Przedstawiamy prostą i szybką metodę ładowania określonej liczby komórek do mikrofabrykowanych studni oraz ich utrzymywania w celu rozwoju ciał embrionalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Krople wiszące typu Shrinky-Dink: prosty sposób formowania i hodowli ciał embrioidalnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ciałka zarodkowe (EB) są agregatami embrionalnych komórek macierzystych. Najczęstszą metodą tworzenia tych agregatów jest metoda wiszącej kropli, wymagające podejście polegające na pipetowaniu dowolnej liczby komórek do płytek z dołkami. Interakcje między komórkami macierzystymi, wymuszonym bliski kontakt, sprzyjają powstawaniu EB. Ponieważ pożywka w każdym z dołków musi być codziennie wymieniana ręcznie, metoda ta jest pracochłonna.
Ponadto, ponieważ parametry środowiskowe, w tym interakcje międzykomórkowe, oddziaływania czynników rozpuszczalnych, pH oraz dostępność tlenu mogą być funkcjami wielkości ciał embrioidalnych (EB), populacje komórek otrzymane z tradycyjnych kropli wiszących mogą się znacząco różnić, nawet jeśli były hodowane w identycznych warunkach. Niedawne badania wykazały, że początkowa liczba komórek tworzących agregat może mieć istotny wpływ na różnicowanie komórek macierzystych. Opracowaliśmy prostą, szybką i skalowalną metodę hodowli, pozwalającą na wprowadzenie precyzyjnie określonej liczby komórek do mikrowytrawionych studni i ich utrzymanie w celu rozwoju ciał embrioidalnych. Ostatecznie komórki te są łatwo dostępne do dalszych analiz i eksperymentów. Metoda ta jest dostępna dla każdego laboratorium i nie wymaga specjalistycznego sprzętu. Demonstrujemy tę metodę poprzez tworzenie ciał embrioidalnych przy użyciu czerwonej fluorescencyjnej linii komórkowej myszy (129S6B6-F1).
Protokół
1. Wykonywanie formy Shrinky-Dink
- Wydrukuj wybrany wzór na arkuszu shrinky-dink, używając drukarki o wysokiej rozdzielczości.
- Wypal arkusz shrinky-dink w temperaturze 163° C przez około 10 minut lub do momentu pełnego skurczenia się i uzyskania regularnego kształtu.
- Po ostygnięciu formy shrinky-dink zanurz ją w kąpieli z izopropanolu, aż cała powierzchnia zostanie ledwie przykryta.
- Ostrożnie spryskaj formę acetonem i kilkakrotnie potrząśnij pojemnikiem. Dodaj więcej izopropanolu, aby wypłukać nadmiar acetonu i powtórz ten krok kilka razy, aż forma shrinky-mold będzie wyglądać na czystą.
- Zanurz formę w wodzie destylowanej na 10 minut, aby wypłukać wszelkie pozostałości rozpuszczalnika organicznego.
- Oczyszczaj formę shrinky-mold powietrzem. Podgrzej ją ponownie przez około 5 minut w temperaturze 163° C. Pozwoli to utrwalić tusz i odparować pozostały rozpuszczalnik.
2. Przygotowanie mikrootworów z PDMS
- Przygotować mieszaninę PDMS i czynnika sieciującego w stosunku 10:1, a następnie energicznie mieszać przez kilka minut.
- Umieścić formę shrinky-dink w małej płytce Petriego. Wlewać mieszaninę PDMS, aż jej poziom przekroczy powierzchnię formy o około 1/2 cm.
- Umieścić płytkę w dzwonie próżniowym w celu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza z mieszaniny PDMS.
- Umieścić płytkę w piekarniku w temperaturze 70°C na noc.
- Odciąć utwardzony PDMS od formy i przytwierdzić go do szkiełka przedmiotowego, stosując sam nacisk.
- Odrzucić pierwszy chip mikrootworowy ze względu na obecność resztek tuszu w strukturze PDMS.
- Powtórzyć tę procedurę, aby wytworzyć drugi chip, który będzie wolny od tuszu i będzie miał bardziej zdefiniowany kształt.
- Oczyścić chip mikrootworowy za pomocą 70% roztworu etanolu. Umieścić go pod źródłem światła UV na 10 minut w celu sterylizacji.
3. Pułapkowanie komórek w mikrosodkach
- Należy policzyć komórki i rozcieńczyć je w pożywce hodowlanej do pożądanej koncentracji (zależnie od liczby początkowych komórek w poszczególnych studniach). Na przykład, aby uzyskać około 10-15 komórek na studnię (średnia = 11, SD = 5.4, stopień załadowania = 93%), zastosowano koncentrację 8×104 komórek/ml. Przy koncentracji 17×104 komórek/ml można było stabilnie uzyskać od 25 do 35 komórek na studnię (średnia = 27.17857 SD = 7.7, stopień załadowania = 100%).
- Należy ostrożnie umieścić chip z mikrostudniami w probówce wirówki o pojemności 50 ml zawierającej utwardzoną podstawę z PDMS.
- Należy dodać około 2JDP ml zawiesiny komórkowej.
- Wirować przez 5 minut przy 760 rpm i 4°C.
- Odpompować nadmiar roztworu i ostrożnie przemyć mikrostudnie roztworem PBS 1X.
- Umieścić chip z mikrostudniami w małej płytce Petriego, zachowując ostrożność podczas wyjmowania chipa z probówki wirówki.
- Przemyć nadmiar komórek roztworem 1 X PBS.
- Umieścić chip z mikrostudniami pod mikroskopem odwróconym, aby zweryfikować zamierzoną liczbę komórek w studni.
- Inkubować mikrostudnie z komórkami w standardowych warunkach.
4. Inkubacja komórek
- Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem EB obowiązującym w laboratorium.
- Powoli wymień medium, wprowadzając je od boku komory; unikaj niepokojenia komórki w mikrootworze.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowaliśmy prostą, szybką i skalowalną metodę hodowli do wprowadzania określonej liczby komórek do mikrofabricated wells (wykonanych z folii Shrinky-Dinks) i ich utrzymywania w celu rozwoju ciał zarodkowych (embryoid bodies). Ostatecznie komórki te są łatwo dostępne do dalszych analiz i eksperymentów. Metoda ta jest dostępna dla każdego laboratorium i nie wymaga specjalistycznego sprzętu, ponieważ eliminuje potrzebę stosowania fotolitografii. Możemy zmieniać rozmiar mikrootworów, a także koncentrację komórek na otwór,...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Pragniemy podziękować CIRM za wsparcie tych prac. Linia komórkowa została hojnie przekazana przez dr. Andrasa Nagy’ego z Mount Sinai Hospital w Toronto, Ontario.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nazwa materiału | Typ | Firma | Numer katalogowy |
| Folia termokurczliwa Shrink-Dink | Materiał | K&B Innovations | D300-10A |
| PDMS | Materiał | Dow Corning | Sylgard 184 |
| Aceton | Odczynnik | Fisher Scientific | A16P-4 |
| Ethanol | Odczynnik | Fisher Scientific | A405P-4 |
| PBS | Odczynnik | Sigma | P4417 |
| BMP-4 | Odczynnik | R and D systems | 314-BP-010 |
| Knock-Out DMEM (KO DMEM) | Odczynnik | Invitrogen | 10829 |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Odczynnik | Invitrogen | 10828 |
| Penn-Strep | Odczynnik | Invitrogen | 15070-063 |
| L-glutamina | Odczynnik | Invitrogen | 25030-081 |
| Nieessentialne aminokwasy (NEAA) | Odczynnik | Invitrogen | 11140 |
| D-merkaptoetanol (BME) | Odczynnik | Calbiochem | 444203 |
| Czynnik hamujący białaczkę (LIF) {ESGRO 106 jednostek} | Odczynnik | Chemicon | ESG1106 |
| Drukarka | Narzędzie | HP | Laser Jet 2420d |
| Piec | Narzędzie | Yamato Scientific | DP-22 |
| Dla pożywki do mESC (protokół laboratorium McCloskey): (dla całkowitej objętości pożywki: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: .5ml; 1ml 2mM L-glutamina: .5ml; 1ml NEAA: .5ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100ul Rozcieńczony BME: 50ul; 100ul (Dodać 35ul sterylnie przefiltrowanego BME do 5ml PBS i wysterylizować za pomocą filtra strzykawkowego. Utylizować po 2 tygodniach. Końcowe stężenie w roztworze wynosi .1mM) | |||
Bibliografia
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
- Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).
- Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies. J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).
- Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Controlled differentiation of stem cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).
- Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media. Development. 129, 539-549 (2002).
- Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. J Transl Med. 4, (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
