Rekonstrukcje naczyń krwionośnych u biorców, w tym żyły głównej nadwątrobowej dolnej (SHIVC), żyły wrotnej i żyły podwątrobowej dolnej dolnej (IHIVC), są kluczowymi procedurami dla udanego ortotopowego przeszczepu wątroby u myszy. Poniżej przedstawiamy techniki szycia i wskazówki dotyczące rekonstrukcji SHIVC i IHIVC w modelu przeszczepu wątroby myszy.
Artykuł metodologiczny
Techniki szwów w rekonstrukcji naczyń krwionośnych w ortotopowym przeszczepie wątroby u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania translacyjne z wykorzystaniem modeli zwierzęcych mają zasadnicze znaczenie dla rozwiązania problemów klinicznych związanych z przeszczepami narządów. Chociaż ortotopowy przeszczep wątroby u myszy (LT) jest użytecznym narzędziem do badania mechanizmów regeneracji wątroby, uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego i odpowiedzi immunologicznych po LT, wyzwania techniczne związane z tą procedurą ograniczają jej wykonalność. Kluczowymi aspektami udanej ortotopowej LT myszy jest rekonstrukcja naczyń krwionośnych u biorców, w tym żyły głównej dolnej wątroby (SHIVC), żyły wrotnej (PV) i żyły podwątrobowej dolnej (IHIVC). Oprócz trudności technicznych związanych z rekonstrukcją tych naczyń, ograniczenie fazy bezwątrobowej do 20 minut sprawia, że procedura ta jest bardziej wymagająca. Chociaż do rekonstrukcji PV można zastosować technikę mankietu, do rekonstrukcji SHIVC w fazie bezwątrobowej wymagana jest bezpieczna i szybka technika szycia. W przypadku rekonstrukcji IHIVC, chociaż stosuje się zarówno techniki mankietu, jak i szwu, technika szwów prowadzi do krótszego czasu operacji w chirurgii dawcy i przygotowaniu stołu tylnego oraz może utrzymać większe światło naczyniowe niż technika mankietu. Poniżej przedstawiamy wytyczne dotyczące rekonstrukcji SHIVC i IHIVC przy użyciu techniki szwów, aby ułatwić orttopową LT myszy.
Wprowadzenie
Dzięki postępom w technikach chirurgicznych, lekach immunosupresyjnych i medycynie intensywnej terapii, przeszczepianie narządów stało się standardową terapią schyłkowych chorób narządów. Przeszczep wątroby (LT) jest obecnie jedynym sposobem leczenia schyłkowej niewydolności wątroby i niektórych nowotworów złośliwych wątroby. Badania translacyjne z wykorzystaniem modeli zwierzęcych są niezbędne do rozwiązania problemów klinicznych w LT. Ponieważ w modelach mysich dostępne są różne genetycznie zmodyfikowane zwierzęta, mysi ortotopowy LT jest ważnym narzędziem do badania mechanistycznych wglądów w regenerację wątroby, uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne i odpowiedzi immunologiczne po LT1. Jednak ze względu na to, że wyzwania techniczne związane z tą procedurą ograniczają jej wykonalność, grupy badawcze pracujące nad tym modelem są ograniczone 2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Mysi ortotopowy LT został po raz pierwszy opisany przez Qian i wsp. w 1991 roku2. Procedura chirurgiczna, opracowana przez zastosowanie ortotopowych technik LT u szczurów, składa się z trzech etapów: operacji dawcy, przygotowania przeszczepu wątroby na tylnym stole i operacji biorcy6. Technicznie trudnymi częściami mysiego LT są rekonstrukcja dróg żółciowych i naczyń krwionośnych u biorców, w tym żyły głównej dolnej wątroby (SHIVC), żyły wrotnej (PV) i żyły podwątrobowej dolnej dolnej (IHIVC). Oprócz technik chirurgicznych, faza bezwątrobowa od zaciśnięcia do uwolnienia przepływu PV powinna trwać w ciągu 20 minut, aby leczenie ortotopowe myszy było skuteczne w przypadku orttopowego LT 2,6,11. Ponadto, z naszego doświadczenia, całkowity czas reperfuzji od zaciśnięcia PV do uwolnienia IHIVC powinien wynosić 30 minut, aby osiągnąć długoterminowe przeżycie w LT myszy. Jest to zgodne z poprzednim raportem dotyczącym LT szczura, opisującym preferowany czas niestabilnego ogólnoustrojowego stanu hemodynamicznego wynoszący około 30 minut12. W związku z tym trudności techniczne i ograniczenia czasowe w myszy LT sprawiają, że procedura ta jest bardziej wymagająca.
Chociaż technika mankietu może być stosowana do rekonstrukcji PV, do rekonstrukcji SHIVC w fazie bezwątrobowej wymagana jest technika szwu. Dlatego bezpieczna i szybka technika szycia jest niezbędna do zespolenia SHIVC. Chociaż zarówno techniki mankietu, jak i szwów mają zastosowanie do rekonstrukcji IHIVC, większość wcześniejszych badań wykorzystywała technikę mankietu 5,6,7,11,13. Jednak zastosowanie techniki mankietowej w rekonstrukcji IHIVC prowadzi do wydłużenia czasu operacji w operacjach dawcy i na stole dawczym. Ponadto założenie mankietu może być trudniejsze niż zakładanie szycia dla początkujących ze względu na krótki margines żyły głównej dolnej biorcy (IVC)13.
Poniżej przedstawiamy wytyczne dotyczące udanej rekonstrukcji SHIVC i IHIVC przy użyciu techniki szwów w orttopowym LT myszy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Doświadczeń na Zwierzętach Uniwersytetu w Kioto i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu w Kioto dotyczącymi ochrony zwierząt. Operacje na myszach wykonywano w znieczuleniu ogólnym z zastosowaniem inhalacji izofluranu. Waporyzator został ustawiony na 3% izofluranu z 1 l/min tlenu w celu wywołania znieczulenia. Po laparotomii izofluran zmniejszono do 1% w celu utrzymania znieczulenia. Narzędzia mikrochirurgiczne stosowane w tym protokole, w tym te używane w naszym wcześniej opublikowanym protokole rekonstrukcji naczyń krwionośnych13, są wymienione w Tabeli Materiałów. Do wykonania ortotopowego LT13 u myszy potrzebny był mikroskop. Do utrzymania temperatury ciała myszy użyto podkładki grzewczej13.
1. Zwierzęta
- Użyj myszy o wadze 25-30 g.
UWAGA: Chociaż można użyć myszy o wadze 20-35 g, myszy o wadze około 25 g są odpowiednie zarówno dla dawców, jak i biorców. Ponieważ wiek i stłuszczenie wątroby wpływają na wyniki LT, należy wybrać odpowiednie myszy do każdego celu eksperymentów.
2. Rozwarstwienie IHIVC w wątrobie dawcy
- Odizolować IHIVC od otaczającej tkanki. W razie potrzeby uszczelnij żyły lędźwiowe za pomocą elektrokoagulacji.
- Usuń tłuszcz z IHIVC, aby odsłonić ścianę naczynia.
- Wypreparuj IHIVC powyżej prawej tętnicy nerkowej i żyły (ryc. 1).
UWAGA: Jeśli do rekonstrukcji IHIVC stosuje się technikę szwów, nie jest konieczne wypreparowanie prawej żyły nerkowej w miejscu dawczym. Operacja dawcy trwa zwykle mniej niż 30 minut w przypadku zastosowania techniki szwów do rekonstrukcji IHIVC.
3. Rozwarstwienie SHIVC w wątrobie dawcy
- Po perfuzji roztworu do przechowywania z PV należy przeciąć przednią i tylną ścianę SHIVC (ryc. 1).
UWAGA: Izolacja tylnej ściany SHIVC od przepony jest kluczowa dla uzyskania wystarczającego marginesu do rekonstrukcji.
4. Przygotowanie przeszczepu wątroby na tylnym stole
- Przymocuj mankiet do PV, jak opisano wcześniej13.
- Przymocuj zacisk zaciskowy do IHIVC.
- Odwróć wątrobę do góry nogami i odsłoń kikut SHIVC.
- Umieść szew podporowy z nylonu 10-0 na obu krawędziach SHIVC i przytrzymaj je zaciskami buldoga.
UWAGA: Przygotowanie stołu zajmuje około 10 minut bez mocowania mankietu do IHIVC.
5. Rekonstrukcja SHIVC u biorcy
- Otocz SHIVC jedwabiem 4-0, aby cofnąć wątrobę w dół.
- Zmniejszyć stężenie izofluranu do 0,3-0,5% przed fazą bezwątrobową.
- Zacisnąć IHIVC nad prawą żyłą nerkową za pomocą mikroserrefine.
- Clamp PV za pomocą kleszczy grochowych13.
- Zacisnąć SHIVC z membraną za pomocą zacisku buldoga, jednocześnie cofając wątrobę w dół.
- Przetnij przednią ścianę SHIVC, a następnie przetnij tylną ścianę (ryc. 1).
UWAGA: Izolacja tylnej ściany SHIVC od przepony u biorcy i dawców ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wystarczającego marginesu do rekonstrukcji. - Po wypreparowaniu PV i IHIVC blisko wątroby biorcy, należy usunąć wątrobę od biorcy (ryc. 1).
- Przygotowany przeszczep wątroby należy umieścić w jamie brzusznej biorcy i odpowiednio umieścić wątrobę.
- Umieść i podwiąż szew podtrzymujący na prawym końcu SHIVC i przytrzymaj go zaciskiem buldoga, aby pociągnąć szew w kierunku brzusznej strony biorcy (ryc. 2A).
UWAGA: Prawa strona SHIVC leży głęboko w jamie brzusznej. Wyciągnij prawą stronę SHIVC tak, aby tylna ściana znalazła się z przodu. - Umieść i podwiąż szew podtrzymujący na lewym końcu SHIVC.
- Rozpocznij ciągłe szycie metodą śródświateł na tylnej ścianie SHIVC od lewej strony (ryc. 2A).
- Po dotarciu do prawego końca tylnej ściany SHIVC obróć stół operacyjny o 90° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
UWAGA: Obróć stół operacyjny o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara dla chirurgów leworęcznych. Alternatywnie, chirurdzy mogą zszyć przednią ścianę od przodu do tyłu bez rotacji. - Kontynuuj szew z szwem wielokrotnym na przedniej ścianie SHIVC od prawej strony (ryc. 2A).
UWAGA: Wymagane jest około sześciu do ośmiu szwów na tylną ścianę i osiem do dziesięciu szwów na przedniej ścianie. Szew na lewym końcu przedniej ściany jest ważny, aby zapobiec krwawieniu. - Po przepłukaniu powietrza w SHIVC, podwiązać szew ciągły ze szwem podciągowym po lewej stronie SHIVC.
- Obróć stół operacyjny o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby przywrócić pozycję odbiorcy do pierwotnej pozycji.
- Po rekonstrukcji i reperfuzji PV odblokuj SHIVC.
UWAGA: Rekonstrukcja SHIVC trwa 10-15 minut. Ponieważ czas zaciskania PV może wpływać na wyniki LT, czas znieczulenia (od zaciskania PV do odkręcania PV) powinien być ustalony na maksymalnie 20 minut w zależności od umiejętności chirurga. Po reperfuzji PV izofluran jest resetowany do 1% w celu utrzymania znieczulenia.
6. Rekonstrukcja IHIVC u biorcy
- Umieść i podwiąż szwy rozwleczone nylonem 10-0 na obu końcach IHIVC.
- Przytrzymaj szwy podporowe za pomocą zacisków buldoga, aby pociągnąć w obie strony, tak aby kikut IHIVC stał się szeroki i prosty.
- Rozpocznij ciągłe szycie metodą śródświateł po lewej stronie tylnej ściany (ryc. 2B).
- Po dotarciu do prawej strony kontynuuj szycie w kółko na przedniej ścianie od prawej strony biorcy (ryc. 2B).
UWAGA: Obrót stołu operacyjnego nie jest wymagany do rekonstrukcji IHIVC. Wystarczy około sześciu do ośmiu szwów na każdą tylną i przednią ścianę. - Przepłukać powietrze w IHIVC.
- Odblokuj zaciski IHIVC od strony przeszczepu, a następnie od strony biorcy.
UWAGA: Podwiązanie szwu ciągłego ze szwem podciągowym po lewej stronie IHIVC nie jest konieczne. Rekonstrukcja IHIVC trwa 8-10 minut. Całkowity czas reperfuzji od zaciśnięcia PV do zwolnienia IHIVC powinien wynosić 30 minut.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Biorca myszy wyzdrowiał ze znieczulenia w ciągu 30 minut, gdy przeprowadzono udaną rekonstrukcję naczyń przy użyciu normalnego przeszczepu wątroby bez wydłużonego czasu niedokrwienia zimna. Wskaźnik sukcesu >90% można uznać za wykwalifikowany w tej procedurze. Zbadaliśmy krzywe uczenia się u jednego chirurga pod kątem wskaźników powrotu do zdrowia po LT (powrót do zdrowia po znieczuleniu), czasu bezwątrobowego (od zaciśnięcia do uwolnienia przepływu PV) i całkowitego czasu reperfuzji (od zaciśnięcia PV do uwolnienia p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule tym udokumentowano szczegółowe techniki rekonstrukcji SHIVC i IHIVC za pomocą techniki szwów w ortotopowym LT myszy. Rekonstrukcja naczyń krwionośnych, zwłaszcza zespolenie SHIVC, które wymaga techniki szycia w fazie bezwątrobowej, jest kluczową umiejętnością dla udanego LT myszy. Oprócz bezpiecznej techniki szycia, szybkie szycie jest konieczne, aby utrzymać fazę zniewątrobową w ciągu 20 minut, aby uzyskać powtarzalne wyniki w ortotopowym LT
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Prace te były wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (numer grantu: 24K19356).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10-0 Mikroszew | Korporacja Instrumentów Urgicznych AROSurgical Instruments | T4A10N07 | |
| Cewnik dożylny 16 G | TERUMO | Przekaźnik SR-FF2032 | Mankiet IHIVC |
| Cewnik dożylny 20 G | TERUMO | Przekaźnik SR-FF1651 | Mankiet PV |
| 8-0 warkocz jedwabny | Natsume Seisakusho | Zobacz materiał CR9-80B2 | 8-0 jedwab |
| Rozwiązanie chłodnicze Belzer UW | Astellas (Astellas) | płyn konserwujący narządy | |
| Zacisk buldoga | B BRAUN | FB329R | Zacisk buldoga |
| Zaciski Bulldog | Natsume Seisakusho | Samolot C-42-S-2 | Do mocowania SHIVC |
| Myszy C57BL/6 | Orientalny serwis biologiczny | ||
| Kleszcze | Narzędzia naukowe | 11231-30 | |
| Izofluran, roztwór do inhalacji | Viatris (Zjawik) | Środek znieczulający | |
| Mikro końcówki 0,1 mm x 0,06 mm | Narzędzia naukowe | 11253-20 | Mikrokleszcze proste |
| Mikro nożyczki | Instrumenty medyczne Muranaka | 451-609-13 | |
| Mikro serrefine | Narzędzia naukowe | 18055-03 | Do mocowania IHIVC |
| Mikro serrefine | Narzędzia naukowe | 18055-04 | Do mocowania PV |
| Aplikator Micro Serrefine Clamp z blokadą | Narzędzia naukowe | 18056-14 | Aplikator klipsów do naczyń |
| Mikro uszlachetnienia | Narzędzia naukowe | 18055-4 | Klips do naczynia |
| Płody z mikroszwami | Aesculap powiedział: | FD281R | |
| Aplikator zaciskowy Micro-serrefine | Narzędzia naukowe | 18056-14 | |
| Uchwyt na igłę | Aesculap powiedział: | FD231R | |
| No.11 Ostrza zapasowe | Maszynka do golenia FEATHER | 11 | Ostrza |
| Nożyczki okulistyczne, okrągła rączka | B BRAUN | FD103R | Mikronożyczki |
| Plastikowy pojemnik w kształcie prostokąta | Daiso powiedział: | 10 cm długości, 15 cm szerokości i 6 cm wysokości | |
| Końcówki SuperGrip | Narzędzia naukowe | 00649-11 | Zakrzywione mikrokleszcze |
| SZX7 | Olympus | SZX7 | Mikroskop |
| Nożyczki Vannas | Światowe instrumenty precyzyjne | 501232 | |
| Klips naczyniowy | Korporacja BEAR Medic | TKF-1-30 | Do zaciskania IHIVC na przeszczepie wątroby |
Bibliografia
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E. Orthotopic liver transplantation in the mouse. Transplantation. 52 (3), 562-564 (1991).
- Tian, Y., Rudiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Klein, I., Gassel, H. J., Thiede, A., Crispe, I. N., Steger, U. A microsurgical approach to hepatic and extrahepatic antigen presentation and its effects on the migration pattern of activated CD8(+) T cells. Microsurgery. 27 (4), 289-294 (2007).
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Kojima, H., et al. T cell CEACAM1-TIM-3 crosstalk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248.e9 (2023).
- Tanaka, K., et al. Recipient toll-like receptor 4 determines the outcome of ischemia-reperfusion injury in steatotic liver transplantation in mice. Am J Transplant. 25 (6), 1168-1179 (2025).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Hori, T., et al. Comprehensive and innovative techniques for liver transplantation in rats: A surgical guide. World J Gastroenterol. 16 (25), 3120-3132 (2010).
- Tanaka, K., et al. Vascular reconstruction with the cuff technique in mouse orthotopic liver transplantation. J Vis Exp. (202), e66215(2023).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie