Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pojedynczokomórkowe ludzkie organoidy jelitowe do badań nad organoidami

741 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69265

⸱

6 lutego 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Graduate School of Medical Science, Brain Korea 21 Project, Yonsei University College of Medicine, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, NYU Grossman School of Medicine, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Department of Pathobiology, University of Pennsylvania Perelman School of Veterinary Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół generowania organoidów jelitowych pochodzących z pojedynczych komórek nasiennych, dostarczając standaryzowane hodowle redukujące niejednorodność i poprawiające powtarzalność do dalszych badań i zastosowań medycyny precyzyjnej.

Streszczenie

Najnowsze osiągnięcia w technologii organoidów umożliwiły powstanie organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów (PDIO), które odtwarzają cechy strukturalne, funkcjonalne, genetyczne i epigenetyczne ich pierwotnych tkanek. Jednak konwencjonalne organoidy pochodzące z przejścia nieuchronnie prowadzą do zróżnicowanych populacji pod względem wielkości i liczby, co prowadzi do niespójnych wyników nawet w identycznych warunkach. Aby temu zaradzić, ustanowiono ustandaryzowane podejście, tutaj określane jako "single cell-seeded PDIO". W tej metodzie dojrzałe PDIO były enzymatycznie dysocjowane na pojedyncze komórki i zasiewane w określonej liczbie do pojedynczych dołków płyty 96-dołkowej. To kontrolowane zasiewanie normalizowało rozmiar i liczbę PDIO. W porównaniu z organoidami pochodzącymi z przejścia, pojedyncze komórki PDIO wykazywały zmniejszoną zmienność między dołkami w liczbie organoidów oraz zmienność rozmiarów organoidów wewnątrzdołkowo, co umożliwia określenie efektywności generowania i poprawia powtarzalność testów żywotności. Ponadto platforma ta jest kompatybilna z analizą dalszą, w tym analizą transkryptomiczną i profilowaniem ekspresji białek. Łącznie takie podejście może zwiększyć spójność eksperymentów i zapewnić praktyczną podstawę do powtarzalnych badań opartych na PDIO.

Wprowadzenie

Jelito ludzkie to wysoce złożony ekosystem definiowany przez precyzyjnie dostrojone interakcje między mikrobiotą jelitową, nabłonkiem jelitowym oraz układem odpornościowym1. Te składniki utrzymują homeostazę jelit poprzez ściśle regulowane sieci sygnalizacyjne. Na przykład mikrobiota jelitowa, obejmująca ponad dziesięć bilionów mikroorganizmów, oddziałuje z komórkami odpornościowymi, modulując aktywność układu odpornościowego i utrzymując zrównoważone środowisko jelitowe2. Nabłonek jelitowy odgrywa kluczową rolę w pośredniczeniu w komunikacji mikrobioty i układu odpornościowego 3,4. Komórki macierzyste jelitowe (ISC), kluczowe czynniki odnawiania nabłonka, nieustannie regenerują się i różnicują w wyspecjalizowane typy komórek, w tym linie wydzielnicze (komórki Paneth, komórki pucharowe, komórki enteroendokrynne i komórki Tuft), enterocyty absorpcyjne oraz komórki mikrofałdów 5,6. Razem te komórki tworzą istotną fizyczną barierę i funkcjonalne interfejs, które chroni gospodarza przed bodźcami zapalnymi.

W ostatnich latach PDIO stały się potężną platformą w badaniach translacyjnych7. Te trójwymiarowe (3D) hodowle powstają z ISC izolowanych z tkanek pacjentów i utrzymywanych w macierzy zewnątrzkomórkowej, takiej jak macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), wraz z określonymi czynnikami wzrostu, które stanowią niszę ISC 8,9. Co istotne, PDIO zachowują cechy genetyczne i epigenetyczne tkanki dawcy, co pozwala na trwałe rozszerzanie się i powtarzalne eksperymenty. Od czasu, gdy Sato i in. po raz pierwszy opracowali PDIO z receptora sprzężonego z białkiem G bogatym w leuczynę (Lgr5⁺) ISCs10, kolejne badania zidentyfikowały niezbędne czynniki wzrostu dla generowania i różnicowania PDIO, co doprowadziło do szeroko przyjętych protokołów w laboratoriach 11,12,13. Jednak środowiska eksperymentalne stosowane do leczenia PDIO lekami kandydatskimi różnią się znacznie w poszczególnych badaniach i często są niewystarczająco opisane 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44, 45,46,47. Ponadto PDIO są zazwyczaj przepuszczane przez mechaniczne zakłócenia, co skutkuje heterogenicznością rozmiaru, morfologii i układu przestrzennego organoidów. Ta zmienność utrudnia dokładną ocenę reakcji na leki oraz mechanizmów molekularnych. Aby rozwiązać to ograniczenie, najnowsze badania opracowały PDIO pochodzące z jednokomórkowej zawiesiny lub sortowanych pojedynczych komórek 45,48,49,50,51,52,53,54.

W tym artykule, jako jedna z komplementarnych i praktycznych metod, wprowadzono "jednokomórkowe PDIO" w celu generowania standaryzowanych PDIO z zawiesiny pojedynczej komórki przy użyciu konwencjonalnego ECM i mediów, umożliwiając dokładne i powtarzalne testy. Krótko mówiąc, pojedyncze komórki wyizolowane z dojrzałych PDIO były osadzane w ECM przy określonych gęstościach komórek, a powstałe hodowle monitorowano przez 2 tygodnie, podczas gdy liczność, rozmiar i morfologia były ilościowo określane. Ponieważ każda kopuła ECM jest osadzona w znanym wejściu komórki, liczba organoidów na odwór jest stała, co pozwala na obliczenie wydajności generowania jako odczytu zdolności regeneracyjnej w każdej liniiorganoidów 49,54. Chociaż kopulasty Matrigel wykazuje niejednorodność rozmiaru ze względu na przestrzenny gradient stężenia Wnt3a wynikający z jego inherentnej niestabilności i ograniczonej dyfuzji55, zmienność wielkości między dołkami w pojedynczokomórkowych PDIO jest wyraźnie niższa niż w organoidach pochodzeniaprzejściowym 49,54. Jednak to podejście nadal ma praktyczne ograniczenia. Bez sortowania komórek aktywowanych fluorescencją niektóre organoidy mogą powstawać z dubletów lub tripletów, co skutkuje wewnętrzną biologiczną heterogenicznością w ramach PDIO. Ponadto optymalna liczba pojedynczych komórek musi być empirycznie określona dla każdej linii organoidalnej ze względu na zróżnicowaną efektywność generacyjną. Wreszcie, w pełni zróżnicowane PDIO z pojedynczymi komórkami poddane analizom końcowym, w tym ilościowej transkrypcji odwrotnej PCR (qRT-PCR), Western blot oraz immunohistochemii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie materiały i odczynniki wymagane do eksperymentu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie odczynników i materiałów

  1. Podgrzej płytkę hodowlową organoidów w inkubatorze 37 °C przez ponad 90 minut.
    UWAGA: Wstępne podgrzewanie płyty hodowli pomoże utrwalić ECM i zachować kształt kopuły. 90 minut to minimalny wymagany czas polimeryzacji ECM. Zaleca się podgrzewanie talerza przez ponad 12 godzin.
  2. Stosuj pożywkę do wzrostu organoidów (EXP) z dodatkiem 0,5% penicylin-streptomycyny (PS) jako pożywki do hodowli organoidów.
  3. Do różnicowania PDIO z pojedynczych komórek należy użyć pożywki różnicowej (DIF) składającej się z podłoża bazalnego uzupełnionego czynnikami wzrostu (Tabela 1). Podstawa podłoża składa się z zaawansowanego DMEM/F12 uzupełnionego o 0,5% PS, 0,25% siarczanu gentamicyny i 1% glutaminy, wraz z następującymi czynnikami wzrostu: Noggin (100 ng/mL), R-Spondin-1 (1 μg/mL), Wnt3a (100 ng/mL), czynnik wzrostu naskórka (EGF; 50 ng/mL), N-acetyl-L-cysteina (1 mM), [Leu15]-gastryna I ludzka (10 nM), A 83-01 (500 nM), Insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-I; 200 ng/mL), czynnik wzrostu fibroblastów (FGF; 100 ng/mL) oraz suplement B-27 (1x) (Tabela 1).
    UWAGA: PS i gentamicyna są niebezpieczne biologicznie i należy je traktować w rękawiczkach i ochronie oczu.
  4. Świeżo przygotować roztwór do odzyskiwania komórek (CRS), bufor do płukania (DMEM o wysokim glukozie z 1% BSA), 1 mM Y-27632, EXP i DIF, i przechowywać w lodzie do użycia.
    UWAGA: Pozwól EXP i DIF wyrównać się do temperatury pokojowej przez co najmniej 20 minut przed dodaniem do wcześniej podgrzanych płyt hodowlanych.
  5. Rozmroź ECM na lodzie i upewnij się, że zawsze pozostaje chłodny.
    UWAGA: ECM wymaga rozmrażania na lodzie i zawsze powinno być przechowywane w zimnie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji.
  6. Wyrównaj enzymatyczny reagent dysocjacyjny do temperatury pokojowej. Przed aplikacją podgrzej odczynnik w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Odczynnik enzymatyczny dysocjacyjny jest drażniącym i należy go obchodzić się odpowiednim środkiem ochronnym.

2. Rozmrażanie i odzyskiwanie krioprezerwacji PDIO

  1. Pobierz rurkę kriowialną zawierającą organoidy z zbiornika ciekłego azotu. Poluzuj lekko korek rurki i rozmrażaj w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 60-90 sekund.
    UWAGA: Po rozmrożeniu natychmiast przełóż rurkę na lód.
  2. Wstępnie zwilż końcówkę pipety o szerokim przekształceniu z buforem do płukania i przenieś organoidy z rurki kriowialnej do rurki o pojemności 50 mL.
  3. Przepłucz kriovial 1 mL bufora do płukania i przelej pozostałą zawartość do probówki 50 mL. Powtórz ten krok płukania dwa razy.
  4. Wiruj w 290 × g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że na dnie rurki pojawi się widoczny granulek.
  5. Aspiruj nadwysoka.
  6. Ponownie zawiesić w ECM za pomocą szerokiej rury wstępnie zwilżonej końcówki.
  7. Zkropuj ECM na podgrzaną płytę z 24 dołkami i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    UWAGA: Użyj 30 μL ECM na odwiert.
  8. Dodaj EXP i otocz studnie sterylną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) lub wodą destylowaną.
    UWAGA: Używaj 500 μL EXP na odwiert. Hodowla w EXP uzupełniona przez pierwsze 3 dni o 10 μM Y-27632, potem zmieniona na EXP bez Y-27632.

3. Przekazywanie PDIO

  1. Wdysaj wyczerpane EXP.
  2. Wstępnie zwilż końcówkę pipety o szerokim przekształceniu z buforem do płukania, dodaj 1 mL odczynnika do dysocjacji komórki, aby odłączyć ECM, i przenieś zawartość do probówki o pojemności 15 mL.
  3. Inkubuj rurkę na kołysce przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Wirówka w 300 × g przez 7 minut w 4 °C.
  5. Przelej supernatant i dodaj 1 ml buforu do prania. Zawiesz 20 razy.
  6. Dodaj kolejne 1 ml buforu do mycia, ponownie zawiesz 20 razy i przelej do probówki 50 mL.
  7. Wirówka w 300 × g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Aspiruj nadwysoka.
  9. Ponownie zawiesić w ECM za pomocą szerokiej rury wstępnie zwilżonej końcówki.
  10. Zkropuj ECM na podgrzaną płytę z 24 dołkami i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    UWAGA: Użyj 30 μL ECM na odwiert.
  11. Dodaj EXP i otocz studnie sterylnym PBS lub wodą destylowaną.
    UWAGA: Używaj 500 μL EXP na odwiert. Hodowla w EXP uzupełniona przez pierwsze 3 dni o 10 μM Y-27632, potem zmieniona na EXP bez Y-27632.

4. Pojedynczokomórkowa kultura PDIO

  1. Wdysaj wyczerpane EXP.
    UWAGA: Odpady zawierające antybiotyki (np. zużyte medium z PS lub gentamicyną) powinny być autoklawowane przed utylizacją.
  2. Myj 1 mL sterylnego 1x PBS.
  3. Wstępnie zwilż szerokoprzeciążową pipetę z buforem płuczącym, dodaj 300 μL CRS w celu odłączenia ECM i przelej zawartość do rurki 50 mL.
  4. Wirówka w 300 × g przez 5 minut w 4 °C (Rysunek 1A).
  5. Aspiruj supernatant, dodaj 3 mL bufora do prania i ponownie zawiesz 20 razy.
    UWAGA: Ten krok mechanicznie zakłóca działanie organoidów.
  6. Wirówka w 300 × g przez 5 minut w 4 °C (Rysunek 1B).
  7. Aspiruj supernatant i dodaj 5 mL wcześniej podgrzanego enzymatycznego odczynnika dysocjacyjnego zawierającego 10 μM Y-27632. Mieszaj 2-3 razy i inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut, potrząsając tubką co 5 minut.
    UWAGA: Agregaty zanieczyszczenia zazwyczaj pojawiają się w ciągu 10 minut od inkubacji. Ogranicz całkowite leczenie enzymatycznym reagentem dysocjacyjnym do mniej niż 20 minut. Nie przekraczaj 25 minut, ponieważ nadmierne trawienie znacznie obniża wydajność i żywotność pojedynczych komórek.
  8. Dodaj 10 ml DMEM o wysokim poziomie glukozy.
  9. Wirówka w 300 × g przez 5 minut w 4 °C (Rysunek 1C).
  10. Aspiruj supernatant i dodaj 1 ml buforu do prania. Zawiesz 20 razy.
    UWAGA: Odpady zawierające enzymatyczny reagent dysocjacyjny należy zbierać oddzielnie i inaktywować wybielaczem 0,5-1% przez co najmniej 30 minut przed utylizacją zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego biobezpieczeństwa.
  11. Przefiltruj przez sitko ogniwa 40 μm do nowej rurki 50 mL (Rysunek 1D).
    UWAGA: Ten krok jest kluczowy dla izolowania pojedynczych komórek od dojrzałych organoidów. Do izolacji pojedynczych komórek należy użyć sitnika o średnicy 40 μm.
  12. Licz komórki za pomocą trypanowego niebieskiego. Przenieś obliczoną objętość do probówki 1,5 mL.
    UWAGA: Płyta 3 000-4 000 komórek na odwiert w podgrzanej płycie z 96 dołami.
  13. Wirówka w 300 × g przez 5 minut w 4 °C (Rysunek 1E).
  14. Usuń supernatant pipetą.
  15. Ponownie zawiesijcie komórki w ECM (100-500 komórek/μL) za pomocą szerokiego przekształcenia, wstępnie zwilżonego końcówki pipety.
  16. Dotuj ECM do wcześniej podgrzanej płyty z 96 dołkami i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    UWAGA: Użyj 10 μL ECM na odwiert.
  17. Dodaj DIF do studni. Otocz studnie sterylnym 1x PBS lub wodą destylowaną.
    UWAGA: Użyj 150 μL DIF na odwiert. Hodowla w DIF uzupełniona 10 μM Y-27632 przez 3 dni, następnie zmieniona na DIF bez Y-27632. Zmieniaj medium co 3 dni i utrzymuj go łącznie przez 10 dni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby wygenerować PDIO z pojedynczą komórką, pobrano biopsje śluzowe kości śluzowej kości jelita niebrzędowego i jelita wznoszącego się od zdrowych osób wyrażających zgodę podczas kolonoskopii obserwacyjnej za pomocą standardowych kleszczy biopsji 2,8 mm, zgodnie z Radą Instytucjonalną Przeglądu NYU Grossman School of Medicine (Profilowanie immunologiczne błony śluzowej u pacjentów z chorobami zapalnych jelit; S12-01137). Następnie powstały PDIO z pojedynczą komórką poprzez dysocjację 6 000 komórek wyizolowanych z dojrzały...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

PDIO mają ogromne szanse na precyzyjne modelowanie chorób, badania przesiewowe leków oraz medycynę regeneracyjną, wiernie zachowując genetyczny i epigenetyczny krajobraz poszczególnych pacjentów. Jednak ich praktyczne zastosowania często utrudniają trudności w standaryzacji generowania i charakteryzacji organoidów. Aby pokonać te wyzwania, w ostatnich badaniach wprowadzono podejście wykorzystujące PDIO pochodzące z zawiesiny jednokomórkowej lub pojedynczej komórki: 45,48,49,50,51,52,53,54.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Jordan E. Axelrad otrzymał granty badawcze od BioFire Diagnostics, Genentech, Janssen i Takeda; opłaty konsultingowe, honoraria lub opłaty rady doradczej od AbbVie, Abivax, Adiso, Biomerieux, Bristol-Myers Squibb, Celltrion, Ferring, Fresenius, Janssen, Merck, Pfizer, Sanofi, Takeda i Vedanta. K.C. jest wynalazcą amerykańskiego patentu nr 10,722,600 oraz patentów tymczasowych 62/935,035 i 63/157,225.

Podziękowania

Prace te były częściowo wspierane przez grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT) (RS-2025-00557588, RS-2024-00411768, RS-2025-18362970 oraz RS-2025-02214844, Kyung Ku Jang); grant na Koreański Projekt Badań i Rozwoju Technologii Zdrowotnych realizowany przez Koreański Instytut Rozwoju Przemysłu Zdrowotnego (KHIDI), finansowany przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej Republiki Korei (RS-2024-00406488, Kyung Ku Jang); Grant Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) DK093668 (Ken Cadwell); K23DK124570 (Jordan E. Axelrad); Fundacja Crohna i Zapalenia Grubego (Jordan E. Axelrad). Fundatorzy nie mieli żadnej roli w projektowaniu badania, zbieraniu i analizie danych, decyzji o publikacji ani przygotowaniu rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
[Leu15]-Gastrin I człowiekSigma-AldrichG91450-0,1 mg
15 mL stożkowa lampaSPL50015
20X PBS, pH 7,4BiosesangP2007-7.4
50 mL stożkowa rurkaSPL50050
A 83-01Tocris2939-10 mg
Zaawansowany DMEM/F-12Gibco12634010
Axygen 1000 & micro; Końcówki pipetu L, szerokie przełążki, przezroczyste, niesterylneAxygenT-1005-WB-C
Axygen 200 & micro; Końcówki pipetu L, szerokie przełążki, przezroczyste, niesterylneAxygenT-205-WB-C
Suplement B-27 (50X) bez serumGibco17504044
Albumina surowicy bydłaRoche10735078001
Mikropłyty z przezroczystego polistyrenu Corning z 96 dołkamiCorning3599
Rozwiązanie do odzyskiwania ogniw CorningaCorning354253
Corning ECM Matrix (Corning Matrigel)  Corning356231
Costar 24-odwiertowy przezroczysty TC-obróbkowy wieloodwiertowy płytkiCorning3526
Wysoki poziom glukozy w DMEM ze stabilną glutaminą i pirorotrowinianem soduBiowestL0103-500
GentamicinGibco15750060
Łagodny odczynnik do dysocjacji komórkowejKomórka macierzysta100-0485
Ludzkie białko FGF-zasadowe (FGF-2/bFGF) (154 aa) rekombinowaneGibco100-18B-100UG
Ludzki IGF-I, bezzwierzęcy rekombinowany białkoGibcoAF-100-11-500UG
Ludzkie białko NogginaAkrobiosystemNON-H5219-1mg
Ludzkie białko R-Spondin 1 / RSPO1 (21-146)AkrobiosystemRS6-H4220-1mg
IntestiCult Medium Wzrostu Organoidów (Człowiek)Komórka macierzysta6010
L-glutamina 100XBiowestX0550-100
Białko rekombinowane EGF myszyGibco315-09-100UG
N-acetyl-L-cysteinaSigma-AldrichA9165-5 g
Roztwór penicyliny-streptomycyny 100XBiowestl0022-100
Rekombinowana ludzka surogatka Wnt3aAkrobiosystemWNE-W5253-50ug
TrypLE (enzymatyczny reagent dysocjacyjny) ekspresuje enzym (1X), bez fenolu red Gibco12604013
Dichlorek Y-27632Tocris1254-10MG

Bibliografia

  1. Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).
  2. Zheng, D., Liwinski, T., Elinav, E. Interaction between microbiota and immunity in health and disease. Cell Res. 30 (6), 492-506 (2020).
  3. Liebing, E., Krug, S. M., Neurath, M. F., Siegmund, B., Becker, C. Wall of Resilience: How the Intestinal Epithelium Prevents Inflammatory Onslaught in the Gut. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 19 (2), 101423(2025).
  4. Soderholm, A. T., Pedicord, V. A. Intestinal epithelial cells: at the interface of the microbiota and mucosal immunity. Immunology. 158 (4), 267-280 (2019).
  5. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: Regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  6. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
  7. Lucafò, M., et al. Patient-derived organoids for therapy personalization in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 28 (24), 2636-2653 (2022).
  8. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2, (2022).
  9. Parente, I. A., Chiara, L., Bertoni, S. Exploring the potential of human intestinal organoids: Applications, challenges, and future directions. Life Sci. 352, 122875(2024).
  10. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  11. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  12. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  13. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793.e6 (2018).
  14. An, S., Huh, H., Ko, J. S., Moon, J. S., Cho, K. Y. Establishment and characterization of patient-derived intestinal organoids from pediatric Crohn's disease patients. Pediatr Gastroenterol Hepatol Nutr. 27 (6), 355-363 (2024).
  15. d'Aldebert, E., et al. Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients. Front Cell Dev Biol. 8, 363(2020).
  16. Arnauts, K., et al. Ex vivo mimicking of inflammation in organoids derived from patients with ulcerative colitis. Gastroenterology. 159 (4), 1564-1567 (2020).
  17. Deleu, S., et al. High acetate concentration protects intestinal barrier and exerts anti-inflammatory effects in organoid-derived epithelial monolayer cultures from patients with ulcerative colitis. Int J Mol Sci. 24 (1), (2023).
  18. Dennison, T. W., et al. Patient-derived organoid biobank identifies epigenetic dysregulation of intestinal epithelial MHC-I as a novel mechanism in severe Crohn's Disease. Gut. 73 (9), 1464-1477 (2024).
  19. Ding, W., Marx, O. M., Mankarious, M. M., Koltun, W. A., Yochum, G. S. Disease severity impairs generation of intestinal organoid cultures from inflammatory bowel disease patients. J Surg Res. 293, 187-195 (2024).
  20. Dotti, I., Mayorgas, A., Salas, A. Generation of human colon organoids from healthy and inflammatory bowel disease mucosa. PLoS One. 17 (10), e0276195(2022).
  21. Ferrer-Picón, E., et al. Intestinal inflammation modulates the epithelial response to butyrate in patients with inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 26 (1), 43-55 (2020).
  22. Gopalakrishnan, S., et al. Comprehensive protocols for culturing and molecular biological analysis of IBD patient-derived colon epithelial organoids. Front Immunol. 14, 1097383(2023).
  23. Hammoudi, N., et al. Autologous organoid co-culture model reveals T cell-driven epithelial cell death in Crohn's Disease. Front Immunol. 13, 1008456(2022).
  24. Jurickova, I., et al. Eicosatetraynoic acid and butyrate regulate human intestinal organoid mitochondrial and extracellular matrix pathways implicated in Crohn's disease strictures. Inflamm Bowel Dis. 28 (7), 988-1003 (2022).
  25. Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., van Griensven, M., Giselbrecht, S. A Microwell-based intestinal organoid-macrophage co-culture system to study intestinal inflammation. Int J Mol Sci. 23 (23), (2022).
  26. Karakasheva, T. A., et al. Patient-derived colonoids from disease-spared tissue retain inflammatory bowel disease-specific transcriptomic signatures. Gastro Hep Adv. 2 (6), 830-842 (2023).
  27. Kawamoto, A., et al. Ubiquitin D is upregulated by synergy of notch signalling and TNF-α in the inflamed intestinal epithelia of IBD patients. J Crohns Colitis. 13 (4), 495-509 (2019).
  28. Kelsen, J. R., et al. Colonoids from patients with pediatric inflammatory bowel disease exhibit decreased growth associated with inflammation severity and durable upregulation of antigen presentation genes. Inflamm Bowel Dis. 27 (2), 256-267 (2021).
  29. Lee, C., et al. Intestinal epithelial responses to IL-17 in adult stem cell-derived human intestinal organoids. J Crohns Colitis. 16 (12), 1911-1923 (2022).
  30. Matsuzawa-Ishimoto, Y., et al. An intestinal organoid-based platform that recreates susceptibility to T-cell-mediated tissue injury. Blood. 135 (26), 2388-2401 (2020).
  31. Matsuzawa-Ishimoto, Y., et al. The γδ IEL effector API5 masks genetic susceptibility to Paneth cell death. Nature. 610 (7932), 547-554 (2022).
  32. Murthy, S., et al. Single-cell transcriptomics of rectal organoids from individuals with perianal fistulizing Crohn's disease reveals patient-specific signatures. Sci Rep. 14 (1), 26142(2024).
  33. Nanki, K., et al. Somatic inflammatory gene mutations in human ulcerative colitis epithelium. Nature. 577 (7789), 254-259 (2020).
  34. Niklinska-Schirtz, B. J., et al. Ileal derived organoids from Crohn's disease patients show unique transcriptomic and secretomic signatures. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 1267-1280 (2021).
  35. Nishimura, R., et al. Establishment of a system to evaluate the therapeutic effect and the dynamics of an investigational drug on ulcerative colitis using human colonic organoids. J Gastroenterol. 54 (7), 608-620 (2019).
  36. Rees, W. D., et al. Enteroids derived from inflammatory bowel disease patients display dysregulated endoplasmic reticulum stress pathways, leading to differential inflammatory responses and dendritic cell maturation. J Crohns Colitis. 14 (7), 948-961 (2020).
  37. Sarvestani, S. K., et al. Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity. Nat Commun. 12 (1), 262(2021).
  38. Skovdahl, H. K., et al. Patient derived colonoids as drug testing platforms-critical importance of oxygen concentration. Front Pharmacol. 12, 679741(2021).
  39. Suzuki, K., et al. Single cell analysis of Crohn's disease patient-derived small intestinal organoids reveals disease activity-dependent modification of stem cell properties. J Gastroenterol. 53 (9), 1035-1047 (2018).
  40. Tindle, C., et al. A living organoid biobank of patients with Crohn's disease reveals molecular subtypes for personalized therapeutics. Cell Rep Med. 5 (10), 101748(2024).
  41. Tsuchiya, M., et al. Functional analysis of isoflavones using patient-derived human colonic organoids. Biochem Biophys Res Commun. 542, 40-47 (2021).
  42. Vanhove, W., et al. Biopsy-derived intestinal epithelial cell cultures for pathway-based stratification of patients with inflammatory bowel disease. J Crohns Colitis. 12 (2), 178-187 (2018).
  43. Xu, P., et al. Interleukin-28A induces epithelial barrier dysfunction in CD patient-derived intestinal organoids. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 320 (5), G689-G699 (2021).
  44. Ko, C. Y., et al. Alleviative Effect of alpha-lipoic acid on cognitive impairment in high-fat diet and streptozotocin-induced type 2 diabetic rats. Front Aging Neurosci. 13, 774477(2021).
  45. Jang, K. K., et al. Tofacitinib uptake by patient-derived intestinal organoids predicts individual clinical responsiveness. Gastroenterology. 167 (7), 1453-1456.e5 (2024).
  46. Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn's disease assessed using patient-derived intestinal organoids. Int J Mol Sci. 22 (11), (2021).
  47. Laudadio, I., et al. Characterization of patient-derived intestinal organoids for modelling fibrosis in Inflammatory Bowel Disease. Inflamm Res. 73 (8), 1359-1370 (2024).
  48. Marinucci, M., et al. Standardizing patient-derived organoid generation workflow to avoid microbial contamination from colorectal cancer tissues. Front Oncol. 11, 781833(2021).
  49. Lin, X., et al. IL-17RA-signaling in Lgr5(+) intestinal stem cells induces expression of transcription factor ATOH1 to promote secretory cell lineage commitment. Immunity. 55 (2), 237-253.e8 (2022).
  50. Miller, D. S., Talbot, C. A., Simpson, W., Korey, A. A comparison of naproxen sodium, acetaminophen and placebo in the treatment of muscle contraction headache. Headache. 27 (7), 392-396 (1987).
  51. Yang, L., et al. A tunable human intestinal organoid system achieves controlled balance between self-renewal and differentiation. Nat Commun. 16 (1), 315(2025).
  52. Abdulla, N., Aronson, R., Plessis, T. D., Bebington, B., Kaur, M. Protocol for the establishment and characterization of South African patient-derived intestinal organoids. STAR Protoc. 6 (3), 103970(2025).
  53. Kang, S., Lee, M. R., Choi, W., Kong, S. Y., Kim, Y. H. Protocol for generation and utilization of patient-derived organoids from multimodal specimen. STAR Protoc. 6 (3), 104039(2025).
  54. Zhou, C., et al. Epigenetic reprogramming alters intestinal stem cell fate in pouchitis. bioRxiv. , (2025).
  55. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372(2020).
  56. Jang, K. K., et al. Variable susceptibility of intestinal organoid-derived monolayers to SARS-CoV-2 infection. PLoS Biol. 20 (3), e3001592(2022).
  57. He, G. W., et al. Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of paneth cell formation. Cell Stem Cell. 29 (9), 1333-1345.e6 (2022).
  58. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  59. Sockell, A., et al. A microwell platform for high-throughput longitudinal phenotyping and selective retrieval of organoids. Cell Syst. 14 (9), 764-776.e6 (2023).
  60. Saito, T., Amako, J., Watanabe, T., Shiraki, N., Kume, S. Human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids for pharmacokinetic studies. Eur J Cell Biol. 104 (2), 151489(2025).
  61. Velasco, V., Shariati, S. A., Esfandyarpour, R. Microtechnology-based methods for organoid models. Microsyst Nanoeng. 6, 76(2020).
  62. Kakni, P., et al. Intestinal organoid culture in polymer film-based microwell arrays. Adv Biosyst. 4 (10), e2000126(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

wysiew pojedynczych kom rekorganoidy pochodz ce od pacjent wzmienno organoid wpowtarzalno organoid wtest ywotno ci organoid wwydajno generowania organoid wanaliza transkryptomicznaprofilowanie ekspresji bia ek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.