Multipleksowe fluorescencyjne testy immunologiczne stają się źródłem informacji do badań serologicznych. Ich zastosowanie jest jednak ograniczone ze względu na złożoność i czasochłonne procesy sprzężenia kulki z analizą koralików. Raport ten przedstawia półautomatyczny, powtarzalny protokół multipleksowego mikrokulkowego sprzężenia kulek, który jest porównywalny ze standardową metodą, a jednocześnie znacznie skraca czas oczekiwania na uzyskanie rezultatów.
Artykuł metodologiczny
Multipleksowy test serologiczny do wykrywania odpowiedzi przeciwciał na arbowirusy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wirusy przenoszone przez stawonogi (arbowirusy) to grupa patogenów przenoszonych przez komary, które są rozpowszechnione na całym świecie. Od czasu wybuchu wirusa Zika (ZIKV) w obu Amerykach w 2016 roku, który zwrócił uwagę publiczną na te infekcje, arbowirusy nadal stanowią znaczne obciążenie dla zdrowia publicznego. Ich pojawienie się w wcześniej nieendemicznych regionach budzi obawy o zdrowie publiczne. Nadzór i kontrola zakażeń arbowirusowych jest obecnie priorytetem Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), która w 2024 roku uruchomiła globalny plan strategiczny walki z chorobami arbowirusowymi. Technologia multipleksów® zrewolucjonizowała dziedzinę nadzoru serologicznego, umożliwiając jednoczesne pomiary wielu przeciwciał przy minimalnej objętości próbki. Bazując na doświadczeniu w rozwoju multipleksowych testów serologicznych, opracowano multipleksowy test koralikowy do wykrywania przeciwciał przeciwko antygenom arbowirusowym. Test obejmuje wiele antygenów specyficznych dla powszechnych arbowirusów, w tym dengę (DENV), żółtą febrę (YFV), wirusy Zika oraz chikungunya (CHIKV). Zastosowano półautomatyczną metodę kowalencyjnego wiązania antygenów z kulkami mikrosfery. Ten nowy protokół jest bardzo skuteczny, umożliwiając sprzężenie do 96 antygenów w jednym eksperymencie, zapewniając jednocześnie powtarzalne wyniki. Dane o medianie intensywności fluorescencji (MFI) zostały zebrane za pomocą przyjaznego dla użytkownika systemu obrazowania fluorescencji. Stosowany do próbek surowicy ludzkiej z krajów endemicznych, przewidujemy, że ten test stanie się potężnym narzędziem do działań seroinseryzjologicznych.
Wprowadzenie
Arbowirusy łącznie odpowiadają za tysiące zgonów każdego roku. Wirusy te są przenoszone na ludzi przez zainfekowane stawonogi, głównie komary i kleszcze. Nasilenie zakażeń arbowirusowych jest zróżnicowane i waha się od bezobjawowych infekcji po ciężkie choroby, które mogą prowadzić do śmierci. W 2024 roku Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) odnotowała ponad 10 000 zgonów spowodowanych przez cztery serotypy samego wirusa dengi (DENV). W tym samym roku wirus zaraził ponad 14 milionów osób, w tym 50 000 ciężkich przypadków1. Chociaż DENV jest najbardziej widocznym arbowirusem, grupa ta obejmuje inne zagrażające życiu patogeny, które były odpowiedzialne za liczne epidemie na całym świecie. Niedawny przegląd zakażeń arbowirusowymi w Afryce wykazał, że te wirusy, w tym DENV, wirus żółtej febry (YFV), wirus chikungunya (CHIKV), wirus gorączki krwotocznej Krym-Kongo (CCHFV), wirus gorączki Rift Valley (RVFV), wirus Zachodniego Nilu (WNV) oraz wirus Zika (ZIKV), spowodowały co najmniej 29 ognisk na kontynencie w 2023roku. W 2022 roku raport opublikowany przez Regionalne Biuro WHO dla Afryki podkreślił obecne ograniczenia nadzoru arbowirusów w regionie, podkreślając pilną potrzebę opracowania metod nadzoru i kontroli arbowirusów3.
Kliniczna diagnoza zakażeń arbowirusowych jest trudna ze względu na podobieństwa objawów, takie jak gorączka, zapalenie stawów i ogólne złe samopoczucie, które są typowe dla innych patogenów występujących w regionach endemicznych4. Ponadto, ze względu na współkrążenie i potencjalne współzakażenie wirusów, trudno jest rozróżnić patogen etiologiczny5. Potwierdzenie laboratoryjne jest kluczowe dla diagnozy różnicowej. Istnieje kilka metod wykrywania arborwirusów w próbkach ludzkich. Metody bezpośrednie, w tym testy diagnostyczne molekularne, wykrywanie antygenów wirusowych oraz izolacja wirusa, wykrywają obecność patogenu, podczas gdy metody pośrednie, takie jak diagnostyka serologiczna, mierzą odpowiedź immunologiczną na infekcję wirusową6.
Opracowano wiele metod wykrywania odpowiedzi przeciwciał na arbowirusy. Należą do nich enzymatyczne testy immunosorbentne (ELISA), utrwalanie dopełnienia, hamowanie hemaglutynacji oraz mikrosferowe testy immunotestowe 6,7. Raport przedstawia multipleksowy fluorescencyjny mikrosferowy immunotest (FMIA) do wykrywania odpowiedzi przeciwciał na antygeny arbowirusowe. Testy oparte na mikrosferze8 są szeroko stosowane w serologii i oferują kilka zalet, z których najważniejsza jest możliwość wykrywania wielu analitów w jednej reakcji przy minimalnej objętości próbki. Mikrosfery kodowane optycznie (magnetyczne kulki polistyrenowe) pokryte rekombinowanymi antygenami są wykorzystywane w pośrednim seologicznym immunoasedzie. Następnie sprzężone kulki są inkubowane z próbkami, a przeciwciała antygenowo-specyficzne wykrywane są za pomocą przeciwciała przeciwdziałającego IgG przeciwdziałającego ludziom, sprzężonego z raportującym fluoroforem Phycoerythrin (PE). Dostępnych jest kilka analizatorów do wykrywania emitowanej fluorescencji, która jest określana jako MFI.
Zasada testu została szczegółowo opisana w artykule Angeloni i in.8. Krótko mówiąc, antygeny zainteresowania są chemicznie związane z mikrosferami oznaczonymi kolorami. W tym celu kulki początkowo traktowane są karbodiamidem 1-etylo-3-[3-dimetylaminopropylowym] karbodiamidem (EDC) oraz N-hydroksysulfosukcynimidem (sulfo-NHS), które aktywują grupę karboksylową na powierzchni kulek, tworząc związek reaktywny na aminy. Ten pośredni półstabilny związek jest następnie mieszany z interesującym się białkiem, dzięki czemu części aminowe białka są kowalencyjnie związane z kulkami, tworząc stabilne mikrokulki pokryte interesującym białkiem na powierzchni. Koraliki związane z antygenem są inkubowane z próbkami, co pozwala przeciwciałam wiązać się z konkretnymi antygenami. Przeciwciała związane z antygenem wykrywa się za pomocą przeciwciał przeciwnowych, które są sprzężone z barwnikiem fluorescencyjnym. Używamy przeciwciał wtórnych z oznakowaniem PE. MFI są mierzone za pomocą obrazowania światła (szczegóły instrumentu podano w Tabeli Materiałów). Instrument wykorzystuje dwie diody LED, czerwoną diodę LED i zieloną diodę LED, które osobno pobudzają wewnętrzne barwniki koralików oraz fluorescencję reporterową na powierzchni kulek9. Następnie filtry są używane do klasyfikacji kulek na podstawie koloru oraz do ilościowego określenia fluorescencji emitowanej przez anality.
Wcześniej stosowaliśmy technologię wykrywania odpowiedzi przeciwciał na SARS-CoV-210 oraz choroby zapobiegające szczepionką11 i wykazaliśmy, że testy multipleksowe stanowią nieocenione narzędzie do badań seroprewalencji i nadzoru. Celem tego projektu jest rozszerzenie zastosowania FMIA na wykrywanie odpowiedzi przeciwciał na wiele antygenów należących do arbowirusów, z zamiarem zastosowania testu na próbkach z regionu afrykańskiego.
Testy multipleksowe arbowirusów z wykorzystaniem technologii multipleksowej zostały opisane w innych miejscach z wykorzystaniem różnych celów antygenowych, takich jak niestrukturalne białko 1 (NS1)12,13 lub domena otoczkowa III (EDIII)14. Przedstawiono test 50-plexowy, obejmujący 26 antygenów arbowirusowych (w tym NS1, EDIII, cząstki podobne do wirusa (VLP) oraz wiele innych antygenów do testowania patogenów współkrążących w tym regionie). Test pozwoli na ocenę intensywności transmisji tych patogenów. Podsumowanie antygenów rekombinowanych użytych do opracowania testu znajduje się w Tabeli 1. Protokół przedstawiony w tym raporcie został opracowany jako uzupełnienie szeroko zakrojonego badania metody, skupionego na optymalizacji wykrywania arbowirusów.
Zazwyczaj sprzężenie (lub fiksacja) antygenów z kulkami mikrosfery odbywa się w pojedynczych rurkach8 (sprzężenie ręczne). Proces ten jest czasochłonny, uciążliwy i podatny na błędy powtarzalności. W tym artykule opisano protokół wykorzystujący zautomatyzowane urządzenie do wykonywania kolejnych etapów związanych z chemicznym wiązaniem antygenów z kulkami. W tym manuskrypcie przedstawiamy kroki podjęte w celu weryfikacji nowego protokołu. Walidacja nowego protokołu została przeprowadzona poprzez porównanie odpowiedzi IgG zmierzonych z 50-plex FMIA, używając kulek sprzężonych z antygenem, przygotowanych metodą ręczną lub protokołem automatycznym. Dalszą walidację metody przeprowadzono poprzez analizę próbek surowicy ludzkiej z kohort afrykańskich i francuskich.
Automatyczny protokół sprzężenia kulek jest szybki, umożliwiając jednoczesne sprzężenie do 96 analitów w jednym przebiegu. Co ważniejsze, wyniki są porównywalne z tymi uzyskanymi przy użyciu ustalonego protokołu ręcznego, z mniejszą zmiennością między partiami.
Protokół
Uzyskano odpowiednie zatwierdzenie etyczne dla wykorzystania próbek ludzkich. Próbki były anonimowymi pozostałościami z wcześniejszych badań. Protokół stosowania próbek ORPAL z "standardowej puli" został zatwierdzony przez Narodową Radę Etyki Surinamu (CMWO (Commissie voor Mensgebonden Wetenschappelijk Onderzoek), Opinia nr VG 25-17). Wykorzystanie próbek z Madagaskaru zostało zatwierdzone w ramach projektu PvSTATEM przez Komitet Etyki London School of Hygiene & Tropical Medicine (28541) oraz Madagaskar Comité d'Éthique de la Recherche Biomédicale (135MSANP/SG/AMM/CERBM), natomiast użycie próbek senegalskich zostało zatwierdzone w ramach trwającego projektu Dielmo i Ndiop przez Senegalski Narodowy Komitet Etyki Badań Zdrowotnych (CNERS Sénégal). Zezwolenie na pomiar przeciwciał przeciwko NTD w tych próbkach uzyskało CNERS Sénégal (N 00000007 MSAS/CNERS/Sec). Próbki nieendemiczne francuskie pochodziły z rutynowych badań medycznych w laboratoriach szpitalnych i przetwarzane zgodnie z obowiązującymi przepisami i wytycznymi Komisji Ochrony Danych Francuskiej (Commission Nationale de l'Informatique et des Libertes). Próbki surowicy u ludzi pobrano od osób z regionów o wysokiej częstości występowania arbowirusów oraz od naiwnej populacji francuskiej. Próbki surowicy zostały inaktywowane termicznie przed użyciem przez inkubację w temperaturze 56 °C przez 30 minut. Jeśli próbki nie są dezaktywowane, należy je przesunąć pod szafkę bezpieczeństwa. Większość antygenów rekombinowanych była pozyskiwana komercyjnie, z wyjątkiem białek rekombinowanych EDIII, które były syntetyzowane na miejscu. Do pozyskiwania danych użyto analizatoraopartego na obrazowaniu 9. Odczynniki i używany sprzęt są przedstawione w Tabeli Materiałów.
1. Określenie optymalnych stężeń antygenów do sprzężenia
UWAGA: Aby zapobiec fotobieleniu, minimalizuj ekspozycję kulek mikrosfery na światło podczas całego zabiegu. Przed sprzężeniem objętym optymalizuj stężenia sprzężenia dla każdego antygenu za pomocą ręcznego protokołu sprzężenia. Protokół został zaadaptowany na podstawie Angeloni i in.8. Bufory i rozwiązania są szczegółowo opisane w Tabeli Uzupełniającej 1.
- Wybierz obszary kulek do sprzężenia. Dokładnie wiruj przez 20 sekund. Sonikuj rurkę przez minimum 60 sekund.
- Przenieś 200 μL (2,5 M) kulek do rurki o pojemności 1,5 mL.
- Umyć kulki 200 μL 100 mM monozasadowego fosforanu sodu/0,125x tryton.
- Umieść rurkę na separatorze rurki magnetycznej na 60 sekund. Ostrożnie usuń supernatant, nie dotykając koralików.
- Dodaj bufor monozasadowy fosforanu sodu. Zostaw na magnetycznym stojaku przez 60 sekund. Usuń supernatant.
- Aktywuj kulki buforem zawierającym 80 μL 100 mM monozasadowego fosforanu sodu, 0,125x tritonu, 10 μL sulfo-NHS oraz 10 μL EDC.
- Dodaj monozasadowy fosforan sodu -sulfo-NHS -EDC do rurek. Inkubuj w ciemności przez 20 minut w temperaturze pokojowej na rolku.
- Płucz kulki w 250 μL PBS (1x) i 0,125x Triton. Powtarzaj pranie trzy razy.
- Związać antygeny.
- Przygotuj różne stężenia (rozcieńczenia seryjne) antygenów w całkowitej objętości 1 mL, 1x PBS i 0,125x triton. Zbadaj co najmniej dwa stężenia antygenów.
- Dodaj roztwory antygenowe do aktywowanych kulek. Inkubuj w ciemności 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C na rolce.
- Sprzężone koraliki myj w 500 μL PBS-TBN i 0,125x Triton. Powtórz mycie trzy razy.
- Ponownie zawiesić sprzężone kulki w 1 mL PBS-TBN i 0,125x Triton.
UWAGA: Przechowuj sprzężone koraliki w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny przed użyciem. Sprzężone kulki wykazywały zmienność MFI podczas testów bezpośrednio po sprzężeniu w porównaniu do testów po 24 godzinach. - Wybierz optymalne stężenie do wykorzystania w kolejnych wielkoskalowych sprzężeniach. Do immunotestu na standardowej puli używaj różnych sprzężonych kulek. Wybierz najniższe stężenie, przy którym uzyskano liniową krzywą standardową.
UWAGA: Przykład liniowości odpowiedzi przeciwciał na standardową pulę przedstawiono w sekcji wyników, Rysunek 1.
2. Duże automatyczne łączenie kulek
- Przygotuj Pro Magnetic COOH koraliki.
- Oblicz wymagane kulki: Używając 500 koralików na próbkę, 2,5 miliona koralików wystarcza na 5000 próbek.
- Przygotuj obszary kulek do sprzęgania zgodnie z opisaną wcześniej.
- Przenieś pożądaną objętość kulek do przydzielonych studni. Do 2,5 miliona zastosowano 200 μL koralików (standardowe stężenie Luminex to 1,25e7 koralików/mL).
- Przygotuj antygeny. To kluczowy krok, aby zapewnić dokładne ilości antygenów.
- Oblicz ilości wymaganego antygenu po optymalizacji. Stężenia stosowane dla każdego antygenu są szczegółowo opisane w Tabeli 1.
- W probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL dokładnie wymieszaj odpowiednią objętość interesujących się antygenów z 1x PBS / 0,125x Triton, co daje łącznie 1 mL.
- Przygotuj talerze z odczynnikami. Przygotuj płyty na 96 głębokości w wykonanie otworów w następujący sposób. Wolumeny są na odwiert i obliczane dla sprzężenia 2,5 miliona kulek.
- Płytka 1 (grzebienie na końcówkach): ładuj grzebienie do końcówek.
- Tablica 2 (Koraliki): Dodaj 8 μL 0,125x Triton oraz 200 μL obszarów zainteresowania kulkami.
- Płytka 3 (Wash1): Dodaj 200 μL 100 mM monozasadowego fosforanu sodu / 0,125x tryton.
- Płytka 4 (aktywacja): Dodaj 80 μL 100 mM monozasadowego fosforanu sodu / 0,125x triton + 10 μL sulfo-NHS + 10 μL EDC.
- Tablica 5 (Wash2): Dodaj 250 μL 1x PBS / 0,125x tryton.
- Płytka 6 (sprzężenie): Przelej 1 mL roztworu antygenu do przydzielonego dołka.
- Tablica 7 (Wash3): Dodaj 500 μL PBS-TBN/0,125x Triton.
- Płyta 8 (Ostatnia płytka, zawiera sprzężone koraliki): Dodaj 1 mL PBS-TBN + 0,125x Triton.
- Cykl sprzężenia ustaw w zautomatyzowanym procesorze.
- Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby włączyć urządzenie i skonfigurować protokół. Niezbędne oprogramowanie można pobrać na PC15. Parametry specyficzne dla serii są szczegółowo opisane w Tabeli Uzupełniającej 2.
- Załaduj płytki do wyznaczonego slotu w maszynie. Wybierz protokół. Rozpocznij ten cykl. Szacowany czas ukończenia programu to 2:50.
- Koniec cyklu
- Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby wyłączyć urządzenie. Rozładujcie talerze zgodnie z instrukcją. Sprawdź wzrokowo, czy na tablicy 8 znajdują się koraliki (brązowy pellet). Dodatkowo z instrumentów eksportowany jest raport z runów.
- Przenieś sprzężone kulki z płyty 8 do pojedynczych rurek 1,5 mL do przechowywania. Przechowywać sprzężone koraliki w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
- Policz koraliki.
UWAGA: Użyto licznika komórek. Do ręcznego liczenia za pomocą hemacytometru zapoznaj się z podręcznikiem kucharskim Luminex8.- Dokładnie wirujące koraliki sprzężone. Przelej 10 μL do komory liczącej komórki. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby odczytać liczbę kulek na mL.
- Sprawdź agregację, wizualizując obraz na liczniku komórek. Zobacz Ilustracyjny obraz nieagregowanych koralików na Rysunku Uzupełniającym 1 .
- Jeśli są obecne agregaty, dokładnie przeszukaj wiry i sonikuj przez co najmniej 5 minut. Powtarzanie liczenia
UWAGA: Po liczeniu kulek oceniono efektywność sprzężenia poprzez przeprowadzenie immunotestu sprzężonych kulek na standardowej puli w celu oceny liniowości odpowiedzi przeciwciał.
Tabela 1: Panel antygenów zawartych w 50-plexie. Test obejmuje wiele antygenów do wykrywania infekcji arbowirusowych oraz współkrążących patogenów. Podawane są ilości antygenów użytych do sprzężenia 1,25 miliona koralików. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.
3. Multipleksowy immunotest
UWAGA: Szczegółowe kroki protokołu pomiaru MFI znajdują się w odpowiednim podręczniku9. Aby zminimalizować ekspozycję koralików na światło i ryzyko fotobielenia, wszystkie roztwory i próbki są przygotowywane przed wyjęciem koralików z lodówki.
- Ustaw układ tablic. Stosowano płyty z 96 dołkami, które zawierały seryjne rozcieńczenia standardowego puli oraz pusty (tylko bufor) w pierwszym rzędzie.
- Próbki rozcieńczone i standardowane w buforze PBT na osobnej, niewiążącej płycie. Dla próbek zastosowano rozcieńczenie 1:200 (końcowe stężenie 1:400). Dla krzywej standardowej zastosowano rozcieńczenie 1:50 standardowej puli surowicy (co dało końcowe stężenie 1:100) oraz dziesięć dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych.
- Określ ilość sprzężonych kulek do wykorzystania w całkowitej objętości 50 μL/dołek. Używano 500 kulek z każdej kulki na dołek i dostosowano do objętości za pomocą bufora PBT.
- Dokładnie przeszukaj wiry, sprzężone koraliki mieszają się przez 30 sekund. Sonikat przez co najmniej 60 sekund.
- Oblicz objętość każdej sprzężonej kulki, aby dodać ją do mieszanki multipleksowej, aby zapewnić równą ilość kulek dla każdego analitu. Objętości koralików obliczano następująco: Objętość koralików na studnię = liczba koralików na dołek/liczbę koralików.
UWAGA: Przykład obliczania kulek i objętości buforu niezbędnych dla premixu przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej 3. - Przenieś odpowiednie objętości antygenu kulek do rurki wirówki.
- Dostosuj głośność za pomocą PBT.
- Dokładnie wymieszaj gotowy miks.
- Rozprowadz 50 μL mieszanki na mikropłytę obrazującą (np. ps, płyty f-bottom).
- Dodaj 50 μL rozcieńczonych próbek do kulek.
- Mieszaj na posypce przez 30 minut w temperaturze pokojowej, 700 obr./min.
- Myj talerze trzy razy w następujący sposób (myj ręcznie).
- Umieść płytkę na magnetycznej stojaku na 60 sekund w temperaturze pokojowej. Trzymaj płytkę mocno na stojaku i wyrzucaj supernatant.
- Dodaj 100 μL bufora PBT. Zostaw na magnetycznym stojaku przez 60 sekund. Powtarzaj prania
UWAGA: Alternatywnie można użyć podkładkipłytowej 16 . Pralka była ustawiona następująco: 1 cykl moczenia, następnie 3 cykle (aspiracja, dozowanie i możenie) oraz ostatni cykl aspiracji.
- Odrzuć supernatant i dodać 50 μL rozcieńczonego przeciwciała wtórnego.
- Postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy i przygotowuj zapasowy roztwór przeciwciała wtórnego. Zastosowano roztwór rozcieńczający przeciwciała wtórnego o stężeniu 1/120. Objętość przeciwciał wtórnych obliczono następująco: objętość przeciwciał wtórnych = całkowita objętość/współczynnik rozcieńczenia.
- Zmieszaj przeciwciało wtórne z odpowiednią objętością buforu PBT. Dokładnie wymieszaj. Dodaj 50 μL rozcieńczonego przeciwciała wtórnego do umytych kulek.
- Inkubuj na shakerze przez 15 minut w temperaturze pokojowej, 700 obr./min.
- Wykonaj trzy mycia zgodnie z opisaniem wcześniej.
- Ponownie zawiesij kulki w buforze PBT 150 μL.
- Inkubuj na shakerze przez 5 minut w temperaturze pokojowej, 700 obr./min. Stosuj się do instrukcji producenta, aby ustawić przyrządy9.
UWAGA: Użyto oprogramowania xPONENT17 dołączonego do instrumentu obrazujących. Ustawienia dla odczytu fluorescencji zostały ustawione następująco: objętość zbierania została ustawiona na 50 μL, z minimalnym pomiarem 50 kulek, bez podgrzewacza XY i bez typu analizy.
4. Analiza danych
- Walidacja uruchomienia
- Sprawdź, czy osiągnięto minimalną liczbę kulek. Zaleca się co najmniej 35 kulek na odwiert, aby uzyskać statystycznie ważny MFI8.
- Sprawdzenie pustych i negatywnych wartości MFI są minimalne.
- Sprawdź wartości MFI dla standardów, rysując krzywą standardową. Są one wyższe niż w próbce kontroli pustej i/lub ujemnej.
- Analiza danych próbnych
- Eksportuj dane jako pliki CSV i analizuj je zewnętrznie za pomocą oprogramowania R.
Wyniki
Aby zilustrować proces walidacji protokołu, wybraliśmy trzy antygeny reprezentujące trzy rodziny arbowirusów: flawiwirusy (białko DENV1 NS1), alfawirusy (białko CHIKV VLP) oraz bunyawirusy (RVFV NP). Antygeny testowano na standardowej puli populacji przedeksponowanej (ORPAL), serumy populacji francuskiej (nienarżonej) oraz dwóch kohort z Afryki (Senegal i Madagaskar).
Liniowość rozcieńczenia odpowiedzi przeciwciał
Stężenie antygenów przeznaczonych do sprzężenia kulek zostało określone za pomocą szeregowych rozcieńczeń puli ORPAL. Optimum stężenia zostało wybrane jako najniższe stężenie, przy którym uzyskano liniową krzywą standardową (dane nie pokazano). Rysunek 1 pokazuje liniowość wybranych antygenów arbowirusowych w optymalnym stężeniu dla każdego antygenu. Dla kontroli jakości sprzężenia każda partia sprzężonych kulek była testowana pod kątem liniowości rozcieńczenia na standardowej puli ORPAL, używając wcześniej wybranego stężenia.
Porównywalność ze standardowym testem ręcznego sprzężenia
Aby ocenić porównywalność danych uzyskanych za pomocą nowego protokołu automatycznego z dobrze ugruntowanym sprzężeniem ręcznym, porównaliśmy standardowe krzywe uzyskane na podstawie wyników sprzężeń ręcznych i automatycznych. Rysunek 2 pokazuje równoległą liniowość obu testów. Wartości MFI różnią się w zależności od antygenu.
Wariant partii sprzęgania kulek
Różnica w partii sprzężenia, ponieważ oceniano powtarzalność testów z tej samej partii sprzężenia, oceniano na podstawie wykresu Levey-Jennings18. Reprezentatywne antygeny oraz kulki sprzężone przez kontrolę BSA zostały użyte i przetestowane na puli standardów ORPAL. Rysunek 3 pokazuje MFI z 19 różnych płytek, testowanych w różne dni dla każdego antygenu. Powstałe MFI mieszczą się w zakresie średniej ± 3 SD dla trzech antygenów i kontroli.
Wpływ multipleksowania na MFI
Aby dokładniej ocenić skuteczność testu, sprawdziliśmy, czy multipleksowanie kilku antygenów wpływa na zmierzoną odpowiedź przeciwciał. Odpowiedź porównano z pojedynczym antygenem (lub pojedynczym kulką plexu) przy użyciu standardowej puli ORPAL. Rysunek 4 pokazuje silną korelację (R = 0,99, s. < 2,2e-16) między wynikami uzyskanymi, gdy MFI były mierzone na pojedynczych antygenach lub na mieszance zawierającej 50 antygenów.
Odpowiedzi przeciwciał z próbek surowicy ludzkiej w populacjach afrykańskich
Aby ocenić zastosowanie testu do próbek z różnych kohort, porównaliśmy odpowiedzi przeciwciał w próbkach surowicy ludzkiej z populacji afrykańskich, które mają wysokie prawdopodobieństwo narażenia na arbowirusy, z odpowiedziami z kohorty francuskiej, która prawdopodobnie ma niższą ekspozycję na te wirusy. Łącznie przebadano 1 596 próbek dla Madagaskaru, 1 428 dla Senegalu oraz 84 dla kohorty francuskiej. Rysunek 5 przedstawia wykresy gęstości dla różnych kohort. W kohorcie senegalskiej zaobserwowano wyraźny rozkład dwumodalny dla odpowiedzi na CHIKV VLP, co sugeruje dwie odrębne odpowiedzi na CHIKV w populacji. Subtelny ogon bimodalny obserwuje się również u DENV1 NS1 i RVFV NP w kohorcie senegalskiej, podczas gdy nie ma różnicy między kohortą francuską a madagaskarską.
Rysunek 1: Liniowość odpowiedzi przeciwciał testowana na standardowej puli ORPAL. Wybrane antygeny arbowirusowe pokazano jako przykład. Mediana intensywności fluorescencji (MFI) jest pokazana na osi y (skala logarytmiczna), a szeregowe rozcieńczenie standardowej puli na osi x. Wszystkie antygeny w panelu zostały wstępnie przetestowane w standardowej puli przed testami masowymi na próbkach. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 2: Równoległa liniowość odpowiedzi przeciwciał za pomocą metod sprzężenia. Log MFI (oś y) reprezentatywnych antygenów (faset) testowany na seryjnych rozcieńczeniach puli standardowej ORPAL (oś x). Kolory reprezentują różne metody sprzężenia: automatyzację (czerwony, zielony, niebieski) oraz manualną (fioletowy). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 3: Różnice między płytami. Levey_Jennings wykresy dla BSA sprzężonej kulki (kontrola), DENV1 NS1, CHIKV VLP i RVFV są pokazane dla standardowej puli ORPAL w stężeniu 1:400. Wyniki obejmują 19 tablic uruchamianych w różne dni. MFI są prezentowane na osi y, liczba testów jest na osi x. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 4: Korelacja odpowiedzi przeciwciał z testem mono i multipleks . Standardowa pula została rozcieńczona w końcowym stężeniu 1:400 i przetestowana na mieszance zawierającej antygeny 50-plex równolegle z pojedynczymi kulkami pokrytymi antygenami. Do analizy zastosowano korelację Pearsona. Na przykład pokazano trzy reprezentatywne antygeny. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 5: Zastosowanie testu na kohorcie endemicznej i nieendemicznej. Test testowano na próbkach z Madagaskaru (zielony), Senegalu (niebieski) i Francji (czerwony). Próbki rozcieńczono w końcowym stężeniu 1:400. Oś X reprezentuje znormalizowane MFI (nMFI), obliczane jako stosunek MFI próby do standardowej puli MFI przy tym samym stężeniu (1:400). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Ilustracja uzupełniająca 1: Przykładowy obraz agregacji koralików. Panel (A) pokazuje koraliki nieagregowane, a panel (B) agregaty koralików. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 1: Tabela buforów. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 2: Ustawienia protokołu sprzężenia kulek KingFisher Apex. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 3: Przykład obliczania objętości kulek dla mieszanki wstępnej. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Stosowanie FMIA zmieniło krajobraz badań serologicznych. Siłą testów jest możliwość oceny odpowiedzi przeciwciał na wiele antygenów w jednej reakcji, co skraca czas do uzyskania wyników i obniża koszty testowania. Jest to szczególnie ważne w nadzorze serologicznym. Rutynowe stosowanie testów FMIA jest jednak utrudnione przez pracochłonny, czasochłonny ręczny etap łączenia kulek, który wymaga obsługi pojedynczych antygenów na reakcję. Niniejszy raport przedstawia zautomatyzowaną metodę chemicznego sprzężenia antygenów z koralikami. Automatyzacja umożliwia jednoczesne sprzężenie do 96 antygenów w jednym przebiegu, znacznie skracając czas potrzebny na wysokoprzepustowe sprzężenie antygenów.
Rysunek 1 pokazuje, że antygeny zostały pomyślnie związane z koralikami. Wyniki pokazują również silną równoległość między nowym protokołem automatycznym a dobrze ugruntowanym protokołem ręcznym (Rysunek 2), co wskazuje na nieniższą dokładność wykrywania odpowiedzi IgG na oceniane antygeny. Wyniki zmian partii płyta do płyty (Rysunek 3) oraz sprzęgania kulek (Rysunek 2) pokazują porównywalność danych przy użyciu zautomatyzowanej metody sprzężenia. Wysoka korelacja między multipleksowymi a singleplex MFI (Rysunek 4) pokazuje, że multipleksowanie dużej liczby antygenów nie wpływa na odpowiedź przeciwciał na zestaw pojedynczych antygenów użytych w tym badaniu.
Do walidacji testu testowano próbki zarówno z kohort endemicznych, jak i nieendemicznych (Rysunek 5). Chociaż badania seroprewalencji arbowirusów są wciąż rzadkie w Afryce, dostępne dane 19,20,21,22 sugerują zniuansowany obraz z zmiennymi seroprewalencjami IgG pomiędzy i w obrębie poszczególnych krajów. Co istotne, istniejące dane sugerują wyższą częstość występowania trzech wirusów (chikungunya, denga i Rift Valley) w Senegalu w porównaniu do Madagaskaru, na przykład19. Te częstości występowania są zgodne z obserwacją zawartą w tym raporcie, która wykazała wyraźną, wyraźną odpowiedź na różne antygeny w Senegalu w porównaniu z innymi kohortami. To potwierdza zdolność testu do rozróżniania profili przeciwciał w kontekście stosunkowo wysokiej seroprewalencji. Dane obserwowane dla kohorty madagaskarskiej można wyjaśnić zgłoszoną niską częstością występowania wirusów w miejscu pobrania próbek22, podczas gdy porównywalność danych z kohortą nieendemicznym można częściowo wyjaśnić małą próbą kohorty francuskiej. Dodatkowo, zgłaszana zmienność między regionami może tłumaczyć różnice obserwowane w zbiorach danych. Konieczne jest szeroko zakrojone badanie oceny seroprewalencji IgG; jednak dane przedstawione w tym raporcie pokazują, że opracowany test jest specyficzny do wykrywania odpowiedzi IgG na oceniane antygeny arbowirusowe, rozróżniając dane z regionów endemicznych oraz subtelne, odrębne odpowiedzi w obrębie tej samej populacji.
Kluczowe wyzwania techniczne obejmowały osiągnięcie jednorodnych roztworów antygenowych mimo ich użycia w bardzo małych ilościach, zapewnienie równomolowej reprezentacji obszarów kulek w premixie oraz minimalizację agregacji koralików. Aby przezwyciężyć trudności w uzyskaniu jednorodnego roztworu na płycie 96-dołkowej, wprowadzono krok, w którym wszystkie roztwory antygenowe były dokładnie wymieszane w probówce o pojemności 1,5 mL przed rozprowadzeniem do płyty. Dodatkowo dodano krok do liczenia sprzężonych koralików i regulacji objętości, aby zapewnić równą liczbę obszarów kulek do premixu. Wprowadzono także etap sonifikacji, aby ułatwić mieszanie kulek i zminimalizować agregację w premixie.
W tym ograniczonym badaniu nie oceniono stabilności sprzężonych kulek i ich wpływu na wydajność testu, ponieważ wszystkie próbki zostały przebadane w ciągu miesiąca od połączenia koralików. Ta ocena wykraczała poza zakres tego raportu i zostanie oceniona w przyszłych badaniach. Pomimo tych ograniczeń, raport przedstawia szybką i wiarygodną metodę wykrywania odpowiedzi przeciwciał na różne patogeny, w tym na arbowirusy. Serologiczny nadzór nad zakażeniami arbowirusowymi jest kluczowy dla kontroli chorób, a dostępność powtarzalnej, szybkiej metody wykrywania odpowiedzi przeciwciał na te wirusy stanowi znaczący postęp w globalnych wysiłkach mających na celu ocenę heterogeniczności transmisji i celowanych interwencji mających na celu ograniczenie obciążenia tymi infekcjami. Ponadto, choć ten raport koncentruje się na arbowirusach, protokół ten jest szeroko stosowany w szerokim zakresie antygenów i stanowi znaczący postęp w tej dziedzinie.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy serdecznie dziękują uczestnikom badania oraz pracownikom zdrowia społeczności w każdym z miejsc badania. Z wdzięcznością dziękujemy również całemu personelowi laboratoriów i terenowym za ich zaangażowanie w zbieranie próbek, pozyskiwanie danych i analizy laboratoryjne. Prace te zostały poparte grantem Reconstructing the transmission intensity of arboviruses across Africa and the impact of intervention in a changing climate (xSTAR) od Wellcome Trust [228185/Z/23/Z]. W celu otwartego dostępu autorzy zastosowali publiczną licencję CC BY na każdą wersję rękopisu akceptowanego przez autora wynikającą z tego zgłoszenia. Dziękujemy również następującym za zgodę na wykorzystanie próbek: Rob Van Der Pluijm (Epidemiologia i Analityka Chorób Zakaźnych, Institut Pasteur, Paryż) oraz Maylis Douine i Alice Sanna (Centre d'Investigation Clinique Antilles-Guyane, Centre Hospitalier de Cayenne, Cayenne).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL | - | Ogólne materiały laboratoryjne | |
| Jednostki filtracyjne 1000 mL 0,2 um | Thermo fisher Scientific | 567-0020 | |
| 25 mL zbiorników | Termonaukowe | 95128095 | |
| 50 mLFalcon lamp | - | Ogólne materiały laboratoryjne | |
| 96 płyt głębokich studni - KingFisher DW | Termonaukowe | 10373480 | |
| Automatyczna myjka płyt (opcjonalnie) | TECAN | Podkładka mikropłytowa HydroFlex Plus | |
| B krztusiec FHA | Rodzimy antygen & nbsp; | BP-FHA-50 | |
| Równowaga | - | Ogólny sprzęt laboratoryjny | |
| Wirówka stołowa | - | Ogólny sprzęt laboratoryjny | |
| BioPlex Pro Magnetic COOH Beads | Luminex | MC10xxx (x=obszar koralików) | |
| Albumina surowicy wołowej, BSA | Sigma | A7906 | |
| Branson Ultrasonics Bransonic Ultrasonics Ultrasonics Ultrasonic Ultrasonic Ultracleaner, model B200 | Fisher Scientific | 15-337-22 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| CCHF GP | Antygen natywny | REC31639-100 | |
| Licznik komórek/Hemacytometr | Biorad/Merck | TC20 /Z359629 | |
| CHIKV E2 | Antygen natywny | REC31617-100 | |
| CHIKV VLP | Antygen natywny | CHIKV-VLP-100 | |
| Przezroczyste płytki immuno-niesterylne z płaskim dnem na 96 dołków | Termonaukowe | 3455 | |
| CMV-cząstki | Antygen natywny | CMV-HP-100 | |
| Liczenie preparatów, dwukomorowe liczniki komórek i nie liczą komórek; | Biorad | L003662 A | |
| cp23 | Antygen natywny | Prot produkcji | |
| CT694 | Antygen natywny | Prot produkcji | |
| CtxB | |||
| DENV1 EDIII + SNAP | Produkcja wewnętrzna | - | |
| DENV1 NS1 | Antygen natywny | DENV1-NS1-100 | |
| DENV1 VLP | Antygen natywny | DENVX4-VLP-100 | |
| DENV2 EDIII + SNAP | Produkcja wewnętrzna | - | |
| DENV2 NS1 | Antygen natywny | DENV2-NS1-100 | |
| DENV2 VLP | Antygen natywny | DENVX4-VLP-100 | |
| DENV3 EDIII + SNAP | Produkcja wewnętrzna | - | |
| DENV3 NS1 | Antygen natywny | DENV3-NS1-100 | |
| DENV3 VLP | Antygen natywny | DENVX4-VLP-100 | |
| DENV4 EDIII + SNAP | Produkcja wewnętrzna | - | |
| DENV4 NS1 | Antygen natywny | DENV4-NS1-100 | |
| DENV4 VLP | Antygen natywny | DENVX4-VLP-100 | |
| dyfteria Tox | Rodzimy antygen & nbsp; | DIP-TNL-100 | |
| EBV-GP125 | Antygen natywny | REC31601-100 | |
| EDC | Sigma | 03449 | |
| Etanol 100% | - | Ogólne laboratorium | |
| Uszczelnienie foliowe aluminiowe, niesterylne | - | Ogólne | |
| Instrument do obrazowania fluorescencyjnego – System MAGPIX | Luminex | MAGPIX-XPON4.1-CEIVD | |
| Ręczny magnes do płyt – magnetyczny separator 96-dołkowy | Luminex | CN-0269-01 | |
| hev-ORF2 | Rodzimy antygen & nbsp; | REC31653-100 | |
| Inaba OSP | Boston_MGH | - | |
| Grzebień Kingfisher DeepWell z końcówką 96 dołków | Termonaukowe | 17170069 | |
| Leishmania K28 | Naukowości kliniczne | MBS3040095 | |
| Zestaw kalibracyjny Luminex MAGPIX | Luminex | MPX-CAL-K25 | |
| Zestaw weryfikacyjny Luminex MAGPIX | Luminex | MPX-PVER-K25 | |
| Separator lamp magnetycznych | Invitrogen | DynaMag | |
| MAGPIX Drive Fluid Plus | Luminex | 40-50030 | |
| NP z odrą | Antygen natywny | REC31796 | |
| Mikropłytowy shaker | Randox | ||
| MIKROPŁYTA, 96 OTWORÓW, PS, F-DNO (STUDNIA KOMINOWA) | Greiner-Bio One | 655096 | |
| MiliQ H20 | - | Ogólne laboratorium | |
| Pipety wielokanałowe 10, 300 | SARTORIUS | ||
| NIE | Antygen natywny | Prot produkcji | |
| Ogawa OSP | Boston_MGH | - | |
| ONNV E2 | Naukowości kliniczne | IT-022-006Ep | |
| Instrument procesora partikuli | Termonaukowe | Thermo Scientific KingFisher Flex | |
| PBS 10x PH~7,0 | EUROMEDEX | ET330 | |
| Przeciwciało wtórne IgG Fc sprzężone z PE | Badania Jacksona Immuno | 709-116-098 | |
| PfAMA1 | Produkcja wewnętrzna | - | |
| PfMSP1 | Antygen natywny | REC32013-100 | |
| PGP3 | Antygen natywny | Prot produkcji | |
| Końcówki pipety (dostawca) 10 & micro; L, 200 & mikro; L, 1000 & mikro; L | - | Ogólne materiały laboratoryjne | |
| Pm MSP1 | Naukowości kliniczne | CUST-PRT-31102024-1B | |
| Po MSP1 | Naukowości kliniczne | CUST-PRT-31102024-1A | |
| PvMSP1 | Antygen natywny | REC31724-100 | |
| Oprogramowanie R R4.4.1 | - | - | |
| RVFV NP | Antygen natywny | REC31640-100 | |
| Pipety jednokanałowe 10p, 20p, 200p, 1000p | Eppendorf | ||
| SNAP | Produkcja wewnętrzna | - | |
| S-NHS | Sigma | 56485 | |
| Azyd sodu | Sigma | S2002 | |
| Roztwór podchlorynu sodu (wybielacz) | - | Wybielacz ogólny domowy | |
| Toksyna tężca | Antygen natywny | REC31801-100 | |
| Thermo Scientific BindIx Software wersja 1.1 | ThermoFisher Scientific | - | |
| TRITON | Thermo Scientific | A16046 | |
| Wałek rurowy | IKA | Roller 6D -100219627 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| USUV EDIII + SNAP | Produkcja wewnętrzna | - | |
| USUV NS1 | Antygen natywny | USUV-NS1-100 | |
| Vortex | - | Ogólny sprzęt laboratoryjny | |
| VSP3 | Antygen natywny | Prot produkcji | |
| VSP5 | Antygen natywny | Prot produkcji | |
| WNV EDIII + SNAP | Produkcja wewnętrzna | - | |
| WNV NS1 | Antygen natywny | WNV-NS1-100 | |
| oprogramowanie xPONENT | Luminex | 89-30000-00-759 Rev A May-19 | |
| YFV EDIII + SNAP | Produkcja wewnętrzna | - | |
| YFV NS1 | Antygen natywny | YFV-NS1-100 | |
| ZIKV EDIII + SNAP | Produkcja wewnętrzna | - | |
| ZIKV NS1 | Antygen natywny | ZIKV-NS1-100 | |
| ZIKV VLP | Antygen natywny | ZIKV-VLP-100 |
Bibliografia
- Global dengue surveillance. , World Health Organization. https://worldhealthorg.shinyapps.io/dengue_global (2025).
- Bangoura, S. T., et al. Arbovirus epidemics as global health imperative, Africa, 2023. Emerg Infect Dis. 31 (2), e240754(2024).
- World Health Organization. Surveillance and control of arboviral diseases in the WHO African Region: assessment of country capacities. , WHO. (2022).
- Starolis, M. W., Perez, O., Powell, E. A. Clinical features and laboratory diagnosis of emerging arthropod-transmitted viruses. J Clin Virol. 132, 104651(2020).
- Alves, R. P. D. S., Amorim, J. H. Editorial: Arboviruses: Co-circulation, co-transmission, and co-infection. Front Microbiol. 14, 1321166(2023).
- Pan American Health Organization. Recommendations for laboratory detection and diagnosis of arbovirus infections in the region of the Americas. , PAHO. (2023).
- Fischer, C., et al. Challenges towards serologic diagnostics of emerging arboviruses. Clin Microbiol Infect. 27 (9), 1221-1229 (2021).
- Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. xMAP cookbook: A collection of methods and protocols for developing multiplex assays with xMAP technology. Luminex. , https://info.diasorin.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook (2025).
- Luminex MAGPIX user manual. , Luminex Corporation. (2023).
- Rosado, J., et al. Multiplex assays for the identification of serological signatures of SARS-CoV-2 infection: An antibody-based diagnostic and machine learning study. Lancet Microbe. 2 (2), e60-e69 (2021).
- Bloch, E., et al. Investigation of the sero-epidemiology of vaccine preventable diseases and common viral infections in French populations using a multiplex serological assay. medRXiv. , (2024).
- Venkateswaran, N., Sarwar, J., Nelson, W., Venkateswaran, K. Determination of IgG antibody profile to arboviruses using a multiplex serology panel. , (2024).
- Lawford, H. L. S., et al. Integrated serological surveillance for neglected tropical diseases, vaccine-preventable diseases, and arboviruses in Samoa, 2018. Sci Rep. 15 (1), 12667(2025).
- Bailly, S., et al. Spatial distribution and burden of emerging arboviruses in French Guiana. Viruses. 13 (7), 1299(2021).
- KingFisher Apex purification system: User guide. , Thermo Fisher Scientific Inc. https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0018970_kingfisher_apex_UG.pdf (2025).
- Instructions for use for HydroFlex Plus. , Tecan. (2025).
- XPONENT 4.3 installation instructions. , Luminex Corporation. https://us.diasorin.com/sites/default/files/products-documentation-tool/89-30000-00-759.pdf (2025).
- Van Den Hoogen, L. L., et al. Quality control of multiplex antibody detection in samples from large-scale surveys: the example of malaria in Haiti. Sci Rep. 10 (1), 1135(2020).
- Bangoura, S. T., et al. Seroprevalence of seven arboviruses of public health importance in sub-Saharan Africa: a systematic review and meta-analysis. BMJ Glob Health. 9 (10), e016589(2024).
- Awuah, A. A., et al. Seroprevalence of dengue in the Democratic Republic of Congo, Ghana and Senegal: results of the SERODEN study. Int J Infect Dis. 152, 107428(2025).
- Mhamadi, M., et al. Human and livestock surveillance revealed the circulation of Rift Valley Fever virus in Agnam, Northern Senegal, 2021. Trop Med Infect Dis. 8 (2), 87(2023).
- Broban, A., et al. Seroprevalence of IgG antibodies directed against dengue, chikungunya and West Nile viruses and associated risk factors in Madagascar, 2011 to 2013. Viruses. 15 (8), 1707(2023).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie