Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena dynamiki rozszczepienia/fuzji mitochondrialnej w komórkach rurkowatych nerek bliższych

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69268

⸱

14 listopada 2025

 ,  ,  ,  , 
1Lewis Katz Medical School at Temple University

W tym artykule

Podsumowanie

Artykuł ten opisuje wykorzystanie mikroskopii konfokalnej oraz ImageJ do oceny dynamiki rozszczepienia i fuzji mitochondriów za pomocą fluorescencji przełączającej się foto Dendra2.

Streszczenie

Mitochondria są najbardziej znane ze swojej roli w syntezie ATP i stanowią kluczowe regulatory metabolizmu komórkowego. Dynamika mitochondriów obejmuje ruch wewnątrzkomórkowy i międzykomórkowy mitochondriów, a także procesy rozszczepienia i fuzji. Te zdarzenia są kluczowe dla utrzymania funkcji mitochondriów poprzez utrzymanie homeostazy komórkowej, morfologii, bioenergetyki, kontroli jakości oraz reakcji na stres. Z kolei dysregulacja dynamiki mitochondriów wpływa na morfologię i funkcjonowanie komórek. Precyzyjne pomiary zdarzeń rozszczepienia i fuzji mitochondriów mogą świadczyć o zdrowiu komórkowym. Obecne metody pomiaru dynamiki mitochondriów wykorzystują zaawansowane obrazowanie, takie jak mikroskopia superrozdzielczości, techniki fluorescencji (Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)) do łączności oraz narzędzia optogenetyczne do kontroli przestrzenno-czasowej. Analiza ilościowa wykorzystuje narzędzia obliczeniowe do pomiaru parametrów takich jak długość, liczba i rozgałęzienie, które wskazują na równowagę rozszczepienia i fuzji. Jednak te metody wymagają umiejętności i zaawansowanych instrumentów. W tym artykule opisujemy zastosowanie mikroskopii konfokalnej w połączeniu z darmowymi narzędziami w ImageJ (Fidżi) do badania zdarzeń rozszczepienia i fuzji z wykorzystaniem właściwości przełączania zdjęć białka dendra2, oznaczonego jako cytochrom mitochondrialny c.

Wprowadzenie

Mitochondria to dynamiczny organelle odgrywający kluczową rolę w produkcji energii, śmierci komórek oraz transdukcji sygnału1. Morfologia mitochondriów odnosi się do wielkości i kształtu przedziałów mitochondrialnych, które są bardzo wrażliwe na warunki wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe oraz są kluczowe dla utrzymania zdrowia komórkowego2. Morfologia mitochondriów może dostarczyć kluczowych informacji na temat ich funkcji, jednak zmiany w kształcie mitochondriów mogą wpływać na metabolizm komórkowy i ogólny stan zdrowia3. Zaburzenia morfologii mitochondriów wiążą się z kilkoma chorobami, w tym zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, nowotworami i chorobami metabolicznymi4. Morfologia mitochondriów jest dynamicznie regulowana przez zdarzenia fuzji i rozszczepienia/fuzji, które są kluczowe dla utrzymania homeostazy komórkowej i reagowania na różne potrzeby metaboliczne 5,6.

Dynamika mitochondrialna pomaga organellom reagować na różne stresory i potrzeby metaboliczne7. Polega na ciągłym rozszczepieniu/fuzji oraz przemieszczaniu mitochondriów wewnątrz komórek lub między nimi. Mitochondria adaptują się do potrzeb energetycznych komórek poprzez zmiany morfologii w wyniku zdarzeń rozszczepienia i fuzji8. Procesy te określają kształt mitochondriów i wpływają na funkcje mitochondriów, takie jak produkcja energii wydzielanej, produkcja reaktywnych rodzajów tlenu (ROS) oraz kontrola jakości mitochondriów 7,9,10. Ponadto rozszczepienie/fuzja mitochondrialna to mechanizmy równoważące utrzymujące funkcjonalną sieć mitochondrialną11. Fuzja umożliwia wymianę zawartości mitochondrialnej, sprzyjając komplementarności i buforowaniu przed lokalnymi uszkodzeniami, natomiast rozszczepienie umożliwia segregację i usuwanie uszkodzonych mitochondriów za pomocą mitofagii 7,12. Ponadto rozszczepienie pomaga segregować uszkodzone elementy mitochondriów, które następnie są usuwane przez mitofagię, selektywny proces autofagii13. Fuzja natomiast pozwala na komplementarzację zawartości mitochondrialnej, rozcieńczając uszkodzone składniki14. Kluczowymi uczestnikami w rozszczepieniu/fuzji mitochondrialnej są mitofuzyny (MFN1/2), niezbędne do fuzji błony mitochondrialnejzewnętrznej 15,16 (OPA1): ta dynamynopodobna GTPaza odpowiada za fuzję błony mitochondrialnej16. Białka rozszczepienia obejmują białko związane z dynaminą 1 (Drp1), białko pro-rozszczepienie13,17. Białko rozszczepienia mitochondrialnego 1 (Fis1), czynnik rozszczepienia mitochondrialnego (Mff) oraz regulator rozszczepienia mitochondrialnego 1 (MTFR1L). Do badania ultrastruktury mitochondrialnej18 zastosowano kilka technik, takich jak superrozdzielczość EM. Do wizualizacji pojedynczych mitochondrialnych mRNA i powiązanych białek (smFISH) połączona z mikroskopią STED i MINFLUX superrozdzielczością (nanoskopia) zostały wykorzystane do wizualizacji pojedynczego mitochondrialnego mRNA i powiązanych białek18. Techniki mikroskopii lokalizacji pojedyncząsteczki (SMLM) śledzą zmiany w rozstawie błon19. Mikroskopia stochastyczna optyczna rekonstrukcyjna (STORM) umożliwia badanie wewnętrznych kompleksów błon mitochondrialnych20. Jednak korzystanie z tego zaawansowanego sprzętu nie jest łatwo dostępne. Mikroskopia konfokalna jest dostępna i wymaga mniej doświadczenia. Ponadto rozwój białek fluorescencyjnych ukierunkowanych na mitochondria znacząco przyspieszył badania dynamiki mitochondrialnej w żywych komórkach21, ponieważ używamy fotoaktywowalnego zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) do wizualizacji i ilościowej identyfikacji fuzji mitochondrialnej22.

Aby badać rozszczepienie i fuzję mitochondriów, komórki są poddawane stresowi lub narażonym na działanie leków takich jak cisplatyna, które wiążą się z DNA i powodują uszkodzenia DNA, co kończy się apoptozą wywołaną przez mitochondria23. W tym badaniu wykorzystaliśmy mitochondria Dendra2 z fotoaktywowalnymi i oznakowanymi mitochondriami z fotoaktywowalnych myszy do badania rozszczepienia i fuzji w komórkach rurkowodów nerek objętych cisplatiną, ponieważ są one bogate w mitochondria i mają wysoką zdolność regeneracji. Jednak protokół ten może być stosowany w dowolnym typie komórek, które mają mitochondria Dendra2 oznaczone fotoprzełączalnie (Rysunek 1A-C).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Cała praca ze zwierzętami była wykonywana zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Temple, Temple University (Protokół Zwierzęcy-5183). Myszy Pham, które mają mitochondria ekspresujące białko Dendra2, zostały zakupione.

1. Przygotowanie pożywki hodowli komórkowej

  1. Izoluj komórki proksymalne nerki rurkowate zgodnie z protokołem po ich oddzieleniu od komórek śródbłonka kłębuszkowego za pomocą kulek24 (Rysunek 1A). Bouchareb i in. opracowali metodę izolowania i hodowli komórek śródbłonka kłębuszkowego (GEC) z nerek myszy transgenicznych, które ekspresują fluorescencyjne mitochondria (mito-dendra2) za pomocą kulek magnetycznych. Po izolacji GEC rurki pozostawione w osadzie są izolowane i hodowlane.
  2. Posiew komórek rurkowatych nerek bliższych w naczyniu o średnicy 10 cm z 10 mL DMF-12 wzbogaconym o 5% FBS (inaktywowane przez ciepło), penicylinę (100 U/mL) oraz streptomycynę (100 μg/mL). Hoduj kanaliki przez 2-3 dni, aż wyjdą z nich.
  3. Wybieraj komórki rurkowate według morfologii po głodzeniu (z DMF-12 bez FBS) przez 2 dni.
    UWAGA: Do eksperymentów używaj dysku z 50-70% zbieżnymi komórkami. Policz komórki hemocytometrem przed zasiewaniem.
  4. Rozsiewanie komórek do eksperymentów: Rozsiewaj komórki na szklanych płytach hodowlanych o gęstości 1-5 ×10-5 komórek na odwiert, w zależności od wymagań eksperymentalnych. Pozwól komórkom przykleić się i rosnąć przez noc, zanim dodasz cisplatynę.
    UWAGA: Cisplatina to niebezpieczny lek chemioterapeutyczny, dlatego kluczowe jest przestrzeganie protokołów bezpieczeństwa, aby chronić personel i środowisko. W tym celu należy stosować się do instrukcji dotyczących szafki bezpieczeństwa biologicznego klasy II, środków ochrony osobistej (PPE), dekontaminacji, kontroli wycieków oraz utylizacji odpadów (chemioterapia odpadami leków niebezpiecznych): noś podwójne rękawiczki, okulary, odczyszcz powierzchnię roboczą i trzymaj zestaw do usuwania rozcieków blisko stanowiska pracy, wyraźnie oznacz pojemnik na odpady. Dla DMSO noś środki ochrony osobistej, pracuj w okapie wypalającym i stosuj się do procedur dekontaminacji i usuwania rozcieków.

2. Indukcja stresu przy użyciu cisplatyny

  1. Przygotowanie pożywki cisplatynowej
    1. Przygotuj roztwór zapasowy 50 mM cisplatyny, rozpuszczając ją w DMSO.
    2. Na płytkę hodowlową szklanej dolnej płytki przyłóż płytkę 1-5 x 10 x 10 bliskich komórek rurkowych, dodaj 2 mL podłoża DMF-12.
      UWAGA: Można użyć dowolnego dysku do hodowli szklanego dna.
    3. Dodaj cisplatynę do końcowego stężenia 2 μM na płytce eksperymentalnej, aby uzyskać 0,004% jako końcowe stężenie DMSO.
      UWAGA: Przygotuj 2 μL 50 mM cypplatyny rozcieńczonej w 1 998 μL wolnego nośnika FBS DMF-12 i dodaj 80 μL do płyty eksperymentalnej.
    4. Inkubuj komórki przez 24 godziny.

3. Obrazowanie

  1. Wykorzystanie mikroskopu konfokalnego
    1. Konfiguruj lasery na 405 nm (konwersja zdjęć Dendra2), 488 nm (nieprzekonwertowane wzbudzenie Dendra2) oraz 561 nm (fotokonwertowane Dendra2, Alexa 594).
    2. Włącz lasery i daj czas na stabilizację (~10 min)
  2. Badanie rozszczepienia i zdarzeń fuzji
    1. Konfiguruj lasery na 405 nm (konwersja zdjęć Dendra2), 488 nm (nieprzekonwertowane wzbudzenie Dendra2) oraz 561 nm (fotokonwertowane Dendra2, Alexa 594).
    2. Włóż dysk hodowli do komory inkubacyjnej.
    3. Dodaj wodę wokół komory i ustaw temperaturę na 37 °C. Należy utrzymać dostawyCO2 .
    4. Pozwól komorze inkubacyjnej się wyrównać. Zmiana temperatury obciąża komórki.
    5. Wizualizuj komórki za pomocą większego powiększenia i rozdzielczości do obrazowania mitochondriów.
    6. Otwórz menu rozwijane w lewym górnym rogu i wybierz opcje FRAP (rysunek 2A-D).
    7. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) za pomocą oprogramowania LAS X, gdzie będzie wykonywane fotobielenie.
      UWAGA: Obszar zainteresowania można narysować w dowolnym rozmiarze, co nie wpływa na wyniki, ponieważ analizowane są poszczególne mitochondria.
    8. Wykonaj serię zdjęć przed wybielaniem o niskiej intensywności lasera, aby ustalić bazową intensywność fluorescencji. Ustaw lasersto405nm długości fali dla przełączania zdjęć (0,00), 48 nm (0,20) i 56 nm (0,20), zapewniając ostrość ogniw.
      UWAGA: Wartości w nawiasach po długościach fal lasera wskazują intensywność lasera, którą można ustawić na dowolną wartość, ponieważ nie wpływa to na fotobielenie.
    9. Aby foto-wybielić komórki, należy zastosować impuls laserowy o wysokiej intensywności, aby wybielić w wyniku zwrotu z inwestycji. Ustaw lasery FRAP na 405 nm (4,00), 488 nm (0,00) i 561 nm (0,00). Ustaw poziom przedwybielania na 5,140 s przez 59 iteracji, a po wybielaniu na pożądany czas (Rysunek 2B) (intensywność lasera przed wybielaniem i po wybielaniu są wymienione w nawiasach).
    10. W przypadku obrazowania po wybielaniu kontynuuj wykonywanie zdjęć z niską intensywnością lasera, aby obserwować odzyskiwanie fluorescencji przez 10 minut. Utrzymuj lasery FRAP na 405 nm (0,00), 488 nm (0,50) i 561 nm (0,50).
      UWAGA: Czas wybielania może się różnić w zależności od typu komórek, w naszych rękach podobne czasy wybielania stosowano dla mitochondriów w komórkach rurkowych oraz komórkach międzymiąższowych zastawki (VIC). Po zakończeniu FRAP można wykonać zdjęcia lub obrazowanie żywych komórek (Rysunek 3 i Wideo uzupełniające 1), oprócz pozyskania zdjęć po wybielaniu.

4. Analiza obrazu

UWAGA: Ponieważ mitochondria są oznaczone białkiem Dendra2, podczas fotobielenia nieodwracalna zmiana konformacyjna w białku dendra2 prowadzi do wzrostu czerwonej fluorescencji wykrywanej przez laser 561 nm. Gdy czerwone mitochondria łączą się z niewybielonymi zielonymi mitochondriami, połączenie nadaje żółty kolor. Wykorzystując to zjawisko, można zmierzyć dynamiczne zdarzenia rozszczepienia i fuzji.

  1. Profilowanie połączonych czerwonych i zielonych mitochondriów
    1. Zainstaluj wtyczkę profilera RGB, aby profilować czerwony i zielony sygnał na całym wybranym miejscu.
      UWAGA: Stosuj się do instrukcji na stronie, aby dodać wtyczkę do sekcji Fiji.
    2. Otwórz ImageJ (Rysunek 4A).
    3. W menu File znajdź i otwórz plik, aby go przeanalizować (rysunek 4B).
    4. Wybierz tryb kolorowy kompozycji, sprawdź opcję automatycznego skalowania i otwórz wideo do analizy (Rysunek 4C).
    5. Wybierz prostokątny obszar do analizy (Rysunek 4D).
    6. Najedź kursorem w pobliżu wybranego obszaru prostokąta, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz duplikat (Rysunek 4E).
    7. Wybierz opcję duplikacji hiperstosu , która duplikuje wszystkie stosy obrazów (rysunek 4F).
    8. Aby przekonwertować zduplikowany stos do formatu RGB, wybierz obraz i wybierz opcję RGB w rozwijanym menu obrazu (Rysunek 4G-H).
    9. Obraz RGB jest zdublowany, wybierając tylko jedną klatkę (Rysunek 4I).
    10. Jeśli mitochondria na obrazie są zakrzywione, narysuj linię wzdłuż ich długości. Następnie przejdź do menu Edytuj , wybierz Wybrane i kliknij Wyprostowanie (Rysunek 5A).
    11. Wybierz tytuł obrazu i ustaw szerokość linii na 20 pikseli (rysunek 5B).
    12. Po wyprostowaniu mitochondriów narysuj linię wzdłuż interesujących ich mitochondriów, aby upewnić się, że są one w linii prostej (rysunek 5C).
    13. Otwórz wtyczkę RGB Profiler (Rysunek 5D).
    14. Po aktywacji wtyczka wygeneruje wykres pokazujący intensywność fluorescencji czerwonej i zielonej wzdłuż narysowanej linii. Wysokość każdego szczytu jest bezpośrednio proporcjonalna do intensywności fluorescencji (Rysunek 5E).
      UWAGA: Morfologię mitochondriów można również obliczyć za pomocą wtyczki analizatora mitochondriów25. Wybierz obszary używane do ekspozycji, przeanalizuj próg w wybranych obszarach, a następnie zmierz morfologię mitochondriów i analizę 2D. Można wybrać obwód obszaru i inne parametry.

5. Analizuj zdarzenia fuzji

  1. Ustalenie poziomu bazowego przed fuzją: Przed fuzją mitochondriów potwierdzić, że czerwona fluorescencja (561 nm) jest zlokalizowana w jednym mitochondrionie, a zielona (488 nm) w sąsiednim. Odpowiedni wykres intensywności powinien przedstawiać dwa wyraźne szczyty, jeden czerwony i jeden zielony, z minimalnym nakładaniem się.
  2. Potwierdź zdarzenie po fuzji: Po fuzji czerwony sygnał (reprezentujący zawartość macierzy Dendra2) powinien rozprzestrzenić się do sąsiedniego zielonego mitochondrium, wskazując na mieszanie zawartości. Wykres intensywności pokaże teraz nakładające się czerwone i zielone szczyty, potwierdzając zdarzenie fuzji.
  3. Ocena zdarzeń fuzji może być określona poprzez staranny dobór zdrowych mitochondriów oraz fotowybielonych mitochondriów do fuzji w obrazowaniu żywych komórek. Zmiana stosunku czerwieni do zieleni w czasie wskazywałaby na zdarzenie fuzji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pierwotne komórki nabłonkowe rurkowate zostały wyizolowane z nerki myszy przez trawienie enzymatyczne i hodowane w DMF-12 z dodatkiem 5% FBS oraz 1% penicylin-streptomycyny w temperaturze 37 °C i 5%CO2. Po osiągnięciu 80% konfluencji komórki były trypsynizowane (0,25% trypsyna-EDTA) i zasiewane z gęstością 5 × 104 komórek na dołek do szklanych płytek hodowlanych, wstępnie pokrytych kolagenem.

Pożywka hodowla zawierała cisplatynę w końcowym stężeniu μM w DMF-12, uzupełnion...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Rozszczepienie/fuzja mitochondriów to kluczowe, dynamiczne procesy utrzymujące homeostazę mitochondrialną i żywotność komórek26. Właściwa ocena tych procesów wymaga zaawansowanych technik obrazowania do wizualizacji i ilościowego określenia morfologii, dynamiki oraz funkcji mitochondriów27,28. Do pomiaru rozszczepienia i fuzji mitochondriów stosowano różne techniki. Do zaawansowanych narzędzi należą nanoskopia Stymulowanego Emisyjnego Uszc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Prace te były wspierane grantami badawczymi z grantu National Institute of Health numer 5R01DK135470-03, grantem ISAC-NIH 5U24DK128851-03 oraz stypendium podoktorskim American Heart Association.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
hodowla komórek 
DMEM/F12 Podstawa podłoża (Gibco/Cat. Nr 11320033 ) Hodowla komórek rurkowatych w bliskim proksym;
Serum bydlęce płodu (FBS)  5-10% suplementacji (Biowest/Cat. Nr S181B)  Wzbogacanie medium kulturowego 
Penicylina-Streptomycyna 100X (Gibco/Cat. Nr 15140122)  Ochrona antybiotykowa  
Kolagen IV i bezpłodny;powłoka  (Sigma-C5533-5M) i cnot;Powłoka płytowa Ibidi  
Trypsin-EDTA 0,25% roztworu (Gibco/Cat. Nr 25200056)  Odłączenie komórek 
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)  (Gibco/Cat. Nr 10010023 ) Mycie komórek  
Treatments 
Cisplatin 2 & mikro; M koncentracja robocza  (Selleck Chemicals/Cat. Nr S1166)  Indukcja naprężeń   
Dimetylsulfotlenek (DMSO)  kontrola pojazdów (Fisher Scientific/Cat. Nr D1391)  Kontrola rozpuszczalnika cisplatyny 
Imaging 
Medium bez fenolu czerwonego (Phenol Red-Free );obrazowanie na żywo (Gibco/Cat. nr 21041025)  Zmniejszona fluorescencja tła 
Biologia molekularna 
TRIzol®  Ekstrakcja RNA (Gibco/Cat. nr 15596018)  Całkowita izolacja RNA 
SYBR Green Master Mix  qPCR chemia (Termo Naukowe/Cat. Nr K0221)  Ekspresja genów dynamiki mitochondrialnej (DNM1L, FIS1, MFN1, MFN2, OPA1)  
Narzędzia fluorescencyjne  
Dendra2 Tag matrycy mitochondrialnej Laboratorium Jacsona (PhAMwycięte) Fotoprzełączalny reporter (konwersja 405nm, obrazowanie 488/561nm)  
Microscopes 
Mikroskop konfokalny Leica DMi8 obrazowanie żywymi komórkami oraz FRAP Lasery 405nm/488nm/561nm 
Obraz J https://imagej.net/software/fiji/downloads 
Wtyczka RGB Profiler & nbsp;https://imagej.net/ij/plugins/rgb-profiler.html. Analiza zdarzeń fuzji (nakładanie się czerwonych i zielonych sygnałów) 

Bibliografia

  1. Liesa, M., Palacin, M., Zorzano, A. Mitochondrial dynamics in mammalian health and disease. Physiol Rev. 89 (3), 799-845 (2009).
  2. Chen, Z., Berquez, M., Luciani, A. Mitochondria, mitophagy, and metabolic disease: towards assembling the puzzle. Cell Stress. 4 (6), 147-150 (2020).
  3. Ding, Y., et al. Mitochondrial segmentation and function prediction in live-cell images with deep learning. Nat Commun. 16, 743(2025).
  4. Jiao, H., et al. Mitocytosis, a migrasome-mediated mitochondrial quality-control process. Cell. 184 (11), 2896-2910.e13 (2021).
  5. Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
  6. He, X., et al. GTPBP8 modulates mitochondrial fission through a Drp1-dependent process. J Cell Sci. 137 (8), jcs261612(2024).
  7. San-Millán, I. The key role of mitochondrial function in health and disease. Antioxidants. 12 (4), 782(2023).
  8. Ponte, S., et al. Drp1-mediated mitochondrial fission regulates calcium and F-actin dynamics during wound healing. Biol Open. 9 (5), bio048629(2020).
  9. Sabouny, R., Shutt, T. E. The role of mitochondrial dynamics in mtDNA maintenance. J Cell Sci. 134 (24), jcs258944(2021).
  10. Huang, H., et al. Mitochondrial dynamics tracking with two-photon phosphorescent terpyridyl iridium(III) complexes. Sci Rep. 6, 20887(2016).
  11. Chen, W., Zhao, H., Li, Y. Mitochondrial dynamics in health and disease: mechanisms and potential targets. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 333(2023).
  12. Sabouny, R., Shutt, T. E. Reciprocal regulation of mitochondrial fission and fusion. Trends Biochem Sci. 45 (7), 564-577 (2020).
  13. Jin, P., et al. Mitochondrial adaptation in cancer drug resistance: prevalence, mechanisms, and management. J Hematol Oncol. 15 (1), 97(2022).
  14. Wai, T., et al. The membrane scaffold SLP2 anchors a proteolytic hub in mitochondria containing PARL and the i-AAA protease YME1L. EMBO Rep. 17 (12), 1844-1856 (2016).
  15. Schiavon, C. R., Shadel, G. S., Manor, U. Impaired mitochondrial mobility in Charcot-Marie-Tooth disease. Front Cell Dev Biol. 9, 624823(2021).
  16. Sivakumar, A., Shanmugarajan, S., Subbiah, R., Balakrishnan, R. Cardiac mitochondrial PTEN-L determines cell fate between apoptosis and survival during chronic alcohol consumption. Apoptosis. 25 (7-8), 590-604 (2020).
  17. Simula, L., et al. Mitochondrial metabolism sustains CD8+ T cell migration for an efficient infiltration into solid tumors. Nat Commun. 15 (1), 2203(2024).
  18. Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).
  19. Whelan, D. R., Bell, T. D. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5, 7924(2015).
  20. Palmer, C. S., et al. Super-resolution microscopy reveals the arrangement of inner membrane protein complexes in mammalian mitochondria. J Cell Sci. 134 (13), jcs252197(2021).
  21. Liu, F., et al. The interactome of intact mitochondria by cross-linking mass spectrometry provides evidence for coexisting respiratory supercomplexes. Mol Cell Proteomics. 17 (2), 216-232 (2018).
  22. Karbowski, M., Cleland, M. M., Roelofs, B. A. Methods Enzymol. , Elsevier. Netherlands. (2014).
  23. Kleih, M., et al. Direct impact of cisplatin on mitochondria induces ROS production that dictates cell fate of ovarian cancer cells. Cell Death Dis. 10 (11), 851(2019).
  24. Bouchareb, R., Yu, L., Lassen, E., Daehn, I. S. Isolation of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cells with fluorescent mitochondria. J Vis Exp. (187), e64147(2022).
  25. Chu, C. H., Tseng, W. W., Hsu, C. M., Wei, A. C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Front Phys. 10, 855775(2022).
  26. Montecinos-Franjola, F., Ramachandran, R. Methods Mol Biol. , Springer, US. (2020).
  27. Gaspar, M. L., Chang, Y. F., Jesch, S. A., Aregullin, M., Henry, S. A. Interaction between repressor Opi1p and ER membrane protein Scs2p facilitates transit of phosphatidic acid from the ER to mitochondria and is essential for INO1 gene expression in the presence of choline. J Biol Chem. 292 (45), 18713-18728 (2017).
  28. Karbowski, M. Adv Exp Med Biol. , Springer, US. (2010).
  29. Yang, X., et al. Mitochondrial dynamics quantitatively revealed by STED nanoscopy with an enhanced squaraine variant probe. Nat Commun. 11 (1), 3699(2020).
  30. Opstad, I. S., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy data of mitochondria and lysosomes in cardiomyoblasts under normal and galactose-adapted conditions. Sci Data. 9 (1), 98(2022).
  31. Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Front Cell Dev Biol. 8, 617(2020).
  32. Teixeira, P., Galland, R., Chevrollier, A. Super-resolution microscopies, technological breakthrough to decipher mitochondrial structure and dynamic. Semin Cell Dev Biol. 159 - 160, 38-51 (2024).
  33. Kirchweger, P., et al. Snapshots of mitochondrial fission imaged by cryo-scanning transmission electron tomography. J Cell Sci. 138 (9), jcs263639(2025).
  34. Collins, H. E., et al. Mitochondrial morphology and mitophagy in heart diseases: qualitative and quantitative analyses using transmission electron microscopy. Front Aging. 2, 670267(2021).
  35. Marshall, A. G., Damo, S. M., Hinton, A. Revisiting focused ion beam scanning electron microscopy. Trends Biochem Sci. 48 (6), 585-586 (2023).
  36. Adebayo, M., Singh, S., Singh, A. P., Dasgupta, S. Mitochondrial fusion and fission: the fine-tune balance for cellular homeostasis. FASEB J. 35 (6), e21620(2021).
  37. Munro, D., Baldy, C., Pamenter, M. E., Treberg, J. R. The exceptional longevity of the naked mole-rat may be explained by mitochondrial antioxidant defenses. Aging Cell. 18 (3), e12916(2019).
  38. Varuzhanyan, G., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics during spermatogenesis. J Cell Sci. 133 (14), jcs235937(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dynamika mitochondri wfuzja mitochondri wmikroskopia konfokalnatechnika FRAPbia ko Dendra2analiza w programie ImageJobrazowanie ywych kom rekmorfologia mitochondri w
Ocena dynamiki rozszczepienia/fuzji mitochondrialnej w komórkach rurkowatych nerek bliższych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.