Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do podejść mikroskopowych

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69185

⸱

7 listopada 2025

 ,  ,  , 
1Division of Biological and Biomedical Systems, School of Science and Engineering, University of Missouri Kansas City

W tym artykule

Podsumowanie

Drosophila to potężny model do zrozumienia podstawowych mechanizmów miogenezy. Ten protokół do sekcji i przygotowania przecięć półklatki piersiowej umożliwia mikroskopową analizę mięśni pośrednich lotów zarówno w stadium poczwarki, jak i dorosłych. Protokół ten umożliwia konfokalne obrazowanie morfologii komórkowej, lokalizacji białek, struktury mięśni oraz wielu innych aspektów miogenezy.

Streszczenie

Pośrednie mięśnie lotu (IFM) Drosophila melanogaster stanowią potężny model genetyczny do badania podstawowych zasad miogenezy. Mechanizm kurczliwy oraz wiele składników sarkomeru są zachowane od much po kręgowce, umożliwiając badanie procesów komórkowych od regulacji transkrypcji i przetwarzania RNA po metabolizm i mechanobiologię, które kierują i precyzyjnie dostosowują rozwój mięśni. Wiele z tych szlaków komórkowych jest zmienionych w ludzkich miopatiach, a badania IFM dostarczają istotnych informacji na temat molekularnej etiologii chorób mięśni. W szczególności muchy doskonale nadają się do mikroskopii, analizując morfologię i funkcję miofibry oraz sarkomeru w całym procesie miogenezy IFM, od specyfikacji mioblastów po tworzenie, dojrzewanie i utrzymanie miofibryli. Przedstawiono tutaj protokół do sekcji D. melanogaster IFM w punktach czasowych poczwarki i dorosłych dla podejść mikroskopowych. Przedstawiono ilustrowane protokoły do sekcji hemitorax późnych poczwarek i dorosłych IFM, a także do otwartej księgi rozwarstwiania wczesnych IFM poczwarek. Opisano procedury utrwalania, barwienia i montażu próbek oraz typowe artefakty rozcinania, a reprezentatywne dane pokazują kompatybilność sekcji IFM z różnymi odczynnikami fiksacyjnymi. Protokoły te są stosowane do badania hipomorficznego allelu SmnE33 neuronu przeżywalnego (Smn) wiążącego białko RNA, 26 godzin po utworzeniu poczwarki (APF), 72 h APF oraz u dorosłych IFM, dostarczając nowych wglądów w model zaniku ruchowego rdzenia (SMA) i ilustrując ogólną użyteczność tego protokołu. Ten szczegółowy protokół ułatwia dostęp do systemu modelu IFM oraz pozyskiwanie wysokiej jakości danych mikroskopicznych w celu badania zasad miogenezy.

Wprowadzenie

Zwierzęta mają setki mięśni, które kontrolują różne ruchy, od umożliwiania chodzenia, przez ułatwianie mowy, po chwytanie narzędzia. Aby wspierać tak szeroki zakres funkcji, mięśnie różnią się rozmiarem, przyczepem, zdolnością kurczliwym, metabolizmem i ekspresją genów1. Głównym obszarem w dziedzinie biologii mięśni jest zrozumienie, jak te różnice strukturalne i funkcjonalne powstają w trakcie rozwoju i jak są zmieniane w chorobie mięśni2. Skurcz mięśni jest napędzany przez sarkomery zbudowane z cienkich filamentów zawierających aktynę, zakotwiczonych w dysku Z, które przeplatają się z grubymi włóknami zawierającymi miozynę w dwubiegunowym, zakotwiczonymi na liniiM-3. Sarkomery są zorganizowane od końca do końca w miofibrilach, a ten regularny układ w mięśniach prążkowanych objawia się jako naprzemienne jasne i ciemne pasy pod mikroskopem4, co stanowi praktyczną wizualną metodę monitorowania zmian w montażu i organizacji sarkomerów. W połączeniu z genetyką i podejściami biochemicznymi, mikroskopia dostarczyła ważnych informacji na temat procesów komórkowych, takich jak regulacja transkrypcji, przetwarzanie RNA, metabolizm oraz mechanotransdukcja 5,6,7, które instruują i dopracowują rozwój oraz funkcję mięśni. Wiele z tych procesów komórkowych jest zakłóconych w ludzkich miopatiach i zaburzeniach nerwowo-mięśniowych 8,9, podkreślając znaczenie zrozumienia rozwoju mięśni, aby lepiej zrozumieć etiologię chorób mięśni. Postępy w inżynierii genetycznej, umożliwiające manipulację pojedynczymi komórkami oraz endogenne znakowanie białek10,11, w połączeniu z postępem technologicznym w pozyskiwaniu obrazów i rozdzielczości12,13, zapewniają ciągłe znaczenie mikroskopii dla badań mięśniowych. Systemy modelowe z jasnymi i łatwymi do wdrożenia protokołami do sekcji i przygotowania próbek mięśni są zatem cenne w dziedzinie mięśni.

Mięśnie pośredniego lotu (IFM) D. melanogaster są potężnym i dobrze scharakteryzowanym modelem do badania podstawowych zasad miogenezy8. IFM składają się z sześciu mięśni grzbietowo-podłużnych (DLM) na hemitoraksie, które tworzą się na larwalnych wzorcach mięśniowych, oraz siedmiu włókien grzbietowo-brzusznych (DVM), które powstają de novo podczas rozwoju poczwarki14. Ze względu na ich dostępność w pobliżu linii środkowej, wiele badań IFM koncentruje się na DLM, największym mięśniu dorosłych much obejmujących całą długość 1 mm tułowia15. Na początku poczwarkownictwa mioblasty IFM migrują ze swojej niszy na zawiasie dysku skrzydła do klatki piersiowej, gdzie łączą się, tworząc myorurki syncytialne16. Po przyczepieniu ścięgien około 24 godzin APF w temperaturze 27 °C, miofibry IFM stopniowo organizują cytoplazmę i cytoszkielet, kompaktowają się i rozpoczynają miofibrylogenezę od 30 do 32 h APF17. Do miofibrylów dodaje się nowe sarkomery, a włókna rosną, wypełniając tułów aż do około 48 godzin APF. IFM przechodzą następnie proces dojrzewania zgodny ze zmianami zarówno w transkrypcji, jak i splicingu, co sprzyja nabyciu właściwości metabolicznego i kurczliwego u dorosłych oraz aktywacji rozciągania18. Dorosłe muchy wylatują z przewarki w odległości od 90 do 100 godzin APF w 27 °C, a około 100 h APF (samice około 98 h APF, samce około 102 h APF) przy 25 °C19. IFM to wszechstronny i istotny system modelowy. Mogą być monitorowane na wszystkich etapach miogenezy, morfologicznie i funkcjonalnie różnią się od innych typów miofibr u muchy oraz korzystają z szerokiego wachlarza dostępnych narzędzi genetycznych i podejść do manipulacji 8,20. Mechanizm kurczliwy, podstawowa morfologia sarkomerów oraz wiele elementów strukturalnych są zachowane od much do kręgowców5, co umożliwia przeniesienie zasad miogenicznych z much na ludzi. Rzeczywiście, modele much chorób nerwowo-mięśniowych, takich jak dystrofia miotoniczna, zanik ruchowy rdzenia kręgosłupa (SMA), miofibrylacje i aktinopatie, dostarczyły etiologicznych i terapeutycznych wglądów21,22. Co istotne, muchy doskonale nadają się do mikroskopii, analizując morfologię miofibry i sarkomeru w różnych obszarach miogenezy, od specyfikacji mioobszaru, przez miofibrylogenezę, aż po dojrzewanie i utrzymanie sarkomerów.

IFM Drosophila są wykorzystywane w mikroskopii od ponad czterech dekad, co znacząco przyczynia się do zrozumienia wzrostu i rozwoju mięśni8. W tym czasie protokoły rozcinania IFM były nieustannie adaptowane wraz z postępem technologii, co doprowadziło do szerokiego wachlarza protokołów prezentowanych na różnym poziomie szczegółowości, które są optymalne dla jednych, a suboptymalne dla innych technik obrazowania. Na przykład protokoły opracowane dla mikroskopii elektronowej obejmują silne warunki fiksacji, ultracienkie sekcjonowanie oraz barwienie kontrastowe metalamiciężkimi 3,23,24,25, ale nie są optymalne dla mikroskopii lekkiej. Protokoły opracowane do szybkiego rozkładania IFM z tułowia do zastosowań w testach biochemicznych lub analizach molekularnych26,27 tracą kontekst tkankowy i mogą zakłócać strukturę miofibryli, przez co są nieoptymalne dla podejść mikroskopowych. Metody sekcji opracowano do analizy mięśni larwalnych lub dorosłych mięśni brzucha20,28, ale nie są optymalne do izolacji nienaruszonych IFM. Metody obrazowania na żywo wymagają albo minimalnie inwazyjnych sekcji, albo specjalnych mediów, aby utrzymać tkankę IFM przy życiu podczas procesu obrazowania29,30, i nie obejmują etapów fiksacji niezbędnych do zachowania mięśni do immunohistochemii. Istnieje wiele protokołów dotyczących osadzania parafiny lub kriogenicznego przecięcia tkanek IFM, które są zgodne z barwieniem histochemii lub przeciwciałami 27,31,32, ale podejścia te zazwyczaj obejmują zamrażanie i odwodnienie tkanek, co może zmieniać ultrastrukturę mięśni i ograniczać rozpoznawanie niektórych antygenów przez przeciwciała pierwotne. Protokoły bezpośrednio ustalające IFM zachowują morfologię mięśni i ograniczają zmiany w konformacji antygenów i są pożądane w wielu eksperymentach immunohistochemicznych24. Jednak protokoły te są również skierowane do konkretnych zastosowań, na przykład protokołów dysocjujących IFM umożliwiających analizę pojedynczych miofibryli za pomocą fluorescencji, krioEM lub mikroskopii superrozdzielczej 20,33,34. Inne przykłady to protokoły polegające na rozcinaniu nienaruszonych włókien IFM z tułowia 32,35 lub generowaniu preparatów pełnościennych lub hemitoraksu 20,32,36, które umożliwiają analizę zarówno miofibr, jak i sarkomerów w nienaruszonym kontekście. Dla nowego użytkownika może być trudno przejrzeć się przez dużą liczbę istniejących protokołów, z których większość jest oparta na tekstie. Studenci i studenci naukowi skorzystaliby z szczegółowego protokołu sekcji IFM stosowanego w standardowych zastosowaniach immunohistochemii.

Artykuł zawiera serię protokołów dotyczących sekcji i przygotowania IFM D. melanogaster na etapach poczwarki i dorosłych dla podejść mikroskopii immunohistochemicznej. Podejście to zostało wykorzystane w ostatnich publikacjach śledzących funkcje rozwojowe białek wiążących RNA Bruno137 i Rbfox138 w całym okresie miogenezy IFM. Protokół zawiera szczegółowe ilustracje i obrazy krok po kroku, które prowadzą potencjalnych użytkowników przez rozwarstwienie hmitołówki IFM dorosłych i późnych poczwarek (48 h do 96 h APF), gdzie tułów jest przecięty wzdłuż linii środkowej, zachowując nienaruszoną strukturę miofibry. Ponadto protokół obejmuje otwarte rozdziały wczesnych stadiów poczwarki (8 h do 48 h APF), gdzie brzuszna część tułowia jest przecięta i podnoszona, podobnie jak otwieranie książki, aby odsłonić nienaruszone IFM przyczepione do grzbietowej naskórki. Dalsze etapy protokołu obejmują utrwalanie, barwienie i montaż próbek, a reprezentatywne dane pokazują, że to podejście jest kompatybilne z różnymi metodami fiksacji przygotowującymi tkanki do immunohistochemii i mikroskopii fluorescencyjnej. Przedstawione są reprezentatywne przykłady, aby pomóc nowym użytkownikom w identyfikacji powszechnych artefaktów sekcji. Protokół ten jest stosowany do analizy fenotypu rozwojowego IFM SmnE33, hipomorficznego allelu neuronu ruchowego przeżycia (Smn), używanego jako model muchy zaniku ruchowego rdzenia (SMA)21,39, w 26 h APF, 72h APF oraz u dorosłych IFM. Przedstawione tutaj dane dostarczają wglądu w specyficzną funkcję mięśniową Smn i podkreślają zastosowanie tego protokołu sekcji do badania rozwoju mięśni oraz etiologii chorób mięśni.

Protokół

Oświadczenie etyczne:
Wszystkie eksperymenty w tym protokole wykorzystują Drosophila melanogaster, owada holometabolicznego. Bezkręgowce nie podlegają regulacjom dotyczącym dobrostanu zwierząt w Stanach Zjednoczonych, a ich stosowanie nie wymaga etycznego zatwierdzenia. Wszystkie prace były prowadzone zgodnie ze standardowymi wytycznymi dotyczące bezpieczeństwa biologicznego i bezpieczeństwa laboratoryjnego, a prace zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Bezpieczeństwa Instytucjonalnego Uniwersytetu Missouri Kansas City na podstawie protokołu numer 21940 (22-11).

1. Rozwarstwienie mięśnia piersiowego u dorosłych (Rysunek 1)

  1. Zbierz niezbędne materiały, w tym dwie kleszcze Dumont #5 z końcówkami biologicznymi, kleszcze Dumont #3, parę nożyczek sprężynowych Vannas, plastikową pipetę, pędzel malarski, płytkę z 24 dołkami, chusteczki bezkłaczkowe, szkiełko do mikroskopu oraz ostrza kriostatu (patrz Tabela materiałów). Przygotuj 1x PBS, 0,05% PBS-T oraz roztwory stabilizacyjne (patrz Plik Uzupełniający 1). Dostępny jest przegląd diagramu przepływu następującego rozwarstwienia dorosłej hemitorax (Rysunek uzupełniający 1).
  2. Zbieraj dorosłe osobniki o pożądanym genotypie i wieku (na przykład świeżo wydzielone, dorosłe osobniki 1 dzień lub 5 dni dorosłe). Znieczulaj próbki naCO2 lub lodzie.
    UWAGA: Muchy używane w tym protokole hodowano w cyklu 12-godzinnym dniem i 12-godzinnym nocnym w inkubatorze kontrolowanym temperaturą i wilgotnością. Drosophila jest standardowo uprawiana w temperaturze 25 °C lub 27 °C, a może być uprawiana w 18 °C, co wydłuża cykl wzrostu z 10 do około 20 dni.
  3. Użyj plastikowej pipety, aby przenieść kroplę 1x PBS40 na szkiełko mikroskopowe pod mikroskopem stereo rozcinającym.
  4. Przenosi się próbki much do kropli PBS w małych grupach za pomocą pędzla lub kleszczy (Rysunek 1A). Usuń głowę (Rysunek 1B), skrzydła (Rysunek 1C - D) i odwłok (Rysunek 1E) za pomocą nożyczek szynowych Vannas. Zostaw nogi przymocowane (rysunek 1F).
  5. Delikatnie przenieś piersi za pomocą szczoteczki lub kleszczy do roztworu utrwalającego 500 μL w jednej z dołków płyty z 24 dołkami. Umocuj na żądany czas (zazwyczaj 15-60 minut) na nutatorze/shakerze rockingowym.
    UWAGA: Ten protokół jest kompatybilny z wieloma wiązaniami, w tym paraformaldehydem, glutaraldehydem, metanolem, roztworem glioksalowym i innymi. Zobacz Reprezentatywne Wyniki oraz Plik Uzupełniający 1 , aby uzyskać szczegóły dotyczące optymalizacji warunków fiksacji. Utrwalające środki należy obchodzić się rękawicami i odpowiednim środkiem ochrony osobistej (PPE) zgodnie z wytycznymi dotyczącymi niebezpiecznych substancji chemicznych obowiązujących w Twojej instytucji.
  6. Usuń utrwalacz pipetą 200 μL i przepłucz w 1 mL 0,05% PBS-T na nutatorze/bujającym shakerze przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Uwalniaj utrwalający zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi niebezpiecznych chemikaliów. Dla większości antygenów stałe torace można przechowywać w 1 ml 0,05% PBS-T przez maksymalnie 2 tygodnie w temperaturze 4 °C przed cięciem i barwieniem. Wyższe stężenia Triton X-100 powinny być testowane przed użyciem, ponieważ długie inkubacje w detergentze mogą obniżać strukturę sarkomeru.
  7. Usuń bufor pipetą 200 μL i przenieś toras pędzelką lub kleszczami do kropli 0,05% PBS-T na szkiełku mikroskopowym pod mikroskopem stereoskopowym.
  8. Ukierunkuj tułów tak, że tarcza skierowana jest do góry i ustabilizowana między parą kleszczy Dumont #3 (Rysunek 1G-H).
  9. Przesuwaj ostrze kriostatu przez tułów, aby naciąć tarczę (rysunek 1H, J, L), a następnie przetnij jednym gładkim ruchem w dół wzdłuż linii środkowej (rysunek 1I, J, L - N), aby uzyskać przekrój półklatki piersiowej odsłaniający IFM (rysunek 1K).
    UWAGA: Ważne jest, aby skórka była "nacięcia" lub popękana przed przecięciem IFM, aby uniknąć rozciągania artefaktów uszkadzających strukturę sarkomu. Nie "piłuj" ostrza tam i z powrotem, ponieważ ten ruch mechanicznie uszkadza IFM, powodując postrzępione miofibril. Zbyt duża ilość bufora destabilizuje tułów między kleszczemi i utrudnia cięcie. Alternatywne metody obejmują stabilizację klatki piersiowej pojedynczo taśmą dwuprzylepną, aby ułatwić cięcia, a także cięcie od strony brzusznej klatki piersiowej.
  10. Przenieś obie połówki tułowia na miejsce na zlewce, gdzie pozostaną przykryte buforem, aby nie wysychać, ale nie przeszkadzać w przyszłych cięciach. Powtarzaj kroki 1.8-1.10, aż wszystkie klatki piersiowe zostaną przecięte.
  11. Użyj kleszczy do przeniesienia półprzekrojów klatki piersiowej z preparatu mikroskopowego do 500 μL 0,05% PBS-T w jednym dołku płytki z 24 dołkami i przeprowadzić blokowanie oraz immunodbarwienie (patrz sekcja 4 poniżej).

2. Rozwarstwienie hemitoraksu późnego poczwarkowego IFM (~48 h do 96 h APF) (Rysunek 2, Rysunek 3)

  1. Poczwarki w stadium pożądanego genotypu i wiek do wybranego punktu rozwoju poczwarki (Rysunek 2). Zbieraj białe pre-poczwarki męskie lub żeńskie (Rysunek 2A, B) za pomocą wilgotnego pędzla i inkubuj na zwilżonym papierze filtracyjnym w misce do hodowli komórek o średnicy 60 mm. Wcześniej opisano etap i usunięcie poczwarki z obudowy poczwarki.
    UWAGA: Poczwarki przechodzą liczne zmiany morfologiczne wraz z wiekiem, takie jak odwrócenie głowy i pigmentacja osłony poczwarki, oczu i włosia19,41 (Rysunek 2C). Te cechy morfologiczne mogą posłużyć jako przybliżony przewodnik do określenia wieku poczwarki (Rysunek 2D-E) oraz do identyfikacji poczwarek, które nie rozwijają się prawidłowo (Rysunek 2F). Aby jednak zapewnić dokładny harmonogram etapowania, zaleca się zbieranie białych pre-poczwarek w wąskich oknach czasowych, na przykład co 30 minut lub co 2 godziny. Ściśle uporządkowane punkty czasowe są niezbędne do wyróżnienia istotnych zmian w strukturze cytoszkieletu i długości miofibry, które występują od 24 do 35 h APF, a także do wyróżnienia w strukturze sarkomeru po 35h, 48h, 60h, 72h, 80h i 90h APF18,42.
  2. Zbierz niezbędne materiały, w tym pędzel malarski, dwie kleszcze Dumont #5 z końcówkami biologicznymi, parę nożyczek sprężynowych Vannas, taśmę dwuprzylepną, szkiełko do mikroskopu, plastikową pipetę, płytkę z 24 dołkami, Kimwipes oraz ostrza kriostatu (patrz Tabela materiałów). Przygotuj 1x PBS, 0,05% PBS-T oraz roztwory stabilizacyjne (patrz Plik Uzupełniający 1). Dostępny jest przegląd w formie diagramu przepływu następującego rozwarstwienia hemitorax poczwarki (Rysunek uzupełniający 2).
  3. W wyznaczonym momencie używaj pędzla, aby przenieść poczwarki z papieru filtrującego na pasek taśmy dwuprzylepnej przyklejonej do szkiełka mikroskopu pod mikroskopem stereo z powiększeniem 10-20x (Rysunek 3A,B). Ułóż poczwarki na taśmie skierowane w tym samym kierunku, od strony brzusznej do dołu.
  4. Użyj pary kleszczy #5, aby otworzyć przednią część obudowy poczwarki pierwszej poczwarki, delikatnie usuwając operkulum (obszar nad głową) (Rysunek 3C, D, I).
  5. Ostrożnie użyj kleszczy #5, aby przeciąć obudowę poczwarki tuż grzbietową od skrzydła i odklejać ją od poczwarki w krokach 1-2 mm. Przymocuj obudowę poczwarki do taśmy podwójnej klejącej, gdy przesuwamy od przodu do tyłu (Rysunek 3E - G, I). Unikaj kłucia poczwarki, zamiast tego włóż końcówkę kleszczy między obudowę poczwarki a błoną podstawną/pęcherką otaczającą poczwarkę.
  6. Po usunięciu obudowy użyj ruchu nabierania kleszczemi, aby podnieść ją pod powierzchnię (rysunek 3H, I) i delikatnie przenieść poczwarkę z obudowy do kropli 1x PBS na drugim szkiełku mikroskopowym (rysunek 3J, K), aby uniknąć odwodnienia. Powtarzaj kroki 2.4-2.6 (Rysunek 3I), aż wszystkie poczwarki zostaną usunięte z obudowy poczwarki.
  7. Usuń odwłok z rozciętych poczwarek za pomocą nożyczek sprężynowych Vanna (Rysunek 3L).
    UWAGA: W kolejnym kroku usuwa się odwłok, aby umożliwić lepszą penetrację za pomocą utrwalacza. Aby uniknąć uszkodzenia klatki piersiowej, tnij bezpośrednio w brzuchu, pozostawiając do 30% brzucha przyczepionego do klatki piersiowej.
  8. Delikatnie przenieś główkę poczwarki razem z tułowiem (rysunek 3M) szczoteczką lub kleszcze do 500 μL roztworu fiksacyjnego w jednym dołku płytki z 24 dołkami. Utrwalić przez pożądany czas (zazwyczaj 15-60 min) i przemyć w 1 mL 0,05% PBS-T, zgodnie z krokami 1,5-1,6.
  9. Usuń bufor pipetą 200 μL i przenieś klatkę piersiową szczoteczką lub kleszcze do kropli 0,05% PBS-T na szkiełku mikroskopowym pod stereoskopowym mikroskopem rozcinającym, przy 10-krotnym powiększeniu.
  10. Oddziel jedną próbkę od reszty i ustabilizuj ją brzuszną stroną w dół, ustabilizowaną między parą kleszczy Dumont #3 (Rysunek 3N).
  11. Przesuń ostrze kriostatu po tułowiu aż błona podstawna i skórka zostaną rozcięte, a następnie jednym gładkim ruchem w dół wzdłuż linii środkowej (Rysunek 3O), aby uzyskać przecięcia półpiersiowe odsłaniające IFM (Rysunek 3P).
    UWAGA: Nie "piłuj" ostrza tam i z powrotem, ponieważ ten ruch mechanicznie uszkadza IFM, powodując strzępione mięśnie mięśniowe. Zbyt duża ilość bufora destabilizuje tułów między kleszczemi i utrudnia cięcie. Poczwarki piersiowe mogą być przecięte z przymocowaną głową i skierowane w lewo lub w prawo.
  12. Przenieś obie połówki tułowia na miejsce na zlewce, gdzie pozostaną przykryte buforem, aby nie wysychać, ale nie przeszkadzać w przyszłych cięciach. Powtarzaj kroki 2.10-2.12, aż wszystkie piersi zostaną przecięte.
  13. Użyj kleszczy, aby przenieść półprzecięcia tułowia z preparatu mikroskopowego do 500 μL 0,05% PBS-T w jednym dołku płytki z 24 dołkami i przeprowadzić blokowanie oraz immunobarwienie (patrz krok 4 poniżej).

3. Otwarta sekcja wczesnego IFM poczwarki (~15 h do 48 h APF) (Rysunek 4)

  1. Poczwarki stadia pożądanego genotypu i wiek do wybranego punktu rozwoju poczwarki (Rysunek 2), jak opisano powyżej (Krok 2.1).
    UWAGA: W przypadku sekcji otwartej książki poczwarki powinny być rozcięte w grupach nie więcej niż 8-10 much.
  2. Zbierz niezbędne materiały, w tym pędzel, dwie szczypce Dumont #5 z końcówkami biologicznymi, parę nożyczek sprężynowych Vannas, taśmę do przylepów, szkiełko do mikroskopu, plastikową pipetę, czarną silikonową miskę do rozcinania, czarną szklaną miskę do bejcowania, szpilki przeciwowadniowe oraz chusteczki bez kłaczków (patrz Tabela materiałów). Przygotuj 1x PBS, 0,05% PBS-T oraz roztwory stabilizacyjne (patrz Plik Uzupełniający 1). Dostępny jest przegląd w formie diagramu przepływu poniższej otwartej sekcji poczwarki (Rysunek Uzupełniający 3).
  3. W wybranym momencie usuń poczwarki z obudowy poczwarki, jak opisano w krokach 2.3-2.6. Po wyjęciu z obudowy przenieś poczwarki do czarnej krzemowej misy do rozcinania napełnionej 1x PBS (rysunek 4A).
  4. Po uwolnieniu wszystkich poczwarek z obudowy poczwarki użyj kleszczy Dumont #5, aby pokonać napięcie powierzchniowe i delikatnie przeciąć rozczłonkowane poczwarki na powierzchnię krzemu. Ułóż poczwarki w linię blisko środka naczynia (rysunek 4B).
  5. Przez odwłok każdej poczwarki włóż dwie igły owadzie za pomocą kleszczy Dumont #5, aby utrzymać ją na miejscu (rysunek 4C,D). Upewnij się, że poczwarki są ustawione tak, że brzuszna strona jest do góry.
  6. Użyj nożyczek sprężynowych Vannas, aby rozciąć błonę podstawną i przednią część głowy każdej poczwarki (Rysunek 4E).
  7. Włóż nożyczki do otworu i tnij wzdłuż prawej i lewej strony każdej poczwarki (Rysunek 4F, G, Q). Umieść nożyczki i tnij tuż poniżej rozwijającego się notum z powrotem do połączenia między tułowiem a odwłokiem, aby usunąć nogi i skrzydła z częścią brzuszną. Upewnij się, że nożyczki są włożone poziomo i nie dotykają grzbietowej części tułowia (Rysunek 4Q).
  8. Użyj kleszczy Dumont #5, aby chwycić i podnieść brzuszną część poczwarki i usunąć ją nożyczkami sforsowymi Vanna (Rysunek 4H, I, Q).
  9. Usuń mózg, brzuszny sznur nerwowy (VNC), tchawicę i jelita za pomocą kleszczy Dumont #5 (Rysunek 4J,K,Q). Należy uważać, aby nie zakłócić rozwijających się IFM, które znajdują się bezpośrednio pod tchawicą oraz VNC przyczepionych do naskórka na grzbietowej części klatki piersiowej.
  10. Przycinaj końcówkę pipety o pojemności 200 μL, aby stworzyć szersze otwarcie. Użyj pipety 200 μL z przyciętą końcówką, aby delikatnie przemyć 1x bufor PBS na tułowiu, aby usunąć większość pozostałych tłuszczów i odsłonić IFM (Rysunek 4L, M). Bądź delikatny, aby nie naderwać przyczepów ścięgien łączących włókna mięśniowe z naskórkiem.
  11. Użyj nożyczek sprężynowych Vannas, aby przyciąć linię środkową grzbietowej klatki piersiowej, tworząc dwa "listki" zawierające IFM (rysunek 4N).
  12. Odetnij listki grzbietowego tułowia od odwłoka nożyczkami (rysunek 4O, Q) i przenieś je do 300 μL roztworu utrwalającego w czarnej szklanej misce za pomocą kleszczy Dumont #5 (rysunek 4P). Chwyć listki przy głowie za pomocą kleszczy, aby nie uszkodzić miofibr lub ścięgien IFM.
  13. Ustaw na pożądany czas (zazwyczaj 15 minut). Użyj pipety 200 μL, aby ostrożnie usunąć utrwalacz i przemyć 500 μL 0,05% PBS-T. Przystąpić do blokowania i immunodymatycznego (patrz krok 4 poniżej).
    UWAGA: Nie nutować ani nie robić próbek kamieniem w czarnych szklanych naczyniach. Przyczepy mięśniowo-ścięgnowe na wczesnych etapach poczwarki są bardzo delikatne i ulegają pękaniu przy stałym buforowym poruszeniu, co prowadzi do utraty IFM. Powoli i ostrożnie pipetuj wokół krawędzi bufora w naczyniu, aby nie wciągać próbek do końcówki podczas zmiany roztworów.

4. Immunobarwienie i histochemia stałych próbek IFM

  1. Zbierz niezbędne materiały, w tym pipetę, końcówki pipet oraz wymagane przeciwciała lub plamy. Przygotuj 0,05% PBS-T, roztwór blokujący oraz mieszanki przeciwciał/barwników (patrz Plik Uzupełniający 1).
  2. Pipetą odbierz roztwór płukający (0,05% PBS-T) z próbek i dodaj roztwór blokujący. Inkubuj próbki w roztworze blokującym przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej (z kołyszaniem w etapach 1-2, bez kołysania w kroku 3).
    UWAGA: Próbki można alternatywnie blokować przez noc w temperaturze 4 °C. W tym protokole próbki zostały zablokowane w 5% prawidłowej surowicy koziej (NGS) zawartej w 0,05% PBS-T. Dalsze informacje o opcjach blokowania rozwiązań znajdują się w Pliku Uzupełniającym 1.
  3. Usuń roztwór blokujący z klatki piersiowej pipetą. Dodaj mieszankę przeciwciał pierwotnych i inkubuj co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C (z kołyszaniem w etapach 1-2, bez kołysania w kroku 3).
    UWAGA: Ten protokół jest kompatybilny z większością pierwotnych przeciwciał. Przeciwciała powinny być rozcieńczone w roztworze blokującym. Pierwotne rozcieńczenia przeciwciał testowane tym protokołem wahają się od 1:10 do 1:2000 i są określane eksperymentalnie dla każdego pojedynczego przeciwciała. Dalsze szczegóły dotyczące optymalizacji pierwotnego barwienia przeciwciał znajdują się w Pliku Uzupełniającym 1.
  4. Usuń pierwotną mieszankę przeciwciał pipetą i myj próbki 3 razy przez 10 minut każda, w stężeniu 0,05% PBS-T.
  5. Dodaj do próbki wtórne przeciwciała lub mieszankę barwników. Przykryj próbkę kawałkiem folii aluminiowej, aby zminimalizować wybielanie. Inkubuj co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C (kołysząc w kroku 1-2, bez kołysania w kroku 3).
    UWAGA: Większość przeciwciał wtórnych i fluorescencyjne barwienia komórkowe można stosować przy tym protokole. Wiele przeciwciał wtórnych stosuje się w rozcieńczeniu 1:500. W reprezentatywnych danych poniżej (patrz Reprezentatywne Wyniki) jądra były oznaczone DAPI (1 mg/mL materiał, rozcieńczony 1:1000 w 0,05% PBS-T) oraz F-aktyną z rodaminą falloidyną (300 jednostek/mL, rozcieńczony 1:500 w 0,05% PBS-T).
  6. Usuń mieszankę wtórną/barwną pipetą i myj próbki 4 razy przez 10 minut każda, w stężeniu 0,05% PBS-T w temperaturze pokojowej. Przejdź do montażu (krok 5) bezpośrednio po umyciu.

5. Montaż barwnych próbek na preparatach do analizy mikroskopowej (Rysunek 5)

  1. Zbierz niezbędne materiały, w tym pędzel, kleszcze, szkiełka do mikroskopu matowego, pokrywki (grubość #1), przezroczysty lakier do paznokci, medium mocujące oraz chusteczki bez kłaczków (patrz Tabela materiałów).
  2. Oznacz matowe miejsce pisania na szkiełku mikroskopowym odpowiednim numerem próbki lub preferowaną informacją identyfikacyjną (data, genotyp, przeciwciało, numer preparatu itp.).
  3. Dodaj dystansy pokrywkowe (#1 pokrywki), pozostawiając około 1 cm między tymi slipami do umieszczenia próbki (rysunek 5A-C). Użyj niewielkiej kropli 50% glicerolu, aby utrzymać dystansy na miejscu (rysunek 5A, D).
    UWAGA: Dystansy zapobiegają zniekształceniom próbki podczas montażu grubych próbek. Dorosłe piersiowe zazwyczaj wymagają dystansu o grubości 2 pokrywy, 48-h płetowych pierścią, 1-pokrywkowego dystansu oraz ulotek otwartych bez dystansu.
  4. Dodaj kroplę medium montażowego do jamy pomiędzy dystansami pokrywy lub do środka szkiełka mikroskopu, jeśli montujesz wczesne próbki poczwarki (rysunek 5C-D). Umieść szkiełko pod stereoskopem rozcinającym.
    UWAGA: Dostępnych jest wiele rodzajów nośników montażowych. Jeśli używasz medium samoutwardzających, rozważ takie, które ma czas utwardzania wynoszący kilka godzin, aby zapewnić odpowiedni sposób na ukierunkowanie próbek przed utwardzeniem nośnika. Wykazano, że nośniki montażowe wpływają na wymiary sarkomerów43, 44, 45, dlatego ten sam odczynnik powinien być stosowany dla wszystkich próbek w eksperymencie.
  5. Użyj pipety, aby usunąć jak najwięcej buforu płukania z próbek. Natychmiast przenieś próbki za pomocą kleszczy lub pędzla na kroplę medium mocującego na szkiełku (Rysunek 5E).
  6. Korzystając z kleszczy Dumont #5, zorganizuj próbki w rzędy i kolumny, upewnij się, że próbki się nie nakładają, i zorientuj klatki piersiowe tak, aby IFM były skierowane do góry (Rysunek 5F,J,Q,S). Orientacja może wymagać ostrożnego przewracania próbek tam, gdzie włosie/skórka są skierowane do góry (Rysunek 5G, H, K, L, R). Należy uważać, by nie dotykać IFM, ponieważ kontakt może uszkodzić strukturę sarkomeru (patrz Reprezentatywne Rezultaty).
  7. Ostrożnie dodaj pokrywkę #1 (18 x 18 mm lub 22 x 22 mm) na próbki tułowia (rysunek 5M). Jeśli używasz dystansów, delikatnie naciśnij pokrywkę, aż dotknie się dystansów po obu stronach próbek (rysunek 5N).
  8. Użyj końcówki lub zakraplacza pipety, aby wypełnić obszar próbki medium mocującym, aż wszystkie klatki piersiowe będą zamknięte (rysunek 5O). Unikaj tworzenia bąbelków powietrza, które zakłócą pozyskiwanie obrazu.
  9. Użyj przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić mokre mocowanie. Pamiętaj, aby uszczelnić zarówno pokrywę próbki, jak i pokrywy dystansu (Rysunek 5P, S).
    UWAGA: Unikaj nakładania lakieru wierzchniego lub szybkoschnącego lakieru do paznokci, ponieważ źle się uszczelniają, a podczas parowania medium mocującego powstają pęcherzyki powietrza.
  10. Susz przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przechowywać je w etui na preparaty w temperaturze 4 °C. Preparaty można fotografować przez kilka dni lub tygodni.
  11. Próbki obrazów na mikroskopie fluorescencyjnym, mikroskopie konfokalnym lub innym systemie zgodnie z projektem eksperymentalnym. Protokoły do pozyskiwania i analizy obrazów są dostępne w innych miejscach: 14,30,46,47,48.

Wyniki

Opisany powyżej protokół sekcji może być używany do generowania wysokiej jakości próbek do mikroskopowej analizy morfologii miofibry i sarkomeru IFM już od 8 godzin po utworzeniu poczwarki (APF) metodą otwartej księgi (krok 3) aż do stadia dorosłych z zastosowaniem metody rozwarstwiania hemitoraksu (kroki 1 i 2). Te sekcje zostały zastosowane do badania formowania mięśni i sarkomerów 18,42,49, funkcji czynników transkrypcyjnych50,51 oraz regulacji RNA 37,38, między innymi. Reprezentatywne wyniki przedstawione poniżej pokazują kompatybilność tego protokołu z różnymi metodami fiksacji, szczegółowo opisują typowe artefakty sekcyjne oraz wykorzystują fenotyp mutanta Smn E33, aby zilustrować przydatność tego protokołu w rozwiązywaniu zagadnień morfologicznych i biologicznych komórek w modelu IFM.

Sekcja IFM jest kompatybilna z wieloma metodami fiksacji

Kluczowym aspektem przygotowania próbek do próbek histochemii lub immunofluorescencji jest dokładne zachowanie struktur komórkowych poprzez utrwalanie. Utrwalacze zachowują strukturę i morfologię tkanek poprzez zapobieganie degradacji oraz stabilizację struktur białek i lipidów poprzez siecikrzyżowe 52,53. Różne klasy utrwalaczy, na przykład rozpuszczalniki aldehydowe i organiczne, mają różną efektywność penetracji i sieci krzyżowych oraz różnie wpływają na rozpoznawanie przeciwciał i celu, celując w różne grupy funkcjonalne53,54. Rozwarstwienie IFM jest kompatybilne z wieloma metodami utrwalania, w tym 4% paraformaldehydu (PFA), 9% glioksalu oraz wiązaniem metanolu (Rysunek 6), co podkreśla ogólną użyteczność tego protokołu sekcji.

Aby porównać rozmiar i morfologię sarkomeru z zastosowaniem różnych metod fiksacji, przeprowadzono sekcje hemitorax dorosłych 1 dzień z 1118 muchami. Porównano wiązanie 4% PFA w soli buforowanej fosforanem (PBS) (Rysunek 6A,E) lub roztworze relaksującym (RS) (Rysunek 6B,F). Roztwór relaksujący zawiera ATP i jest zalecany do stosowania przy ilościowym określaniu wymiarów sarkomerów, aby zachować sarkomery w stanie relaksacyjnym20,55 (patrz Plik Uzupełniający 1). Fiksacja PFA na poziomie 4% skutecznie zachowuje morfologię sarkomeru, ale zaobserwowano istotną różnicę w szerokości sarkomeru między 4% fiksacją PFA w PBS a RS (rysunek 6I,J). Utrwalenie w metanolu zachowało strukturę miofibry i sarkomeru (rysunek 6C,G), jednak sarkomery były znacząco krótsze i cieńsze niż przy fiksacji PFA 4% (rysunek 6I,J). IFM można było skutecznie zachować przy nocnym utrwaleniu glioksalu 9% (rysunek 6D,H) (utrwalenie glioksalu 3% było nieskuteczne), co również znacząco zmieniło szerokość sarkomeru w porównaniu do 4% fiksacji PFA (rysunek 6I,J). Podsumowując, hemitoraki IFM można skutecznie zachować przy użyciu wielu utrwalaczy. Jednak ponieważ zarówno utrwalający, jak i bufor mogą wpływać na pomiar wymiarów sarkomerów, eksperymenty powinny być projektowane z odpowiednimi kontrolami oraz dobrze zdefiniowanym i spójnym protokołem utrwalania.

Typowe artefakty sekcji i fiksacji w IFM

Jednym z wyzwań mikroskopii, zwłaszcza dla nowych użytkowników i uczestników, jest rozróżnienie artefaktów technicznych od fenotypów kości. Aby ułatwić to rozróżnienie w IFM Drosophila, przedstawiono reprezentatywne dane najczęściej obserwowanych artefaktów i niepowodzenia sekcji (Rysunek 6). Protokoły utrwalania wymagają optymalizacji typu, stężenia i długości utrwalania, aby uniknąć niedofiksacji lub jej nadfiksacji 52,53,54. Korzystając z przebiegu czasu fiksacji w1118 – 1 dzień podczas rozwarstwień dorosłego hemitorax inkubowanego w 4% PFA w roztworze relaksującym, zaobserwowano, że podczas gdy 15- lub 30-minutowy czas fiksacji dokładnie zachowuje morfologię sarkomeru, 7-minutowa fiksacja powoduje niespójne morfologie sarkomerów (rysunek 6K-M). Ponadto tkanka jest mniej sztywna i krótszy czas utrwalenia, co utrudnia cięcie i przecięcie tułowia bez uszkodzenia IFM. Dodatkowe artefakty mogą pojawić się zarówno podczas cięcia, jak i montażu. Struktura miowłóknu IFM może wydawać się nieregularna, jeśli ostrze jest i powoduje rozdzieranie lub strzępienie (rysunek 6N) lub jeśli ostrze się ślizga lub cięcie jest pod kątem (rysunek 6O). Jeśli kleszcze stykają się bezpośrednio ze stałymi IFM podczas manipulacji lub montażu, robią odcisk, który może prowadzić do wgłębień lub rozciągania i rozciągać sarkomery (rysunek 6P). Rozciąganie lub deformacja klatki piersiowej, zarówno podczas cięcia, manipulacji, jak i montażu, również rozciąga sarkomery i prowadzi do utraty wyraźnie wyznaczonego dysku Z (rysunek 6Q). Na koniec, "piłowanie" lub "pocieranie" IFM kleszczami lub ostrzem prowadzi do ścierania oraz rozplątania, strzępienia i dezorganizacji miofibryli, zwłaszcza na powierzchni miofibryli (rysunek 6R). Potencjalni użytkownicy powinni zapoznać się z tymi artefaktami technicznymi i wykluczyć je z analizy fenotypowej.

Progresja rozwojowa fenotypu Smn E33 u IFM

Dyssekcie otwartej książki i hemitorax są szczególnie przydatne do śledzenia trajektorii rozwojowej fenotypu mięśniowego oraz do określenia, kiedy w rozwoju pojawia się gen zainteresowania lub pojawia się fenotyp miofibrilowy. Fenotyp rozwojowy IFM SmnE33, hipomorficznego allelu białka wiążącego RNA, neuronu ruchowego przeżycia (Smn)39 , przedstawiony jest jako reprezentatywne dane ilustrujące szeroką użyteczność dyssekcji otwartej księgi i hemitorax multiplax.

Małe jądrowe rybonukleoproteiny (snRNP), które tworzą spliceosom, makrocząsteczkowy kompleks katalizujący reakcję splicingu w celu powstania mRNA7, są składane przez kompleks SMN. Kompleks SMN, składający się z neuronów ruchowych przetrwania (Smn) i białek Gemin, jest niezbędny do przeżycia u wszystkich organizmów56. Obniżony poziom SMN u ludzi prowadzi do ciężkiego dziedziczonego zaburzenia nerwowo-mięśniowego – zaniku ruchowego kręgosłupa (SMA)21. Drosophila była wykorzystywana jako model do zrozumienia etiologii SMA oraz funkcji komórkowej Smn, w tym rozwoju allelu hipomorficznego SmnE33. MuchySmn E33 są żywotne i płodne, ale nie mogą latać ani skakaćna wysokość 39. Chociaż muchy SmnE33 mają wady arboryzacji neuronów ruchowych, wykazują również nieuporządkowaną strukturę IFM oraz utratę specyficznej ekspresji Actin88Fspecyficznej dla mięśnia lotu 39,57. SMN jest współlokalizowany z alfa-aktininą na dysku Z u much i myszy39, co sugeruje, że Smn może pełnić funkcję specyficzną dla mięśni.

Aby lepiej zrozumieć, kiedy struktura miofibrylu zostaje utracona, a funkcja Smn jest wymagana do rozwoju mięśni, przeprowadzono analizę przebiegu rozwoju fenotypu SmnE33 u IFM w 26 godzinach APF, 72 godzinach APF oraz 1 do 5 dni dorosłych. Podczas gdy IFM w1118 w 72h APF i u dorosłych mają silny sygnał F-aktynowy barwiony falloidyną (Rysunek 7E,E',I') oraz regularną strukturę sarkomerową (Rysunek 7G,G',K'), sygnał falloidynowy jest drastycznie zredukowany (Rysunek 7F,F',J,J'), a struktury sarkomerowe są nieobecne (Rysunek 7H, H',L,L') w SmnE33 IFM. F-aktyna jest natomiast obserwowana w strukturach przypominających siatkę wokół jąder lub w nieregularnych wiązkach bądź strukturach "gwiezdnych" w cytoplazmie (rysunek 7H,H',L,L'), co jest zgodne z utratą ekspresji Act88F18,39 oraz niemożnością składania cienkich filamentów. Przeprowadzono otwarte sekcje w celu zbadania fenotypu SmnE33 w 26 godzinach APF i wykazały, że wczesny rozwój IFM przebiega normalnie w SmnE33. Podobnie jak w 1118 kontrolne IFM (Rysunek 7A,A',C'), muchy Smn E33 mają 6 grzbietowych podłużnych włókien IFM na hemitoraks, tworzą zorganizowane kable F-aktyny na obwodzie miofibrylogeni przed miofibrylogenezą (Rysunek 7B,B') oraz prezentują siatkowatą sieć F-aktyny w całym miofibrylopenie (Rysunek 7D,D'). Wyniki te wskazują, że początkowe etapy różnicowania IFM przebiegają normalnie, podczas gdy Smn jest niezbędny na późniejszych etapach rozwoju IFM, aby utrzymać ekspresję Act88F i budować sarkomery. Co ważne, te reprezentatywne wyniki ilustrują szczegółowość fenotypową i rozdzielczość, którą można osiągnąć poprzez otwarte rozdziały i sekcje hemishoraksu.

figure-results-1
Rysunek 1: Rozwarstwienie hemiprzekroju dorosłych IFM. (A) Umieść dorosłą muchę w 1x PBS na szkiełku mikroskopowym. (B) Używając kleszczy (cyjan, kropka) do stabilizacji muchy, usuń głowę nożyczkami (pomarańczowymi). (C-E) Usuń lewe (C) i prawe (D) skrzydło oraz odwłok (E). (F) Usuń głowę, odwłok i skrzydła, a następnie przenieś tułów do pozycji utrwalającej. (G,H) Ukierunkuj stały tułów na przesuwce w opadce 1x PBS-T, z tyłem (P) i tarczą skierowaną do góry (G), używając kleszczy do stabilizacji orientacji (H). (I-K) Użyj ostrza kriostatu, aby przeciąć tułów na pół (I-J), aby uzyskać dwie półprzecięcia klatki piersiowej (K). (L) Schemat ostrza kriostatu i klatki piersiowej, ilustrujący położenie cięcia strzałkowego, aby uzyskać półprzekroje. Ostrze przesuwa się w prawo, aby naciąć tarczę piersiową, a następnie płynnie (żółte strzałki) przesuwa się w dół, by przeciąć tułów (przerywana czerwona linia). (M,N) Schemat widoku koronalnego (M) i poprzecznego (N) klatki piersiowej, ilustrujący pozycję głównych grup mięśniowych oraz pozycję cięcia (między żółtymi trójkątami). Orientacja tułowia jest wskazana (lewa, lewa; R, po prawej; V, brzuszna; D, grzbietowo; A, przednia; P, tylny). Skala = 1 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

figure-results-2
Rysunek 2: Etap poczwarki i cechy rozwoju poczwarki. (A) Poczwarki męskie i (B) żeńskie można rozróżnić jako białe pre-poczwarki przy 0-2 godzinach APF. Pupy samców mają parowane, okrągłe, przezroczyste struktury (rozwijające się jądra) w kierunku tylnej części (strzałki). (C) Tabela cech charakterystycznych rozwoju poczwarki. Cechy obejmują dojrzewanie obudowy poczwarki, odwrócenie głowy i odłączenie poczwarki od obudówki, rozwój pigmentacji oczu, pigmentację szczeciny, skrzydeł, nóg, epandrii i skórki oraz widoczność dziewiczej plamki (mekonium). Kolor i pigmentacja oczu stopniowo ciemnieją. Czas i etapy rozwoju poczwarki oznaczone na górze każdej kolumny w tabeli (punkty czasowe oznaczone czarnym tekstem, odpowiadający etap rozwoju poczwarki poniżej niebieskim) zostały wcześniej określone przez Bainbridge'a i Bownesa19,41. (D-E) Czas rozwoju poczwarki w czasie 0-2 godziny, 24 godziny, 48 godzin, 72 godziny i 96 godzin APF w nienaruszonej poczwarce z czerwonymi oczami (D; Mef2-Gal4, fln-GFP) oraz w poczwarce z pomarańczowymi oczami wyciętymi na zewnątrz obudowy poczwarki (E; Fln-Gal4). Zwróć uwagę na stopniowe ciemnienie oczu i włosia od 48 do 96 godzin APF. (F) Przykłady śmiertelności poczwarki we wczesnych, średnich i późnych etapach rozwoju. Muchy fathal pharate są w pełni uformowane, ale nie udaje im się całkowicie odciąć od obudowy poczwarki. Skala = 1 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

figure-results-3
Rysunek 3: Rozwarstwienie przekroju półprzekrojowego poczwarki IFM (>48 h APF). (A-H) Usunięcie poczwarki z obudowy poczwarki. Przyklej poczwarki do paska taśmy dwuprzylepnej (A,B). Rozwinąć na przednim grzbiecie (C) i usunąć zaczep (D) za pomocą kleszczy Dumont #5 (niebieskie, strzałka oznacza kierunek ruchu, kropka jest nieruchoma). Użyj kleszczy, aby rozciąć (E) i odklejać (F) osłonę poczwarki w paskach (G). Paski obudowy poczwarki są przyklejane do taśmy podwójnej klejącej. Po odsłonięciu odwłoka podnieś poczwarkę z obudowy (H). (I) Schemat ilustrujący proces wycinania poczwarki z obudowy poczwarki. Panele ilustracyjne odpowiadające każdemu krokowi na schemacie są oznaczone (na dole). Czerwona linia przerywana wskazuje miejsce, gdzie można włożyć kleszcze bez uszkodzenia poczwarki, aby otworzyć obudowę poczwarki. (J-L) Po wyjęciu poczwarki z obudowy (J) i przeniesieniu do szkiełka mikroskopowego w kropli 1x PBS (K), użyj nożyczek do usunięcia odwłoka (L). (M) Usuń odwłok i przenieś klatkę piersiową do pozycji utrwalającej. (N) Po fiksacji przenieś poczwarkę piersiową do szkiełka w kropli 1x PBS-T. Ustabilizuj grzbietową stronę poczwarki do góry i ustabilizuj kleszczem. (O-P) Użyj ostrza kriostatu (O), aby przeciąć półprzekrojnik poczwarki (P). Umiejscowienie cięcia jest takie samo jak na rysunku 1 M-N. Skala = 1 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

figure-results-4
Rysunek 4: Otwarta sekcja poczwarek IFM (<48 h APF). (A) Po wyjęciu poczwarki z obudowy poczwarki, jak pokazano na Rysunku 3 A-I, przenieś poczwarkę do 1x PBS w czarnej krzemowej misce do rozcinania. (B-D) Delikatnie dociskaj poczwarkę na powierzchnię krzemowej misy za pomocą kleszczy (B) i przyłóż brzuszną stronę do góry za pomocą dwóch szpilek owadów (C,D). (E) Otwórz błonę podstawną (bm) i skórkę głowy nożyczkami (pomarańczowym). (F,G) Przetnij po prawej (F) i lewej (G) stronie. Pozycja cięcia jest przedstawiona na diagramie w (Q). (H,I) Podnieś część brzuszną kleszczycą (H) i usunąć nożyczkami (I). (J,K) Użyj kleszczy, aby usunąć mózg (J), boczną tchawicę tułowia oraz jelita (K). (L-M) Użyj delikatnego strumienia buforu z pipety, aby usunąć tłuszczowe ciała i odsłonić IFM. (N) Przetnij tułów na dwie listki. (O,P) Odetnij listki i przełóż je do utrwalania. (P) Schemat podsumowujący kroki w otwartej książce analizy. Panele ilustracyjne odpowiadające każdemu krokowi są oznaczone (na dole). Widoki z góry i z boku ilustrują rozmieszczenie cięć (czerwona linia przerywana) po lewej i prawej stronie poczwarki. Skrzydła, nogi i trąb (oznaczony) służą do rozróżnienia grzbietowej i brzusznej strony poczwarki. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-5
Rysunek 5: Montaż próbek na szkiełkach mikroskopowych. (A-D) Do montażu grubych próbek półprzekroju klatki piersiowej stosuje się dystansy pokrywkowe. Glicerol (A) służy do mocowania dystansów (slipów #1) do oznaczonego szkiełka (B), a próbki montuje się w medium montażowym w przestrzeni między podkładkami (C). Późne poczwarki i dorosłe piersiowe wymagają dwóch przestrzennych przestrzenek #1 coverslip (D). Punkty czasowe w połowie poczwarki wymagają pojedynczej dystansy #1 coverslip, a wczesne sekcje poczwarki mogą być montowane bez podkładki. (E-H) Próbki dorosłego hemitorax są przenoszone do medium montażowego za pomocą kleszczy lub pędzla (E). Piersi są początkowo losowo skierowane (F) i mogą wymagać odwrócenia za pomocą kleszczy (G), tak aby IFM były skierowane w górę w stronę pokrywy (H). (I-L) Ulotki z wczesnych rozwarstwień poczwarek z otwartej książki są przekazywane do montażu za pomocą kleszczy (I). Listki są losowo ustawione (J) i można je obracać za pomocą kleszczy (K), tak aby IFM były skierowane w górę w stronę slipu pokrywowego (L). (M-P) Po prawidłowym ustawieniu próbek załóż na próbki slip pokrywający (M) i stukaj nim równomiernie o dystansy (N). Wypełnij próbki medium mocującym (O), uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków. Zabezpiecz wszystkie otwarte krawędzie pokrywy i dystansów lakierem do paznokci (P), aby zapobiec parowaniu materiału montażowego. (Q-R) Zdjęcia prawidłowo zamontowanych próbek dorosłego tułowia (Q, 10x powiększenie) skierowanych z IFM skierowanymi w stronę pokrywy (R, 20x powiększenie). (S) Schemat gotowego preparatu, z próbkami ustawionymi IFM w górę między dystansami i lakierem uszczelniającym wszystkie otwarte krawędzie. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-6
Rysunek 6: Sekcje IFM są kompatybilne z różnymi utrwalającymi. (A-H) Konfokalna projekcja z-struktura miofibry (A-D) lub jednopłaszczyznowe obrazy miofibrylu i sarkomera (E-H) w kontroli w1118 dorosły IFM. Rozwarstwienie hemitoraksu jest kompatybilne z wieloma metodami utrwalania, w tym 4% paradehydu (PFA) w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) (A,E) lub roztworu relaksującym (RS) (B,F), metanolu (C,G) lub 9% roztworu glioksalu (D,H). DAPI (1:1000), niebieski; falloidyna (1:500) barwiona F-aktyna, szara. (I,J) Ilościowa długość (I) i szerokość sarkomeru (J) od E-H. Metoda fiksacji i bufor mogą znacząco wpłynąć na pomiar długości i szerokości sarkomeru. Długość sarkomeru 3,040 ± 0,2935 μm przy wiązaniu metanolu była istotnie krótsza niż zmierzone długości 3,271 ± 0,2736 μm, 3,190 ± 0,2586 μm oraz 3,217 ± 0,2023 μm z PFA (PBS), PFA (RS) i 9% fiksacją glioksalu (p < 0,001). Szerokość sarkomeru różniła się istotnie między wszystkimi testowanymi metodami fiksacji (PFA (PBS), 1,410 ± 0,1331 μm; PFA (RS), 1,284 ± 0,2514 μm; metanol, 1,280 ± 0,1538 μm; oraz 9% fiksacji glioksalnej, 1,137 ± 0,2032 μm). Wykresy pudełkowe są przedstawiane z wąsami Tukey, a odstępne punkty danych oznaczone czarnymi kropkami. Istotność została określona przez ANOVA za pomocą testu Tukeya po chwili (**, s. < 0,01; ***, s. < 0,001). (K-M) Jednopłaszczyznowe obrazy konfokalne przebiegu czasu fiksacji u dorosłego osobnika w1118 z 4% PFA w fiksacji RS, pokazujące, że czas fiksacji wynoszący 15 (L) lub 30 (M) min, w porównaniu do 7 min (K), skutkuje dobrze zachowaną i spójną strukturą sarkomu. (N,O) Projekcje stosu Z dorosłych IFM Act88F-Gal4 zafiksowane w 4% PFA, demonstrujące artefakty rozwarstwiania w miofibrach. Typowe artefakty to ścięte, postrzępione lub częściowe włókna z ostrza (N) lub nacięcia pod kątem (O). (P-R) Jednopłaszczowe obrazy konfokalne dorosłych z1118 próbkami utrwalonymi w 4% PFA w PBS, pokazujące typowe artefakty sekcyjne u sarkomerów i miofibryli. Typowe artefakty techniczne to nieregularne rozciąganie sarkomerów spowodowane kontaktem z kleszczami podczas montażu (P), wyciąganie dyszek Z z rejestru przez rozciąganie miofibryen podczas cięć podłużnych (Q) oraz postrzępione, nieuporządkowane lub skręcone miofibrile spowodowane ścieraniem lub ostrzem (R). DAPI (1:1000), niebieski; falloidyna (1:500) barwiona F-aktyna, szara. Pasek skali = 100 μm (A-D, N-O), 5 μm (E-H, K-M, P-R). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-7
Rysunek 7: Zastosowanie sekcji w celu badania fenotypu rozwojowego IFM SmnE33. (A-D) Struktura mięśni u wczesnych poczwarek przy 26 h APF. Jednopłaszczyznowy obraz konfokalny struktury miofibry (A, A', B, B') oraz struktury miofibrylu i sarkomeru (C, C', D, D') w kontroli (A, A', C, C') i SmnE33(B, B', D, D'). Zarówno sterowanie, jak i SmnE33 mają sześć miofibr IFM na hemitorax i tworzą kable F-aktyny. (E-H) Struktura mięśni u późnych poczwarek przy 72 h APF. Obraz projekcji Z struktury miofibry w sterowaniu (E, E') oraz SmnE33 (F, F'). IFM w SmnE33 są obecne na podstawie barwienia DAPI, ale nie mają silnego sygnału F-aktyny. Jednopłaszczyznowe obrazy konfokalne pokazują, że kontrolowane IFM mają silnie zorganizowaną strukturę sarkomową (G, G'). Dla porównania, SmnE33 IFM (H, H') mają nieprawidłowe gwiaździste struktury F-aktyny (żółte strzałki) i nie mają zorganizowanej struktury sarkomerowej obserwowanej u kontrolnych IFM. (I-L) Struktura mięśni dorosłych w kontroli (I, I', K, K') oraz SmnE33 (J, J', L, L'). Projekcja Z (I,J) i jednopłaszczyznowe obrazy konfokalne (K,L) wykazują znacznie obniżoną zawartość F-aktyny oraz nieprawidłowe struktury aktyny (żółte strzałki) w SmnE33IFM. DAPI (1:1000), niebieski; falloidyna (1:500) barwiona F-aktyną, magentą lub szarością. Pasek skali = 50 μm (A, B), 10 μm (C, D, G, H, K, L), 100 μm (E, F, I, J). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Plik uzupełniający 1: Szczegółowy opis metod utrwalania i barwienia użytych w tekście, a w szczególności do generowania danych przedstawionych na Rysunku 6 i Rysunku 7. Dodatkowe informacje dotyczące określania rozcieńczeń przeciwciał pierwotnych są zawarte. Podana jest również lista komponentów bufora i przepisów używanych w tym protokole. Dane te motywują protokół sekcji i pokazują jego przydatność w mikroskopii konfokalnej oraz analizie fenotypów rozwojowych IFM. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 1: Diagram przepływu kroków w rozwarstwieniu hemitoraksy dorosłych IFM. Tekstowe podsumowanie kroków na Rysunku 1 do przygotowania sekcji IFM hemitoraaksu. Po sekcji, fiksacji i przecięciu tułowia przekroje są barwione do analizy mikroskopowej. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Rysunek uzupełniający 2: Diagram przepływu kroków w rozwarstwieniu hemitoraksu poczwarkowych IFM. Tekstowe podsumowanie kroków na Rysunku 3 w celu przygotowania sekcji hemitorax w poczwarkach IFM. Po wyjęciu z obudowy poczwarki poczwarki są utrwalane, przecinane na pół i barwione do mikroskopii. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Rysunek uzupełniający 3: Diagram przepływu kroków w otwartej książce na rozwarstwieniu wczesnych poczwarek IFM. Tekstowe podsumowanie kroków pokazanych na Rysunku 4 w celu przeprowadzenia otwartej sekcji poczwarki IFM przed 48 godzinami APF. Po rozwarstwieniu i fiksacji nabłonkowe listki z dołączonymi IFM są barwione do mikroskopii. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Dyskusja

Protokół ten przedstawia procedurę sekcji Hemitorax dorosłych (Rysunek 1) i późnych poczwarek (48 h - 96 h APF) (Rysunek 3) oraz otwartą sekcję IFM w wczesnych punktach czasowych poczwarki (8 h - 48 h APF) (Rysunek 4). Protokół ten jest optymalny do zastosowań w immunohistochemii i mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół jest ilustrowany schematami i zdjęciami krok po kroku z procedury sekcji. Diagramy przeglądowe dodatkowo udostępniają protokół naukowcom nowym w dziedzinie Drosophila, a także studentom licencjackim i wczesnym stażystom. Przedstawiono reprezentatywne przykłady błędów związanych z utrwaleniem i przygotowaniem próbki, aby umożliwić użytkownikom protokołu odróżnienie artefaktów od prawdziwych fenotypów sarkomerów.

Najtrudniejszym krokiem w rozwarstwieniu hemitoraxu IFM jest przecięcie tułowia na pół (Rysunek 1I, J, L i Rysunek 3O). Ten krok wymaga czasu i praktyki, by go opanować. Dla większej stabilności podczas cięcia można przyłożyć poszczególne piersi na taśmę dwuprzylepną i wyciąć36, ale należy zachować ostrożność, aby nie wysychać IFM. Możliwe jest także cięcie od brzusznej strony klatki piersiowej, z grzbietową stroną skierowaną w dół, aby nowi użytkownicy mogli przetestować, które podejście jest najskuteczniejsze w ich ustawieniu. Cięcia powinny być wykonywane nowymi, ostrymi ostrzami, aby nie uszkodzić IFM, a ostrze powinno być wymieniane, gdy staje się. W tym protokole do czystego cięcia tułowia używa się mikrotomowych (kriostatowych) ostrzy, w przeciwieństwie do innych protokołów wykorzystujących igłę, kleszcze lub ostrze skalpela 24,32,36. Żyletki to kolejna opcja do czystego przecięcia klatki piersiowej na pół. Fiksacja jest również ważna przed przecięciem, ponieważ lekko utrwalona tkanka, choć stabilnie zachowana, może być "miękka" i trudniejsza do cięcia. Czas fiksacji to 30-60 minut, równoważność dostępności antygenów i sztywność tkanek ułatwiający cięcia, a można skrócić do 15 minut z doświadczeniem.

Jednym z ograniczeń preparatów hemitorax jest penetracja przeciwciał. Hemitoraki to grube próbki32, a najlepszej jakości mikrofotografie konfokalne pochodzą z górnych 10-20 μm IFM 42,58. Zbyt niskie stężenie detergentu lub zbyt krótki czas przepuszczania może prowadzić do słabego i nieregularnego zabarwienia. Przenikanie przeciwciał można również poprawić poprzez dłuższą (2-3 dni) inkubację pierwotnego przeciwciała. System dwufotonowy lub obiektyw o większym zasięgu roboczym również może zwiększyć głębokość obrazowania59. Jeśli eksperymentator musi obrazować pełną średnicę miowłókna IFM, należy rozważyć alternatywne podejście, takie jak mikrotom24,58 lub kriosekcja27 w płaszczyźnie strzałkowej.

Ważnym aspektem, który nie jest uwzględniony w głównym protokole, jest analiza danych obrazowych. Do analizy miofibr IFM na obrazach 10x lub 20x (rysunek 6A-D, rysunek 7A,B,E,F,I,J) STANDARDOWA ANALIZA OBEJMUJE OKREŚLENIE, CZY WŁÓKNA SĄ POŁĄCZONE ORAZ CZY MORFOLOGIA GRUBA MIOFIBRY JEST NIENARUSZONA37,38. Przykłady parametrów, które można ilościowo określić, w zależności od eksperymentu, to długość, szerokość, liczba, liczba dołączonych lub liczba rozdartych miofibrów37,60. Główną zaletą tego protokołu jest kompatybilność z mikroskopią fluorescencyjną oraz możliwość analizy morfologii sarkomeru i miofibrylu przy większych powiększeniach 60x lub 100x (Rysunek 6E-H, Rysunek 7C, D,G,H, K,L). Morfologia sarkomerów powinna być analizowana w próbkach wolnych od artefaktów technicznych (rysunek 6K-P). Wcześniej zdefiniowano wiele kategorii możliwych fenotypów miofibrylnych i sarkomerowych(60). Najczęściej długość i szerokość sarkomeru mierzy się albo poprzez narysowanie i zmierzenie linii od Z-disc do Z-disc w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, albo alternatywnie za pomocą jednego z kilku dostępnych narzędzi automatycznych 18,45,61. Ocenę morfologii sarkomeru można ulepszyć, dodając markery oznaczające Z-dysk lub linię M, albo grube lub cienkie filamenty 30,34,58. Dane te mogą być użyte do ilościowego opisu fenotypów miofibryli, miofibrylu i sarkomeru pomiędzy próbką kontrolną a testową przygotowaną przy użyciu tego protokołu sekcji.

Użytkownicy protokołu powinni być świadomi, że choć fiksacja zachowuje morfologię miofibry i sarkomeru, utrwalający, i ośrodek montażowy mogą powodować kurczenie się lub obrzęk tkanek oraz wpływać na pomiar parametrów morfologicznych45. Utrwalanie i odwodnienie glutaraldehydu niezbędne do mikroskopii elektronowej jest znane z kurczenia się średnicy sarkomeru43, natomiast włóknistość i gliceracja zwiększają średnicę sarkomeru 44,45. To zjawisko może stanowić podstawę różnic w parametrach sarkomerów w literaturze i podkreśla znaczenie uwzględniania próbek kontrolnych i testowych w każdym eksperymencie. IFM kontrolne i testowe powinny być przetwarzane jednocześnie w tych samych dla dokładnego porównania ilościowych parametrów sarkomerów.

Ten szczegółowy protokół ma na celu uczynienie rozbiorów IFM u dorosłych i poczwarek w zakresie immunohistochemii oraz mikroskopii fluorescencyjnej bardziej dostępną dla początkujących i zaawansowanych drosofilistów. Protokół ten może być dostosowany do stosowania z innymi owadami, a także do innych technik obrazowania, takich jak mikroskopia krioelektronowa (cryo-EM), hybrydyzacja in situ fluorescencją pojedyncząłych cząsteczek (smFISH) czy transkryptomika przestrzenna. Połączenie potężnych narzędzi genetycznych Drosophila z mikroskopią fluorescencyjną daje wyjątkowe możliwości badania zachowanych zasad miogenezy i funkcji mięśni. Ponieważ IFM są również podatne na podejścia molekularne ibiochemiczne 26,27, przyszłe badania łączące fenotypy molekularne z morfologią mięśni, biologią komórek i funkcją zapewnią głębsze zrozumienie miogenezy i etiologii zaburzeń mięśniowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Gregory'emu Materze za udostępnienie allelu Smn E33 oraz za pomocne dyskusje na temat Smn. Autorzy dziękują Frankowi Schnorrerowi, Cornelii Schoenbauer, Manueli Weitkunat oraz Aynur Kaya-Copur za pomocne dyskusje i wsparcie. Autorzy doceniają centrum zapasowe w Bloomington za dostarczanie much. Prace te były wspierane przez początkowe środki z University of Missouri Kansas City (UMKC) School of Science and Engineering, Division of Biological and Biomedical Systems (MLS), UMKC Funding for Excellence Program (MLS) oraz UMKC Office of Undergraduate Research and Creative Scholarship (SF, MLS).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynia do hodowli tkanek o średnicy 60 mmFisher ScientificFB01292160 mm, polistyren
Kwas octowy, lodowiec (certyfikowany ACS)Fisher ScientificA38S-212
Adenozynotrifosforan (ATP)Millipore SigmaA1852
Folia aluminiowa, wytrzymałaAmazon12 cali. x 1000 stóp.
Czarne poduszki do rozcinania silikonu: proszek z węgla aktywnegoMillipore SigmaC9157Dostępne także w większości aptek
Czarne naczynia do rozcinania krzemu: Sylgard 184Millipore Sigma761036Aby przygotować talerze do rozcinania krzemu, połącz składniki Sylgard w woreczku strunowym i dobrze wymieszaj. Dodaj proszek z węgla aktywnego (~200 mg) do Sylgard (~50 g), dobrze wymieszaj, odetnij róg worka, napełnij 60 mm misek do hodowli, usuń bąbelki końcówką pipety i utwardzaj przez noc.  
Kartonowa taca na slajdy, Research Products International CorpFisher Scientific50-136-7558
Mikroskop konfokalny, odwrócony mikroskop konfokalny Nikon AXRNikonwww.microscope.healthcare.nikon.com/
Mikroskop konfokalny, Zeiss LSM 780 odwrócony konfokalnyZeisswww.zeiss.com
Komora do wychowu owadów Darwin (inkubator)Fisher Scientific/Darwin ChambersIN034Inkubator kontrolowany światłem, temperaturą i wilgotnością
Talerz do rozcinania (czarne szkło)Mikroskop Technik Diethelm398011Lymphbecken (miski do barwienia/zbiorniki limfatyczne), czarne szkło, 4x4 cm, z przezroczystą szklaną pokrywą
Kleszcze Dumont #3Narzędzia Nauki Ścisłej11231-30Dumokel prosta końcówka 12 cm z końcówką 0,17 x 0,1 mm & nbsp;
Kleszcze Dumont #5Narzędzia Nauki Ścisłej11252-20Pinpsy o prostym końcówce inox 11 cm, klasy biologicznej z końcówką 0,05 x 0,02 mm 
EGTA (kwas egtazowy)Millipore Sigma324626
Etanol, Absolutny (200 Proof)Fisher ScientificBP28184Stopień biologii molekularnej
Glassglass Premium Fisherbrand (18 x 18 mm), slipyFisher Scientific12548ASzkło, kwadratowe, grubość #1 (0,13 - 0,16 mm)
Glassglass Premium Fisherbrand (22 x 22 mm), pokrywkiFisher Scientific12548BSzkło, kwadratowe, grubość #1 (0,13 - 0,16 mm)
Płytki hodowli komórek płaskiego dna (24-dołkowe)Fisher Scientific7200740
Kamera mikroskopu fluorescencyjnego do rozwarstwiania, kamera Infinity8Teledyne (Visual Dynamix)6 megapikseli, w słabym świetle, monochromatycznie
Latać: Smn[E33]Muchowe indy; dar Grzegorza Matery
Mucha: w[1118]Centrum Stockowe BloomingtonRRID:BDSC_3605Zapas muchowy
GlicerolFisher ScientificBP229-1Stopień biologii molekularnej
Roztwór glioksalu (40% masy w H2O)Millipore Sigma128465  To jest 40% roztworu bulwaryjnego
Oprogramowanie do przetwarzania obrazów, Affinity Designer 2Pokrewieństwohttps://affinity.serif.com/en-us/
Oprogramowanie do przetwarzania obrazów, Image J (Fidżi)ImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Szpilki owadzieNarzędzia Nauki Ścisłej26002-10Stal nierdzewna, średnica 0,1 mm (piny miniaturowe)
Chlorek magnezu (MgCl2)Fisher ScientificAA12315A1
Metanol (HPLC)Fisher Chemical (Fisher Scientific)A452-4Chill przy -20? Przed użyciem
Szkiełka mikroskopowe, matowaneFisher Scientific12-550-400Powierzchnia pisania, nienaładowana, 75 mm x 25 mm x 1 mm
Szkiełka mikroskopowe, gładkie szkłoFisher Scientific12-544-4Wstępnie oczyszczony, 75 mm x 25 mm
Łopatki mikrotomowe MX35 Ultraepredia (Fisher Scientific)3053835Niski profil, 34 i g; kąt cięcia; Ostrza C35 feather 80mm sprawdzają się dobrze
Lakier do paznokci, przezroczysty (Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish)Amazon0,4 fl. oz.
Zwykłe serum koziegoMillipore SigmaS26-LITR
Nutator (Mini Nutating Rocker, Benchmark)Midwest ScientificH3D102024 obr./min, stałe; 8 x 6 cali. Peron z matą z wgłębieniami
Pędzel (Runda nr 0)AmazonOkrągły pędzel nr 0 lub podobny z dowolnego materiału plastycznego
Paraformaldehyd (PFA)Millipore Sigma158127-500G
Sól fizjologiczna buforowana fosforanową (PBS): KClMillipore Sigma529552-250GMPrzygotować PBS zgodnie z Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Sól fizjologiczna buforowana fosforanową (PBS): KH2PO4Millipore SigmaP0662-500GPrzygotować PBS zgodnie z Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS): Na2HPO4Millipore SigmaS9763-500GPrzygotować PBS zgodnie z Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS): NaClFisher Chemical (Fisher Scientific)S271-1Przygotować PBS zgodnie z Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Końcówki do pipety PR1MA (10 & micro; L)Midwest ScientificPR10XLRK-NSUniwersalny 10 & mikro; Końcówki pipety L
Końcówki do pipety PR1MA (1000 &; L)Midwest ScientificPR-1000RK-FLUniversal 1000 & micro; Końcówki pipety L
Końcówki do pipety PR1MA (200 & mikro; L)Midwest ScientificPR-200RK-NSUniversal 200 µ Końcówki pipety L
Rodamina-faloidynaInvitrogen, sondy molekularneR415
Taśma szkocka dwustronnaSzkocka/3M (Staples)649280Obie strony pokryte klejem, 0,5" x 7 jardów, dostępne u większości sklepów z artykułami biurowymi
Dihydrat fosforanu sodu (NaH2PO4)Fisher ScientificAAA1131636
Oprogramowanie: GraphPad PrismGraphPad Prismwww.graphpad.com
Oprogramowanie: Infinity Analyze 7Teledyne (Visual Dynamix)https://www.teledynevisionsolutions.com/products/infinity-analyze/
Oprogramowanie: Microscoft ExcelMicrosofthttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
chusteczki/ Kimtech Science Kimwipes Delikatne Wycieraczki Zadaniowe, 1 warstwaFisher Scientific06-666Standardowe chusteczki do tkanek
Pipeta transferowaFisher Scientific13-711-9AMMDPlastikowa pipeta
Trition X-100Millipore SigmaT9284-100ML
Nożyczki sprężynowe VannasNarzędzia Nauki Ścisłej15000-00Krawędź tnąca 3 mm, średnica grotu 0,05 mm, długość 8 cm
Vectashield z DAPILaboratoria VectorH-2000
Vectashield bez DAPILaboratoria VectorH-1900
Papier WhatmanMillipore SigmaWHA1004070Okręgi z papieru filtracyjnego, Grade 4, 70 mm
Fluorescencyjny stereo mikroskop rozcinający z10Visual Dynamix (Midwest Scientific)http://www.visualdynamix.net/
Ergonomiczny stereo zoom mikroskop rozcinający z850Visual Dynamix (Midwest Scientific)http://www.visualdynamix.net/

Bibliografia

  1. Schiaffino, S., Reggiani, C., Murgia, M. Fiber type diversity in skeletal muscle explored by mass spectrometry-based single fiber proteomics. Histol Histopathol. 35 (3), 239-246 (2020).
  2. Plantié, E., Migocka-Patrzałek, M., Daczewska, M., Jagla, K. Model organisms in the fight against muscular dystrophy: lessons from Drosophila and zebrafish. Molecules. 20 (4), 6237-6253 (2015).
  3. Reedy, M. C., Beall, C. Ultrastructure of developing flight muscle in Drosophila. I: assembly of myofibrils. Dev Biol. 160 (2), 443-465 (1993).
  4. Henderson, C. A., Gomez, C. G., Novak, S. M., Mi-Mi, L., Gregorio, C. C. Overview of the muscle cytoskeleton. Compr Physiol. 7 (3), 891-944 (2017).
  5. Luis, N. M., Schnorrer, F. Mechanobiology of muscle and myofibril morphogenesis. Cells Dev. 168, 203760(2021).
  6. Romani, P., Valcarcel-Jimenez, L., Frezza, C., Dupont, S. Crosstalk between mechanotransduction and metabolism. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (1), 22-38 (2021).
  7. Nikonova, E., Kao, S. -Y., Spletter, M. L. Contributions of alternative splicing to muscle type development and function. Semin Cell Dev Biol. , (2020).
  8. Jawkar, S., Nongthomba, U. Indirect flight muscles in Drosophila melanogaster as a tractable model to study muscle development and disease. Int J Dev Biol. 64 (1-3), 167-173 (2020).
  9. Sparrow, J., Hughes, S. M., Segalat, L. Other model organisms for sarcomeric muscle diseases. Adv Exp Med Biol. 642, 192-206 (2008).
  10. Khan, A. O., Simms, V. A., Pike, J. A., Thomas, S. G., Morgan, N. V. CRISPR-Cas9 mediated labelling allows for single molecule imaging and resolution. Sci Rep. 7 (1), 8450(2017).
  11. Atoki, A. V., et al. Exploring the versatility of Drosophila melanogaster as a model organism in biomedical research: a comprehensive review. Fly (Austin). 19 (1), 2420453(2025).
  12. Ling, Y. -P., Li, J. -J., Liu, J. -W., Zeng, B., Chen, G. -L., Wang, N. Technical innovations of signal amplification in fluorescence in situ hybridization. Gene. 964, 149647(2025).
  13. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  14. Fernandes, J., Bate, M., VijayRaghavan, K. Development of the indirect flight muscles of Drosophila. Development. 113 (1), 67-77 (1991).
  15. Swank, D. M. Mechanical analysis of Drosophila indirect flight and jump muscles. Methods. 56 (1), 69-77 (2012).
  16. Dobi, K. C., Schulman, V. K., Baylies, M. K. Specification of the somatic musculature in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (4), 357-375 (2015).
  17. Gunage, R. D., Dhanyasi, N., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Drosophila adult muscle development and regeneration. Semin Cell Dev Biol. 72, 56-66 (2017).
  18. Spletter, M. L., et al. A transcriptomics resource reveals a transcriptional transition during ordered sarcomere morphogenesis in flight muscle. eLife. 7, e34058(2018).
  19. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
  20. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  21. Matera, A. G. Chaperone dysfunction in motor neuron disease: new insights from studies of the SMN complex. Genetics. 229 (3), iyae223(2025).
  22. Jagla, K., Kalman, B., Boudou, T., Hénon, S., Batonnet-Pichon, S. Beyond mice: emerging and transdisciplinary models for the study of early-onset myopathies. Semin Cell Dev Biol. 64, 171-180 (2017).
  23. Reedy, M. K., Reedy, M. C. Rigor crossbridge structure in tilted single filament layers and flared-X formations from insect flight muscle. J Mol Biol. 185 (1), 145-176 (1985).
  24. Fyrberg, E. A., Bernstein, S. I., VijayRaghavan, K. Chapter 14: basic methods for Drosophila muscle biology. Methods Cell Biol. 44, 237-258 (1994).
  25. Volk, T., Fessler, L. I., Fessler, J. H. A role for integrin in the formation of sarcomeric cytoarchitecture. Cell. 63 (3), 525-536 (1990).
  26. Kao, S. -Y., Nikonova, E., Ravichandran, K., Spletter, M. L. Dissection of Drosophila melanogaster flight muscles for omics approaches. J Vis Exp. (152), e60309(2019).
  27. Bryantsev, A. L., Castillo, L., Oas, S. T., Chechenova, M. B., Dohn, T. E., Lovato, T. L. Myogenesis in Drosophila melanogaster: dissection of distinct muscle types for molecular analysis. Methods Mol Biol. 1889, 267-281 (2019).
  28. Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila pupal abdomen immunohistochemistry. J Vis Exp. (56), e3139(2011).
  29. Segal, D. Live imaging of myogenesis in indirect flight muscles in Drosophila. Bio Protoc. 7 (13), e2377(2017).
  30. Lemke, S. B., Schnorrer, F. In vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in Drosophila pupae. J Vis Exp. 132, e57312(2018).
  31. Kucherenko, M. M., Marrone, A. K., Rishko, V. M., Yatsenko, A. S., Klepzig, A., Shcherbata, H. R. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. J Vis Exp. (46), e2438(2010).
  32. Hunt, L. C., Demontis, F. Whole-mount immunostaining of Drosophila skeletal muscle. Nat Protoc. 8 (12), 2496-2501 (2013).
  33. Szikora, S., Novák, T., Gajdos, T., Erdélyi, M., Mihály, J. Superresolution microscopy of Drosophila indirect flight muscle sarcomeres. Bio Protoc. 10 (12), e3654(2020).
  34. Szikora, S., et al. Nanoscopy reveals the layered organization of the sarcomeric H-zone and I-band complexes. J Cell Biol. 219 (1), e201907026(2020).
  35. Xiao, Y. S., Schöck, F., González-Morales, N. Rapid IFM dissection for visualizing fluorescently tagged sarcomeric proteins. Bio Protoc. 7 (22), e2606(2017).
  36. Chakraborty, K., VijayRaghavan, K., Gunage, R. A method to injure, dissect and image indirect flight muscle of Drosophila. Bio Protoc. 8 (10), e2860(2018).
  37. Nikonova, E., et al. Bruno 1/CELF regulates splicing and cytoskeleton dynamics to ensure correct sarcomere assembly in Drosophila flight muscles. PLoS Biol. 22 (4), e3002575(2024).
  38. Nikonova, E., Mukherjee, A., Kamble, K., Barz, C., Nongthomba, U., Spletter, M. L. Rbfox1 is required for myofibril development and maintaining fiber type-specific isoform expression in Drosophila muscles. Life Sci Alliance. 5 (4), e202101342(2022).
  39. Rajendra, T. K., Gonsalvez, G. B., Walker, M. P., Shpargel, K. B., Salz, H. K., Matera, A. G. A Drosophila melanogaster model of spinal muscular atrophy reveals a function for SMN in striated muscle. J Cell Biol. 176 (6), 831-841 (2007).
  40. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  41. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology. , Academic Press. San Diego. (2013).
  42. Weitkunat, M., Kaya-Çopur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle. Curr Biol. 24 (7), 705-716 (2014).
  43. Chakravorty, S., et al. Flightin maintains myofilament lattice organization required for optimal flight power and courtship song quality in Drosophila. Proc Biol Sci. 284 (1854), 20170431(2017).
  44. Tanner, B. C. W., Farman, G. P., Irving, T. C., Maughan, D. W., Palmer, B. M., Miller, M. S. Thick-to-thin filament surface distance modulates cross-bridge kinetics in Drosophila flight muscle. Biophys J. 103 (6), 1275-1284 (2012).
  45. Görög, P., et al. A myofilament lattice model of Drosophila flight muscle sarcomeres based on multiscale morphometric analysis during development. bioRxiv. , (2025).
  46. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  47. Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons. Biol Methods Protoc. 4 (1), bpz010(2019).
  48. Elliott, A. D. Confocal microscopy: principles and modern practices. Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68(2020).
  49. Kaya-Çopur, A., et al. The Hippo pathway controls myofibril assembly and muscle fiber growth by regulating sarcomeric gene expression. eLife. 10, e63726(2021).
  50. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  51. Zhang, X., et al. Mechanoresponsive regulation of myogenesis by the force-sensing transcriptional regulator Tono. Curr Biol. 34 (18), 4143-4159.e6 (2024).
  52. Kouchmeshky, A., McCaffery, P. Chapter six: use of fixatives for immunohistochemistry and their application for detection of retinoic acid synthesizing enzymes in the central nervous system. Methods Enzymol. 637, 119-150 (2020).
  53. Konno, K., Yamasaki, M., Miyazaki, T., Watanabe, M. Glyoxal fixation: an approach to solve immunohistochemical problem in neuroscience research. Sci Adv. 9 (28), eadf7084(2023).
  54. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. J Oral Maxillofac Pathol. 16 (3), 400-405 (2012).
  55. Schönbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
  56. Monani, U. R. Spinal muscular atrophy: a deficiency in a ubiquitous protein; a motor neuron-specific disease. Neuron. 48 (6), 885-896 (2005).
  57. Imlach, W. L., Beck, E. S., Choi, B. J., Lotti, F., Pellizzoni, L., McCabe, B. D. SMN is required for sensory-motor circuit function in Drosophila. Cell. 151 (2), 427-439 (2012).
  58. Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
  59. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
  60. Schnorrer, F., et al. Systematic genetic analysis of muscle morphogenesis and function in Drosophila. Nature. 464 (7286), 287-291 (2010).
  61. Baheux Blin, M., Loreau, V., Schnorrer, F., Mangeol, P. PatternJ: an ImageJ toolset for the automated and quantitative analysis of regular spatial patterns found in sarcomeres, axons, somites, and more. Biol Open. 13 (6), bio060548(2024).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mi nie lotne Drosophilasekcja mi nimodel miogenezymorfologia sarkomer wmikroskopia immunofluorescencyjnarozw j mi ni poczwarkistruktura miofibrylimetody utrwalaniamodel chor b mi ni
Rozwarstwienie pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do podejść mikroskopowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.