Artykuł metodologiczny

FLEX: Protokół szkolenia z ćwiczeń lotniczych dla muszki owocowej Drosophila

DOI:

10.3791/69217

⸱

14 października 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, LSU School of Veterinary Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest zapewnienie ćwiczeń lotniczych muszce owocowej Drosophila. Reprezentatywne wyniki pokazują, że trening lotniczy skutkuje zwiększoną pojemnością tlenową i odpornością na dietę wysokotłuszczową.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila stała się ostatnio popularnym modelem do badania otyłości i powiązanych zaburzeń. Chociaż stosunkowo łatwo jest wywołać zaburzenia metaboliczne u Drosophili stosując konkretne diety, stworzenie modelu ćwiczeń dla much jest trudniejsze. Istniejące metody, takie jak Power Tower i Treadwheel, wykorzystują drżące lub obracające się fiolki do wywoływania wspinaczki much, wykorzystując ich negatywną reakcję geotaksyjną. Jednak ciągłe wspinanie się przez długi czas jest dla much nienaturalne i może prowadzić do urazów i śmiertelności związanych z ćwiczeniami. Niniejszy artykuł wprowadza nowy protokół ćwiczeń, który wykorzystuje naturalną zdolność muchy do latania, oferując bardziej naturalne, fizjologiczne i wolne od kontuzji podejście do ćwiczeń. Eksperymenty pokazują, że pięciodniowy program ćwiczeń lotniczych zwiększa bioenergetyczność muchy i przeciwdziała negatywnym skutkom diety zachodniej (WD), poprawiając zachowania wspinaczkowe i zmniejszając śmiertelność związaną z WD. Protokół ten umożliwia jednoczesne szkolenie dużej liczby much w celu badania interakcji między ćwiczeniami a różnymi czynnikami, w tym dietą, lekami, starzeniem się i genetyką. Razem ta metoda może uzupełniać istniejące metody badania wpływu ćwiczeń na fizjologię i zachowanie much.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywność fizyczna i ćwiczenia są przedmiotem intensywnych badań pod kątem ich natychmiastowych i długoterminowych korzyści zdrowotnych:1. Ze względu na silny ogólnoustrojowy wpływ na metabolizm, ćwiczenia są coraz częściej wykorzystywane do zapobiegania i leczenia zaburzeń metabolicznych, sercowo-naczyniowych oraz neurologicznych 2,3,4. Pomimo rosnących dowodów na liczne korzyści zdrowotne związane z regularnym ćwiczeniem, dokładne molekularne mechanizmy leżące u podstaw tych korzyści pozostają słabo poznane5. Aby zrozumieć te mechanizmy, niezbędne jest wykorzystanie innowacyjnych i wysokowydajnych modeli zwierzęcych. Chociaż modele gryzoni są powszechnie wykorzystywane do badania wpływu ćwiczeń na choroby metaboliczne, takie badania wymagają znacznych kosztów, nadzoru regulacyjnego oraz specjalistycznego sprzętu 6,7.

Ostatnio Drosophila melanogaster stała się nowym modelem do badań nad biologią ćwiczeń (recenzje 8,9,10). Wyposażona w szeroki wachlarz potężnych narzędzi genetycznych, krótki cykl życia, rozległe potomstwo oraz ekonomiczne wymagania dotyczące utrzymania, muszka owocowa stanowi cenne źródło do badania mechanizmów genetycznych, epigenetycznych i międzypokoleniowych. Modelując ćwiczenia u much, obecne metody zazwyczaj opierają się na negatywnej geotaksji, czyli reakcji behawioralnej na wznoszeniesię w górę 11,12.

Jednym z pierwszych zautomatyzowanych protokołów ćwiczeń był specjalny sprzęt o nazwie Power Tower11. Power Tower wykorzystuje jednostkę silnikową, która wielokrotnie podnosi fiolki ze zwierzętami, a następnie zrzuca je w dół, wywołując negatywną odpowiedź geotaksji11. Długotrwałe ćwiczenia w Power Tower skutkują znaczącym zmniejszeniem spadku mobilności i wydajności serca związanej z wiekiem13. Dodatkowo, program Power Tower może być stresujący dla much, a nadmierna intensywność treningu może powodować urazy lub śmiertelność11.

Aby rozwiązać ten problem, opracowano inny paradygmat ćwiczeń zwany Treadwheel14. Treadwheel wykorzystuje także negatywną reakcję geotaksyjną Drosophili, ale zamiast podnosić i zrzucać muchy jak w Power Tower, odwraca fiolki ze zwierzętami. W przeciwieństwie do Power Tower, ta metoda jest łagodniejsza dla much i zapobiega urazom oraz śmiertelności związanej z ćwiczeniami9. Jednak muchy w Treadwheel mogą przyzwyczaić się do ruchu obrotowego, co może utrudnić interpretację wyników12. Aby rozwiązać ten problem, dodano monitor aktywności lokomotorycznej (LAM25H, Trikinetics), który mierzy aktywność podczas ćwiczeń, ilościowo określa aktywność Drosophila oraz uwzględnia habituację. Następnie nazwa systemu została zaktualizowana do Rotacyjnego Systemu Ilościowego Ćwiczeń (REQS)12.

Co ciekawe, bardzo niewiele badań wykorzystało naturalne zdolności lotu Drosophila do modelowania ćwiczeń. Głównym obszarem badań lotniczych były aerodynamika i biomechaniczne aspekty unoszenia się i manewrowania w powietrzu 15,16,17,18. Kilka badań zagłębiło się w fizjologiczne i komórkowe mechanizmy związane z lotem19,20. W tych badaniach oceniano zdolność lotu za pomocą testu lotu21,22, gdzie pojedyncze muchy były wypuszczane do przezroczystego akrylowego pudełka, a ich zdolność do utrzymania stałej wysokości i lotu zaobserwowano23.

W jednym z badań naukowcy badali skutki wywołanego lotu, umieszczając muchy w butelkach przymocowanych do wirującego shakera. Shaker delikatnie potrząsał butelkami w losowych odstępach od 5 do 10 minut, używając programowalnego timera19. Badanie wykazało, że wywołane zachowania ucieczkowe przyspieszały starzenie się oraz zależną z wiekiem utratę zdolności antyoksydacyjnej w mięśniach lotu19. Bazując na wcześniejszych badaniach, nasze laboratorium opracowało nowy protokół ćwiczeń o nazwie FLEX (flight exercise), integrując zautomatyzowany system negatywnej geotaksji z umieszczeniem much w dużych kontenerach24. Podczas szkolenia FLEX muchy umieszczano w przezroczystych plastikowych miski o pojemności 1 galonu, przymocowanych do poziomej platformy przymocowanej do silnika. Silnik był sterowany przez timer, który inicjował obroty co 5 minut. Każdy obrót podnosił platformę, a następnie ją opuszczał, wywołując lot much. FLEX wykonywano codziennie przez 7 godzin przez 5 dni. Nie zaobserwowano żadnych zgonów ani urazów związanych z ćwiczeniami w24 przypadkach. Ponadto 5-dniowy program FLEX u much na diecie zachodniej (WD) znacznie zniwelował niepożądane skutki choroby odstawienia, poprawiając przeżycie, zachowania wspinaczkowe oraz oddychanie mitochondrialne24. Razem ten artykuł przedstawia nowy paradygmat ćwiczeń oparty na naturalnej aktywności lotu, która nie powoduje urazów. Jest to procedura o wysokiej przepustowości, która pozwala na jednoczesne szkolenie dużej liczby much w celu badania interakcji między ćwiczeniami, dietą, lekami, starzeniem, środowiskiem i/lub genetyką. Protokół ten może być stosowany jako uzupełnienie istniejących metod ćwiczeń w celu badania wpływu aktywności fizycznej na fizjologię i zachowanie much.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja i obsługa maszyny do ćwiczeń

  1. Zbuduj maszynę w Uniwersyteckim Warcie Maszynowym. Użyj prostokątnej aluminiowej podstawy o wymiarach 35 mm x 35 mm x 1,4 mm z silnikiem AC/DC oraz poziomą aluminiową platformą 35 mm x 35 mm x 0,5 mm (Rysunek 1A).
  2. Aby przekształcić ruch obrotowy na liniowy, zbuduj na silniku specjalnie wykonaną obrotową krzywkę okrągłą o średnicy 15 cm (Rysunek 1B). Przymocuj podnośnik z rolką o średnicy 2 cm do dolnej części poziomej platformy, tak aby platforma była podnoszona przez podnośnik, a następnie opuszczona z powrotem do pierwotnej pozycji, gdy rolka przejdzie przez krzywkę.
  3. Reguluj prędkość silnika za pomocą potencjometru obrotowego tak, aby pełny okres obrotu wynosił około 5 360 ms.
    UWAGA: Dokładne specyfikacje silnika, wymiary podciąga i rolki oraz geometria wałka rozrządu nie są kluczowe. Każda konfiguracja silnikowa, która niezawodnie podnosi i opuszcza platformę, aby wypchnąć muchy i pozwala użytkownikowi kontrolować częstotliwość zrzutów, jest akceptowalna.
  4. Przymocuj przezroczyste plastikowe miski o pojemności 1 galona do platformy za pomocą sznurów bungee zaczepowanych o śrubowe oczka (rysunek 1C).

2. Protokół FLEX

  1. Trzymaj muchy w inkubatorze lub pomieszczeniu o temperaturze 24 °C z wilgotnością 60% i 12-godzinnym cyklem światła/ciemności.
  2. Zbieraj muchy dopasowane do wieku w ciągu 3-4 dni od wyklucia. Po zebraniu losowo przypisz muchy do grup ćwiczących i siedzących. Używaj równej liczby much zarówno dla grupy ćwiczącej, jak i siedzącej.
    UWAGA: Muchy mogą być umieszczone w gęstości od 30 do 400 na miskę, ponieważ nie przeszkadza to w ćwiczeniach lotniczych. Jednak grupy eksperymentalne i kontrolne zawsze powinny być dopasowane pod względem liczby, płci i wieku, aby zapewnić porównywalność.
  3. Zapewnij siedzącym i kontrolowanym muchom 7 ml karmy formułowej. Zabezpiecz fiolki z jedzeniem w miskach taśmą.
  4. Transfer fly do misek z lekkim i krótkim znieczuleniemCO2 dzień przed rozpoczęciem ćwiczeń. Otwory misek przykryj siatką zabezpieczoną gumkami.
    UWAGA: Muchy powinny być krótko znieczulone pod lekkimCO2 na podkładce. Ekspozycja musi pozostać krótka, aby uniknąć trwałych skutków behawioralnych; Dlatego znieczulenie powinno być przeprowadzone na dzień przed eksperymentem ćwiczeniowym.
  5. Przymocuj miski do platformy za pomocą sznurów bungee. Trening ćwiczeń przeprowadzaj w pomieszczeniu o temperaturze 24 °C i wilgotności 60%. Jeśli wilgotność w pomieszczeniu nie jest kontrolowana, zapewnij muchom dostęp do wody, wkładając fiolki z mokrą watą do misek i przymocowując fiolki taśmą do ściany misy.
  6. W eksperymentach kontrolnych (ćwiczenie pozorowane) umieść równą liczbę much w misce ustawionej obok maszyny do ćwiczeń, ale nie przymocowanej do platformy.
  7. Ćwiczenia mijają w moten sposób przez 5 kolejnych dni.
    1. Sterować silnikiem za pomocą dwóch timerów (rysunek 1D). Pierwszy timer włącza i wyłącza maszynę o określonej porze dnia. Ćwiczenia zaczynają o 8:00 i kończą o 15:00.
    2. Użyj drugiego timera, aby zainicjować serię trzech obrotów silnika, z każdą sekwencją co 5 minut. Każdy obrót podnosi platformę, a następnie ją opuszcza, uruchamiając loty w powietrzu.
    3. Po zakończeniu zabiegu ćwiczeń na dany dzień odłóż miski do inkubatorów. Protokół ten można łatwo zmodyfikować, aby dostosować się do konkretnego eksperymentu.
      UWAGA: Wilgotność poniżej 60% może powodować wzrost śmiertelności. Niewielka liczba much może nie rozpocząć lotu po pierwszym zrzucie, ale zazwyczaj zaczyna latać po drugim lub trzecim zrzucie. Chociaż nie da się śledzić lotu u każdego osobnika, większość much wykonuje lot, i zakłada się, że wszystkie z nich ostatecznie uczestniczą w ćwiczeniach. Ponadto duży kontener zapewnia przestrzeń dla dobrowolnego lotu między zrzutami.
  8. Na koniec programu FLEX unieruchom muchy, umieszczając miski w chłodni na 5 minut. Następnie przenosi muchy do nowych fiolek do dalszych analiz cech fenotypowych lub do rurek mikrowirówek w celu badań molekularnych i/lub biochemicznych.
    UWAGA: Przykładami dalszych analiz są testy behawioralne i biochemiczne i/lub ekspresja genów. Testy z udziałem żywych much muszą być przeprowadzane szybko, zgodnie z konkretnymi celami testu fenotypowego. Protokół można tu zatrzymać, a próbki do biochemii/biologii molekularnej zostały odpowiednio zamrożone i przechowywane, w zależności od przeprowadzonych ocen. Podsumowanie protokołu przedstawiono w Tabeli 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół FLEX został wcześniej zweryfikowany w opublikowanej pracy z naszego laboratorium. W opublikowanym badaniu wykazano, że ćwiczenia lotnicze łagodzą negatywne skutki metaboliczne diety zachodniej (WD)24. Dieta ta została opracowana na podstawie standardowej diety Nutri-Fly Bloomington z dodatkami: 15% Nutiva USDA Certified Organic, nie-GMO, olej palmowy z czerwonej palmy, 15% sacharozy oraz 0,1 mln NaCl.

Dorosłe samce muszek owocowych w wieku od trzech do czterech...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół FLEX dostarcza nowatorską i fizjologicznie istotną metodę indukowania ćwiczeń tlenowych u Drosophila melanogaster podczas lotu. W przeciwieństwie do tradycyjnych paradygmatów, takich jak Power Tower i TreadWheel, które opierają się na negatywnej geotaksji i ruchach mechanicznych, FLEX wykorzystuje wrodzone zachowanie lotu muchy. Takie podejście minimalizuje urazy i reakcje stresowe wywołane wysiłkiem, czyniąc je bezpieczniejszym i bardziej biologicznie odpowiednim modelem dla biologii ćwiczeń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te były wspierane przez NIDDK R01DK129455 (AKM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
17 x 100 mm 14 mL probówka z polipropylenem i inkas;VWR  60818-689
1-galonowe przezroczyste
plastikowe bębnowe miski na akwaryta 		PetcoN/ADostępne w Petco
8 gniazdek ochronnych przeciwprzepięciowych z 7-dniowym cyfrowym timeremBN-LINK EGPH020028Dostępne na Amazon
Silnik AC/DC Dayton  Model 12W368 z momentem obrotowym 80 IN-LBS
Formuła Bloomington diet Nutri-Fly  66-112Dostępne w Genesee Scientific Inc., San Diego, CA
Kim-wipesFisher Scientific06-666Kimberly-Clark Professional 34120
Wielofunkcyjny programowalny timer outletowy z odliczaniem i nieskończonym krótkim cyklemNEARPOW SPM10188153502Dostępne na Amazon

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ruegsegger, G. N., Booth, F. W. Health benefits of exercise. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (7), a029694(2018).
  2. Valenzuela, P. L., et al. Exercise benefits on Alzheimer's disease: State-of-the-science. Ageing Res Rev. 62, 101108(2020).
  3. Petridou, A., Siopi, A., Mougios, V. Exercise in the management of obesity. Metabolism. 92, 163-169 (2019).
  4. Fiuza-Luces, C., et al. Exercise benefits in cardiovascular disease: Beyond attenuation of traditional risk factors. Nat Rev Cardiol. 15 (12), 731-743 (2018).
  5. Neufer, P. D., et al. Understanding the cellular and molecular mechanisms of physical activity-induced health benefits. Cell Metab. 22 (1), 4-11 (2015).
  6. Hastings, M. H., et al. Animal models of exercise from rodents to pythons. Circ Res. 130 (12), 1994-2014 (2022).
  7. Garton, F. C., North, K. N., Koch, L. G., Britton, S. L., Nogales-Gadea, G., Lucia, A. Rodent models for resolving extremes of exercise and health. Physiol Genomics. 48 (2), 82-92 (2016).
  8. Sujkowski, A., Wessells, R. Using Drosophila to understand biochemical and behavioral responses to exercise. Exerc Sport Sci Rev. 46 (2), 112-120 (2018).
  9. Watanabe, L. P., Riddle, N. C. New opportunities: Drosophila as a model system for exercise research. J Appl Physiol. 127 (2), 482-490 (2019).
  10. Ding, M., Li, H., Zheng, L. Drosophila exercise, an emerging model bridging the fields of exercise and aging in human. Front Cell Dev Biol. 10, 966531(2022).
  11. Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. Endurance training protocol and longitudinal performance assays for Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (61), e3786(2012).
  12. Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Characterization of the rotating exercise quantification system (REQS), a novel Drosophila exercise quantification apparatus. PLoS One. 12 (10), e0185090(2017).
  13. Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. Exercise-training in young Drosophila melanogaster reduces age-related decline in mobility and cardiac performance. PLoS One. 4 (6), e5886(2009).
  14. Lowman, K. E., Wyatt, B. J., Cunneely, O. P., Reed, L. K. The TreadWheel: Interval training protocol for gently induced exercise in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (136), e57788(2018).
  15. Cheng, X., Sun, M. Wing-kinematics measurement and aerodynamics in a small insect in hovering flight. Sci Rep. 6, 25706(2016).
  16. Aono, H., Liang, F., Liu, H. Near- and far-field aerodynamics in insect hovering flight: An integrated computational study. J Exp Biol. 211 (Pt 2), 239-257 (2008).
  17. Bennett, L. Insect aerodynamics: Vertical sustaining force in near-hovering flight. Science. 152 (3726), 1263-1266 (1966).
  18. Fry, S. N., Sayaman, R., Dickinson, M. H. The aerodynamics of hovering flight in Drosophila. J Exp Biol. 208 (Pt 12), 2303-2318 (2005).
  19. Lane, S. J., Frankino, W. A., Elekonich, M. M., Roberts, S. P. The effects of age and lifetime flight behavior on flight capacity in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 217 (Pt 9), 1437-1443 (2014).
  20. Margotta, J. W., Roberts, S. P., Elekonich, M. M. Effects of flight activity and age on oxidative damage in the honey bee, Apis mellifera. J Exp Biol. 221 (Pt 14), jeb183228(2018).
  21. Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Sci Rep. 5, 15298(2015).
  22. Chambers, R. P., et al. Nicotine increases lifespan and rescues olfactory and motor deficits in a Drosophila model of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 253, 95-102 (2013).
  23. Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131 (9), 2183-2194 (2004).
  24. Murashov, A. K., et al. Preference and detrimental effects of high fat, sugar, and salt diet in wild-caught Drosophila simulans are reversed by flight exercise. FASEB Bioadv. 3 (1), 49-64 (2021).
  25. Murashov, A. K., et al. Paternal Western diet causes transgenerational increase in food consumption in Drosophila with parallel alterations in the offspring brain proteome and microRNAs. FASEB J. 37 (6), e22966(2023).
  26. Van der Horst, D. J. Insect adipokinetic hormones: Release and integration of flight energy metabolism. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 136 (2), 217-226 (2003).
  27. Suarez, R. K. Energy metabolism during insect flight: Biochemical design and physiological performance. Physiol Biochem Zool. 73 (6), 765-771 (2000).
  28. Lehmann, F. O., Skandalis, D. A., Berthe, R. Calcium signalling indicates bilateral power balancing in the Drosophila flight muscle during manoeuvring flight. J R Soc Interface. 10 (82), 20121050(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

wiczenia Drosophilatrening lotumodel muszki owoc wkizaburzenia metabolicznewydolno bioenergetycznadieta zachodniazachowanie wspinaczkoweanaliza fenotypowaefekty transgeneracyjnetechniki omiczne

Powiązane artykuły