Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model myszy noworodkowej nekrotyzującego enterokolitu i izolacji lamina propria w celu profilaktyki komórek odpornościowych

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69233

⸱

19 września 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje noworodkowy model mysiego nektyzującego enterokolitisu (NEC) oraz późniejsze izolację komórek odpornościowych z blaszki właściwej jelita cienkiego noworodków.

Streszczenie

Nekrotyzujące zapalenie jelit (NEC) to ciężka choroba zapalna jelit noworodków, dotykająca głównie niedorozwiniętych płodów. NEC charakteryzuje się uszkodzeniem nabłonka, dysbiozą mikrobiomu i dysregulowanym odpowiedzią immunologiczną, często prowadzącymi do martwicy jelit i ogólnoustrojowego stanu zapalnego. Eksperymentalne modele na myszach, które odzwierciedlają kluczowe aspekty ludzkiej choroby, odegrały istotną rolę w poszerzaniu naszego rozumienia mechanizmów choroby i informowaniu rozwoju terapii. Ten protokół opisuje dobrze ugruntowany noworodkowy model myszy z nekrotyzującym zapaleniem jelit (NEC) wykorzystujący karmienie mieszanką, okresową niedotlenię, doustne podawanie lipopolisacharydu (LPS) oraz bakterie jelitowe hodowane z organizmu niemowlęcia z NEC. To połączenie niezawodnie wywołuje cechy histologiczne, transkrypcyjne i immunologiczne zgodne z NEC u ludzkich niemowląt i było fundamentem wielu kluczowych odkryć w tej dziedzinie. Dodatkowo, ten protokół opisuje izolację komórek immunologicznych z blaszki właściwej jelita cienkiego noworodków myszy. Izolacja komórek blaszki właściwej umożliwia szczegółowe profilowanie komórek immunologicznych poprzez cytometrię przepływową, ułatwiając analizę zarówno komórek naturalnych, jak i adaptacyjnych populacji wewnątrz jelit.

Wprowadzenie

Nekrotyzujące zapalenie jelit (NEC) to ciężka choroba zapalna jelit, która prawie wyłącznie dotyka wcześniaków. Około 7%-8% niemowląt z bardzo niską masą urodzeniową (mniej niż 1500 g) zostanie dotkniętych NEC, a wskaźniki śmiertelności związanej z chorobą mogą sięgać 50% u noworodków, które wymagają interwencji chirurgicznej1. Patogeneza NEC pozostaje niedostatecznie zrozumiana; jednakże, obecne dowody sugerują, że NEC powstaje z połączenia wielu czynników, w tym niedojrzałej bariery jelitowej, dysregulacji sygnalizacji immunologicznej i dysbiozy mikrobiomu2,3,4. Zbieżność tych czynników może inicjować i zaostrzyć reakcje zapalne w jelitach, najbardziej zauważalne poprzez aktywację receptora podobnego do Toll 4 (TLR4), prowadząc do uszkodzenia nabłonka i różnych rodzajów śmierci komórkowej, w tym apoptozy i nekrozy5,6. Celem tego protokołu jest przedstawienie reprodukowalnego i fizjologicznie odpowiedniego modelu NEC u myszy, który naśladuje zapalenie jelit i pneumatosis intestinalis (gaz w ścianie jelita) obserwowane u ludzkich noworodków, umożliwiając badanie mechanizmu patogenezy choroby. Ponadto, ten protokół opisuje izolację komórek odpornościowych z blaszki właściwej jelita cienkiego noworodków myszy, umożliwiając badaczom przeprowadzenie profilu komórek odpornościowych poprzez cytometrię przepływową.

W porównaniu z większymi modelami zwierzęcymi, takimi jak noworodki szczurów czy świń7,8, noworodkowe modele mysze oferują kilka wyraźnych zalet, w tym niższy koszt, większy dostęp do zwierząt transgenicznych i możliwość przeprowadzania eksperymentów na większych kohortach. Murynowe modele NEC głównie wykorzystują kombinację karmienia mieszankami, stresu zimna i niedotlenienia, aby symulować złożoną patofizjologię NEC obserwowaną u ludzkich pacjentów7,8,9. Jednakże, wiele muzynych modeli NEC jest ograniczone przez ich uzależnienie od szerokiego spektrum czynników mikrobiologicznych lub sztucznych zmian mikrobiomu, co może obniżyć ich znaczenie kliniczne. W przeciwieństwie do tego, model opisany w tym protokole przeciwdziała tym ograniczeniom poprzez integrację kilku kluczowych czynników zaangażowanych w patogenezę NEC u ludzkich niemowląt10,11. Konkretnie, ten model łączy stres hipoksyczny, który został zaangażowany w zakłócenie integralności bariery jelitowej3,12, z doustnym podaniem mieszanek dla niemowląt uzupełnionych lipopolisacharydem (LPS), dobrze scharakteryzowanym ligandem TLR4, który indukuje zapalenie jelit, jak również klinicznie istotną dysbiozę mikrobiomu z enterycznymi bakteriami hodowlanymi od pacjenta z NEC totalis, najcięższej postaci choroby, charakteryzującej się opanowującą martwicą jelit10,13. Poprzez integrację tych klinicznie istotnych i specyficznych dla choroby czynników stresowych, nasz model dokładnie odzwierciedla kliniczne i molekularne cechy NEC. Ponadto, aby zapewnić badaczom ramę do badania mechanizmów pośredniczących w odpowiedzi immunologicznej leżących u podstaw patogenezy NEC, ten protokół opisuje izolację komórek blaszki właściwej z jelita cienkiego noworodków myszy do analizy cytometrii przepływowej. Jako główne miejsce aktywności immunologicznej błony śluzowej jelit, blaszka właściwa zawiera dynamiczny repertuar komórek odpornościowych stałych i napływowych, które odgrywają centralną rolę w zapaleniu związanym z NEC14. Cytometria przepływowa zapewnia solidną i skalowalną platformę do charakteryzacji tych populacji komórek odpornościowych z wysoką rozdzielczością, umożliwiając szczegółową analizę fenotypu komórek, ilościową ocenę odpowiedzi immunologicznych i identyfikację podpisów immunologicznych zaangażowanych w patogenezę NEC15.

Muzyny model NEC opisany w tym protokole uzupełnia modele in vitro poprzez umożliwienie badania interakcji gospodarz-mikrobiom, odpowiedzi immunologicznych i sygnalizacji zapalnej w złożonym środowisku jelita noworodków. Odtwarza kluczowe aspekty patogenezy NEC, które nie mogą być modelowanie in vitro, co czyni go cennym narzędziem do wyjaśniania mechanizmów choroby i oceny strategii terapeutycznych. Mimo że gatunkowe różnice specyficzne dla gatunku pozostają ograniczeniem, ten model oferuje solidną i dostępną platformę do poszerzenia naszego zrozumienia NEC i przyspieszenia rozwoju ukierunkowanych interwencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie metody zostały wykonane zgodnie z wytycznymi etycznymi przedstawionymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine. Myszy były hodowane, utrzymywane i kwaterowane zgodnie z procedurami opisanymi w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals na podstawie projektu badania zatwierdzonego przez IACUC (protokół nr 24-114) w University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine. Do wszystkich eksperymentów opisanych w niniejszym badaniu wykorzystano myszy C57BL/6J. Model rozpoczynano u szczeniąt w 4. dobie postnatalnej, przy masie ciała od 1,8 do 2,3 g; zwierzęta spoza tego zakresu wagowego zostały wykluczone. Kohorty eksperymentalne miały zrównoważony rozkład płci, przy czym samce i samice stanowiły odpowiednio około 50% leczonych zwierząt. Wykorzystane odczynniki i sprzęt są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Mysi model NEC

UWAGA: Zapas bakterii jelitowych otrzymuje się poprzez pobranie treści jelitowej od niemowlęcia z najcięższą postacią NEC, NEC totalis13,16. Treść jelitową inkubuje się przez noc w 1 x g przez 16 h w 37 °C, wiruje przy 3000 x g przez 10 min w 4 °C, a następnie resuspendsuje w 50% glicerolu. Alikwoty o objętości 20 µL pipetuje się do krioprobówek i przechowuje w -80 °C do długotrwałego przechowywania. Wybrane w tym protokole czasy inkubacji dobrano w celu zapewnienia wydajności pracy. Punkty czasowe te można dostosować w zależności od potrzeb, aby dopasować je do harmonogramu konkretnego laboratorium, bez wpływu na ogólny model. Ponadto protokół ten został zoptymalizowany dla maksymalnej liczby 40 myszy, ale można go zwiększyć w razie potrzeby.

  1. Przygotowanie hodowli bakteryjnej
    1. W dniu eksperymentalnym 0 o godzinie 15:00 dodać 20 µL alikwot bakterii jelitowych wyhodowanych z próbki pobranej od niemowlęcia z NEC totalis do probówki hodowlanej o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml pożywki Luria-Bertani (LB). Inkubować kulturę bakteryjną w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną przy zakrętce probówki w pozycji wentylowanej w 37°C, 1 x gprzez noc, przez 16 h; równocześnie inkubować probówkę zawierającą jedynie 2 ml bulionu LB jako kontrolę w celu oceny ewentualnego zanieczyszczenia bulionu LB.
      1. Należy wizualnie potwierdzić wzrost kultury nocnej, porównując mętność kultury bakteryjnej z klarowną kontrolą zawierającą wyłącznie podłoże LB; należy kontynuować procedurę tylko wtedy, gdy kultura bakteryjna jest mętna, a kontrola pozostaje klarowna.
    2. W 1. dniu eksperymentu, o godzinie 07:00, należy podzielić na alykwoy 125 µL szczepionej kultury nocnej do kolby hodowlanej T75 z wentylowaną zakrętką zawierającej 25 ml bulionu LB. Przygotować łącznie cztery kolby T75 i inkubować je w pozycji pionowej w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną w 37°C, 1 x gprzez 2 h w celu namnożenia kultury bakteryjnej.
      UWAGA: Hodowle nocne są przygotowywane w dniach eksperymentalnych 0, 1 i 2 modelu NEC.
  2. Przydzielanie szczeniąt do grup eksperymentalnych
    1. W pierwszym dniu eksperymentu o godzinie 07:00 należy zważyć szczęta w 4. dobie po urodzeniu.
      ​UWAGA: Optymalny zakres masy wynosi od 1,8 do 2,3 g; wartości odstające należy wykluczyć z eksperymentu.
    2. Podziel myszy eksperymentalne na kohorty karmione mlekiem zastępczym oraz karmione przez matkę, a następnie oblicz średnią masę ciała myszy karmionych mlekiem zastępczym. Oddziel wyznaczone myszy karmione mlekiem zastępczym od matki i umieść je w nowej klatce znajdującej się w inkubatorze dla noworodków, wstępnie podgrzanym do 37 °CPozostawić karmione przez matkę młode w oryginalnej klatce wraz z matką.
      UWAGA: Noworodki myszy są szczególnie wrażliwe na zmiany temperatury otoczenia. Aby zapewnić stałą termoregulację po oddzieleniu od matki, szczenięta karmione mieszanką utrzymuje się w inkubatorze dla noworodków z kontrolą temperatury, ustawionym na 37 °CPodejście to jest zgodne z uznanymi protokołami dotyczącymi NEC, które pozwalają na utrzymanie temperatury fizjologicznej bez konieczności stosowania dodatkowych interwencji termicznych.11,17,18,19.
    3. Powtórzyć w drugim i trzecim dniu eksperymentu, ważąc myszy karmione mieszanką i obliczając średnią wagę każdego dnia przed godziną 07:00, wyznaczoną jako punkt czasowy karmienia.
  3. Pomiar gęstości optycznej (OD) hodowli bakteryjnej
    1. Po 2 h inkubacji w 37 °C oraz 1 x gw dniach eksperymentalnych 1, 2 i 3 wyjmij z inkubatora orbitalnego cztery kolby T75 z namnożoną kulturą. Połącz zawartość czterech kolb T75, dokładnie wymieszaj, a następnie pipetuj 1 ml kultury bakteryjnej do kuwety.
      1. Przygotować roztwór kontrolny (blank), dodając 1 ml sterylnego bulionu LB do kuwety. Zmierzyć gęstość optyczną kultury bakteryjnej przy 600 nm (OD600 nm) za pomocą spektrofotometru.
        UWAGA: Docelowa OD600 nm wynosi 0,6 ± 0,02. Jeśli OD600 nm Jeśli gęstość optyczna kultury bakteryjnej jest poniżej wartości docelowej, należy kontynuować inkubację zgodnie z opisem w kroku 1.3.1, aż do osiągnięcia docelowej wartości OD.600 nm wynoszącej 0,6 ± osiągnięto wartość 0,02. Jeśli OD600 nm przekracza 0,6, należy rozcieńczyć kulturę bakterii sterylnym bulionem LB.
    2. Przenieś 80 ml kultury bakteryjnej do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i odwiruj przy 3000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °CPotwierdź pomyślny przebieg hodowli, sprawdzając, czy na dnie każdej probówki znajduje się widoczny osad.
  4. Przygotowanie formuły
    1. Przygotowanie formuły należy rozpocząć o godzinie 09:00 w dniach eksperymentalnych 1, 2 i 3. Połączyć 16 ml formuły dla niemowląt i 8 ml mleka dla szczeniąt w stosunku 2:1 w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    2. Usunąć nadosad z dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 mL zawierających osad z kultury bakterii (krok 1.3.2).
    3. Dokładnie resuspenduj każdy z dwóch osadów w 2 ml mieszaniny formuły, a następnie przenieś resuspensję do mieszaniny formuły, aby przygotować 24 ml formuły NEC.
      UWAGA: Końcowe stężenie bakterii w formulacji NEC powinno wynosić od 4 do 5 x 109 JCF/ml
    4. Oznakuj sześć probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, przypisując każdą z nich do jednego z sześciu punktów czasowych karmienia (10:00, 13:00, 16:00, 19:00, 22:00, 07:00).
    5. Do każdej oznakowanej probówki pipetować 4 ml formuły NEC.
    6. Przygotować sześć jednorazowych alikwotów roztworu zapasowego LPS (5 mg/mL) i przechowywać w mikroprowetkach o niskim wiązaniu w temperaturze -20°CDodaj LPS (patrz UWAGA w celu sprawdzenia stężenia) do formuły NEC bezpośrednio przed karmieniem w każdym punkcie czasowym.
      UWAGA: Ilość LPS dodawana do formuły NEC jest oparta na średniej masie ciała szczeniąt karmionych formułą, obliczanej każdego dnia o godzinie 07:00, przy zastosowaniu dawki wynoszącej 5 µg LPS na gram masy ciała szczeniąt. Końcowe stężenie LPS zmienia się w zależności od masy ciała. Na przykład, przy objętości podania wynoszącej 80 µL przy średniej masie kohorty szczeniąt wynoszącej 2 g, stężenie LPS w preparacie wyniosłoby 0,125 mg/ml.
  5. Karmienie
    UWAGA: W 1. dniu eksperymentu myszy przeznaczone do modelu NEC są poddawane 3-godzinnemu postowi po oddzieleniu od matki. Pierwsze karmienie formułą NEC odbywa się o godzinie 10:00, a następnie jest kontynuowane co 3 godziny aż do godziny 22:00. W 2. i 3. dniu eksperymentu myszy są karmione o godzinach 07:00, 10:00, 13:00, 16:00, 19:00 i 22:00. W 4. dniu eksperymentu myszy nie są karmione.
    1. Bezpośrednio przed karmieniem myszy należy rozmrozić i wymieszać wirówką jedną porcję LPS przez 15 s. Do probówki z 4 ml przygotowanej formuły NEC dodać odpowiednią ilość LPS, obliczoną na podstawie średniej masy ciał myszy (patrz krok 1.4.6 w celu obliczeń), a następnie dokładnie wymieszać za pomocą pipety.
    2. Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml preparatem NEC i podłączyć ją do kaniuli kardiologicznej wprowadzanej obwodowo u noworodka (PICC). Upewnić się, że w strzykawce oraz w linii PICC nie ma pęcherzyków powietrza.
    3. Podaj formułę NEC szczeniętom za pośrednictwem podawanie doustne przez cewnik PICC.
      1. Delikatnie unieruchom każdego szczeniaka, chwytając za luźną skórę u podstawy szyi, i trzymaj mysz w pozycji pionowej. Za pomocą pęsety wprowadź dystalny koniec cewnika PICC do jamy ustnej i przełyku, tak aby końcówka cewnika PICC znalazła się w żołądku.
        UWAGA: Długość wprowadzenia cewnika PICC jest równa odległości od kącika ust do górnej krawędzi plamy mlecznej w żołądku. Optymalny punkt wprowadzenia należy następnie wyraźnie zaznaczyć na cewniku PICC za pomocą niezmywalnego markeru.
      2. W przypadku odczucia znacznego oporu podczas wprowadzania cewnika PICC, należy go wycofać, zmienić jego położenie i ostrożnie ponownie podjąć próbę wprowadzenia.
      3. Odpięlić 8 µL roztwór NEC powoli do żołądka, uważnie monitorując szczenię podczas całego karmienia pod kątem oznak aspiracji. Należy obserwować, czy pojawi się biała plamka mleka, aby potwierdzić prawidłowe podanie do żołądka.
      4. Usuń cewnik PICC. Obserwuj szczenię pod kątem utrudnionego oddychania lub wymiotów. Jeśli szczenię zwymiotuje karmę, osusz pysk i nos za pomocą niepozostawiającej włókien chusteczki laboratoryjnej.
    4. Powtórz ten proces w każdym punkcie czasowym karmienia.
    5. Dwa razy dziennie poddawaj szczenięta hipoksji przez 10 min bezpośrednio po karmieniu o godzinie 13:00 i 19:00.
      1. Po dwóch karmieniach dziennie umieść młode w komorze hipoksji podłączonej do butli z gazem zawierającym 95% azotu i 5% tlenu. Otwórz zawór butli i monitoruj poziom tlenu w szczelnej komorze hipoksji za pomocą przenośnego monitora. Gdy w komorze hipoksji zostanie osiągnięte stężenie 5%± 0,5% tlenu; utrzymuj szczenięta przy tym poziomie tlenu przez 10 min.
        UWAGA: Przepływ powinien zostać zoptymalizowany tak, aby stężenie tlenu malało z 20% do 5% w stałym, kontrolowanym tempie w ciągu 2 minut.
    6. Obserwuj szczenięta myszy między karmieniami pod kątem wszelkich oznak niewydolności oddechowej, bladości lub bezdechu. W przypadku wystąpienia tych objawów należy wyjąć dotknięte szczenię z komory hipoksji, uważnie monitorować proces powrotu do zdrowia i w razie potrzeby przeprowadzić eutanazję szczeniąt zgodnie z polityką IACUC.
    7. Kontynuuj karmienie przez zgłębnik doustny oraz ekspozycję na hipoksję w zaplanowanych punktach czasowych przez pełne 72 h trwania modelu NEC.
      UWAGA: Jeśli pierwszy dzień eksperymentu rozpoczyna się w poniedziałek o godzinie 10:00, punkt końcowy po 72 h przypada w czwartek o godzinie 10:00. Jest to wyznaczony jako 4. dzień modelu. Myszom nie podaje się pokarmu o godzinie 07:00 w 4. dniu modelu, a o końcowej godzinie 10:00 poddaje się je eutanazji w celu pobrania tkanek.
  6. Eutanazja zwierząt i pobieranie tkanek
    1. Rano w 4. dniu modelu zważyć i odnotować płeć każdego szczenięta, a następnie poddać je eutanazji zgodnie z wytycznymi IACUC.
    2. Po eutanazji należy pobrać krew od każdego szczenięcia do probówki z separatorem serum zawierającej aktywator krzepnięcia i żel.
    3. Wiruj w wirowarce z prędkością 16 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia surowicy. Przenieść surowicę pipetą do oznakowanych probówek o pojemności 1,7 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    4. Wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości 1–2 cm przez ścianę brzucha i otrzewną, aby odsłonić przewód pokarmowy. Obejrzyj odsłonięte jelita pod kątem charakterystycznych cech NEC, w tym wzdęć, rumienia oraz gromadzenia się gazu w obrębie ściany jelita (pneumatoza jelitowa), oraz widoczne pęcherzyki powietrza.
    5. Zidentyfikować i wyciąć odcinek od dwunastnicy do dystalnej części odbytnicy. Umieścić tkankę w szalce Petriego na lodzie. Do wypłukania jelita użyć lodowatego roztworu soli fosforanowo-buforowanej (PBS).
    6. Zidentyfikuj kątnicę i przetnij ją proksymalnie, aby oddzielić kątnicę i okrężnicę od jelita cienkiego. Pobierz fragmenty tkanek, zaczynając od dystalnej części jelita krętego i kierując się w stronę jelita czczego. Odcinek o długości 1 cm umieść w probówce zawierającej bufor do lizy RNA i kulki z tlenku cyrkonu o średnicy 1,5 mm, a następnie przechowuj na lodzie do analizy transkrypcyjnej.
      1. Przepłucz fragment o długości 1,5 cm za pomocą strzykawki z PBS i przymocowaną igłą stępioną 24 G, a następnie umieść go w probówce do mikrocentryfugi zawierającej 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA). Zamroź gwałtownie fragment jelita o długości 1 cm i przechowuj w temperaturze -80 °C do analizy białek. Szybko zamrozić 1 cm fragment jelita i przechowywać w temperaturze -80 °C do wszelkich dodatkowych analiz.
    7. Przetworzyć tkankę zebraną do buforu lizującego RNA w homogenizatorze kulkowym (5,50 m/s, 1,0 min, cykl = 1,0, przerwa: 10 s, 4 °C) w celu homogenizacji tkanki, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.
  7. Fixacja tkanek
    1. Umieścić fragmenty tkanki zebrane w 4% PFA na kołysce przy 4 °C utrwalać przez 24 h. Po 24 h usunąć 4% PFA z każdej probówki i zastąpić go 1 ml PBS w celu przemycia tkanki. Umieścić probówki ponownie na wstrząsarce przy 4 °C przez 15 min. Powtórzyć płukanie w PBS raz.
      1. Usunąć PBS, dodać 1 ml 50% etanolu do każdej probówki i umieścić probówki z powrotem na kołysce w 4 °C przez 15 min. Usunąć 50% etanol, dodać 1 ml 70% etanolu i przechowywać w 4 °C do czasu przetworzenia tkanki w bloki histologiczne w parafinie.
        UWAGA: W razie potrzeby do dalszych analiz można pobrać dodatkowe segmenty jelit lub próbki kału.

2. Izolacja komórek odpornościowych z blaszki właściwej

UWAGA: Niniejszy protokół został zoptymalizowany pod kątem izolacji komórek blaszki właściwej od myszy noworodkowych w wieku około jednego tygodnia. Jeśli do spektralnej cytometrii przepływowej wymagane są próbki referencyjne, można wykorzystać odsadzone myszy (3–4 tydzień po urodzeniu). W przypadku próbek od odsadzonych myszy należy podwoić wszystkie objętości odczynników określone w protokole.

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Przygotować 1x zrównoważony roztwór soli Hanksa bez Ca2+ i Mg2+ (HBSS W/O) zawierający 10mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotować bufor do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), rozpuszczając 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS + 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Dzień przed przeprowadzeniem izolacji komórek blaszki właściwej przygotować roztwór do przedtrawienia, dodając 5mM EDTA, 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1 mM ditiotreitolu (DTT) do HBSS W/O.
    4. Przygotować roztwór do trawienia bezpośrednio przed izolacją komórek blaszki właściwej, uzupełniając pożywkę Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) o 10% FBS i  2 mg/mL kolagenazy IV.
      UWAGA: HBSS W/O można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze pokojowej. Bufor FACS należy przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze 4 °C. Roztwory do przedtrawienia i trawienia muszą być przygotowane na świeżo bezpośrednio przed izolacją blaszki właściwej i przechowywane w lodzie.
  2. Pobieranie i przygotowanie tkanki jelitowej do trawienia
    1. Zlokalizować kątnicę i przeciąć ją proksymalnie, aby usunąć kątnicę i okrężnicę. Wyciąć 2-3 cm dystalnego jelita cienkiego (jelita krętego) i umieścić go w lodowatym HBSS W/O w szalce Petriego (kontynuując od kroku 1.6.5).
    2. Używając igły tępokonicznej 24 G przymocowanej do strzykawki, całkowicie przepłukać światło jelita lodowatym HBSS W/O, stabilizując tkankę pęsetą. Wizualnie potwierdzić, że po płukaniu w świetle jelita nie ma treści kałowej.
    3. Ostrożnie usunąć wszelką pozostałą tkankę łączną z segmentu jelita za pomocą precyzyjnej pęsety lub nożyczek.
    4. Przeciąć jelito wzdłużnie, aby je otworzyć, a następnie pociąć poprzecznie na segmenty o długości 1-1. cm.
  3. Dysocjacja blaszki właściwej
    1. Przenieść segmenty jelit do probówki wirówkowej 1 mL zawierającej 1 mL schłodzonego w lodzie roztworu do przedtrawienia.
    2. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 20 min przy ciągłym obracaniu, aby ułatwić dysocjację tkanki.
    3. Delikatnie zakręcić probówką, a następnie przelać zawartość przez sitko komórkowe 10 µm umieszczone nad probówką wirówkową 5 mL.
      UWAGA: Filtrat zebrany przez sitko 10 µm zawiera limfocyty wewnątrznabłonkowe (IELs) i może być użyty do dalszych analiz, jeśli jest to wymagane.
    4. Przenieść fragmenty tkanki do nowej probówki wirówkowej 15 mL zawierającej 10 mL podgrzanego do 37 °C roztworu do trawienia. Następnie inkubować próbkę przez 40 min w temperaturze 37 °C przy ciągłym obracaniu.
    5. Przenieść całą próbkę do automatycznej probówki do dysocjacji tkanki i uruchomić program dysocjacji składający się z czterech cykli obrotowych po 15 s każdy, naprzemiennie w kierunku zgodnym i przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
      UWAGA: Alternatywą dla automatycznego dysocjatora tkankowego jest ręczne rozcieranie tkanki jelitowej za pomocą matowych końców dwóch szkiełek przedmiotowych. Stosując tę metodę, należy wywierać delikatny, równomierny nacisk, aby uniknąć nadmiernego stresu mechanicznego, który może znacząco obniżyć żywotność komórek.
    6. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową w wstrząsarzu typu vortex, a następnie odwirować próbki w probówce do dysocjacji tkanki przy 300 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    7. Ostrożnie odpietować nadosad bez naruszania osadu, a następnie resuspendować komórki w  mL lodowatego buforu FACS.
    8. Umieścić sitko komórkowe 10 µm na probówce wirówkowej 5 mL. Przenieść resuspendowaną zawiesinę komórkową przez filtr, a następnie przemyć filtr dodatkowymi  mL lodowatego buforu FACS.
    9. Policzyć komórki i ocenić żywotność za pomocą błękitu trypanu lub barwnika do oceny żywotności. Odwirować objętość wymaganą do cytometrii przepływowej przy 30 × g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Użyć komórek niezwłocznie do dalszych zastosowań, aby zachować żywotność i ekspresję markerów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany w niniejszym protokole noworodkowy mysi model NEC odtwarza kluczowe cechy tej choroby. Analiza przeżywalności metodą Kaplana-Meiera (Rycina 1A) ujawniło istotny spadek przeżywalności w grupie leczonej NEC w porównaniu z grupami kontrolnymi karmionymi przez matki (9/21 vs 8/8; p = 0,0063). Makroskopowa ocena jelit myszy poddanych modelowi (Rycina 1B) wykazali charakterystyczne cechy NEC, w tym rozszerzenie jelit, pęcherzyki powietrza oraz widoczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten protokół integruje fizjologicznie odpowiedni noworodkowy mysi model NEC z izolacją komórek odpornościowych z blaszki właściwej, zapewniając kompleksową platformę do badania odpowiedzi immunologicznych błony śluzowej podczas stanu zapalnego jelit. Łącząc klinicznie istotne ekspozycje, takie jak mikrobiom jelitowy z przypadków ludzkiej NEC, stres hipoksyczny i karmienie mieszankami, model ten odwzorowuje złożoną i wieloczynnikową patogenezę obserwowaną w chorobie u ludzi10,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie ma żadnego konfliktu interesów związanego z tym pismem.

Podziękowania

Niniejszy rękopis został wsparty przez R01DK124614, R01HD105301, DP1DK140012, Grant Inicjatywy Chan Zuckerberg o numerze 2022-316749, Nagrodę Yang Biomedical Scholar oraz Wydział Pediatrii Uniwersytetu Karoliny Północnej w Chapel Hill.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 mL Syringe-Tuberculin Slip TipBecton Dickinson309659Strzykawka do karmienia preparatem
1.5 mL semi-micro Disposable CuvettesBRAND GMBH + CO KG759085D
1.7 ml Microtubes ClearAxygen - Corning Inc.MCT-175-CNonpryogenic & Rnase-/Dnase-free
5% Oxygen, Balance Nitrogen Certified Reference Material, Size 200 High Pressure Steel Cylinger, CGA 580AirgasX02NI95C2003186
Anti-Mo CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-85
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-86
APC anti-mouse Ly-6C Clone: HK1.4 Isotype: Rat IgGcBioLegend128015
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222
BB515 Rat Anti-CD11b Clone: M1/70BD Biosciences564455
BB700 Rat Anti-Mouse CD4 Clone: RM4-5BD Biosciences566408
BD Microtainer SSTBecton Dickinson365867Serum Tube
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p1200Fisher Scientific12-111-365
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p20Fisher Scientific12-111-366
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p200Fisher Scientific12-111-362
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563795
BUV615 Rat Anti-Mouse Ly-6G Clone: 1A8BD Biosciences751263
BV650 Rat Anti-Mouse I-A/I-E Clone: M5/114.15.2BD Biosciences563415
C57BL/6J Neonatal MiceThe Jackson Laboratory000664
CD45-VioGreen mouseMiltenyi Biotec 130-102-412
CD64 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 770, REAfinity Clone REA286Miltenyi Biotec 130-119-659
CFX Opus Real-Time PC Systems Bio-Rad12011319
Collagenase Type 4Worthington Biochemical Corporation LS004188
DL-dithiothreitol SigmaD9779-5g
eBioscience FOXP3/Transcription Factor Staining Buffer SetLife Technologies Corp. 00-5523-00
EDTA (0.5M), pH 8.0Quality Biological Inc351-027-721
Esbilac Puppy Milk ReplacerPet-Ag, Inc.99502-1Puppy Milk
Fisherbrand Disposable CuvettesFisher Scientific14-955-127
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 10mLFisher Scientific13-678-11E
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 25mLFisher Scientific13-678-11
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 50mLFisher Scientific13-678-11F
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 5mLFisher Scientific13-678-11D
Genie Temp-Shaker 300USA Scientific, Inc.SI-G1600
gentleMACS Dissociator (protocol; m_intestine-01)Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS  C TubesMiltenyi Biotec 130096334
Ghost Dye Red 780 Viability DyeTonbo Biosciences13-0865-T100
Glycerol ReagentPlusSigma-AldrichG7757-500ML
GraphPad Prims Software, Version 10.0GraphPadN/A
Greiner Bio-One Round Bottom Polypropylene Culture Tube with Two-Position Vent StopperFisher Scientific07-000-212
Handi+ Oxygen analyzerMaxtecN/A
Hanks' Balanced Salt SolutionGibco141650-095
HEPES BufferMediatech, Inc. 25-060-CI
Hypoxia ChamberBillups-Rothenburg, Inc.N/A
ImageJSchneider et al., 2012N/A
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 10.2cmFisher Scientific12-460-655
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 9cmFisher Scientific12-460-598
Integra Miltex™ Swiss Jeweler-Style ForcepsFisher Scientific12-460-110
Isolette Infant IncubatorAir-Shields VickersC100-200-2 Series 02Incubator for mice
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task WipesKimberly-Clark34120
LPSSigma-AldrichL3129-10mg
Luria Broth Broth, Miller Molecular Genetics PowderFisher ScientificBP1426-500
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec 130-091-376
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec 130-090-753
Microcentrifuge TubesThermo Scientific34511.5 ml, clear, graduated, sterile
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermoFisher ScientificND-ONEC-W
Ohaus scout portable balanceFisher Scientific30253024
ParaformaldehydeThermo

Bibliografia

  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of necrotizing enterocolitis: A systematic review and meta-analysis. BMC Pediatr. 20 (1), 344(2020).
  2. Warner, B. B., Tarr, P. I. Necrotizing enterocolitis and preterm infant gut bacteria. Semin Fetal Neonatal Med. 21 (6), 394-399 (2016).
  3. Rose, A. T., Patel, R. M. A critical analysis of risk factors for necrotizing enterocolitis. Semin Fetal Neonatal Med. 23 (6), 374-379 (2018).
  4. Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: Modeling the innate immune response. Am J Pathol. 185 (1), 4-16 (2015).
  5. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair1. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  6. Hackam, D. J., Sodhi, C. P. Toll-like receptor-mediated intestinal inflammatory imbalance in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 6 (2), 229-238.e1 (2018).
  7. Sulistyo, A., Rahman, A., Biouss, G., Antounians, L., Zani, A. Animal models of necrotizing enterocolitis: Review of the literature and state of the art. Innov Surg Sci. 3 (2), 87-92 (2018).
  8. Lopez, C. M., et al. Models of necrotizing enterocolitis. Semin Perinatol. 47 (1), 151695(2023).
  9. Jilling, T., et al. The roles of bacteria and TLR4 in rat and murine models of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 177 (5), 3273-3282 (2006).
  10. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A mouse model of necrotizing enterocolitis. Methods Mol Biol. 2321, 101-110 (2021).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protoc. 2 (4), 100951(2021).
  12. Kaplina, A., et al. Necrotizing enterocolitis: The role of hypoxia, gut microbiome, and microbial metabolites. Int J Mol Sci. 24 (3), 2471(2023).
  13. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus hn001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: Evidence in mice for a role of TLR9. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  14. Denning, T. L., Bhatia, A. M., Kane, A. F., Patel, R. M., Denning, P. W. Pathogenesis of nec: Role of the innate and adaptive immune response. Semin Perinatol. 41 (1), 15-28 (2017).
  15. Yu, Y. -R. A., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLOS ONE. 11 (3), e0150606(2016).
  16. Mihi, B., et al. Interleukin-22 signaling attenuates necrotizing enterocolitis by promoting epithelial cell regeneration. Cell Rep Med. 2 (6), 100320(2021).
  17. Bautista, G. M., Cera, A. J., Chaaban, H., Mcelroy, S. J. State-of-the-art review and update of in vivo models of necrotizing enterocolitis. Front Pediatr. 11, 1161342(2023).
  18. Sodhi, C. P., et al. The human milk oligosaccharides 2'-fucosyllactose and 6'-sialyllactose protect against the development of necrotizing enterocolitis by inhibiting toll-like receptor 4 signaling. Pediatr Res. 89 (1), 91-101 (2021).
  19. Blum, L., Vincent, D., Boettcher, M., Knopf, J. Immunological aspects of necrotizing enterocolitis models: A review. Front Immunol. 15, 1434281(2024).
  20. Nolan, L. S., et al. Indole-3-carbinol-dependent aryl hydrocarbon receptor signaling attenuates the inflammatory response in experimental necrotizing enterocolitis. Immunohorizons. 5 (4), 193-209 (2021).
  21. Valle-Noguera, A., Gómez-Sánchez, M. J., Girard-Madoux, M. J. H., Cruz-Adalia, A. Optimized protocol for characterization of mouse gut innate lymphoid cells. Front Immunol. 11, 563414(2020).
  22. Booth, J. S., et al. Characterization and functional properties of gastric tissue-resident memory T cells from children, adults, and the elderly. Front Immunol. 5, 294(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

zapalenie jelitcytometria przepływowaizolacja komórek odpornościowychuszkodzenie nabłonkadysbioza mikrobiologicznakomórki odporności adaptacyjnej
Model myszy noworodkowej nekrotyzującego enterokolitu i izolacji lamina propria w celu profilaktyki komórek odpornościowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.