Artykuł metodologiczny

Model defektu kości dwułopowatej półsegmentalnej u szczurów do oceny wydajności substytucji kości w obszarach nośnych

DOI:

10.3791/69211

⸱

30 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Cariology and Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 3Department of Jinjiang Outpatient, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to ustanowiło model defektu półsegmentalnego szczura kości udowej do oceny mechanicznej i osteogenicznej wydajności materiałów zastępczych kości w warunkach nośnych, bez użycia wewnętrznego lub zewnętrznego fiksacji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładna przedkliniczna ocena materiałów zastępujących kości wymaga modeli, które nie tylko wspierają regenerację tkanek, ale także odzwierciedlają mechaniczne wyzwania fizjologiczne warunków obciążenia. Jednak większość konwencjonalnych modeli defektów kostnych u zwierząt nie spełnia pod tym względem. Na przykład modele defektów kalvarialnych, choć szeroko stosowane, powstają w obszarach nieobciążających. Podobnie defekty wiertnicze lub częściowe defekty w długich kościach koncentrują się głównie na lokalnym gojeniu, nie zapewniając wystarczającego przenoszenia obciążenia do oceny wsparcia mechanicznego. Badanie to ustanowiło standaryzowany półsegmentalny model defektu kości przekrzynionej w kości udowej szczura, aby ocenić zarówno mechaniczną, jak i biologiczną funkcjonalność materiałów zastępujących kost w kontekście nośnym bez użycia urządzeń stabilizujących. Za pomocą szybkiej rękodziejki i specjalistycznego cylindrycznego dziorka dentystycznego powstała półcylindryczna wada o długości 4 mm i promieniu 1,5 mm w bocznym trzonie kości udowej. Dwa reprezentatywne materiały o różnych właściwościach – żelatyna-metacryloyl (GelMA) hydrogel oraz polimetakrylan 3D (3DP-PMMA) – zostały wszczepione, aby zweryfikować zdolność modelu do różnicowania właściwości mechanicznych materiałów. Analizy radiograficzne, histologiczne i immunofluorescencyjne przeprowadzone 4 tygodnie po implantacji wykazały, że z powodu niewystarczającego wsparcia mechanicznego implantacja GelMA prowadziła do zniesienia, z dominacją tkanki włóknistej i ograniczoną integracją kości. Dla porównania, 3DP-PMMA ułatwiło organizację nowej kości, ciągłość okołokostalną oraz rekrutację komórek ekspresyjnych mechanoczułych kanałów jonowych typu Piezo1+ (Piezo1+) i receptorów leptynowych (LepR+). Model ten stanowi praktyczną i powtarzalną platformę do oceny nośności, osteoindukcjonalności oraz potencjału osseointegracji biomateriałów. Może służyć jako cenne narzędzie do badania materiałów kandydatów do zastosowań ortopedycznych, takich jak rekonstrukcja długich kości czy naprawa złamań.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W warunkach fizjologicznych kość odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu integralności strukturalnej i funkcji mechanicznej ciała. Wspiera ciężar ciała, umożliwia ruch i chroni narządy wewnętrzne. Gdy kość ulega uszkodzeniu w wyniku urazu, resekcji guza lub infekcji, zwłaszcza w obszarach nośnych, mechaniczna ciągłość zostaje przerwana. To zaburzenie często prowadzi do powikłań takich jak deformacje kości, ograniczona ruchomość, niestabilność kończyn, przewlekły ból, a nawet zagrażające życiu problemy z powodu poważnych złamań i krwotoków 1,2. Obecnie klinicznie stosuje się substytuty kości, takie jak przeszczepy kości i biomateriały, aby zastąpić poważnie uszkodzoną tkankę kostną lub przywrócić duże wady kostne. Podobnie, w przypadku wszczepionych substytutów kostnych, ich osłabiona sprawność mechaniczna może prowadzić do awarii implantu, skutkując niezrośniętymi lub nawet katastrofalnymi złamaniami w miejscu defektu 3,4. Aby przywrócić zarówno strukturę, jak i funkcję, materiały zastępujące kości muszą nie tylko wspierać regenerację kości, ale także posiadać wystarczającą wytrzymałość mechaniczną, by wytrzymać obciążenia fizjologiczne5.

Kluczowym krokiem przed translacją kliniczną jest realistyczna ocena, czy biomateriał, po wszczepieniu in vivo, może sprostać wymaganiom mechanicznym dla wsparcia strukturalnego w obszarach kości nośnych. Chociaż wiele biomateriałów wykazało obiecujące cechy in vitro lub w małych, nieobciążających modelach, ich zastosowanie w praktyce klinicznej często utrudnia brak wiarygodnych modeli przedklinicznych symulujących warunki mechaniczne in vivo. Obecnie stosowane modele zwierzęce do badań wad kości obejmują defekty żuchwy6, defekty jamki7, defekty otworów wiertniczych w kościach długich8, gniazda po ekstrakcji9 i inne. Modele te przede wszystkim oceniają zdolność osteogenną materiału i koncentrują się na końcowych punktach histologicznej lub rentgenologicznej regeneracji10,11. Jednak biorąc pod uwagę, że te miejsca są albo nieobciążalne, albo chronione mechanicznie, nie oddają dynamicznych warunków naprężeń występujących w kościach długich12. Nawet gdy właściwości mechaniczne są testowane technikami in vitro, takimi jak testy wytrzymałości ściskającej lub wytrzymałości na rozciąganie, nie są one w stanie odtworzyć dynamicznego obciążenia i interakcji tkanek gospodarza, które są inherentne środowiskom in vivo13.

Główną luką w badaniach przedklinicznych pozostaje brak standaryzowanego, powtarzalnego modelu zwierzęcego, który umożliwiałby in vivo mechaniczną ocenę substytutów kostnych w warunkach nośnych. Aby temu sprostać problemowi, obecne badanie ustanowiło model półsegmentalnego ubytku kości diafizowej u szczurów. Model ten zapewnia stabilne i powtarzalne miejsce defektu w obszarze nośnym, umożliwiając bezpośrednią ocenę mechanicznej nośności materiałów zastępczych kości pod obciążeniem fizjologicznym, jednocześnie umożliwiając ocenę wyników osteogennych. Ponadto model może być stosowany na różnych gatunkach zwierząt, a rozmiar i lokalizacja defektów dostosowywane są do konkretnego użytego zwierzęcia. Niemniej jednak nie oddaje w pełni złożonego środowiska biomechanicznego ludzkich kości, a dla badań skupionych wyłącznie na defektach nieobciążających, gojeniu kości czaszki lub bardzo dużych implantach strukturalnych, alternatywne modele mogą być bardziej odpowiednie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zabiegi na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu uzyskały zgodę Komitetu Etycznego Zachodniochińskiej Szkoły Stomatologii Uniwersytetu Syczuan (WCHSIRB-AT-2025-342). Samce szczurów Sprague-Dawley (po 180 g) zostały pozyskane ze źródła komercyjnego i losowo podzielone na dwie grupy (n = 6 na grupę) według wszczepionego materiału. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Elementy chirurgiczne
    1. Przygotuj narzędzia chirurgiczne zgodnie ze Rysunkiem 1A, odpowiadające ponumerowanym etykietom na rysunku, w następującej kolejności: zakrzywione kleszcze, jednorazowy sterylny skalpel, proste nożyczki, podnośnik okostny, igła irygacja, specjalny diamentowy żar dentystyczny (patrz powiększony widok na Rysunku 1B), szybka rękołąź, zacisk wernierowy, silnik chirurgiczny, szew monofilamentowy (4-0) oraz uchwyt na igły.
    2. Przygotuj 0,9% sterylny roztwór soli fizjologicznej do nawadniania.
  2. Sterylizacja i dezynfekcja
    1. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne, które wytrzymują autoklawowanie, w tym wygięte kleszcze, nożyczki, podnośnik okostny, diamentowy dzioł dentystyczny, szybką dłoń oraz uchwyt na igły.
      UWAGA: Narzędzia powinny być owinięte medycznymi tkaninami nietkanymi i uszczelnione taśmą autoklawową do sterylizacji parowej w temperaturze 121-134 °C przez 20-25 minut.
    2. W przypadku instrumentów wrażliwych na ciepło, takich jak zaciski wernier czy silnik chirurgiczny, należy wystawić je na promieniowanie ultrafioletowe przez co najmniej 30 minut w celu dezynfekcji. Jednorazowe przedmioty, takie jak jednorazowy sterylny skalpel, igła irygacyjne czy szwy, powinny pozostać zamknięte w oryginalnym sterylnym opakowaniu do czasu użycia.
    3. Upewnij się, że środowisko chirurgiczne jest sterylne i kontrolowane temperaturą. Przetrzyj stół chirurgiczny i otaczające je powierzchnie 75% etanolem. Do pokrycia stołu operacyjnego używaj sterylnych, medycznych tkanin nietkanych.
      UWAGA: Etanol jest łatwopalny; Obchodzić się z dala od źródeł zapłonu i przechowywać w zamkniętych pojemnikach. Zbieraj odpady etanolowe w wyznaczonych pojemnikach na odpady chemiczne, aby zapewnić odpowiednią utylizację. Noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego, w tym rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i gogli ochronnych.
  3. Znieczulenie
    1. Zważ szczura i oblicz dawkę środka znieczulenia (100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny, dootrzewnowkowo).
    2. Wprowadź znieczulenie 20 minut przed operacją (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi) i potwierdź głębokość, sprawdzając brak reakcji na uszczypnięcie palca u stopy i utratę odruchu prostego.
    3. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu.

2. Zabieg chirurgiczny

  1. Przygotowanie stanowiska
    1. Ułóż szczura w pozycji bocznej leżącej na sterylnym stole chirurgicznym. Ogol boczną część uda odpowiadającą wystaniu kości udowej i zdezynfekuj skórę za pomocą nalewki z jodem 2%, a następnie 75% etanolu (rysunek 2Ba).
      UWAGA: Nalewka jodu jest łatwopalna i drażniąca. Obchodzić się w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, mając na sobie rękawiczki, fartuch laboratoryjny i gogle ochronne. Utylizuj zużyte chusteczki i roztwory w wyznaczonych pojemnikach na odpady chemiczne zgodnie z instytucjonalnymi przepisami bezpieczeństwa.
    2. Przebierz się w świeże, sterylne rękawice. Okryj miejsce operacji sterylną, fenestrowaną prześcieradłem, aby utrzymać asepsę.
  2. Otwarcie miejsca chirurgicznego
    1. Używaj wygiętych kleszczy, aby pomóc w stabilizacji tkanek, utrzymaniu mięśni oraz delikatnym zabezpieczeniu kości udowej przez cały zabieg chirurgiczny (rysunek 2Bb-h).
    2. Wykonaj 2-3 cm podłużne nacięcie skóry na bocznej stronie uda sterylnym ostrzem skalpela, aby odsłonić mięśnie pod spodem (Rysunek 2Bb).
    3. Zidentyfikuj mięśnie proste uda i mięśnie rozswojego bocznego i ostrożnie rozdziel je wzdłuż widocznej białej powięzi (oznaczonej żółtą strzałką na Rysunku 2Bb) za pomocą prostych nożyczek (Rysunek 2Bc).
    4. Zlokalizuj i odsłonij przyczepy mięśniowe na bocznej powierzchni kości udowej (Rysunek 2Bd).
    5. Wykonaj podłużne nacięcie wzdłuż przystawów mięśni jednorazowym sterylnym skalpelem, aby uzyskać dostęp do powierzchni kości udowej (Rysunek 2Be).
      UWAGA: Podczas ostrego rozwarstwiania (nożyczkami lub skalpelem) w celu rozdzielenia tkanek miękkich należy uważać, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych i nerwów pod powierzchnią. Jeśli nie znasz struktur anatomicznych, użyj cienkokońcówkowych kleszczy i podnośnika okostowego do wykonania tępego rozwarstwienia.
    6. Wykonaj tępe przecięcie za pomocą podnośnika okołokostnego, aby odłączyć przyczepy mięśniowe i całkowicie odsłonić środkową diefizę kości udowej (Rysunek 2Bf).
    7. Dodatkowo oddziel kość udową od otaczających mięśni i trzymaj środkowy trzon kości udowej za pomocą zakrzywionych kleszczy (Rysunek 2Bg).
  3. Ustanowienie modelu modelu defektu kości dwułopowatej półsegmentowej
    1. Przymocuj płaskokoczący, cylindryczny, specyficzny diament dentystyczny (Rysunek 1B) do szybkiej rękostroji, zasilanej silnikiem chirurgicznym. Ustaw silnik chirurgiczny na 35 000 obr./min.
    2. W bezpośredniej wizualizacji zidentyfikowaj najwyższy punkt środkowego trzona kości udowej jako anatomiczne centrum powstawania wad. W tym miejscu wierć pionowo w dół za pomocą żrebu, aż zaobserwuje się nagła utrata oporu, któremu towarzyszy pojawienie się wydzieliny krwi wewnątrz ubytku, co wskazuje na pełne przebicie kory i dostęp do jamy rdzeniowej (rysunek 2Bh).
      UWAGA: Ze względu na zmienność grubości kory między zwierzętami, operatorom zaleca się zapoznanie się z anatomią kości udowej oraz przeprowadzenie treningu przedeksperymentalnego w celu ustandaryzowania tego kroku.
    3. Powiększ defekt, stosując kontrolowane poziome ruchy pchające-ciągające wokół początkowego punktu penetracji. Przedłuż defekt wzdłużnie (wzdłuż osi kości udowej) i bocznie (wzdłuż średnicy kości udowej), aby stopniowo utworzyć standaryzowany defekt półcylindryczny o długości 4 mm i promieniu 1,5 mm (Rysunek 2Bi, patrz Rysunek 2A , aby poznać morfologię i położenie defektu).
      UWAGA: Po ustaleniu punktu centralnego użyj zacisku werniera, aby stopniowo powiększać defekty, zapewniając jednolite wymiary we wszystkich próbkach. Płaski, cylindryczny kształt specjalistycznego żburu dentystycznego odpowiada defektowi półcylindrycznemu, umożliwiając efektywne i powtarzalne przygotowanie.
    4. Nieustannie płukaj miejsce operacji sterylną solą fizjologiczną za pomocą igły irygacyjnej, aby zapobiec martwicy termicznej podczas cięcia kości.
  4. Wszczepienie kości zastępczej
    1. Delikatnie usuń resztki kości i nawadnij miejsce, aby usunąć resztki.
    2. Wprowadź nienośne żelatynowe metaakryloylowe (GelMA) hydrożele (patrz Tabela materiałów) lub nosne polimetakrylan 3D (3DP-PMMA) przeznaczone do testów wydajności mechanicznej w miejscu defektu, zapewniając dopasowanie (Rysunek 2Bj).
      UWAGA: Dwa użyte tutaj biomateriały zostały celowo wybrane tak, aby odzwierciedlać kontrastujące właściwości mechaniczne i biologiczne: GelMA hydrogel służy jako miękki, nieobciążający materiał o ograniczonym potencjale osteogenicznym, podczas gdy 3DP-PMMA działa jako sztywne, nośne rusztowanie zdolne do skutecznego przenoszenia stresu i wspierania formowania kości14 (Rysunek 2A). Ten kontrast podkreśla zdolność modelu do oceny implantów o szerokim zakresie wytrzymałości mechanicznej i właściwości biologicznych, a w praktyce model defektów może być stosowany do testowania innych kandydatów o właściwościach mechanicznych.
  5. Zamknięcie miejsca chirurgicznego
    1. Zszyj warstwy mięśniowe za pomocą szwów monofilamentowych 4-0 i uchwytu na igły, uważając, aby uniknąć nadmiernego napięcia (Rysunek 2Bk).
    2. Wykonaj zamknięcie skóry za pomocą szwów przerwanych i zdezynfekuj miejsce operacji za pomocą 2% roztworu jodoforowego (rysunek 2Bl).

3. Opieka pooperacyjna

  1. Przenieś szczury na zdezynfekowany, stały termofor (37 °C), aby umożliwić rekonwalescencję po operacji.
  2. Podawaj odpowiednie pooperacyjne środki przeciwbólowe (np. buprenorfinę w dawce 0,03 mg/kg podskórnie co 12 godzin przez 48-72 godziny).
  3. Gdy szczury odzyskają przytomność, umieszczaj je w czystych klatkach z miękką ściółką i łatwym dostępem do jedzenia i wody.
  4. Codziennie monitoruj miejsce operacji pod kątem oznak infekcji, dehiscencji lub nieprawidłowego obrzęku. Obserwuj zachowanie, wagę i mobilność szczurów przez co najmniej 7 dni po operacji, aby zapewnić rekonwalescencję i ocenić ich samopoczucie.

4. Pobieranie próbek i zbieranie danych

  1. Zbieranie próbek
    1. Uśpienie szczurów poprzez wdychanie dwutlenkiem węgla, a następnie wtórne potwierdzenie (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).
    2. Pobrano próbki kości udowej 4 tygodnie po implantacji, a zwierzęta początkowo zostały losowo podzielone na dwie grupy materiałów (n = 6 na grupę), aby ocenić mechaniczne właściwości materiałów.
      UWAGA: W grupie GelMA trzy zwierzęta rozwinęły całkowite złamania niedługo po operacji i zostały wykluczone, pozostawiając trzy próbki dostępne do kolejnych analiz.
    3. Utrwalić próbki kości udowej w 4% paradehydu przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny i powinien być obsługiwany w certyfikowanym okapie wyparowym. Noś rękawiczki, fartuch laboratoryjny oraz okulary ochronne lub przyłbicę na twarz. Zbieraj roztwory odpadów w oznaczonych pojemnikach na niebezpieczne chemikalia do utylizacji.
  2. Ocena mikrotomografii komputerowej (μCT)
    1. Wykonaj skanowanie μCT na próbkach kości udowej pobranych 4 tygodnie po implantacji z następującymi parametrami skanowania: potencjał rurki rentgenowskiej, 70 kVp; Intensywność promieniowania rentgenowskiego, 0,2 mA; filtr AL 0,5 mm; czas całkowania, 1 x 300 ms; a rozmiar wokseli 17 μm.
    2. Wykonaj rekonstrukcję 3D za pomocą zdefiniowanych skryptów dostępnych w oprogramowaniu maszynowym μCT. Generuj przekrojowe obrazy miejsca defektu za pomocą funkcji reseju dedykowanego oprogramowania do przetwarzania obrazów. Postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami opisanymi w odpowiednich instrukcjach programowych.
  3. Barwienie histologiczne
    1. Odwapnij próbki w temperaturze 4 °C przy użyciu 12% etylendiaminetetraoctowego kwasu (EDTA) (pH 7,2) przez 6 tygodni na shakerze.
      UWAGA: Wymieniaj roztwór EDTA co 2 dni. Regularnie sprawdzaj postępy w odwapnianiu. Dewaccyfikacja jest zakończona, gdy próbka jest podatna na ugięcie pod ciśnieniem lub przechodzi przez igłę.
      UWAGA: Utylizować roztwory EDTA zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi wodnych odpadów chemicznych. Skażone materiały biologiczne powinny być traktowane jako odpady biologicznie niebezpieczne.
    2. Próbki odwodnić w stopniowej serii rozcieńczeń etanolu, a następnie umieścić je w parafinie.
    3. Próbki osadzone w parafinie pokrój sagittally na plasterki o grubości 6 μm.
      UWAGA: Upewnij się, że przekroje zawierają interfejs między wszczepionym materiałem a tkanką gospodarza.
    4. Wykonaj barwienie hematoksylin-eozyny (H&E) oraz barwienia trójchromowe Massona przy użyciu komercyjnie dostępnych zestawów (patrz Tabela materiałów). Wykonuj wszystkie procedury ściśle zgodnie ze standardowymi protokołami producenta, bez żadnych odstępstw. Obserwuj gojenie się miejsc ubytku za pomocą histopatologii.
      UWAGA: Utylizować roztwory barwiące i skażone materiały eksploatacyjne zgodnie z instytucjonalnymi protokołami biobezpieczeństwa i utylizacji odpadów niebezpiecznych.
  4. Barwienie immunofluorescencyjne (IF)
    1. Odparaffiniuj i nawodnij 6 μm grube przekroje parafiny za pomocą serii roztworów ksylenowych i roztworów etanolu oklasyfikowanego.
      UWAGA: Ksylen jest łatwopalny i toksyczny. Obchodz się z ksylenem w kapturze przeciwspalinowym, mając na sobie rękawiczki, fartuch laboratoryjny i gogle ochronne. Zbieraj rozpuszczalniki odpadów osobno w pojemnikach na odpady chemiczne w celu odpowiedniej utylizacji.
    2. Pobierz antygen, inkubując preparaty w buforze cytrynianowym (pH 6,0) w temperaturze 95-100 °C przez 15-20 minut. Pozwól zamkom naturalnie ostygnąć do temperatury pokojowej.
    3. Przemyj fragmenty solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) przez 5 minut i podaj 0,1% Triton X-100 w PBS przez 20 minut, aby ułatwić penetrację przeciwciał. Następnie blokuj niespecyficzne miejsca wiązania 5% bovą serum albuminą (BSA) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Triton X-100 jest irytujący; Obsługa w rękawiczkach, fartuchu laboratoryjnym i goglach ochronnych w wentylowanym pomieszczeniu. Utylizować roztwory Triton X-100 jako odpady chemiczne w wyznaczonych pojemnikach. We wszystkich procedurach roztwory, które miały kontakt z przekrojami tkanek, takie jak BSA i PBS, powinny być traktowane jako odpady biologiczne i muszą być zbierane oraz uśmietylowane zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa biologicznego.
    4. Inkubuj przekroje z pierwotnymi przeciwciałami (mechanoczuły kanał jonowy typu anty-piezo-Piezo, komponent 1:200, rozcieńczony 1:200; receptor antyleptynowy (LepR), rozcieńczony 1:50) w buforze rozcieńczającym przeciwciała. Nałóż 50 μL rozcieńczonego roztworu przeciwciał do każdej sekcji i inkubuj przez 12-18 godzin w ciemności w ciemności w nawilżonej komorze.
    5. Przemyj szkiełka PBS (3 × 5 min), a następnie inkubuj je z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluoroforem (rozcieńczone 1:200). Na każdą sekcję nałóż 50 μL rozcieńczonego roztworu przeciwciał i inkubuj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności w nawilżonej komorze.
    6. Przepłucz szkiełka ponownie w PBS (3 × 5 min), następnie kontrbarwuj jądra 4',6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI) (rozcieńczonym 1:50) przez 5 minut.
    7. Zamontuj sekcje z antyfade medium mocującym i przykryj pokrywką.
    8. Wizualizuj i rejestruj obrazy za pomocą laserowego skanującego mikroskopu konfokalnego z odpowiednimi ustawieniami filtra.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu model półsegmentalnego defektu kości przepojowej u szczurów został opracowany poprzez wiercenie defektu o długości 4 mm i promieniu 1,5 mm w środkowym trzonie kości udowej za pomocą płaskiego, cylindrycznego, specyficznego diamentowego dziorka dentystycznego (Rysunek 2A). Aby wykazać zdolność modelu do testowania mechanicznej i biologicznej wydajności materiałów, wyznaczyliśmy dwie grupy porównawcze z defektami wszczepionymi albo hydrożelami GelMA, albo 3DP-PMMA (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poza szeroko podkreślanymi właściwościami osteoinduktywności, osteointegracji i biokompatybilności5, mechaniczna responsywność i nośność substytutów kostnych są równie istotne, szczególnie w naprawie wad kości obciążających22. Konwencjonalne oceny wydajności mechanicznej zazwyczaj opierają się na metodach in vitro, takich jak uniwersalne maszyny testujące, testy ściskania czy analizy wytrzymałości na rozciąganie 23,24,25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie oryginalne dane i obrazy zostały zawarte w tym dokumencie. Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało wsparte przez Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Syczuan (2025ZNSFSC0754).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór jodoforów 2%Chengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.Brak
Polimetakrylan drukowany w 3D (3DP-PMMA)uprzejmie udostępnione przez Wydział Nauk i Inżynierii Polimerów Uniwersytetu SyczuanBrak
4% paraformaldehyduBiosharpBL539A
75% etanoluChengdu Jinshan Chemical Reagent Co., Ltd.Brak
WacikiHaishi Hainuo Group Co.  Ltd.Brak
Patyczki bawełnianeLakong Medical Devices Co., Ltd.Brak
Roztwór barwienia DAPIBeyotime Cat#C1005
Jednorazowy sterylny skalpelHangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.20100227
Hydrożele metaloylowe żelatyny (GelMA)uprzejmie udostępnione przez Wydział Nauk i Inżynierii Polimerów Uniwersytetu SyczuanBrak
GelMA 20%CellinkIKG125000005
IgG H& IgG dla kóz przeciwmyszy L (Alexa Fluor® 594)Abcamab150116
IgG H& Kozy przeciwkrólikowe L (Alexa Fluor® 488)Abcamab150077
Zestaw barwienia hematoksyliny i eozynyBiosharpC1005
Szybka rękodziełoFoshan SCS Medical Instrument Co., Ltd.9018499000
Igła irygacjaSyczuan New Century Medical Polymer Products Co., Ltd.Brak
Masson' Zestaw Trichrome Stain KitSolarbioG1340
Medyczne tkaniny nietkaneHenan Yadu Industrial Co., Ltd.  Brak
Medyczne tkaniny nietkaneHenan Yadu Industrial Co., Ltd.  Brak
Mikrotomografia komputerowa (mikro; CT) Scanco Medical AGμ CT 45
Mimics 20.0 dla obrazów przekrojowych (funkcja rezlice)MaterializacjaBrak
Uchwyty na igłyChengdu Shifeng Co., Ltd.Brak
Przeciwciało Ob-R/Receptor Leptynowy (B-3)Santa CruzSC-8391
System skanowania całego szkiełka klasy Olympus Research VS200Chengdu Knowledge Technology Co., LtdVS200
Elewacja okołokostowaChengdu Shifeng Co., Ltd.Brak
Przeciwciało PIEZO1NovusNBP1-78446
Roztwór soli fizjologicznejSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.Brak
Oprogramowanie medycznego wizualizatora Scanco do rekonstrukcji obrazów 3D (zdefiniowane skrypty)Scanco Medical AGBrak
Specyficzny diamentowy żar dentystyczny (TF-22/170-021m/845-021m)Diantong Dental Materials CompanyBrak
Szczury Sprague-Dawley Byrness Weil Biotech LtdBrak
Nożyce prosteChengdu Shifeng Co., Ltd.Brak
Ruch chirurgicznyMARATONN3-140232
Szwy chirurgiczne (4-0 monofilament)Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.Brak
Zacisk VernierDelikatesyDL91150

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitchnik, I. Y., et al. Femur fractures and hemorrhagic shock: Implications for point of injury treatment. Injury. 53 (10), 3416-3422 (2022).
  2. Mitchell, S. A. T., Majuta, L. A., Mantyh, P. W. New insights in understanding and treating bone fracture pain. Curr Osteoporos Rep. 16 (4), 325-332 (2018).
  3. Ritchie, R. O. The conflicts between strength and toughness. Nat Mater. 10 (11), 817-822 (2011).
  4. Carson, J. S., Bostrom, M. P. G. Synthetic bone scaffolds and fracture repair. Injury. 38 (1 Suppl ), S33-S37 (2007).
  5. Janicki, P., Schmidmaier, G. What should be the characteristics of the ideal bone graft substitute? Combining scaffolds with growth factors and/or stem cells. Injury. 42, S77-S81 (2011).
  6. Zandi, M., Dehghan, A., Talimkhani, I., Rezaeian, L., Mohammad Gholi Mezerji, N. Histological evaluation of the healing process of autografted mandibular bone defects in rats under treatment with zoledronate. J Cranio Maxillofac Surg. 47 (11), 1779-1786 (2019).
  7. Wu, J., et al. The establishment of calvarial suture-bony composite defects in rats: A standardized model for suture-regenerative therapy investigation. J Vis Exp. (207), e66417(2024).
  8. Chen, Y., Wu, J., Li, F., Ye, L., Wang, H. Creating a box-cavity defect model in the cortical bone of rat femora. J Vis Exp. (201), e66068(2023).
  9. Yu, C., Yu, F., Li, F., Ye, L. The establishment of a murine mandibular molar extraction socket healing model. J Vis Exp. (191), e64855(2023).
  10. Han, L., et al. 3D magnetic nanocomposite scaffolds enhanced the osteogenic capacities of rat bone mesenchymal stem cells in vitro and in a rat calvarial bone defect model by promoting cell adhesion. J Biomed Mater Res A. 109 (9), 1670-1680 (2021).
  11. Han, Z., Bhavsar, M., Leppik, L., Oliveira, K. M. C., Barker, J. H. Histological scoring method to assess bone healing in critical size bone defect models. Tissue Eng Part C Methods. 24 (5), 272-279 (2018).
  12. Gomes, P. S., Fernandes, M. H. Rodent models in bone-related research: the relevance of calvarial defects in the assessment of bone regeneration strategies. Lab Anim. 45 (1), 14-24 (2011).
  13. Tsiklin, I. L., Shabunin, A. V., Kolsanov, A. V., Volova, L. T. In vivo bone tissue engineering strategies: advances and prospects. Polymers. 14 (15), 3222(2022).
  14. Long, S., et al. Architecture mechanics mediated osteogenic progression in bone regeneration of artificial scaffolds. Sci Adv. 11 (29), eadv8804(2025).
  15. Man, K., et al. GelMA hydrogel reinforced with 3D printed PEGT/PBT scaffolds for supporting epigenetically-activated human bone marrow stromal cells for bone repair. J Funct Biomater. 13 (2), 41(2022).
  16. Chen, N. Embedded 3D printing and pressurized thermo-curing of PMMA for medical implants. J Mech Behav Biomed Mater. 146, 106083(2023).
  17. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
  18. Ikeda, T., et al. Stimulation of osteogenesis in bone defects implanted with biodegradable hydroxyapatite composed of rod-shaped particles under mechanical unloading. Acta Histochem Cytochem. 45 (5), 283-292 (2012).
  19. Du, Y., Xu, B., Li, Q., Peng, C., Yang, K. The role of mechanically sensitive ion channel Piezo1 in bone remodeling. Front Bioeng Biotechnol. 12, 1342149(2024).
  20. Tadge, T., et al. The role of Piezo1 and Piezo2 proteins in tissue engineering: a comprehensive review. Eng Regen. 5 (2), 170-185 (2024).
  21. Prasad, P., Cancelas, J. A. From marrow to bone and fat: exploring the multifaceted roles of Leptin receptor positive bone marrow mesenchymal stromal cells. Cells. 13 (11), 910(2024).
  22. Hart, N. H., et al. Mechanical basis of bone strength: influence of bone material, bone structure and muscle action. J Musculoskelet Neuronal Interact. 17 (3), 114-139 (2017).
  23. Zhong, J., He, D. Combination of universal mechanical testing machine with atomic force microscope for materials research. Sci Rep. 5 (1), 12998(2015).
  24. El Kommos, A., Jackson, A. R., Andreopoulos, F., Travascio, F. Development of improved confined compression testing setups for use in stress relaxation testing of viscoelastic biomaterials. Gels. 10 (5), 329(2024).
  25. Lietaert, K., Cutolo, A., Boey, D., Van Hooreweder, B. Fatigue life of additively manufactured Ti6Al4V scaffolds under tension-tension, tension-compression and compression-compression fatigue load. Sci Rep. 8 (1), 4957(2018).
  26. Bignardi, C., Terzini, M. Novel load systems for in vitro testing of biomaterials and medical devices. Materials. 16 (2), 465(2023).
  27. Teti, A. Bone development: overview of bone cells and signaling. Curr Osteoporos Rep. 9 (4), 264-273 (2011).
  28. McGovern, J. A., Griffin, M., Hutmacher, D. W. Animal models for bone tissue engineering and modelling disease. Dis Model Mech. 11 (4), dmm033084(2018).
  29. Malda, J., et al. 25th anniversary article: engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  30. Altmann, B., et al. Promotion of osteoblast differentiation in 3D biomaterial micro-chip arrays comprising fibronectin-coated poly(methyl methacrylate) polycarbonate. Biomaterials. 32 (34), 8947-8956 (2011).
  31. Bastidas-Coral, A. P., et al. Polymethyl methacrylate does not adversely affect the osteogenic potential of human adipose stem cells or primary osteoblasts. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 108 (4), 1536-1545 (2020).
  32. Öztürk, Z., Tosun, B. Comparison of 3D printed and conventional denture base materials in terms of durability and performance characteristics. Sci Rep. 15, 18234(2025).
  33. Wu, J., et al. Transcriptomic and cellular decoding of scaffolds-induced suture mesenchyme regeneration. Int J Oral Sci. 16 (1), 33(2024).
  34. Kan, C., et al. BMP-dependent, injury-induced stem cell niche as a mechanism of heterotopic ossification. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 14(2019).
  35. Bao, X., et al. 3D biomimetic artificial bone scaffolds with dual-cytokines spatiotemporal delivery for large weight-bearing bone defect repair. Sci Rep. 7 (1), 7814(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bone Defect ModelLoad Bearing BoneDiaphyseal DefectRat Femur ModelBone Substitute Evaluation3D Printed PMMAGelatin Methacryloyl HydrogelMechanical Performance TestingOsseointegration AssessmentImmunofluorescence Staining

Powiązane artykuły