Artykuł metodologiczny

Formułowanie dawek substancji śledzących witaminy A do podawania osobom z wykorzystaniem techniki rozcieńczania izotopów retinolu.

186 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69240

⸱

31 marca 2026

 , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Fera Science Ltd

W tym artykule

Podsumowanie

Przygotowanie stabilnej izotopowej substancji A A, niezbędnej do techniki rozcieńczania izotopów retinolu, musi spełniać normy bezpieczeństwa żywności. Protokół pokazuje przygotowanie dawki w oleju roślinnym w stężeniach odpowiednich dla wybranego systemu dostarczania i zastosowanej platformy analitycznej.

Streszczenie

Technika rozcieńczania izotopów retinolu (RID) opiera się na podawaniu izotopowo znakowanych znaczników witaminy A u ludzi. Przedstawiamy tutaj metodę, która ma pomóc zespołom badawczym w przygotowaniu stabilnych izotopowych znaczników witaminy A zarówno do badań naukowych, jak i badań populacyjnych. Artykuł przedstawia przegląd przygotowania, pozyskiwania materiałów, wymaganego sprzętu oraz procedur zapewniających bezpieczeństwo znaczników dla spożycia przez ludzi. Stabilne izotopy z witaminą A można pozyskać komercyjnie i zwykle są oznaczane deuterem [2H] lub węglem-13 [13C], o czystości >95% całkowicie trans-izometrycznej i >99% wzbogaceniu izotopowym. Przygotowanie stabilnych izotopowych znaczników witaminy A polega na rozpuszczeniu znacznika w jadalnym oleju roślinnym poprzez sonikację i ciepło. Znaczniki muszą być przygotowywane w stężeniu mieszczącym się w granicach objętościowych systemu dostarczania. Na koniec znacznik jest alicytatowany do sterylnych fiolek z bursztynowego szkła, a stężenia znaczników potwierdza się spektrofotometrycznie.

Wprowadzenie

Aby umożliwić skuteczne monitorowanie programów interwencyjnych mających na celu zmniejszenie niedoboru witaminy A, metoda rozcieńczania izotopów retinolu (RID) została skutecznie zastosowana, aby dostarczyć informacji o całkowitych zapasach witaminy A (TBS) w różnych grupach populacji 1,2,3,4. Chociażtesty retinoluw surowicy 5, białko wiążące retinol w surowicy (RBP)6,7,8 oraz zmodyfikowane dawki względnej (MRDR) 9 są często stosowane do potwierdzenia niedoboru witaminy A, RID jest jedyną metodą, która dokładnie określa zapasy witaminy A w całym spektrum – od niedoboru subklinicznego po toksyczność 3,10. Poprzez podanie znanej dawki oznakowanej witaminy A i pomiar jej rozcieńczenia w osoczu po wyrównaniu równowagi, metoda RID dostarcza precyzyjnych szacunków TBS i rezerw witaminy A w wątrobie11,12. Co istotne, metoda RID pozostaje wiarygodna nawet w populacjach z stanem zapalnym, co czyni ją niezbędną do oceny skuteczności interwencji oraz oceny ryzyka toksyczności w nakładających się programach suplementacji i wzmacniania13,14.

Aby przeprowadzić metodę RID, izotopowo oznakowana witamina A musi być podawana doustnie retinylesteru, który w większości przypadków jest octanem retinylowo-rozpuszczonym w jadalnym oleju roślinnym. Większość laboratoriów pozyskuje witaminę A z oznakowaniem izotopowym od komercyjnych dostawców 1,3,7,15,16,17,18,19,20,21,22. Prawie wszystkie komercyjnie dostępne znaczniki izotopów witaminy A są oznaczane za pomocą stabilnych izotopów węgla-13 [13C] lub deuteru [2H] (Tabela 1). Wybór zastosowanej dawki izotopu zależy od instrumentu analitycznego używanego do określenia stężenia retinolu znakowanego masowo w surowicy lub osoczu. Podczas gdy chromatografia gazowo-spektrometria mas (GC-MS) oraz chromatografia ciecz-spektrometria mas tandemowa (LC-MS/MS) mogą analizować zarówno [13C], jak i [2H]22,23,24,25,26,27, chromatografia gazowa-spektrometria stosunku izotopów (GC-C-IRMS) może analizować jedynie [13C] oznaczane znaczniki retinolu 4,25,28. Limity wykrywalności wybranego instrumentu analitycznego, grupy docelowej (dzieci lub dorosłych) oraz długość badania zdecydują o wielkości dawki, którą należy podać 3,25,29. Dotychczas stosowane dawki izotopów wahały się od 0,3 do 4,3 mg ekwiwalentu retinolu (RE; równoważny 1 - 15 μmol RE) u dzieci wwieku 3,4,30 oraz od 0,6 do 10,0 mg RE (równoważny 2 - 35 μmol RE) u dorosłych 2,3,31, przy czym nowsze badania stosowały niższe dawki w zakresie od 0,3 do 0,6 mg RE (1 - 3 μmol RE) u dzieci oraz 0,6 - 2,0 mg RE (2 - 7 μmol RE) u dorosłych. Chociaż pojawiły się obawy, że duża masa witaminy A w dawce może zaburzyć kinetykę witaminy A, niedawna analiza z wykorzystaniem modelowania przedziałowego potwierdziła, że dawki izotopów sięgające 7 μmol RE u dzieci lub 14 μmol RE u dorosłych nie powinny wpływać na dokładność prognoz TBS29. Tutaj pokażemy, jak przygotować izotopowy znacznik do doustnego zastosowania metodą RID, uwzględniając kwestie bezpieczeństwa żywności i uzyskanie dokładnych stężeń dawki. Przygotowanie dawki izotopowej jest kluczowe dla metody RID.

Protokół

Badanie 1 zostało zatwierdzone przez National Research Ethics Service, North-East Sunderland Committee (REC 09/H0904/20) przed rejestracją w UK Clinical Research Network (UKCRN: 7413). Badanie 2 zostało zatwierdzone przez Research Ethics Board Uniwersytetu Filipińskiego w Manili (IRB ID: UPMREB 2016-282-01), Institutional Review Board na UC, Davis (IRB ID: 903681-2) i zarejestrowane w ClinicalTrials.gov (ID: NCT03030339). Badanie 2 było częścią projektu GloVitAS finansowanego przez Fundację Billa i Melindy Gatesów (OPP1115464: Ocena ryzyka toksyczności witaminy A w wyniku masowej fortyfikacji żywności i innych interwencji). Georg Lietz był głównym badaczem projektu GloVitAS i nadzorował realizację badania terenowego. Przegląd protokołu badania przedstawiono na Rysunku 1.

1. Kryteria włączenia i wykluczenia

  1. W badaniu 1 podane kryteria to: Kryteria włączenia: Uwzględnić zdrowych ochotników płci męskiej i żeńskiej w wieku 18-45 lat. Kryteria wykluczenia: Wykluczyć ochotników z ciążą, paleniem palenia, nadciśnieniem, cukrzycą, BMI >30, chorobami wątroby/nerek/przewodu pokarmowego, zaburzeniami metabolizmu lipidów oraz przyjmowaniem multiwitamin (zawierających witaminy A, C, E) lub suplementów β-karotenu na 3 miesiące przed rozpoczęciem badania.
  2. W badaniu 2 podane kryteria to: Kryteria włączenia: Uwzględnić dzieci w wieku 12-18 miesięcy, które pozostawały w obszarze badania przez cały czas trwania badania. Kryteria wykluczenia: Wykluczyć, jeśli dzieci nie otrzymały wysokiej dawki suplementacji witaminy A i mieszkały w miejscach, gdzie nie były narażone na produkty wzbogacone witaminą A na lokalnych targach.

2. Określenie całkowitej ilości stabilnego izotopowego znacznika dla RID

  1. Zdecyduj, ile stabilnego izotopu powinien otrzymać każdy badany z uwzględnieniem czystości izomerycznej. Zaleca się stosowanie stabilnych izotopów witaminy A o czystości całkowicie trans >95%, ponieważ aktywność biologiczna i szlaki metaboliczne różnią się znacząco między izomerami geometrycznymi. Oblicz poziom dawki na podstawie ekwiwalentów retinolu (RE). Przykład obliczania tego znajduje się w Tabeli 2.
  2. Pomnóż poziom dawki przez całkowitą liczbę uczestników. Podstawową liczbę uczestników według obliczeń mocy dla wymaganej próby, ale zwiększa w zależności od oczekiwanej utraty (patrz na przykład Tabela 2 ). Zwiększ całkowitą ilość potrzebnego śladowca, uwzględniając straty pipetowania do 20%.
    UWAGA: Zazwyczaj przygotowanie izotopu musi zawierać nadmiar, ponieważ nie jest możliwe odzyskanie całego materiału z fiolki. Straty mogą również wynikać z lepkości oleju pozostającego na zewnątrz końcówki pipety. Aby uzyskać dokładne ilości dawki podczas podawania, nadmiar oleju na zewnątrz końcówki pipety należy wytrzeć z zewnątrz. Operatorzy mogą zminimalizować straty pipetowania, jeśli końcówka pipety nie jest zanurzona zbyt głęboko w oleju.

3. Określenie ilości oleju roślinnego potrzebnej do rozpuszczenia stabilnego śledarza izotopowego

  1. Zdecyduj, którego oleju roślinnego użyć i jaką ilość dawki na osobę (Tabela 2). Określ ilość dodanego oleju według systemu podawania podczas podawania pacjentów.
    UWAGA: Używamy oleju słonecznikowego ze względu na wysoką zawartość witaminy E, która wspiera stabilność preparatu witaminyA 32,33. Jednak inne grupy stosowały inne oleje roślinne, aby spełnić lokalne normy dietetyczne. Ponieważ RID opiera się na dokładnym dostarczaniu stabilnych znaczników oznaczonych izotopami, zaleca się stosowanie pipety o dodatnim wypróżnieniu do dawkowania przygotowanej w oleju jadalnym. Najnowsze badania stosują objętości do 250 μL, szczególnie jeśli dawka jest podawana dzieciom 1,7,23.
  2. Oblicz stężenie stabilnego izotopowego znacznika w oleju roślinnym w mg/mL. Określ całkowitą objętość potrzebnego oleju roślinnego. Oblicz wagę potrzebnego oleju na podstawie obliczonej objętości i względnej gęstości oleju roślinnego (zobacz Tabelę 2 jako przykład).
    UWAGA: Dla dokładności zaleca się ważenie oleju w celu przygotowania stabilnego śligacza izotopowego. Po obliczeniu całkowitej objętości wymaganego oleju można zamówić znacznik z oznakowaniem izotopowym. Ważne jest, aby poprosić o wysłanie smugnika izotopowego w butelce o odpowiedniej objętości, która umożliwi zespołowi badawczemu odważenie oleju roślinnego bezpośrednio do butelki zawierającej znacznik oznaczony izotopem.

4. Przygotowanie stabilnego izotopowego znacznika w wyznaczonych obszarach do przygotowywania żywności

  1. Ostrożnie otwórz pokrywkę bursztynowej butelki zawierającej ustaloną całkowitą ilość stabilnego izotopowego znacznika i umieść ją na wagi analitycznej, która następnie jest tarowana do zera.
  2. Dodawaj olej kroplami do osiągnięcia pożądanej wagi (z dokładnością ± 0,1 g) za pomocą sterylnej strzykawki 10 mL.
    UWAGA: Ponieważ niektóre kryształy octanowego retinylu mogą być uwięzione wewnątrz nakrętki bursztynowej butelki, butelka należy otwierać bardzo ostrożnie. Po dodaniu oleju roślinnego do bursztynowej butelki, nakrętka jest ostrożnie zakładana z powrotem na butelkę, którą następnie ostrożnie potrząsa ręką, aby ponownie zawiesować pozostałe kryształy octana retynylu wewnątrz kapsla.
  3. Umieść butelkę w kąpieli wodnej sonikującej o mocy ultradźwiękowej: 14 W/L i częstotliwości pracy: 44 kHz. Napełnij wodą powyżej poziomu oleju w butelce, ale poniżej poziomu pokrywki, aby zapobiec przypadkowemu przedostawaniu się wody do preparatu.
  4. Sonikuj butelkę przez 15 minut, a następnie ostrożnie mieszaj ręcznie, a następnie przez kolejne 15 minut. Należy uważać, aby temperatura kąpieli wodnej sonikującego nie przekraczała 50 °C.
    UWAGA: Stosując olej słonecznikowy do przygotowania, stwierdziliśmy, że izomeryzacja do retinoidów cispłciowych nie zachodzi po ekspozycji dawki na 50 °C przez 30 minut (patrz Rysunek 2). Jednak preparaty powinny być analizowane przez HPLC, aby ocenić zakres izomeryzacji termicznej.
  5. Umieść butelkę w podgrzewanej kąpieli wodnej w temperaturze 50 °C na 30 minut, aby całkowicie rozpuścić mikrokryształy.
  6. Weź próbkę oleju o pojemności 20 μL, aby sprawdzić obecność mikrokryształów pod mikroskopem świetlnym z powiększeniem 200x w laboratorium. Jeśli mikrokryształy są obecne, powtórz procedurę sonikowania i podgrzewania.
  7. Po osiągnięciu całkowitego rozpuszczenia należy zaniedbać cały preparat oleju do 2-4 mL sterylnych fiolek bursztynowych ze sterylnym szkłem. Do tego zabiegu używaj pipet o dodatnim przemieszczeniu, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
    UWAGA: Objętość stabilnego izotopowego znacznika dodawanego do szklanych fiolek bursztynowych może być ustalana przez dzienną częstotliwość rekrutacji, np. jeśli dziennie rekrutowanych jest 5 osób, a objętość dawki wynosi 150 μL, fiolka musi zawierać wystarczającą objętość, aby uwzględnić 5 dawek plus straty pipetowania: 5 x 150 μL x 1,2 = 900 μL.
  8. Określ stężenie stabilnego izotopu w potrójnym egzemplarzu. Zarezerwuj 200 μL czystego oleju roślinnego (używanego do przygotowania spektrofotometrycznego pustego elementu) oraz 200 - 350 μL stabilnej dawki izotopu w oddzielnych fiolkach bursztynowych po 2 mL podczas przygotowania znacznika z oznakowanym stabilnym izotopem.
    1. Jeśli stężenie dawki wynosi ≤ 0,5 mg RE, zarezerwuj 350 μL stabilnego izotopu w osobnej fiolce bursztynowej o pojemności 2 mL. Dla stężenia > 0,5 mg RE zarezerwuj 200 μL stabilnej dawki izotopu w osobnej fiolce bursztynowej o pojemności 2 mL.
  9. Okryj fiolki gazem obojętnym (Ar), aby opóźnić potencjalną utlenianie izotopowego znacznika, szczelnie zamknąć i przechować w krioboxie oznaczonym stężeniem izotopu, objętością dawki (ustaloną później), datą przygotowania i nazwą projektu. Przechowuj kriobox w zamrażarce o temperaturze -20 °C do czasu wysyłki. W tych warunkach dawka tracera jest stabilna przez co najmniej 2 lata.

5. Określenie stężenia stabilnego stężenia izotopu w laboratorium

  1. Rozcieńcz stabilny lokalizator izotopowy w 3 kolbach objętościowych z n-heksanem. Napełnij kolby objętościowe n-heksanem do 1 cm poniżej linii kalibracyjnej przed dodaniem dawki śledzącego.
    1. Określ rozcieńczenie stabilnego znacznika izotopowego przez stężenie dawki markera. Jeśli stężenie dawki stabilnego izotopowego znacznika wynosi ≤ 0,5 mg RE, rozcieńcz 100 μL stabilnej dawki izotopu w kolbie objętościowej 50 mL z n-heksanem. Jeśli stężenie dawki wynosi między 0,5 a 2 mg RE, to 50 μL stabilnej dawki izotopu w kolbie objętościowej 50 mL z n-heksanem. Jeśli stężenie dawki wynosi >2 mg RE, to 50 μL stabilnej dawki izotopu w kolbie objętościowej 100 mL z n-heksanem.
    2. Bezpośrednio podawaj 50 lub 100 μL oleju do heksanu, a kolbę przygotowuj do objętości 50 lub 100 mL z dodatkowym heksanem za pomocą szklanej pipety Pasteura. Odwróć kolbę 10 razy, aby wymieszać olej z heksanem.
      UWAGA: Heksan należy obsługiwać w szafie na spaliny, używając odpowiedniej ochrony osobistej. Odpady są zbierane w dedykowanym pojemniku do specjalistycznej utylizacji przez zatwierdzonego wykonawcę.
  2. Przygotuj ślepą kolbę spektrofotometryczną, pipetując tę samą objętość oleju roślinnego co stabilny izotopowy znacznik (50 lub 100 μL) i przelewając ją do heksanu. Upewnij się, że zastosowane rozcieńczenie (50 lub 100 mL) jest takie samo jak w przypadku stabilnego śledarza izotopowego. Odwróć kolbę 10 razy, aby wymieszać olej z heksanem.
    UWAGA: Do pipetowania zarówno ze stabilnym izotopowym znacznikiem, jak i czystym olejem, stosuje się pipetę o pojemności 100 μL o dodatnim przesunięciu (dodatniej przesunięcia). Aby zapewnić precyzyjne pipetowanie, kluczowe jest przetarcie końcówki w dół za pomocą papieru wolnego od kłaczków, aby usunąć pozostałości śladownika/oleju z zewnątrz końcówki. Należy zachować ostrożność podczas wycierania bezpośredniej zastępczej końcówki, aby papier nie zetknął się z otworem końcówki, ponieważ olej będzie pobierany z wnętrza końcówki.
  3. Zmierz stężenia stabilnych izotopów w kiwetie kwarcowej za pomocą spektrofotometru ustawionego na długość fali 325 nm, używając oleju roślinnego w heksanie jako blanku spektrofotometrycznego (zobacz Tabelę 3 jako przykład).
    1. Rozpocznij pomiary, używając oleju roślinnego w heksanie jako spektrofotometrycznego pustego elementu. Między każdym pomiarem czyść kwarcową kuwetę UV, płucząc ją 3 razy n-heksanem. Po odmierzeniu wszystkich próbek ostrożnie wyczyść kuwetę czystym n-heksanem.
  4. Określ stężenie stabilnego śligacza izotopowego na podstawie średnich odczytów AU i zastosuj specyficzny dla izotopu współczynnik molowego wymierania według prawa Beer-Lamberta. Na tej podstawie oblicz objętość przygotowanego stabilnego śligacza izotopowego potrzebną na dawkę (patrz przykład w reprezentatywnych wynikach poniżej oraz w Tabeli 3).

Wyniki

Obliczanie całkowitej dawki znacznika izotopowego
W badaniu przy wielkości próby wynoszącej 100 osób obliczono całkowitą ilość [13C10]octanu retinylu, aby określić ilość [13C10]octanu retinylu wymaganą do syntezy (Tabela 2). Ilość ta została wyznaczona na podstawie obliczeń mocy dla wymaganej wielkości próby (n = 100), przewidywanego ubytku uczestników (n=15; 15% ubytku), strat podczas pipetowania (20%) oraz stężenia [13C10]octanu retinylu na dawkę (0,4 mg RE; w zależności od czułości zastosowanego spektrometru mas, czasu trwania eksperymentu i grupy wiekowej badanych). Otrzymana całkowita ilość wymaganych RE (55,2 mg RE) została następnie przeliczona na wymaganą masę [13C10]octanu retinylu (63 mg).

Aby obliczyć objętość oleju słonecznikowego niezbędną do rozpuszczenia [13C10]octanu retinylu w pożądanym stężeniu, najpierw ustalono objętość podania dawki na 150 µL/dose (0,15 mL/dose). Następnie obliczono stężenie [13C10]octanu retinylu w 1 mL oleju słonecznikowego (Tabela 2). Dzieląc wymaganą masę [13C10]octanu retinylu (63 mg) przez wymagane stężenie dawki, otrzymano całkowitą objętość potrzebnego oleju słonecznikowego. Na koniec, wykorzystując gęstość względną oleju słonecznikowego, wyznaczono jego masę.

Dokładne docelowe stężenie [13C10]octanu retinylu w oleju potwierdzono poprzez pomiar stężeń stabilnego izotopu znacznika przy użyciu spektrofotometru w oparciu o prawo Beera-Lamberta (Tabela 3). Uwzględniając rozcieńczenie stabilnego izotopu znacznika podczas pomiaru (czynnik rozcieńczenia 500), uzyskano stężenie 2,58 µmol/µL [13C10]octanu retinylu w oleju. W związku z tym ustalono, że końcowa objętość przygotowanego stabilnego izotopu znacznika potrzebna do dawki 0,4 mg RE wynosi 155 µL (Tabela 3).

Kontrola potencjalnej izomeryzacji dawki znacznika
Czystość izomeryczną otrzymanej dawki znacznika określono poprzez sprawdzenie izomeryzacji cis za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC; Rysunek 2). W tym celu próbkę rozcieńczonego roztworu znacznika z kroku 5.1.2 odparowano do sucha w strumieniu azotu, a pozostałość rozpuszczono ponownie w 100% etanolu w celu wstrzyknięcia. Analizę HPLC wykonano w trzech powtórzeniach zgodnie z metodą Liu i wsp.34, aby sprawdzić wystąpienie izomeryzacji cis (patrz Rysunek 2). Czystość dawki znacznika należy monitorować przez cały czas trwania badania, aby upewnić się, że dawka nie ulega degradacji.

Wpływ stężeń dawek znacznika na frakcję dawki w czasie
Zastosowanie różnych poziomów dawkowania prowadzi do zmiennej frakcji przyjętej dawki w czasie, co może wpływać na zdolność platformy analitycznej do wykrywania [13C10]retinolu u wszystkich badanych w wymaganych punktach czasowych. Podanie dawki 1 mg lub 0,4 mg [13C10]octanu retinylu w oleju u dorosłych (Rycina 3A) lub dzieci (Rycina 3B) wykazało wyższą frakcję dawki po podaniu 1 mg w porównaniu do 0,4 mg [13C10]octanu retinylu i potwierdziło zdolność zastosowanej metody LC-MS/MS do wykrywania [13C10]retinolu u badanych do 28 dni po podaniu dawki. Potwierdza to, że informacje o frakcji dawki w różnych punktach czasowych są kluczowe dla ustalenia, czy zastosowany poziom dawkowania jest wystarczająco wysoki, aby uzyskać sygnał powyżej granicy wykrywalności dla danej platformy analitycznej, oraz że informacje te powinny być idealnie pozyskane podczas badania pilotażowego na reprezentatywnych próbkach.

Schemat przygotowania znacznika; obliczanie dawki, pomiar oleju, sonikacja, etapy spektrofotometrii.
Rycina 1: Schemat blokowy przygotowania dawek znacznika witaminy A. Kluczowe etapy przygotowania dawki izotopu stabilnego, obejmujące wyznaczenie wymaganych ilości, stężenie otrzymanej dawki znacznika oraz potwierdzenie czystości dawki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wynik chromatografii, piki czasu retencji, wykres porównujący próbki A i B, chemia analityczna.
Rysunek 2: Chromatogram HPLC dawki znacznika w celu zbadania izomeryzacji octanu retinylu. Potencjalną izomeryzację [13C10]octanu retinylu po (A) sonikacji oraz (B) podgrzewaniu do 50 °C przez 30 min w każdym przypadku oceniono za pomocą analizy HPLC dawki izotopowej po każdym etapie. Analizę przeprowadzono na urządzeniu HPLC z detekcją matrycą dioidową zgodnie z metodą Liu i wsp.34. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres farmakokinetyczny frakcji leku w osoczu w czasie, pokazujący wchłanianie i eliminację dawki.
Rysunek 3: Obserwowane wartości średnie frakcji retinolu w osoczu w stosunku do dawki w czasie po podaniu [13C10]octanu retinylu. Frakcja dawki u (A) 45 dorosłych z Wielkiej Brytanii16 oraz (B) 112 dzieci z Filipin1, którym podano odpowiednio dawkę 1 mg lub 0,4 mg [13C10]octanu retinylu. Frakcja dawki = {stężenie [13C]retinolu w osoczu (µmol/L) X szacowana objętość osocza (L) / dawka [13C] (µmol). Dane przedstawiono jako średnią geometryczną ± SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Izotop trwałyDostawca/Producent
octan [D4]-retinyluBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
octan [D6]-retinyluBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
octan [D8]-retinyluBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[13C3octan retinyluBuchem BV/ReseaChem GmbH
[13C4octan retinyluBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[13C8octan retinyluBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory
[13C10octan retinyluBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Cambridge Isotope Laboratory

Tabela 1: Komercyjnie dostępne stabilne znaczniki izotopowe witaminy A. Lista znaczników octanu retinylu znakowanych 13C i 2H od różnych dostawców.

Parametry
Wielkość próby [n]: 100
Zużycie [n] (%): 15 (15%)
Straty podczas pipetowania: 20%
MW [13C10octan retinylu:338.5 µg/µmol
masa cząsteczkowa [13C10retinol:296.46 µg/µmol
Wielkość dawki:0,4 mg RE z [13C10octanu retinylu na ochotnika
Obliczenia
Całkowita wymagana ilość RE:= wielkość dawki w mg RE x wielkość próbki x ubytek x straty podczas pipetowania
= 0,4 mg RE x 100 x 1,15 x 1,2
= 55,2 mg RE
Całkowita ilość [13C10wymagany octan retinylu:= mg RE x MW [13C10octan retinylu / MW [13C10retinol
= 55,2 mg RE x 338.5 µg/µmol / 296.46 µg/µmol
= 63,0 mg [13C10octan retinylu 
Stężenie dawki [13C10octan retinylu w oleju:[13C10]octan retinylu [mg/ml] = 
(mg RE x MW [13C10octan retinylu / MW [13C10]retinol) / 0,15 ml 
= (0,4 mg RE x 338.5 µg/µmol / 296.46 µg/µmol) / 0,15 ml
= 3,04 mg/ml
Całkowita wymagana objętość oleju słonecznikowego:= całkowita [13C10masa octanu retinylu / stężenie dawki w oleju
= 63,0 mg / 3,04 mg/ml
= 20,7 ml oleju 
Wymagana masa oleju słonecznikowego:= całkowita objętość oleju słonecznikowego x gęstość względna oleju słonecznikowego
= 20,7 ml x 0,92 g/ml
= 19,0 g olej słonecznikowy 

Tabela 2: Przykład obliczeń wielkości dawki znacznika izotopu stabilnego. Wskazanie parametrów i obliczeń służących do określenia dawki znacznika oraz ilości oleju roślinnego.

Parametry
Molowy współczynnik ekstynkcji (E1% 1 cm) z [13C10octan retinylu w heksanie: 52718 L mol⁻¹-1 cm-1 x 1 cm
Współczynnik rozcieńczenia: 500 (100µL przygotowania oleju w 50 ml heksanu)
Zmierzona średnia absorbancja:0.917
MW [13C10retinol:296.46 µg/µmol
Obliczenia
Stężenie (mol/L) [13C10octan retinylu w heksanie:Stężenie (mol/L) = Absorbancja / E1% 1 cm x Długość kuwety (1 cm)
= 0,917 / 52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm = 1,739 x 10-5 mol/L
Przeliczanie stężeń na µmol/µL:Stężenie (mol/L) = Stężenie (µmol/µL)
1,739 x 10-5 mol/L odpowiada wartości 1,739 x 10-5 µmol/µL
Korekta o rozcieńczenie: 1,739 x 10-5 µmol/µL x 500 = 8,697 x 10-3 µmol/µL w oleju
Masa na µL (µg/µL):= [13C10octan retinylu µmol/µL w oleju x MW [13C10retinol
= 8,697 x 10-3 µmol/µL Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 296.45 µg/µmol = 2.58 µg/µL
Objętość na dawkę: = Objętość (µL/ 400 µg dawka) = 400µg / 2.58 µg/µL = 155 µL

Tabela 3: Wyznaczanie stężenia dawki znacznika izotopu stabilnego. Wymagane parametry i obliczenia w celu wyznaczenia stężeń dawki znacznika oraz objętości wymaganych do podania doustnego.

Dyskusja

Stabilne znaczniki izotopowe stosowane na ludziach są zazwyczaj uznawane za bezpieczne, bez zgłaszanych negatywnych skutków biologicznych lub fizjologicznych przy stosowanych stężeniach25,35. Jednakże, ponieważ stabilny izotopowy znacznik musi być podawany doustnie, niezbędne jest, aby dawka markera spełniała normy bezpieczeństwa żywności. Można to osiągnąć, wymagając od dostawców i producentów stabilnej izotopowej oznakowanej witaminy A przeprowadzania testów bezpieczeństwa żywności na dostarczonych izotopach 7,20,24. Podobnie konieczne jest, aby przygotowanie i przechowywanie izotopów były wykonywane wyłącznie w wyznaczonych obszarach do przygotowania żywności. Ponadto cały sprzęt używany do przygotowywania stabilnych izotopów musi być przeznaczony wyłącznie do przygotowania izotopów i przechowywany w pomieszczeniach przeznaczonych do przygotowania żywności.

Izotopy znakowane octanem retinylu były wcześniej rozpuszczane za pomocą etanolu, następnie suszone pod gazem azotowym przed rozpuszczeniem w olejuroślinnym 36. Przedstawiamy tutaj metodę umożliwiającą rozpuszczenie znacznika oznaczonego izotopem w oleju roślinnym przy użyciu kombinacji sonikacji i ciepła. Chociaż metoda ta jest łatwiejsza do wykonania w obszarze przygotowującym żywność, należy zachować ostrożność przy stosowaniu ciepła, aby rozpuścić smugnik w oleju roślinnym. All-trans-retinol jest izomeryzowany do 13-cis-retinolu podczas obróbki cieplnej, która przyspiesza przy wyższych temperaturach37. Izomerizacja retinolu dodatkowo wzrasta pod wpływem ekspozycji na światło32. Ponadto stabilność retinolu zależy od właściwości utleniania lipidów oleju roślinnego32,38. Ponieważ zawartość tokoferolu α w oleju roślinnym pozytywnie wpływa na retencję witaminyA 32, a olej słonecznikowy ma jedną z najwyższych zawartości α-tokoferolu33, zdecydowaliśmy się na użycie oleju słonecznikowego do przygotowania dawek znacznika. Decyzja o zastosowaniu ciepła do 50°C w celu rozpuszczenia znacznika opierała się na zastosowaniu ciepła do rozpuszczania kryształów retinolu w produktach kosmetycznych bez znaczącej utraty39. Chociaż nie zaobserwowaliśmy istotnej degradacji octana retynylu w opisanym protokole, kluczowe jest sprawdzenie izomeryzacji dawki śledznika cispłciową zaraz po zabiegu cieplnym (Rysunek 2). Zalecamy również monitorowanie stabilności dawki tracera przez cały czas badania, aby potwierdzić stężenie zastosowanej dawki tracera.

Znacznik musi być przygotowany w stężeniu dobrze mieszczącym się w granicach objętościowych systemu podawania wymaganej dawki. Ponieważ RID opiera się na dokładnym dostarczaniu stabilnych znaczników znakowanych izotopami, zaleca się stosowanie pipety o dodatnim przesunięciu do stosowania dawki. Chociaż dawki do 1 mL były stosowane w przeszłości u dorosłych16, 20, 40, łatwiejsze jest stosowanie objętości w zakresie 100–250 μL, ponieważ wykazano, że te objętości są dobrze tolerowane przez niemowlęta i dzieci1. Alternatywnie, dawki mogą być podawane w formie kapsułek17, ale kluczowe jest wybranie kapsułek specjalnie zaprojektowanych tak, aby zapobiegać wycieku oleju i zapewnić akceptowalność w populacji badanej. Wreszcie, stosowane poziomy dawki zależą od grupy wiekowej populacji docelowej29 lat, zdolności zastosowanej platformy analitycznej do wykrywania niskich poziomów3 oraz całkowitych zapasów organizmu populacji docelowej, przy czym niższa część dawki w osoczu przy wyższych zapasach ciała1.

Jak wskazano w powyższym przykładzie, [13C10] octana retinyla w stężeniu 2,58 μg/μL w oleju słonecznikowym zapewni dawkę 0,4 mg smagnesza RE w 155 μL oleju słonecznikowego, którą można dokładnie podać za pomocą pipety o dodatnim przesunięciu 250 μL. Aby uzyskać stężenia mieszczące się w granicach objętościowych systemu dostarczania, kluczowe jest, aby wybrany olej roślinny do rozpuszczania smugnika był dokładnie ważony za pomocą wagi analitycznej (dokładnej do 0,1 g) w butelce zawierającej stabilny śledźnik izotopowy. Na przykład, jeśli ma być przygotowana łącznie 63 mg [13°C10] octana retynylu w stężeniu 3,04 mg/mL w oleju słonecznikowym, a gęstość właściwa oleju słonecznikowego wynosi 0,92 g/mL przy temperaturze 25 °C, to do butelki zawierającej znacznik należy zważyć 19,0 g (20,7 mL x 0,92 g/mL) oleju. Chociaż końcowe stężenie stabilnego śledarza izotopowego zostanie potwierdzone za pomocą odczytu spektrofotometru, dokładne ważenie śligacza izotopowego i nałożonego oleju gwarantuje, że uzyskane stężenia będą bliskie wybranej objętości podawania dla każdej dawki.

Zaleca się stosowanie preparatów olejowych zgodnie z przewidywanym dziennym zapotrzebowaniem, aby mieć pewność, że wszystkie dawki w fiolce zostaną użyte w ciągu 2 tygodni od otwarcia fiolki. Najlepiej przechowywać preparaty olejowe na lodach w terenie podczas użycia i zamrażać je ponownie tak szybko, jak to możliwe po zakończeniu dawkowania. Chociaż preparaty olejowe nie są podatne na powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania, zawsze muszą być chronione przed światłem i zamrażane, gdy nie są używane.

Podsumowując, protokół ten szczegółowo opisuje precyzyjne przygotowanie i kontrolę jakości dawek znaczników dla metody RID, zapewniając dokładne dawkowanie, stabilność i bezpieczeństwo. Metoda oblicza wymagania dotyczące znaczników, optymalizuje rozpuszczalność w oleju roślinnym oraz weryfikuje czystość i stężenie za pomocą spektrofotometrii i HPLC. Rygorystyczne wytyczne dotyczące obsługi i przechowywania gwarantują niezawodną integralność znaczników dla dokładnych ocen opartych na izotopach.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do oświadczenia.

Podziękowania

Wsparcie dla tych działań zapewniły Fundacja Billa i Melindy Gatesów (numer projektu: OPP1115464) oraz Międzynarodowa Agencja Energii Atomowej (MAEA) w Wiedniu (Numer projektu E4.30.30).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2ml fiolki bursztynowego szkła do alicytacji dawekFisher11573690W zależności od wielkości próby i liczby ochotników podawanych codziennie, może być bardziej efektywne użycie większych, np. fiolek bursztynowych 4 ml
Kolby objętościowe 100mlFisher11323644Certyfikowana kolba objętościowa Pyrex Borosilikatowego Szkła Klasy A
Kolby objętościowe 50 mlFisher11313644Certyfikowana kolba objętościowa Pyrex Borosilikatowego Szkła Klasy A
Wagi analityczne & nbsp;Fisher13592970
Tłoki kapilarne (końcówki pipety) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
Tłoki kapilarne CP1000ST 2x91GilsonF148180
Tłoki kapilarne CP250ST 6x96GilsonF148714
Kartonowa skrzynka krio-skrzynkaStarlabA9623-8181
Hellma cuvette UV quartzSLSCEL1600
Heksan 95% n-heksan dla HPLC CertiFied HPLCFisherH/0406/17
Pokrywki na fiolki z bursztynowego szkła 2 mlFisher11573542
Microman E M1000E Pipette (dodatnia przemieszczność)GilsonFD10006
Microman E M100E Pipette (dodatnia przeporność)GilsonFD10004
Microman E M250E Pipette (dodatnia przeporność)GilsonFD10005
MikroskopNikonEclipse E400
szkiełka mikroskopowe Sigma41122601
Sonikacja kąpieli wodnejVWRUSC100T
SpektrofotometrThermo Fisher ScientificA51119600C
Stabilny izotop oznaczony jako retinyloacetatowy tracerBuchem BVNie maDla metody RID można zastosować szereg stabilnych izotopów. Lista różnych komercyjnie dostępnych izotopów znajduje się w Tabeli 1. 
Niemieszana kąpiel wodnaSLSSLS1176
Olej roślinnyW każdym sklepie spożywczymNie maWażne jest, aby używać świeżego oleju roślinnego o odpowiednim okresie przydatności do spożycia do przygotowania dawek izotopów.
Volac odtyczkowy szklany pasteur pipeta 150mmSLSPIP4150

Bibliografia

  1. Ford, J. L., et al. Use of Model-Based Compartmental Analysis and a Super-Child Design to Study Whole-Body Retinol Kinetics and Vitamin A Total Body Stores in Children from 3 Lower-Income Countries. J Nutr. 150 (2), 411-418 (2020).
  2. Haskell, M. J., Jamil, K. M., Peerson, J. M., Wahed, M. A., Brown, K. H. The paired deuterated retinol dilution technique can be used to estimate the daily vitamin A intake required to maintain a targeted whole body vitamin A pool size in men. J Nutr. 141 (3), 428-432 (2011).
  3. Lietz, G., et al. Current Capabilities and Limitations of Stable Isotope Techniques and Applied Mathematical Equations in Determining Whole-Body Vitamin A Status. Food Nutr Bull. 37, S87-S103 (2016).
  4. Pinkaew, S., et al. Triple-Fortified Rice Containing Vitamin A Reduced Marginal Vitamin A Deficiency and Increased Vitamin A Liver Stores in School-Aged Thai Children. J Nutr. 144 (4), 519-524 (2014).
  5. VMNIS: Serum retinol concentrations for determining the prevalence of vitamin A deficiency in populations. , World Health Organisation. https://www.who.int/publications/i/item/WHO-NMH-NHD-MNM-11.3 (2011).
  6. Engle-Stone, R., et al. Plasma retinol-binding protein predicts plasma retinol concentration in both infected and uninfected Cameroonian women and children. J Nutr. 141 (12), 2233-2241 (2011).
  7. Engle-Stone, R., et al. Filipino Children with High Usual Vitamin A Intakes and Exposure to Multiple Sources of Vitamin A Have Elevated Total Body Stores of Vitamin A But Do Not Show Clear Evidence of Vitamin A Toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  8. Larson, L. M., et al. Approaches to Assess Vitamin A Status in Settings of Inflammation: Biomarkers Reflecting Inflammation and Nutritional Determinants of Anemia (BRINDA) Project. Nutrients. 10 (8), (2018).
  9. Sheftel, J., Tanumihardjo, S. A. Systematic Review and Meta-Analysis of the Relative Dose-Response Tests to Assess Vitamin A Status. Adv Nutr. 12 (3), 904-941 (2021).
  10. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of Nutrition for Development (BOND)-Vitamin A Review. J Nutr. 146 (9), 1816-1848 (2016).
  11. Furr, H. C., et al. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  12. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).
  13. Green, M. H., Ford, J. L., Green, J. B. Development of a Compartmental Model to Investigate the Influence of Inflammation on Predictions of Vitamin A Total Body Stores by Retinol Isotope Dilution in Theoretical Humans. J Nutr. 151 (3), 731-741 (2021).
  14. Suri, D. J., et al. Association between Biomarkers of Inflammation and Total Liver Vitamin A Reserves Estimated by (13)C-Retinol Isotope Dilution among Preschool Children in 5 African Countries. J Nutr. 153 (13), 622-635 (2023).
  15. Furr, H. C., et al. Stable isotope dilution techniques for assessing vitamin A status and bioefficacy of provitamin A carotenoids in humans. Public Health Nutr. 8 (6), 596-607 (2005).
  16. Green, M. H., et al. A Retinol Isotope Dilution Equation Predicts Both Group and Individual Total Body Vitamin A Stores in Adults Based on Data from an Early Postdosing Blood Sample. J Nutr. 146 (10), 2137-2142 (2016).
  17. Green, M. H., et al. Use of Population-Based Compartmental Modeling and Retinol Isotope Dilution to Study Vitamin A Kinetics and Total Body Stores among Ghanaian Women of Reproductive Age. Curr Dev Nutr. 8 (11), 104484(2024).
  18. Haskell, M. J., et al. Population-based plasma kinetics of an oral dose of [2H4]retinyl acetate among preschool-aged, Peruvian children. Am J Clin Nutr. 77 (3), 681-686 (2003).
  19. Lopez-Teros, V., et al. Use of a "Super-child'' Approach to Assess the Vitamin A Equivalence of Moringa oleifera Leaves, Develop a Compartmental Model for Vitamin A Kinetics, and Estimate Vitamin A Total Body Stores in Young Mexican Children. J Nutr. 147 (12), 2356-2363 (2017).
  20. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of beta-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  21. Ribaya-Mercado, J. D., et al. Quantitative assessment of total body stores of vitamin A in adults with the use of a 3-d deuterated-retinol-dilution procedure. Am J Clin Nutr. 77 (3), 694-699 (2003).
  22. Tang, G. W., Qin, J., Hao, L. Y., Yin, S. A., Russell, R. M. Use of a short-term isotope-dilution method for determining the vitamin A status of children. Am J Clin Nutr. 76 (2), 413-418 (2002).
  23. Oxley, A., et al. Determination of Vitamin A Total Body Stores in Children from Dried Serum Spots: Application in a Low- and Middle-Income Country Community Setting. J Nutr. 151 (5), 1341-1346 (2021).
  24. Oxley, A., Lietz, G. Use of stable isotopes to study bioconversion and bioefficacy of provitamin A carotenoids. Methods Enzymol. 670, 399-422 (2022).
  25. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  26. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. Deuterium enrichment of retinol in humans determined by gas chromatography electron capture negative chemical ionization mass spectrometry. J Nutr Biochem. 9 (7), 408-414 (1998).
  27. Wang, J., et al. Vitamin A equivalence of spirulina beta-carotene in Chinese adults as assessed by using a stable-isotope reference method. Am J Clin Nutr. 87 (6), 1730-1737 (2008).
  28. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  29. Green, M. H., Lopez-Teros, V., Green, J. B. Does the Amount of Stable Isotope Dose Influence Retinol Kinetic Responses and Predictions of Vitamin A Total Body Stores by the Retinol Isotope Dilution Method in Theoretical Children and Adults. J Nutr. 152 (1), 86-93 (2022).
  30. Ribaya-Mercado, J. D., et al. Bioconversion of plant carotenoids to vitamin A in Filipino school-age children varies inversely with vitamin A status. Faseb J. 14 (4), A486-A486 (2000).
  31. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).
  32. Hemery, Y. M., et al. Influence of light exposure and oxidative status on the stability of vitamins A and D3 during the storage of fortified soybean oil. Food Chem. 184, 90-98 (2015).
  33. Shahidi, F., de Camargo, A. C. Tocopherols and Tocotrienols in Common and Emerging Dietary Sources: Occurrence, Applications, and Health Benefits. Int J Mol Sci. 17 (10), (2016).
  34. Liu, Z., Lee, H. J., Garofalo, F., Jenkins, D. J. A., El-Sohemy, A. Simultaneous Measurement of Three Tocopherols, All-trans-retinol, and Eight Carotenoids in Human Plasma by Isocratic Liquid Chromatography. J Chromatograph Sci. 49 (3), 221-227 (2011).
  35. Davies, P. S. W. Stable isotopes: their use and safety in human nutrition studies. Eur J Clin Nutr. 74 (3), 362-365 (2020).
  36. Haskell, M. J., Ribaya-Mercado, J. D. Handbook on Vitamin A Tracer Dilution Methods to Assess Status and Evaluate Intervention Programs. , Harvest Plus Technical Monographs. (2005).
  37. Han, S. H., et al. Quantitative characterization of degradation behaviors of antioxidants stabilized in lipid particles. Talanta. 71 (5), 2129-2133 (2007).
  38. Park, H., Mun, S., Kim, Y. R. UV and storage stability of retinol contained in oil-in-water nanoemulsions. Food Chem. 272, 404-410 (2019).
  39. Retinol 50C, 15D and 10S. , BASF. https://www.skinident.world/fileadmin/img/spanish-pictures/pdf/BASF_Vitamin_A.pdf (2005).
  40. Green, M. H., et al. Plasma Retinol Kinetics and beta-Carotene Bioefficacy Are Quantified by Model-Based Compartmental Analysis in Healthy Young Adults with Low Vitamin A Stores. J Nutr. 146 (10), 2129-2136 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

stabilny izotop znacznikowywzbogacenie izotopoweprzygotowanie znacznikapotwierdzenie spektrofotometryczneznakowanie deuteremznakowanie w glem 13rozpuszczanie w oleju ro linnym
Formułowanie dawek substancji śledzących witaminy A do podawania osobom z wykorzystaniem techniki rozcieńczania izotopów retinolu.
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.