą odwróconego mikroskopu przy 100-krotnym powiększeniu. Sfotografuj pięć losowych pól na studzienkę.
  7. Określ ilościowo za pomocą ImageJ. Kliknij na obrazek > Konwertuj na 8-bitowy (Typ > obrazu > 8-bitowy) > Ustaw próg (Obraz > Dostosuj próg >) > Wybierz obszary dodatnie dla PUŁAPKI > Analizuj cząstki (Analizuj > Analizuj cząstki: rozmiar 100-Nieskończoność μm2, okrągłość 0-1,0) > Eksportuj wyniki do Excela 23.

4. Test funkcjonalnej resorpcji kości

  1. Hodowla BMM na płytkach sześciodołkowych (2 x 105 komórek/basenik) z M-CSF przez 24 godziny. Dodaj RANKL (100 ng/ml), aby wywołać tworzenie się preosteoklastów przez 3 dni.
  2. Zbieraj komórki za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Zneutralizuj kompletną pożywką. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego.
  3. Wysiew 1 x 104 preosteoklasty na dołku na 96-dołkowych płytkach pokrytych hydroksyapatytem. Pozwól na zamocowanie na 4 godziny.
  4. Leczyć M-CSF (33,3 ng/ml), RANKL (100 ng/ml) i LY900009 (0, 100, 200, 400 nM) przez 4 dni. Zmieniaj podłoże co 2 dni.
  5. Usuń komórki za pomocą 10% wybielacza przez 10 minut. Umyj 5x wodą destylowaną. Całkowicie wysuszyć na powietrzu.
  6. Wizualizacja wgłębień resorpcyjnych za pomocą automatycznego czytnika obrazowania w 4-krotnym powiększeniu. Przechwyć cały obszar studni. Określ ilościowo resorbowany obszar jako procent całkowitej powierzchni za pomocą ImageJ.

5. Mikroskopia immunofluorescencyjna

  1. Osteoklasty należy hodować na szklanych szkiełkach nakrywkowych na płytkach 24-dołkowych przez 5-7 dni, jak opisano w kroku 3.
  2. Utrwal 4% paraformaldehydem przez 15 min. Przepuszczalność 0,1% Triton X-100 w PBS przez 10 min. Blok z 1% BSA w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Inkubować z rodaminą-falloidyną (1:200) w buforze blokującym przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Przeciwbarwić jądra za pomocą DAPI (1 μg/ml) przez 10 min.
  4. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu. Zbadaj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 200-krotnym powiększeniu. Zmierz obszar pierścienia aktynowego za pomocą ImageJ.

6. Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym

  1. Ekstrahuj całkowite RNA z 2 x 106 komórek za pomocą odczynnika do ekstrakcji RNA. Homogenizować przez pipetowanie. Inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Dodać 200 μl chloroformu. Wstrząsaj energicznie przez 15 s. Inkubować 3 min. Wirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Przenieść fazę wodną do nowej probówki. Dodać 500 μl izopropanolu. Delikatnie wymieszaj. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Umyj granulat 1 ml 75% etanolu. Suszyć na powietrzu przez 10 min. Rozpuścić w 30 μl wody wolnej od RNaz. Zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru (wymagany stosunek A260/A280 >1,8).
  5. Zsyntetyzuj cDNA przy użyciu 1 μg RNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji zgodnie z protokołem producenta.
  6. Przygotuj reakcje qPCR: 10 μL Master Mix, 1 μL cDNA, 0,5 μL każdego startera (10 μM), 8 μL wody. Uruchom w systemie PCR w czasie rzeczywistym: 95 °C przez 10 minut, następnie 40 cykli 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 60 s. Obliczyć ekspresję względną przy użyciu metody 2-ΔΔCt z GAPDH jako genem odniesienia.

7. Analiza Western blot

  1. Lizować komórki w buforze RIPA zawierającym inhibitory proteazy i fosfatazy na lodzie przez 30 min. Wirować przy 14 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Określić stężenie białka za pomocą testu BCA zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotować 30 μg próbek białka w buforze ładującym. Gotować przez 5 minut.
  3. Załaduj próbki na 10% żele SDS-PAGE. Praca pod napięciem 80 V przez 30 minut, a następnie 120 V przez 90 minut. Przenieść na membrany PVDF pod napięciem 100 V przez 90 minut w buforze do zimnego transferu.
  4. Zablokuj membrany z 5% odtłuszczonym mlekiem w soli fizjologicznej buforowanej trisem z 0,1% Tween-20 (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.
  5. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi wyszczególnionymi w tabeli materiałów (1:1000) przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc. Myć 3x łyżką łyżkową po 10 minut.
  6. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z HRP (1:5000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyć 3x łyżką łyżkową.
  7. Wykryć za pomocą odczynnika ECL zgodnie z instrukcjami producenta. Rób obrazy za pomocą systemu obrazowania w podczerwieni. Określ ilościowo intensywność pasma za pomocą ImageJ.

8. Model resorpcji kości indukowanej przez LPS in vivo

  1. Oblicz wielkość próby za pomocą G * Power 3.1 (wielkość efektu = 0,8, α = 0,05, moc = 0,80, co daje n = 5 / grupę). Losowo przydziel 7-8-tygodniowe samce myszy C57BL/6 do grup za pomocą generatora liczb losowych. Trzymaj 5 myszy w klatce z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności, temperaturą 22 ± 2 °C, wilgotnością 55% ± 10%, dostępem ad libitum do standardowej karmy i wody.
  2. Znieczulić myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia pentobarbitalu sodu (50 mg/kg). Potwierdź znieczulenie odruchem szczypania palca u nogi.
  3. Przygotować kontrolę nośnika: PBS zawierający 1% DMSO. Przygotuj LY900009: Niska dawka (2,5 mg/kg) i Wysoka dawka (5 mg/kg) w podłożu. Wstrzykiwać 100 μl podskórnie nad kalwarię za pomocą igły 27G dziennie przez 14 dni. Wstrzyknąć LPS (10 mg/kg) w 1. i 8. dniu.
  4. Monitoruj myszy 2 razy dziennie pod kątem oznak niepokoju. Zdefiniuj humanitarne punkty końcowe: utrata masy ciała >20%, niezdolność do poruszania się, zgarbiona postawa, zmniejszona pielęgnacja. Natychmiast poddaj się eutanazji, jeśli zostaną osiągnięte punkty końcowe.
  5. Eutanazja w 15 dniu z powodu przedawkowania pentobarbitalu (100 mg/kg dootrzewnowo). Zbierz calvariae. Utrwalić w 4% paraformaldehydzie przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.

9. Mikrotomografia komputerowa i analiza histologiczna

  1. Skanuj stałe kalwarie za pomocą mikrotomografu komputerowego o następujących parametrach: 70 kV, 114 μA, filtr aluminiowy 0,5 mm, rozdzielczość 9 μm, obrót o 180° z krokiem co 0,4°.
  2. Rekonstrukcja obrazów za pomocą oprogramowania NRecon. Analizuj za pomocą oprogramowania CTAn. Zdefiniuj obszar zainteresowania jako obszar o wymiarach 3 x 3 mm wyśrodkowany na szwie strzałkowym. Obliczać BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th.
  3. Odwapniać próbki w 10% EDTA (pH 7,4) przez 14 dni z codziennymi zmianami. Przetestuj zakończenie odwapnienia za pomocą testu szczawianu wapnia24.
  4. Proces zatapiania parafiny: odwodnić przez sortowany alkohol, oczyścić z ksylenu, naciekać parafiną. Przekrój o grubości 4 μm za pomocą mikrotomu.
  5. Upewnij się, że zaślepia: Zakoduj wszystkie próbki za pomocą losowych trzycyfrowych liczb. Poproś współpracownika o zachowanie klucza kodu. Wykonuj wszystkie analizy bez wiedzy o grupach badanych. Dekoduj dopiero po zakończeniu zbierania danych.
  6. Wykonaj barwienie H&E: odparafinować, ponownie uwodnić, wybarwić hematoksyliną przez 5 minut, rozróżnić w kwaśnym alkoholu, wybarwić eozyną przez 2 minuty, odwodnić i zamontować.
  7. Wykonaj barwienie TRAP jak w kroku 3.5. Policz komórki wielojądrowe TRAP-dodatnie wzdłuż powierzchni kości. Wyraż się jako liczbę na mm obwodu kości.

10. Analiza statystyczna

  1. Oblicz wymaganą wielkość próby za pomocą G*Power 3.1: Wielkość efektu wejściowego f = 0,8, α = 0,05, moc = 0,80, liczba grup. Zapisz minimalną liczbę n na grupę.
  2. Przetestuj normalność za pomocą testu Shapiro-Wilka w SPSS 28.0. Rozważmy p > 0,05 jako rozkład normalny. Przetestuj jednorodność wariancji za pomocą testu Levene'a. Rozważ p > 0,05 jako równe wariancje.
  3. Zastosuj odpowiednie testy na podstawie rozkładu: W przypadku normalnych danych o równych wariancjach użyj testów parametrycznych. W przypadku dwóch grup zastosuj niesparowany test t-Studenta. W przypadku wielu grup użyj jednokierunkowej usługi ANOVA.
  4. Przeprowadź analizę post hoc: W przypadku istotnej ANOVA (p<0,05) zastosuj test uczciwie znaczącej różnicy Tukeya dla wszystkich porównań parami.
  5. Użyj alternatyw nieparametrycznych dla danych nienormalnych: Zastosuj test U Manna-Whitneya dla dwóch grup i test Kruskala-Wallisa z post hoc Dunna dla wielu grup.
  6. Obliczanie wielkości efektów: d Cohena dla testów t, częściowy eta do kwadratu dla ANOVA.
  7. Raportuj dokładne wartości p z dokładnością do trzech miejsc po przecinku i 95% przedziałów ufności. Normalne dane należy przedstawić jako średnią ± odchylenie standardowe, nienormalne jako medianę (rozstęp międzykwartylowy).
  8. Rozważ, że p < 0,05 jest statystycznie istotne. Poprawkę Bonferroniego można stosować, gdy wykonywane są wielokrotne porównania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślne wdrożenie tego protokołu ujawniło, że LY900009 wywiera silne hamowanie na tworzenie i funkcjonowanie osteoklastów poprzez wiele powiązanych ze sobą mechanizmów. Wstępna ocena cytotoksyczności makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego wykazała zależny od czasu wzrost toksyczności, przy obliczonych wartościach IC50 wynoszących 4,44 μM, 3,66 μM i 2,93 μM odpowiednio po 24 godzinach, 48 godzinach i 96 godzinach (figura 1A, B). Co ważne, te stężenia cytotoksy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejsze badanie dostarcza przekonujących dowodów na to, że stanowi LY900009 obiecujący środek terapeutyczny w chorobach osteolitycznych poprzez silne i selektywne hamowanie osteoklastogenezy, co jest zgodne z rosnącym zainteresowaniem inhibitorami γ-sekretazy w zaburzeniach związanych z kośćmi 14,20,21. Odkrycia pokazują, że ten inhibitor γ-sekretazy skutecznie hamuje indukowane przez RANKL tworzenie osteoklastów i funkcję res...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub konfliktów interesów. Żaden z autorów nie ma powiązań finansowych z podmiotami komercyjnymi wymienionymi w niniejszej pracy. Wszyscy autorzy wypełnili formularze ujawnienia ICMJE.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować personelowi Centralnego Szpitala Afiliowanego przy Pierwszym Uniwersytecie Medycznym w Shandong oraz Szpitala Ludowego Feicheng za wsparcie techniczne i pomoc w trakcie tego badania. Doceniamy również wkład naszych kolegów z laboratorium za ich cenne dyskusje i pomoc w eksperymentach na zwierzętach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowe płytki do hodowli komórkowychCorning3524Mikroskopia immunofluorescencyjna
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowychCorning3516Hodowla komórkowa i western blot
70% etanoluSigma-AldrichE7023 powiedział:Sterylizacja i dezynfekcja
75% etanoluSigma-AldrichE7148 powiedział:Bufor płuczący RNA
96-dołkowe płytki do hodowli komórkowychCorning3596Hodowla komórkowa i testy
Filtr aluminiowy (0,5 mm)BrukerN/AFiltr skaningowy Micro-CT
Przeciwciało anty-CD11b-FITCLegenda biologiczna101206Cytometria przepływowa - marker makrofagów
Przeciwciało przeciw rozszczepieniu Notch1 (monoklonalne królictwo)Technologia sygnalizacji komórkowej4147SWestern blot - sygnalizacja wcięcia
Przeciwciało anty-F4/80-PELegenda biologiczna123108Cytometria przepływowa - marker makrofagów
Medium montażowe zapobiegające blaknięciuLaboratoria wektoroweH-1000Montaż mikroskopii fluorescencyjnej
Przeciwciało anty-Hes1 (monoklonalne królika)Technologia sygnalizacji komórkowej11988SWestern blot - Tarcza z karbem za linią prądu
Przeciwciało anty-NFATc1 (monoklonalne mysie)Biotechnologia Santa CruzSC-7294 powiedział:Western blot - główny regulator osteoklastów
Przeciwciało anty-fosfo-Akt (Ser473)Technologia sygnalizacji komórkowej4060SWestern blot - sygnalizacja PI3K/Akt
Przeciwciało anty-fosfo-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)Technologia sygnalizacji komórkowej4370SWestern blot - sygnalizacja MAPK
Anty-fosfo-NF-κ Przeciwciało B p65 (Ser536)Technologia sygnalizacji komórkowej3033SWestern blot - NF-κ Sygnalizacja B
Przeciwciało anty-fosfo-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)Technologia sygnalizacji komórkowej4511SWestern blot - sygnalizacja p38 MAPK
Przeciwciało anty-&beta-aktynowe (monoklonalne mysie)Technologia sygnalizacji komórkowej4970SKontrola załadunku Western blot
Automatyczny czytnik obrazowaniaUrządzenia molekularneImageXpress MicroKwantyfikacja wgłębienia resorpcyjnego
Zestaw do oznaczania białek BCAPierce/Thermo Fisher23225Oznaczanie stężenia białka
Wybielacz (10% podchloryn sodu)Sigma-Aldrich425044Usuwanie komórek z płytek resorpcyjnych
BSA (albumina surowicy bydlęcej)Sigma-AldrichA7906 powiedział:Bufor blokujący dla immunofluorescencji
Myszy C57BL/6 (samiec, 5-8 tygodni)Laboratoria Charlesa Rivera27Izolacja BMM in vitro i badania in vivo
Odczynnik do badania szczawianów wapniaSigma-AldrichZobacz materiał C0350Testy zakończenia odwapnienia
Odczynnik CCK-8 (Cell Counting Kit-8)Technologie molekularne DojindoCK04 powiedział:Ocena żywotności komórek
Sitko do komórek (70 μ m)BD Sokół352350Filtracja komórek szpiku kostnego
Wirówka (z chłodzeniem)Eppendorf powiedział:5424RPrzygotowanie komórek i próbek
ChloroformSigma-AldrichZobacz materiał C2432Separacja faz ekstrakcji RNA
Komora CO2Euthanex CorpEX-075 (wersja angielska)Eutanazja zwierząt
Oprogramowanie CTAnBrukerWersja 1.20Analiza obrazu mikrotomografii komputerowej
DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol)Sigma-AldrichZobacz materiał D9542Barwienie przeciwjądrowe
Dimetyloformamid (DMF)Sigma-AldrichZobacz materiał D4551Rozpuszczalnik barwiący TRAP
DMSO (sulcotlenek dimetylu)Sigma-AldrichZobacz materiał D2650Przygotowanie do kontroli pojazdu
Podłoże do blottingu ECL Western BlottingPierce/Thermo Fisher32106Wykrywanie białek w western blot
EDTA (10%, pH 7,4)Sigma-AldrichE6758 powiedział:Roztwór odwapniający
Eozyna YSigma-AldrichE4009 powiedział:H& Barwienie histologiczne E
Szybka sól Red Violet LBSigma-AldrichZobacz materiał F3381Chromogen do barwienia TRAP
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco/Thermo Fisher16140-071Suplement do hodowli komórkowych
Cytometr przepływowyBD Nauki biologiczneFACSCalibur powiedział:Charakterystyka BMM
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusZobacz materiał IX73Obrazowanie immunofluorescencyjne
Oprogramowanie G*PowerUniwersytet Heinricha HeinegoWersja 3.1Statystyczna analiza mocy
Szkiełka nakrywkowe szklane (22 i razy; 22 mm)Fisher Naukowy12-541-BMikroskopia immunofluorescencyjna
Pryzmat GraphPadOprogramowanie GraphPadWersja 9.0Obliczenia i wykresy IC50
HematoksylinąSigma-AldrichZobacz materiał H3136H& Barwienie histologiczne E
HemocytometrHausser Scientific3200Zliczanie komórek
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościBiosystemy stosowane4368814Synteza cDNA z RNA
Anty-mysie IgG sprzężone z HRPTechnologia sygnalizacji komórkowejZobacz materiał 7076SPrzeciwciało wtórne Western blot
IgG anty-królicze sprzężone z HRPTechnologia sygnalizacji komórkowejZobacz materiał 7074SPrzeciwciało wtórne Western blot
Płytki 96-dołkowe pokryte hydroksyapatytemCorning BioCoat354651Test funkcjonalny resorpcji kości
ObrazJNIHWersja 1.53eAnaliza obrazu i kwantyfikacja
Inkubator (CO2)Rybak termiczny51033058Utrzymanie kultur komórkowych
System obrazowania w podczerwieniBio-RadChemiDoc MPWykrywanie Western blot
Mikroskop odwróconyOlympusCKX41 powiedział:Monitorowanie kultur komórkowych, zliczanie TRAP
IzopropanolSigma-AldrichI9516 powiedział:Wytrącanie RNA
LPS (lipopolisacharyd z E. coli)Sigma-AldrichL4391Zapalna resorpcja kości in vivo
LY900009 (inhibitor γ-sekretazy)Selleck ChemikaliaZobacz materiał S7999Badany związek - inhibitor osteoklastów
M-CSF (czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów)R& Systemy D416-ML-010Przeżywalność makrofagów i różnicowanie osteoklastów
Skaner mikro-CTBrukerSkaner nieba 1272Analiza mikroarchitektury kości
Czytnik mikropłytekBioTekSynergia H1Pomiary absorbancji (CCK-8)
MikrotomKsięga LeicaZobacz materiał RM2255Cięcie histologiczne
Fosforan naftolu AS-MXSigma-AldrichNr N5000Podłoże barwiące TRAP
Igły (25G, 27G)BD305122, 305109Przepłukanie szpiku kostnego, zastrzyki
Oprogramowanie NReconBrukerWersja 1.7Rekonstrukcja obrazu mikrotomografii komputerowej
Wosk parafinowySigma-AldrichZobacz materiał P3683 powiedział:Osadzanie tkanek
Paraformaldehyd (4%)Sigma-AldrichZobacz materiał P6148Utrwalanie komórek i tkanek
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Gibco/Thermo Fisher14190-144Mycie komórek i przygotowanie buforu
Pentobarbital sodowySigma-AldrichZobacz materiał P3761 powiedział:Znieczulenie zwierząt i eutanazja
Koktajl inhibitorów fosfatazyRoche4906837001Zachowanie fosforylacji
PowerUp SYBR Green Master MixBiosystemy stosowaneNr kat. A25742Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym
Koktajl inhibitorów proteazyRoche11697498001Zapobieganie degradacji białek
Membrana PVDF (0,45 μ m)Bio-Rad1620177Transfer białka Western blot
RANKL (Aktywator Receptora NF-κ B Ligand)R& Systemy D462-TEC-010Indukcja różnicowania osteoklastów
System PCR w czasie rzeczywistymBiosystemy stosowane7500 SzybkiIlościowa analiza ekspresji genów
Rodamina-falloidynaInvitrogen/Thermo FisherCzynnik chłodniczy R415Wizualizacja F-aktyny
Bufor RIPATechnologia sygnalizacji komórkowejZobacz materiał 9806SEkstrakcja białek
Woda wolna od RNazAmbion/Thermo FisherZobacz materiał AM9937Rozpuszczanie RNA i PCR
Żele SDS-PAGE (10%)Bio-Rad4561036Separacja białek Western blot
Odtłuszczone mleko w proszkuBio-Rad1706404Blokowanie Western blot
Bufor octanu sodu (0,1 M, pH 5,0)Sigma-AldrichZobacz materiał S2889Bufor do barwienia TRAP
Winian sodu (50 mM)Sigma-AldrichZobacz materiał S4297Specyfika barwienia TRAP
SpektrofotometrRybak termicznyNanoDrop 2000Pomiar stężenia RNA/białka
SPSSKorporacja IBMWersja 28.0Analiza statystyczna
Strzykawki (1 mL, 10 mL)BD309659, 309604Przepłukanie szpiku kostnego, zastrzyki
Kolby do hodowli komórkowych T75Corning430641Podstawowa kultura BMM
TBST (sól fizjologiczna buforowana trisem z 0,1% Tween-20)Bio-Rad1706531Bufor do płukania Western blot
Bufor transferowyBio-Rad1704270Transfer białka Western blot
Tryton X-100Sigma-AldrichZobacz materiał T8787 TGLPrzenikanie komórek
Odczynnik TRIzolInvitrogen/Thermo Fisher15596026Ekstrakcja całkowitego RNA
Błękit trypanowy (0,4%)Sigma-AldrichZobacz materiał T8154 TGLOcena żywotności komórek
Trypsyna-EDTA (0,25%)Gibco/Thermo Fisher25200-056Pobieranie i oddzielanie komórek
System transferu Western blotBio-RadTrans-Blot TurboPrzenoszenie białek do błony
KsylenSigma-AldrichZobacz materiał X3750Przetwarzanie i oczyszczanie tkanek
α-MEM (Alpha Minimum Essential Medium) (Alfa Minimum Essential Medium)Gibco/Thermo Fisher12561-056Pożywka do hodowli komórkowych

Bibliografia

  1. Langdahl, B., Ferrari, S., Dempster, D. W. Bone modeling and remodeling: potential as therapeutic targets for the treatment of osteoporosis. Ther Adv Musculoskeletal Dis. 8 (6), 225-235 (2016).
  2. Shah, M. A. A., et al. Functional morphology of trabecular system in human proximal femur: a perspective from P45 sectional plastination and 3D reconstruction finite element analysis. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  3. Shah, M. A. A., et al. Microvasculature and trabecular bone in beagle proximal femur: Microstructural insights. Ann Anatomy. 258, 152368(2025).
  4. Mukherjee, K., Chattopadhyay, N. Pharmacological inhibition of cathepsin K: A promising novel approach for postmenopausal osteoporosis therapy. Biochem Pharmacol. 117, 10-19 (2016).
  5. Bertuglia, A., et al. Osteoclasts are recruited to the subchondral bone in naturally occurring post-traumatic equine carpal osteoarthritis and may contribute to cartilage degradation. Osteoarth Cartilage. 24 (3), 555-566 (2016).
  6. Alami, S., Hervouet, L., Poiraudeau, S., Briot, K., Roux, C. Barriers to Effective Postmenopausal Osteoporosis Treatment: A Qualitative Study of Patients' and Practitioners' Views. PLoS One. 11 (6), e0158365(2016).
  7. Hiligsmann, M., et al. A Systematic Review of Cost-Effectiveness Analyses of Drugs for Postmenopausal Osteoporosis. PharmacoEconomics. 33 (3), 205-224 (2014).
  8. Hadji, P., et al. Persistence, adherence, and medication-taking behavior in women with postmenopausal osteoporosis receiving denosumab in routine practice in Germany, Austria, Greece, and Belgium: 12-month results from a European non-interventional study. Osteoporosis Int. 26 (10), 2479-2489 (2015).
  9. Udagawa, N., et al. Osteoblasts/stromal cells stimulate osteoclast activation through expression of osteoclast differentiation factor/RANKL but not macrophage colony-stimulating factor. Bone. 25 (5), 517-523 (1999).
  10. Lee, K., et al. Selective Regulation of MAPK Signaling Mediates RANKL-dependent Osteoclast Differentiation. Int J Biol Sci. 12 (2), 235-245 (2016).
  11. Huang, H., et al. Osteoclast differentiation requires TAK1 and MKK6 for NFATc1 induction and NF-κB transactivation by RANKL. Cell Death Diff. 13 (11), 1879-1891 (2006).
  12. Matsumoto, Y., et al. RANKL coordinates multiple osteoclastogenic pathways by regulating expression of ubiquitin ligase RNF146. J Clin Investigat. 127 (4), 1303-1315 (2017).
  13. Lai, E. C. Notch signaling: control of cell communication and cell fate. Development. 131 (5), 965-973 (2004).
  14. Chen, X., et al. LY411575, a potent γ-secretase inhibitor, suppresses osteoclastogenesis in vitro and LPS-induced calvarial osteolysis in vivo. J Cellular Physiol. 234 (11), 20944-20956 (2019).
  15. Chen, S., Lee, B. H., Bae, Y. Notch Signaling in Skeletal Stem Cells. Calcified Tiss Int. 94 (1), 68-77 (2013).
  16. Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), (2012).
  17. Duan, L. Notch is activated in RANKL-induced osteoclast differentiation and resorption. Front Biosci. (13), 7064(2008).
  18. Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
  19. Hough, F. S., et al. The safety of osteoporosis medication. South African Med J. 104 (4), 279(2013).
  20. Espinosa, L. S., Inglés-Esteve, J., Robert-Moreno, A., Bigas, A. IκBα and p65 Regulate the Cytoplasmic Shuttling of Nuclear Corepressors: Cross-talk between Notch and NFκB Pathways. Mol Biol Cell. 14 (2), 491-502 (2003).
  21. Wang, Z., Li, Y., Sarkar, F. Notch Signaling Proteins: Legitimate Targets for Cancer Therapy. Curr Prot Peptide Sci. 11 (6), 398-408 (2010).
  22. Zhou, Z., et al. PP121 suppresses RANKL-Induced osteoclast formation in vitro and LPS-Induced bone resorption in vivo. Exp Cell Res. 388 (2), 111857(2020).
  23. Shah, M. A. A., et al. Regional distribution of microvasculature within the canine femoral head: a study of plastinated tissue histology and 3D reconstruction. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  24. Clayden, E. C. Practical Section Cutting and Staining. , Churchill. (1955).
  25. McHorney, C. A., Schousboe, J. T., Cline, R. R., Weiss, T. W. The impact of osteoporosis medication beliefs and side-effect experiences on non-adherence to oral bisphosphonates ates. Curr Med Res Opin. 24 (3), 707-708 (2008).
  26. Canalis, E. Notch in skeletal physiology and disease. Osteoporosis Int. 29 (12), 2611-2621 (2018).
  27. Zanotti, S., Canalis, E. Notch Signaling and the Skeleton. Endocrine Rev. 37 (3), 223-253 (2016).
  28. Grevers, L. C., et al. Immune complex-induced inhibition of osteoclastogenesis is mediated via activating but not inhibitory Fcγ receptors on myeloid precursor cells. Ann Rheumatic Dis. 72 (2), 278-285 (2013).
  29. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  30. Weber, J. M., Calvi, L. M. Notch signaling and the bone marrow hematopoietic stem cell niche. Bone. 46 (2), 281-285 (2010).
  31. Kovtonyuk, L. V., Fritsch, K., Feng, X., Manz, M. G., Takizawa, H. Inflamm-Aging of Hematopoiesis, Hematopoietic Stem Cells, and the Bone Marrow Microenvironment. Front Immunol. 7, (2016).
  32. Khosla, S., Hofbauer, L. C. Osteoporosis treatment: recent developments and ongoing challenges. Lancet Diabet Endocrinol. 5 (11), 898-907 (2017).
  33. Reid, I. R. Efficacy, effectiveness and side effects of medications used to prevent fractures. J Inter Med. 277 (6), 690-706 (2015).
  34. Cosman, F., et al. Clinician's Guide to Prevention and Treatment of Osteoporosis. Osteoporosis Int. 25 (10), 2359-2381 (2014).
  35. Chen, Y. H., et al. Melatonin protects against lipopolysaccharide-induced intra-uterine fetal death and growth retardation in mice. J Pineal Res. 40 (1), 40-47 (2005).
  36. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. J Clin Investigat. 100 (6), 1557-1565 (1997).
  37. Black, D. M., Rosen, C. J. Postmenopausal Osteoporosis. New Engl J Med. 374 (3), 254-262 (2016).
  38. Eastell, R., et al. Pharmacological Management of Osteoporosis in Postmenopausal Women: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metabol. 104 (5), 1595-1622 (2019).
  39. Leder, B. Z. Optimizing Sequential and Combined Anabolic and Antiresorptive Osteoporosis Therapy. JBMR Plus. 2 (2), 62-66 (2018).
  40. Grey, A., Bolland, M., Cundy, T. Maintaining Order in Osteoporosis Treatments. Journal of Bone Miner Res. 32 (5), 1147-1147 (2017).
  41. McClung, M. R. Role of bone-forming agents in the management of osteoporosis. Aging Clin Exp Re. 33 (4), 775-791 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hamowanie osteoklastogenezyLY900009osteoklasty indukowane RANKLresorpcja kościmakrofagi szpiku kostnegoWestern Blotbarwienie TRAPścieżka sygnałowa MAPK Akt
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.