Artykuł badawczy

Mikrouszkodzenie połączenia ścięgna z kością spowodowane ostrym, wyczerpującym wysiłkiem u szczurów: zmiany ultrastrukturalne i mechanizm

353 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69184

⸱

14 listopada 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation, Sichuan college of traditional Chinese medicine, 2Department of Rehabilitation, Mian-yang Orthopedic hospital, 3Sports Medicine Center, West China Hospital, Sichuan University, 4Department of Orthopedics and Orthopedic Research Institute, West China Hospital, 5Department of Geriatric Medicine, Mian-yang hospital of traditional Chinese medicine, 6Department of Rehabilitation Medicine, Sichuan Provincial Orthopedic Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego badania były zbadanie zmian ultrastrukturalnych i mechanizmów na styku ścięgna z kością wynikającą z ostrych, wyczerpujących ćwiczeń. Ostre, wyczerpujące ćwiczenia wywołują mikrouraz na styku ścięgna z kością, przejściowo aktywując stres ER i jego pośredniczone szlaki sygnałowe apoptotyczne. Niemniej jednak, te mikrourazy i stres z ER-u mogą być stopniowo przywracane po ćwiczeniach.

Streszczenie

Mikrourazy wywołane wysiłkiem na styku ścięgna z kością (enthesis) mogą prowadzić do tendinopatii. Badanie zmian ultrastrukturalnych i mechanizmów w tkanku po intensywnym, wyczerpującym ćwiczeniach może poprawić naszą wiedzę o tendinopatii i wyznaczyć leczenie kliniczne. W tym badaniu trzydzieści sześć samców szczurów Sprague-Dawley zostało losowo podzielonych na dwie grupy: kontrolną i wyczerpującą aktywność. Grupa wyczerpująca została dalej podzielona na pięć podgrup w zależności od czasu po ćwiczeniu: 0 godz., 6 godzin, 12 godz., 24 godziny i 48 godzin. Do badania zmian w połączeniu ścięgna pięta z kością stosowano barwienie hematoksylino-eozynę oraz mikroskopię elektronową. Ekspresja białek związanych ze stresem siatkówki endoplazmatycznej (ERS) GRP78, CHOP i Kaspaza-12 na styku ścięgna z kością została zmierzona za pomocą immunohistochemii (IHC). Po intensywnym wyczerpaniu połączenia ścięgien u szczurów, które przeszły wyczerpujące ćwiczenia, wykazywały istotne zmiany strukturalne. Chondrocyty i włókna kolagenowe wykazywały zauważalne zmiany ultrastrukturalne wskazujące na ERS. Poziom białka ERS wzrósł natychmiast po wysiłku, osiągając szczyt po 6 godzinach. Poziom białka zaczął spadać po 12 godzinach po wysiłku i wracał do poziomu wyjściowego po 48 godzinach. Podsumowując, ostre, wyczerpujące ćwiczenia powodują mikrouszkodzenia i stres siatkówki endoplazmatycznej w miejscu połączenia ścięgna z kością u szczurów, ale nie dochodzi do nieodwracalnych uszkodzeń. Terminowe leczenie i naprawa tych mikrourazów może zapobiec nadmiernym uszkodzeniom i rozwojowi tendinopatii.

Wprowadzenie

Tendinopatija Achillesa to powszechna choroba kliniczna spowodowana częstymi urazami przeciążenia kostki. To zaburzenie charakteryzuje się obrzękiem ścięgien, bólem i dysfunkcją. Jest bardziej powszechny u osób starszych i sportowców, szczególnie biegaczy i skoczków. Tendinopatija Achillesa dzieli się na tendinopatię nieinsercyjną i insercyjną. Tendinopatia nieintacyjna dotyka ścięgno 2 do 6 cm powyżej przyczepienia kości, natomiast tendinopatia intagencyjna dotyka połączenie ścięgnaz kością 1. Co więcej, tendinopatia nieinsercyjna zwykle występuje u osób z nadwagą, starszymi i mniej aktywnymi, podczas gdy tendinopatia insercyjna występuje u osób bardziej aktywnych1.

Połączenie ścięgna z kością, gdzie ścięgno wchodzi do kości, obejmuje stopniowe przejście z tkanki ścięgna do tkanki kostnej, w tym niezwapniałego włóknistka i zwapniałego włóknistkachrząstki 2. Ta zmiana umożliwia przejście od miękkiej i elastycznej tkanki ścięgna do twardej kości. W terminologii inżynierskiej ten obszar pełni rolę punktu kotwiczenia, przekazując siłę mięśniową ułatwiającą ruch stawów 3,4. Dlatego ten obszar jest miejscem koncentracji stresu i często narażony na urazy związane z przeciążeniem podczas sportu.

Badania kliniczne koncentrowały się głównie na tendinopatii nieinsercyjnej, przy czym mniejsza uwaga poświęcana jest tendinopatii insercyjnej na styku ścięgna z kością2. Badania wskazują, że przeciążenie obciążenia powoduje dezorganizację i fragmentację kolagenu, infiltrację tkanki tłuszczowej oraz neowaskularyzację ścięgna. Prowadzi to również do hiperplazji włóknistych, kostniałości śródochondrylnej oraz powstawania ostrog kostnych zarównow niezwapniałych, jak i zwapniałych obszarach włóknistości chrząstki. Jednak najnowsze badania sugerują, że wzorce skurczów mięśni mogą odgrywać ważniejszą rolę niż ilość wysiłku w przypadku tendinopatii insercyjnej 6,7. Dlatego potrzebne są dalsze badania, aby zrozumieć wpływ nadmiernego używania na połączenia ścięgien z kością. Wcześniejsze badania analizowały wpływ nadmiernego używania, takiego jak długotrwałe skakanie czy bieganie, na te skrzyżowania. Jednak niewielu badało wpływ intensywnego wysiłku fizycznego. Niedawne badanie sugeruje, że ostra aktywność fizyczna wywołuje stres siatkówki endoplazmatycznej w nerkach szczurów, co wskazuje na wzrost poziomu sygnalizacji IL-6 i białek szoku cieplnego (HSP) oraz zmniejszenie mRNA8 mitochondrialnego kompleksu oddechowego. Czy takie zmiany występują w połączeniach ścięgien z kością, nie zostało zgłoszone. Niniejsze badanie koncentruje się na połączeniu ścięgna z kością (enthesis), aby wyjaśnić zmiany i mechanizmy leżące u podstaw wywołane przez intensywne, wyczerpujące ćwiczenia. Wyniki mają na celu przyczynienie się do rozwoju strategii profilaktycznych dla tendinopatii wstawionej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie ze standardami etycznymi dla zwierząt doświadczalnych, ustanowionymi przez Wydział Nauki i Technologii Wyższego Instytutu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Syczuanie (nr zatwierdzenia: 2023DS01). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Projekt i procedura eksperymentalna

  1. Zwierzęta
    Trzydzieści sześć samców, 12-tygodniowych szczurów CD-Sprague-Dawley było trzymanych i karmionych ad libitum przez cały okres eksperymentalny. Środowisko utrzymywano w temperaturze 20-25 °C oraz wilgotności 50%-60%, z 12-godzinnym cyklem światła i ciemności.
  2. Projekt grupowy
    Po tygodniu adaptacyjnego karmienia szczury zostały losowo przydzielone do grupy kontrolnej (Con, n = 6) lub do grupy wyczerpującej ćwiczeń (EE, n = 30). Szczury z grupy EE przeszły szkolenie adaptacyjne, biegając z prędkością 10 m/min przez 15 minut na bieżni pod górę z nachyleniem 10 stopi przez trzy dni. Po szkoleniu adaptacyjnym grupa EE została podzielona na pięć podgrup czasowych: 0 h, 6h, 12 h, 24h oraz 48h po wyczerpujących ćwiczeniach.
  3. Procedura interwencji
    Szczury z grupy kontrolnej nie ćwiczyły, podczas gdy szczury z grupy EE przechodziły wyczerpujące bieganie na bieżni pod górę pod górę pod kątem 10 stopni (Rysunek 1A). Zgodnie z protokołem Bedford9, obciążenie ćwiczeń podzielono na trzy poziomy: Poziom 1 przy 10 m/min przez 15 minut, Poziom 2 przy 15 m/min przez 15 minut oraz Poziom 3 przy 20 m/min aż do wyczerpania (Rysunek 1B). Zmęczenie zostało wyznaczone, gdy szczur nie mógł już biegać i trzykrotnie utknął na torze w ciągu mniej niż 1 min10, pomimo powtarzających się niskointensywnych sygnałów elektrycznych (150 V, 0,5 mA prądu przemiennego) i dźwięku (70 dB).

Szczury zostały poświęcone przez nadmierne podanie 3% pentobarbitalu sodu (200 mg/kg) wewnątrzotrzewnego w określonych godzinach (0 godzin, 6 godzin, 12 godzin, 24 godziny i 48 godzin po wyczerpaniu ćwiczeń). Skóra i tkanki podskórne kości piętowej zostały starannie rozcięte, a ścięgno Achillesa przecięto 2 cm powyżej palca piętowego nożyczkami okulistycznymi. Prawy pięt (w tym przyczepione ścięgno Achillesa) został zachowany w 4% paraformaldehydzie do badań histopatologicznych i immunohistochemicznych. Dodatkowo trzy losowe próbki z lewej strony zostały przechowywane w roztworze 2% paraformaldehydu-2,5% glutaraldehydu do mikroskopii elektronowej w celu badania zmian ultrastrukturalnych ( rysunek 1C).

2. Histologia połączenia ścięgna i kości

Próbki były utrwalane w 4% paraformaldehydu przez 48 godzin i odwapniane 15% EDTA przez 4 tygodnie w temperaturze pokojowej (20-25 °C), przy czym roztwór zmieniano codziennie. Proces odwapnienia zakończył się, gdy kość można było łatwo przebić igłą bez użycia siły. Po odwapnieniu próbki przeszły odwodnienie w automatycznym procesie obejmującym stopniową serię etanolu i ksylenu, a następnie trzy płukania PBS. Próbki zostały osadzone w parafinie sagittally i przecięte na 5 μm. Barwienie hematoksylinowo-eozynowe przeprowadzono zgodnie ze standardowymi procedurami, a obrazy wykonano cyfrowym systemem mikrokamery trójocznej Panthera o powiększeniach 20× i 40×.

3. Skanowanie mikroskopią elektronową

Pozostałe próbki zostały poprzedzone 2% paradehydem-2,5% glutaraldehydem przez 48 godzin, następnie odwodnione w serii roztworów acetonowych, infiltrowane w analizatorze do utwardzania epoksydowego i wsadzone w sagittalnie. Półcienkie przekroje barwiono błękitem metylenowym w celu identyfikacji obszaru połączenia ścięgna z kością. Ultracienkie przekroje, o grubości około 60-90 nm, były cięte nożem diamentowym. Te fragmenty były barwione octanem uranilu przez 10-15 minut, a następnie cytrynianem ołowiu przez 1-2 minuty. Fragmenty zostały zbadane pod mikroskopem elektronowym transmisyjnego z powiększeniami 6000×, 12000× i 25000×.

4. Badanie immunohistochemiczne

Połączenie ścięgna z kością było rutynowo odwapniane i przecinane, jak opisano wcześniej. Po inkubacji roztworem antygenu buforowego cytrynianu przez 10 minut, próbki były traktowane 3%H2 O2przez 10 minut w celu blokowania aktywności endogennej nadoksydazy, a następnie blokowano normalną surowicą kozą przez 20 minut w temperaturze 25 °C. Następnie sekcje były inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C z pierwotnymi przeciwciałami, w tym GRP78 (1:100), CHOP (1:100) oraz Caspase-12 (1:100). Następnie próbki były inkubowane z przeciwciałami wtórnymi przez 2 godziny w temperaturze 25 °C. Rozwój koloru osiągnięto przy użyciu DAB przez 8 minut w 25 °C, co skutkowało pozytywnym sygnałem brązowo-żółtym. Jądra były ponownie barwione hematoksyliną przez 3 minuty. Do analizy średniej gęstości użyto oprogramowania Image-Pro Plus 6.0. Wybrano do analizy trzy obszary zainteresowania w obszarze połączenia ścięgna z kością (ścięgno, włóknistość chrząstkowa i zmineralizowana włóknistkowa chrząstka), a obliczono średnią wartość.

5. Analiza statystyczna

Do analizy danych i generowania wykresów użyto GraphPad Prism 8. Wszystkie dane wyrażane są jako średnia ± odchylenie standardowe. Porównania między różnymi grupami przeprowadzono za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a do porównań parowych zastosowano test Najmniej Istotnej Różnicy (LSD). Wartość P < 0,05 została uznana za statystycznie istotną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak pokazano na rysunku 2A, w grupie kontrolnej chondrocyty i fibrocyty kolagenowe w połączeniu ścięgna z kością są regularnie ułożone, a między włóknistą chrząstką a zmineralizowaną włóknistką znajduje się gładka niebieska linia, znana jako znak pływowy (żółte strzałki). W grupach wymagających wyczerpujących ćwiczeń zachodziły zmiany ultrastrukturalne na styku ścięgna z kością. Zmiany obejmują wzrost liczby chondrocytów (zielonych kół), przerzedzenie i pękni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Połączenie ścięgna z kością, znane również jako entezy lub miejsca przyczepu, umożliwia wknięcie ścięgien do kości i jest miejscem skupienia napięcia, gdzie więzadła i ścięgna przyczepiają się do kości4. Jako punkt kotwiczenia ułatwia ruch kostki, przekazuje siłę skurczu mięśni łydki na więzadła i ścięgna stopy oraz uczestniczy w ruchach kostek i stóp2. Połączenie ścięgna z kością składa się z czterech kolejnych obszarów: ścięgna, włóknistości chrząstki, zmineralizowanej wł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną wyrazić szczere podziękowania za wsparcie otrzymane od Natural Science Foundation (Grant nr 23ZRYB03), Projektu Zespołu Badawczo-Innowacyjnego (TD-2022-04), Grupy Innowacji Klinicznej Medycyny Klinicznej oraz Kolegium Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Syczuanie, a także za projekt badawczy na rok 2025 (25MSZX329) finansowany przez Syczuański Provincialny Zarząd Medycyny Chińskiej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2% Paraformaldehyd-2,5% roztwór glutaraldehyduMKBio, ChinyMM1515, Skan mikroskopii elektronowej
Przeciwciało anty-kaspaza12Hangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.HA500144Badanie immunohistochemiczne
Przeciwciało anty-CHOPHangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.ET1703-05Badanie immunohistochemiczne
Przeciwciało anty-GRP78Hangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.ER1706-50Badanie immunohistochemiczne
BiomikroskopiaMotic Industrial Group Co., Ltd. CHINYBA210DigitalBiomikroskopia w histologii połączenia ścięgna i kości Immunohistochemiczny test
CD-Sprague-Dawley szczuryBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.SCXK2021-0007 CD
Roztwór antygenu buforowego cytrynianuZSGB-Bio, ChinyZLI-9065, Badanie immunohistochemiczne
DAB   ZSGB-Bio, ChinyZLI-9018 Badanie immunohistochemiczne
EDTASinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009717Barwienie hematoksylinowo-eozynowe 
Epox 812Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.XW00000020Skan mikroskopii elektronowej
Etanol  Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009218Barwienie hematoksylinowo-eozynowe 
GraphPad Prism 8 GraphPad Software, Inc.  GraphPad Prism 8 Analiza statystyczna
H2O2 Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.011092708Badanie immunohistochemiczne
Image-Pro Plus 6.0Media Cybernetics Co., Ltd. USAImage-Pro Plus 6.0Badanie immunohistochemiczne
Paraformaldehyd  Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.20230408Barwienie hematoksylinowo-eozynowe  Badanie immunohistochemiczne
PBSZSGB-Bio, ChinyZLI-9062Skan mikroskopii elektronowej
Transmisyjny mikroskop elektronowyJAPOŃSKIE LABORATORIUM OPTYKI ELEKTRONOWEJ CO., LTDJEM-1400Flash, JaponiaSkan mikroskopii elektronowej
Bieżnia dla Szczura i MyszBioMed Easy Technologies Co., Ltd  CHINYSA101Wykonałem wyczerpujące ćwiczenia na bieżni
ksylenSinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10023418Barwienie hematoksylinowo-eozynowe 

Bibliografia

  1. Li, H. Y., Hua, Y. H. Achilles tendinopathy: Current concepts about the basic science and clinical treatments. Biomed Res Int. 2016, 6492597(2016).
  2. Tits, A., et al. Local anisotropy in mineralized fibrocartilage and subchondral bone beneath the tendon-bone interface. Sci Rep. 11 (1), 16534(2021).
  3. Doschak, M. R., Zernicke, R. F. Structure, function and adaptation of bone-tendon and bone-ligament complexes. J Musculoskelet Neuronal Interact. 5 (1), 35-40 (2025).
  4. Benjamin, M., et al. Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites ('entheses') in relation to exercise and/or mechanical load. J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).
  5. Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
  6. Ozone, K., et al. Structural and pathological changes in the enthesis are influenced by the muscle contraction type during exercise. J Orthop Res. 40 (9), 2076-2088 (2022).
  7. Ozone, K., et al. Eccentric contraction-dominant exercise leads to molecular biological changes in enthesis and enthesopathy-like morphological changes. J Orthop Res. 41 (3), 511-523 (2023).
  8. da Silva, A. S. R., et al. Interleukin-6 modulates endoplasmic reticulum stress signaling and mitochondrial protein complexes in the kidney following acute exhaustive exercise. Cell Stress Chaperones. 30 (5), 100111(2025).
  9. Wang, Y., et al. Effect of one-time high load exercise on skeletal muscle injury in rats of different genders: oxidative stress and mitochondrial responses. Acta Cir Bras. 37 (8), e370805(2022).
  10. Świątkiewicz, M., et al. Increases in brain 1 H-MR glutamine and glutamate signals following acute exhaustive endurance exercise in the rat. Front Physiol. 8, 19(2017).
  11. Sun, Y., et al. Reconstruction of large chronic rotator cuff tear can benefit from the bone-tendon composite autograft to restore the native bone-tendon interface. J Orthop Translat. 24, 175-182 (2020).
  12. Gögele, C., Hahn, J., Schulze-Tanzil, G. anatomical tissue engineering of the anterior cruciate ligament entheses. Int J Mol Sci. 24 (11), 9745(2023).
  13. Sartori, J., et al. Three-dimensional imaging of the fibrous microstructure of Achilles tendon entheses in Mus musculus. J Anat. 233 (3), 370-380 (2018).
  14. Wang, L., et al. VEGF and BFGF expression and histological characteristics of the bone-tendon junction during acute injury healing. J Sports Sci Med. 13 (1), 15-21 (2014).
  15. Benjamin, M., Rufai, A., Ralphs, J. R. The mechanism of formation of bony spurs (enthesophytes) in the Achilles tendon. Arthritis Rheum. 43 (3), 576-583 (2000).
  16. Luo, J., et al. Animal model for tendinopathy. J Orthop Translat. 42, 43-56 (2023).
  17. Cook, J. L., et al. Revisiting the continuum model of tendon pathology: What is its merit in clinical practice and research. Br J Sports Med. 50 (19), 1187-1191 (2016).
  18. Yu, C., et al. Exercise effects on the biomechanical properties of the Achilles tendon: A narrative review. Biology (Basel). 11 (2), 172-184 (2022).
  19. Lu, H., et al. Treadmill running initiation times and bone-tendon interface repair in a murine rotator cuff repair model. J Orthop Res. 39 (9), 2017-2027 (2021).
  20. Schwarz, D. S., Blower, M. D. The endoplasmic reticulum: Structure, function and response to cellular signaling. Cell Mol Life Sci. 73 (1), 79-94 (2016).
  21. Oakes, S. A., Papa, F. R. The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology. Annu Rev Pathol. 10, 173-194 (2015).
  22. Celik, C., Lee, S. Y. T., Yap, W. S., Thibault, G. Endoplasmic reticulum stress and lipids in health and diseases. Prog Lipid Res. 89, 101198(2023).
  23. Almanza, A., et al. Endoplasmic reticulum stress signaling - from basic mechanisms to clinical applications. FEBS J. 286 (2), 241-278 (2019).
  24. Huang, J., et al. Endoplasmic reticulum stress associates with the development of intervertebral disc degeneration. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1094394(2023).
  25. Murata, N., et al. Insulin reduces endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis by decreasing mitochondrial hyperpolarization and caspase-12 in INS-1 pancreatic β-cells. Physiol Rep. 12 (12), e16106(2024).
  26. Chen, Y., et al. Single-cell integration analysis of heterotopic ossification and fibrocartilage developmental lineage: Endoplasmic Reticulum Stress Effector Xbp1 transcriptionally regulates the notch signaling pathway to mediate fibrocartilage differentiation. Oxid Med Cell Longev. 2021, 7663366(2021).
  27. Yao, Z., et al. Hydroxycamptothecin inhibits peritendinous adhesion via the endoplasmic reticulum stress-dependent apoptosis. Front Pharmacol. 10, 967(2019).
  28. Yao, Z., et al. Hydroxycamptothecin prevents fibrotic pathways in fibroblasts in vitro. IUBMB Life. 71 (5), 653-662 (2019).
  29. Li, J., et al. Extracellular vesicles from hydroxycamptothecin primed umbilical cord stem cells enhance anti-adhesion potential for treatment of tendon injury. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 500(2020).
  30. Liu, Y. C., et al. Alda-1, an activator of ALDH2, ameliorates Achilles tendinopathy in cellular and mouse models. Biochem Pharmacol. 175, 113919(2020).
  31. Liu, C., et al. Tendon microstructural disruption promotes tendon-derived stem cells to express chondrogenic genes by activating endoplasmic reticulum stress. J Orthop Res. 41 (2), 290-299 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

stres retikulum endoplazmatycznegomodel szczurzybarwienie hematoksylin i eozynmikroskopia elektronowaimmunohistochemiaultrastruktura chondrocyt wzmiany w kien kolagenowych

Powiązane artykuły