Artykuł metodologiczny

Obrazowanie transportu endocytarnego na żywych komórkach z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

DOI:

10.3791/69284

⸱

17 października 2025

 ,  ,  , 
1Biozentrum, University of Basel

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endocytowy i retrogradacyjny transport białek z błony plazmatycznej do sieci trans-Golgiego jest niezbędny do utrzymania homeostazy błony i regulacji sygnalizacji. Tutaj opisujemy metodę obrazowania i ilościowego transportu endocytarnego białek transbłonowych za pomocą mikroskopii komórek żywych, wykorzystując deriwatyzowane nanociała anty-GFP w komórkach HeLa.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endocytoza receptorów i innych białek transbłonowych od powierzchni komórki po endosomy i dalej jest kluczowa dla homeostazy, fizjologii i funkcjonowania. Aby zbadać endocyty i wsteczny transport białek, opracowaliśmy wszechstronny zestaw narzędzi zawierający funkcjonalizowane nanociała do monitorowania transportu z powierzchni komórki do sieci trans-Golgiego (TGN) za pomocą obrazowania stałego i żywego komórek, mikroskopii elektronowej oraz elektroforezy żelowej w połączeniu z autoradiografią. Opracowaliśmy pochodne nanociała skierowane na zielone białko fluorescencyjne (GFP) lub mCherry – monomeryczne, niesieciujące i wysoko powinowujące białka wiążące białka – które można dodawać do linii komórkowych wyrażających interesujące białka błonowe z odpowiednimi zewnętrznymi znacznikami fluorescencji. Po związaniu z transbłonowymi reporterami tagowanymi GFP lub mCherry, nanociała są specjalnie internalizowane i przesyłane równolegle z endogennymi trasami sortowania reporterów. Te nanociałka zostały funkcjonalizowane z wybranymi fluoroforami do śledzenia transportu retrogradacyjnego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i obrazowania na żywo, z peroksydazą askorbatową 2 (APEX2) do rozdzielenia lokalizacji ultrastrukturalnej mikroskopią elektronową oraz z motywami sulfatacji tyrozyny do ilościowej oceny kinetyki przybycia TGN. W tym badaniu metodologicznym szczegółowo przedstawiamy ogólny protokół ekspresji bakterii i oczyszczania funkcjonalizowanych nanociał, a także generowanie stabilnych linii komórkowych GFP-reporter. Przykładem użyteczności tego podejścia do obrazowania komórek żywych jest wykorzystanie mCherry-modyfikowanego nanonono-GFP (VHH-mCherry) do analizy endocytarnego pobierania receptora transferyny (TfR) oraz kationowozależnego receptora mannozy-6-fosforanu (CDMPR).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endocytoza receptorów i innych białek transbłonowych (TM) z błony plazmatycznej do różnych przedziałów wewnątrzkomórkowych jest istotna dla utrzymania homeostazy błony 1,2. Po internalizacji przez endocytozę zależną od klatryny lub niezależną, ładunki białkowe najpierw zapełniają wczesne endosomy, skąd są dalej sortowane wzdłuż układu endolizosomalnego, recyklingowane do błony plazmatycznej lub retrogradywnie wysyłane do sieci trans-Golgiego (TGN)3,4,5. Recykling z endosomów i/lub powierzchni komórki do TGN jest częścią cyklu funkcjonalnego wielu transbłonowych receptorów ładunkowych, takich jak receptory manozy-6-fosforanu zależne od kationów i niezależne od kationów (CDMPR i CIMPR), dostarczające nowo syntetyzowane hydrolazy lizosomatowe z TGN do późnych endosomów i lizosomów 6,7,8. Wntless (WLS) transportuje ligandy Wnt na powierzchnię komórki9, 10,11,12, czyli TGN46, które eskortują rozpuszczalne białka wydzielnicze ładunku, w tym czynnik podwyższony (PAUF) i inne ładunki CARTS, z obszaru TGN 13,14,15,16. Podczas gdy wszystkie te receptory cargo przechodzą przez TGN w celu zbierania nowych białek klienckich, receptor transferynowy (TfR), który internalizuje transferrynę wiązaną żelazem, jest wyłączony z powrotu Golgiego 17,18,19,20,21.

Aby zbadać ruch endocytarny i retrogradacyjny, wcześniej opracowaliśmy zestaw narzędzi oparty na nanociałach, zaprojektowany do znakowania i śledzenia białek cargo od powierzchni komórki do przedziałów wewnątrzkomórkowych17. Nanocciała stanowią nową klasę wiążących białek pochodzących z homodymerycznych przeciwciał tylko na łańcuch ciężkich (hcAbs), naturalnie występujących u wielbłądów i ryb chrząstkowych22,23. Reprezentują zmienną domenę łańcucha ciężkiego (VHH) hcAbs i oferują liczne zalety w porównaniu z konwencjonalnymi przeciwciałami (np. IgG): są monomeryczne, małe (~15 kDa), bardzo rozpuszczalne, pozbawione wiązań dwusiarczkowych, mogą być ekspresowane bakteriami i są podatne na selekcję do wiązania o wysokiej afinitecie24. Aby zwiększyć wszechstronność i szerokie zastosowanie tego zestawu narzędzi nano, zastosowaliśmy funkcjonalizowane nanociała anty-GFP do znakowania powierzchniowego i śledzenia białek oznaczonych tagami GFP na ich domenach zewnętrznych lub lumenalnych. Poprzez rekombinowaną konjugację nanociał z mCherry, peroksydazą askorbianową 2 (APEX2) lub sekwencjami sulfatacji tyrozyny, retrogradacyjny transport prawdziwych białek transbłonowych ładunków można analizować za pomocą stałej i żywej mikroskopii fluorescencyjnej, mikroskopii elektronowej lub testów biochemicznych z użyciem autoradiografii. Biorąc pod uwagę, że sulfatacja tyrozyny, katalizowana przez tyrozyloproteinowe sulfotransferazy TPST1 i TPST2, jest modyfikacją posttranslacyjną ograniczoną do trans-Golgi/TGN, ta strategia umożliwia bezpośrednią ocenę dynamiki transportu i kinetyki z powierzchni komórki do przedziału Golgiego 25,26,27. Ostatnio rozszerzyliśmy ten repertuar funkcjonalizowanych wiążących białek o derywowane nanociała anty-mCherry. Te odczynniki okazały się kluczowe w rozkładaniu maszynowo zależnych szlakow transportowych MPR, szczególnie CDMPR17,28, do TGN poprzez analizy biochemiczne.

Podczas gdy poprzednie badanie koncentrowało się głównie na zastosowaniu nanociał modyfikowanych sekwencjami sulfatacji tyrozyny do biochemicznej oceny przybycia TGN za pomocą autoradiografii19, ten artykuł metodyczny opisuje generowanie fluorescencyjnie oznakowanych, funkcjonalizowanych nanociał (VHH-mCherry) oraz linii komórkowych raportujących do obrazowania komórek żywych transportu endocytów. W połączeniu z dodatkowym fluorescencyjnym białkiem reporterowym rezydenta Golgiego, protokół ten może być dalej adaptowany, aby służyć jako solidny workflow do ilościowej analizy obrazowania obrazowania komórek żywych transportu z endosomu do TGN wybranych białek cargo.

Przed zastosowaniem tego protokołu badacze powinni upewnić się, że docelowe białko jest wyrażane jako konstrukcja fuzji oznaczona tagiem GFP, zazwyczaj generowana standardowymi metodami klonowania molekularnego. Funkcjonalizowane nanociała można łatwo wytwarzać w bakteriach przy wydajności wystarczającej do eksperymentów z oznakowaniem powierzchniowym, przy czym stężenia robocze w niskim zakresie nanomolowych są odpowiednie do większości testów obrazowania komórek żywych. Użytkownicy powinni również pamiętać, że kinetyka transportu może się różnić między białkami cargo, co wymaga regulacji czasu znakowania lub częstotliwości obrazowania, aby optymalizować transport endocytów lub endosomów do TGN.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transformacja bakteryjna z użyciem VHH-mCherry

UWAGA: Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem ekspresji, oczyszczania i analizy funkcjonalizowanych nanociał anty-GFP, jak opisanowcześniej 17. Poniższe kroki zostały dostosowane do VHH-mCherry i są zgodne z wcześniejszym raportem metodologicznym19.

  1. Rozmrażają bakterie chemokompetentne (50-100 μL) odpowiednie do ekspresji białek (np. komórki Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3), umieszczając je w lodzie.
    UWAGA: Przygotuj komórki bakteryjne chemokompetentne zgodnie ze standardowymi protokołami laboratoryjnymi. Do tego celu można stosować komercyjnie dostępne ogniwa BL21 (DE3) firmy NEB.
  2. Dodaj 50 ng plazmidu kodującego funkcjonalizowaną konstrukcję VHH-mCherry (Addgene #109421). Aby zapewnić efektywną biotynylację specyficzną dla miejsca reportera nano-reportera podczas ekspresji bakterii, współtransformuj się z potrójną ilością (150 ng) plazmidu kodującego bakteryjną biotynową ligazę BirA (Addgene #109424). Delikatnie przekręć rurkę 4-5 razy, aby wymieszać komórki z plazmidowym DNA.
    UWAGA: Współtransformacja z plazmidem kodującym BirA nie jest konieczna, jeśli nie jest wymagana biotynowa biotyna akceptorowa peptydowa (BAP).
  3. Inkubuj mieszankę na lodzie przez 30 minut. Unikaj pobudzenia podczas tego etapu.
  4. Komórki bakteryjne wywołujące szok cieplny, umieszczając je dokładnie na 20 sekund w kąpieli wodnej lub bloku grzewczym na dokładnie 20 sekund w temperaturze 42 °C.
  5. Dodaj 1 ml podłoża z bulionu Luria (LB) w temperaturze pokojowej (RT) i inkubuj przekształcone bakterie w termoshakerze (250-500 rpm) przez 1 godzinę w 37 °C, aby umożliwić fenotypową ekspresję genów oporności na antybiotyki.
    UWAGA: Aby przygotować 1 l LB medium, dodaj 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g tryptonu, 10 g NaCl, uzupełnij objętość wodą i sterylizuj przez autoklaw.
  6. Rozpyl bakterie przez wirowanie w 11 000 x g przez 1 minutę, a następnie ponownie zawiesij granulat w 100 μL świeżego medium LB. Dokładnie wymieszaj przez pipetowanie.
  7. Nakładanie zawieszonych bakterii na wcześniej podgrzane płytki LB zawierające odpowiednie antybiotyki (np. z 50 μg/mL kanamycyny; jeśli są współtransformowane z BirA, należy również uwzględnić 50 μg/mL karbancycyliny, patrz krok 1.2).
  8. Inkubuj płytki LB uzupełnione antybiotykiem do góry nogami w temperaturze 37 °C przez 13-15 godzin.
    UWAGA: Protokół można zatrzymać tutaj. Płytki z rozwiniętymi koloniami można przechowywać w temperaturze 4 °C i uszczelniać przepuszczalną folią, aby zapobiec wysychaniu.

2. Hodowla bakteryjna w cieczy i indukcja ekspresji VHH-mCherry

  1. Wybierz pojedynczą kolonię bakteryjną z płytki transformacyjnej i zaszczep ją w kolbie Erlenmeyera zawierającej 20 mL podłoża LB z antybiotykami. Inkubuj hodowlę w inkubatorze potrząsającym przez 13-15 godzin w temperaturze 37 °C (patrz także krok 1.7 dotyczący antybiotyków selekcyjnych).
  2. Następnego dnia rozcieńcz nocną pochówkę bakteryjną o pojemności 20 mL do świeżej kolby zawierającej 1 L podłoża LB z odpowiednimi antybiotykami selekcyjnymi.
  3. Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 °C, aż hodowla osiągnie gęstość optyczną 600 nm (OD600) wynoszącą 0,6-0,7.
    UWAGA: Pozwól hodowli ostygnąć do RT lub do 16 °C przed indukcją ekspresji białek.
  4. Indukować ekspresję VHH-mCherry (oraz BirA, jeśli jest współekspresjony) poprzez dodanie 1 mL 1 mL izopropyl-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG), aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM induktora (rozcieńczenie 1:1000). Jeśli przeprowadzono współtransformację z plazmidem ekspresyjnym BirA, uzupełnić hodowlę 10 mL 20 mM roztworu zapasowego D-biotyny, co daje końcowe stężenie 200 μM D-biotyny w podłożu wzrostowym. Ułatwia to biotinylację epitopu akceptora biotyny (BAP) obecnego w konstrukcji VHH-mCherry.
    UWAGA: Przygotuj zapas D-biotyny w ddH2O i rozpuszczaj go stopniowo dodając 500 mM NaH2PO4.
  5. Inkubuj hodowlę 1 L indukowaną IPTG przez 13-15 godzin w temperaturze 16 °C, aby sprzyjać optymalnemu fałdowaniu i wydajności białek.
    UWAGA: Warunki ekspresji dla nowo zaprojektowanych konstrukcjonów nanono-innych z innymi znacznikami fluorescencyjnymi mogą wymagać empirycznej optymalizacji przez badacza.
  6. Przełóż hodowlę do butelki do wirowania o pojemności 1 l i pozyskaj komórki przez wirowanie w stężeniu 5 000 x g w 4 °C przez 45 minut. Zrzuć supernatant do odpowiednich ciekłych odpadów biologicznych i przystąpić do etapów oczyszczania.
    UWAGA: Protokół można w tym momencie zatrzymać, przechowywając granulat bakteryjny w temperaturze -80 °C. Pellet VHH-mCherry zazwyczaj wygląda na różowy, co wskazuje na prawidłowe składanie fluorescencyjnego białka fuzyjnego.

3. Oczyszczanie VHH-mCherry oparte na IMAC

  1. W razie potrzeby rozmroz zamrożony granulat bakteryjny na lodzie (patrz także krok 2.6).
  2. Dodaj 30 mL buforu wiążącego lodowato (20 mM imidazolu w 1x PBS) do osadu komórek bakteryjnych i dokładnie zawiesaj, pipetując w górę i w dół. Przełóż zawiesinę do oznaczonej rurki wirówki o pojemności 50 mL.
  3. Uzupełnić ponownie zawiesowane komórki lizozymem 200 μg/mL, DNazę I 20 μg/mL, 1 mM MgCl2 oraz 1 mM fenylometylosulfonylowofluorek (PMSF). Inkubuj mieszankę przez 10 minut w RT, a następnie 1 godzinę w 4 °C na rotatorze end-over-end.
    UWAGA: PMSF jest toksyczne. Przygotowywanie i obsługa roztworów w kapturze chemicznej, w rękawiczkach, fartuchu laboratoryjnym i ochronie oczu; utylizować odpady zawierające PMSF w pojemnikach na halogenowane odpady organiczne. Do eksperymentów stosowano roztwór 0,1 M, który dodatkowo rozcieńczono.
  4. Mechanicznie rozbijaj komórki bakteryjne za pomocą sonikatora na końcówce włożonego bezpośrednio do zawiesiny. Stosuj stałe trzy impulsy sonifikacyjne trwające po 1 minutę, pozwalając na 1-minutowy odstęp chłodzenia między każdym impulsem przy określonych ustawieniach sonikatora (rozmiar końcówki sondy: 6 mm, końcówka stała; Amplituda 40%; Cykl pracy (tryb impulsowy): 1 s WŁĄCZONY/1 s WYŁĄCZONY)
  5. Lizat należy klarować przez wirowanie w 15 000 x g w 4 °C przez 45 minut, aby rozpylić zanieczyszczenia komórek bakteryjnych i nienaruszone bakterie.
    UWAGA: Lizat można przelać do butelki wirówki lub zastosować do probarek 5 mL do wirowania stołowego.
  6. Ostrożnie przelej powstały supernatant do nowej probówki 50 mL i wyrzuć granulat do odpowiednich odpadów biologicznych.
  7. Trzymaj wyczyszczony lizat na lodzie, przygotowując się do chromatografii powinowactwa unieruchomionego metalu (IMAC). Do izolacji nanociał oznaczonych histydyną wykorzystaj gotowe, jednorazowe kolumny oczyszczające His-tag, zoptymalizowane do pracy w przepływie grawitacji.
  8. Przymocuj kolumny Ni-NTA (niklowo-nitrilotrioctowy kwas) na metalowym stojaku lub odpowiednim uchwytie na kolumny.
    1. Opróżnij bufor magazynowy z kolumn i wyrównuj z 10 mL buforu wiążącego (20 mM imidazolu w 1x PBS).
    2. Pozwól buforowi przechodzić przez niego grawitacją; Usuwać przepływ jako odpady biologiczne.
  9. Stopniowo nakładaj usunięty lizat bakteryjny (~30 mL) na kolumnę. Pozwól mu przepływać grawitacją i odrzuć przepływ.
  10. Przemyj kolumnę dwoma kolejnymi objętościami po 10 mL buforu wiążącego (20 mM imidazolu w 1x PBS).
  11. Elutuj związane nanociała 2 mL buforu elucijnego (500 mM imidazolu w 1x PBS) do rurki mikrowirówki o pojemności 2 mL.
  12. Wykonaj wymianę bufora.
    1. Wyrównaj kolumnę odsalaniającą umieszczoną w adapterze rurki 50 mL, płucząc 5 mL z 5 mL 1x PBS.
    2. Pozwól buforowi całkowicie wejść do upakowanej żywicy; Usuń przepływ. Po końcowym płukaniu PBS wiruj kolumnę w 1000 x g przez 2 minuty.
    3. Usuń przepływ. Załóż kolumnę z adapterem na nową rurkę 50 mL. Załaduj 2 mL eluowanego funkcjonalizowanego nanonu (od kroku 3.11) na kolumnę odsolania wyrównaną przez PBS i obróć z 1000 x g przez 2 minuty, zbierając eluat.
      UWAGA: Dializa może być stosowana alternatywnie do wymiany.
  13. Ilościowo określić stężenie oczyszczonego białka VHH-mCherry za pomocą kwasu bicynchoninowego (BCA) lub testu Bradforda, zgodnie z protokołami producenta.
    UWAGA: Dla efektywnego pobierania nanoenzymatów w aplikacjach obrazowania komórek żywych zaleca się końcowe stężenie w bazie 5-10 mg/ml.

4. Weryfikacja ekspresji i czystości VHH-mCherry (barwienie Coomasie)

  1. Przygotuj żel dodecylosiarczanu sodu i poliakrylamidu o stężeniu 10% (SDS-PAGE) zgodnie z ustalonymi protokołami laboratoryjnymi.
    UWAGA: Alternatywnie można stosować komercyjnie dostępne prefabrykowane żele gradientowe firmy Bio-Rad dla wygody i powtarzalności.
  2. Zachowaj 20 μg oczyszczonego VHH-mCherry w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i odkurz przez gotowanie w buforze próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
  3. Załaduj zdenaturowaną próbkę nanonomidu na żel SDS-poliakrylamid i wykonuj elektroforezę zgodnie ze standardowymi procedurami PAGE, aż barwnik śledzący (np. bromofenolowy błękit) dotrze do dna żelu rozdzielającego.
  4. Kontynuuj barwienie i odbarwianie żelu przez Coomasie.
    1. Ostrożnie usuń żel z kasety i zanurz go w roztworze barwiącym Coomassie (5% z 10 g/l materiału Coomassie Brilliant Blue w 10% kwasie octowym i 45% metanolu w ddH2O) przez 20-30 minut w RT na delikatnie potrząsającej platformie. Upewnij się, że żel jest całkowicie zanurzony w roztworze barwiącym.
    2. Żel odbarwić za pomocą roztworu odbarwiacza (7,5% kwasu octowego i 15% metanolu wddH2O), wykonując 2-3 kolejne płukania po 1 godzinę w RT. Aby optymalne zredukować tło, pozostawić żel na 13-15 godzin w świeżym roztworze odbarwiającym.
      UWAGA: Nadmiar barwnika można skutecznie wchłonąć, umieszczając ręczniki papierowe wokół żelu podczas procesu odbarwiania. Roztwory barwiące i odbarwiające zawierają łatwopalny metanol oraz drażniący kwas octowy. Używaj w okapie oparowym, noś rękawiczki i gogle oraz zbieraj zużyte roztwory w wyznaczonych pojemnikach na łatwopalne ciecze.
  5. Wyobraź sobie żel za pomocą systemu dokumentacji żelowej lub wybranego aparatu.
    UWAGA: Aby dodatkowo potwierdzić ekspresję nanono, można wykonać immunobbloting z użyciem przeciwciał specyficznych dla epitopu (patrz także Rysunek 1C).

5. Generowanie linii komórkowych HeLa oznaczonych GFP za pomocą transdukcji retrowirusowej

UWAGA: Różne linie komórkowe GFP HeLa α Kioto (tutaj po prostu HeLa lub HeLa α) zostały wcześniej wygenerowane17. Do demonstracji testu obrazowania komórek żywych stosuje się jako reprezentatywne białka cargo tagowane GFP lub TfR. Podczas gdy białka TM o topologii typu I są oznaczone tagiem GFP na skrajnym końcu N, białka TM o topologii typu II wymagają fuzji GFP na końcu C.

  1. Geny kodujące EGFP-CDMPR (Addgene #182642) lub TfR-EGFP (#243763) zostały wcześniej subsklonowane do wektora retrowirusowego pQCXIP przy użyciu standardowych technik klonowania enzymów restrykcyjnych17. Po przekształceniu w chemokompetentny E. coli przygotować plazmidowe DNA o wysokiej czystości przy użyciu zestawów przygotowawczych midi (np. od Macherey-Nagel).
    UWAGA: Komórki bakteryjne dla chemokompetentnych należy przygotować zgodnie ze standardowymi protokołami laboratoryjnymi. NEB 5-alfa Kompetentna E. coli z NEB może być stosowana do klonowania i oczyszczania plazmidów.
  2. Aby uzyskać stabilne linie komórkowe GFP reporter HeLa, cząstki retrowirusowe są produkowane przez transfekcję linii komórkowej opakowania Phoenix ampho. Wszystkie prace hodowlane komórek prowadzone są w warunkach laminarnego przepływu BSL2.
    1. Dzień przed transfekcją zasiej 2,0-3,0 x 10 6 komórek Phoenix ampho do naczynia o średnicy 10 cm w 10 mL medium, aby osiągnąć 60%-80% konfluencję do następnego dnia. Amphomorfomorfy Phoenix są utrzymywane w DMEM wysokoglukozowym GlutaMAX-I z 10% płodowej surowicy bydła (FBS), 100 jednostkami/ml penicyliny/streptomycyny oraz 1 mM pirowierianianu sodu.
    2. W dniu transfekcji zamień podłoże na 10 ml świeżego, kompletnego podłoża.
    3. W mikrowirówce o pojemności 1,5 mL połącz 1 mL bezsurowiczego i suplementacyjnego DMEM o wysokiej glukozie GlutaMAX-I z 10 μg pQCXIP-EGFP-CDMPR lub pQCXIP-TfR-EGFP oraz 30 μL odczynnika transfekcyjnego FuGENE HD. Dokładnie wymieszaj przez pipetowanie.
    4. Inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby umożliwić powstawanie kompleksów odczynników DNA.
    5. Całą mieszankę transfekcyjną dodaj krople do kultury ampho-feniksa. Delikatnie mieszaj talerzem, aby równomiernie rozłożyć złożoności.
    6. Inkubować transfekowane komórki amphomorfomorfów Feniksa przez 13-15 godzin w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
      UWAGA: Można stosować alternatywne linie komórkowe pakowania, pod warunkiem że są one kompatybilne z systemem wektorowym Retro-X Q.
  3. Następnego dnia wyrzuć podłoże transfekcyjne i zastąp go 7 ml świeżego, kompletnego medium, aby zwiększyć produkcję wirusa.
  4. Po 48 godzinach i opcjonalnie 72 godzinach po transfekcji pobierz supernatant hodowli (~7 mL) zawierający cząstki wirusa za pomocą pipety. Monitorowanie ekspresji GFP w transekowanych komórkach ampfonii feniksa za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub systemu obrazowania (np. Bio-Rad ZOE).
    UWAGA: Ponownie, manipulacje retrowirusowe wymagają izolacji BSL-2. Wszystkie prace wykonuj w certyfikowanej szafie bioasekuracyjnej, zakładaj rękawiczki, fartuch laboratoryjny i ochronę oczu, a powierzchnie dekontaminuj 1% heksakwartem, a następnie 70% etanolem przed utylizacją odpadów przez autoklaw.
  5. Filtruj zebrany wirusowy supernatant przez filtr o rozmiarze 0,45 μm. Filtrowany supernatant może być używany natychmiast (patrz krok 5.7) lub przechowywany w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego użytku lub w -80 °C do długotrwałego przechowywania. Należy zauważyć, że miary wirusa mogą spaść po zamrożeniu.
  6. Aby ustanowić stabilne komórki raportujące GFP HeLa, należy przejść do transdukcji retrowirusowej z użyciem filtrowanego supernatantu wirusowego. Wszystkie procedury muszą być wykonywane w warunkach BSL2.
    1. Dzień przed transdukcją należy zasiać około 2,0-3,0 x 10komórek HeLa α w naczyniu o średnicy 10 cm z 10 ml podłoża, aby osiągnąć łączność 60%-80% do następnego dnia. Hodowla komórek HeLa α hodowana jest w DMEM o wysokiej glukozie GlutaMAX-I, uzupełnionej 10% FBS oraz 100 U/mL penicyliny/streptomycyny.
    2. Zmieszaj filtrowany supernatant wirusowy z polibrenem o stężeniu 15 μg/mL (bromek heksadymetrów), aby zwiększyć skuteczność infekcji.
      UWAGA: Polibren jest drażniącym – podczas przygotowania materiału obchodz się z nim w rękawiczkach i ochronie oczu, unikaj powstawania aerozoli oraz utylizuj roztwory zawierające polibren jako niebezpieczne odpady chemiczne.
    3. Następnego dnia zamień standardowy podłoże do wzrostu nierozcieńczonym supernatantem wirusowym zawierającym polibren, zapewniając, że cała powierzchnia naczynia jest pokryta.
    4. Inkubuj komórki HeLa α pod transdukcją przez 13-15 godzin w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
      UWAGA: Aby określić miana wirusa, można przeprowadzić seryjne rozcieńczanie i testy infekcji na komórkach HeLa α. W tym przypadku titrowanie jest opcjonalne, ponieważ retrowirusy infekują tylko komórki dzielące się.
  7. Dzień po transdukcji wyrzuć podłoże wirusowe do odpadów BSL2 i zastąp je 10 mL świeżego, kompletnego HeLa α medium. Inkubuj przez 13-15 godzin w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
  8. Następnego dnia rozpocznij selekcję, zastępując podłoże kompletnym medium zawierającym 1,5 μg/mL puromycyny.
  9. Utrzymuj presję selekcyjną przez 2-3 tygodnie, przepuszczając komórki w razie potrzeby. Przed przeniesieniem genetycznie modyfikowanych komórek do środowiska BSL1 upewnij się, że są wolne od cząstek wirusa zdolnych do replikacji.
  10. Aby uzyskać jednorodną populację, stosuje się izolację klonalną z użyciem pierścieni klonujących lub cylindrów albo sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). FACS można wykonać na transdukowanych komórkach HeLa α przy użyciu FACSAria III lub fuzji (BD Biosciences), aby wzbogacić ją dla populacji o jednolitej ekspresji GFP opartej na intensywności fluorescencji.
    UWAGA: Ekspresję raportu GFP w komórkach HeLa α można dodatkowo zweryfikować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej stałych komórek lub immunoblotingu z użyciem przeciwciał przeciw GFP (patrz także Rysunek 2C).

6. Wychwyt VHH-mCherry przez hodowlane komórki do obrazowania żywych komórek

UWAGA: Wszystkie procedury hodowli komórek przeprowadzane są w warunkach sterylnych w warstwie laminarnej przed mikroskopią żywych komórek.

  1. 6.1 W sterylnym przepływie laminarnym w każdej jamie μ-szkiełkowego szkła ibiTreat komory ibiTreat zasiewa około 50 000 do 110 000 komórek HeLa stabilnie wyrażających raport CDMPR lub TfR tagowany GFP. Użyj 700 μL kompletnego pożywki hodowlanego zawierającej antybiotyki (DMEM wysokoglukozowe, bez fenolu czerwonego), uzupełnionej 10% FBS, 100 U/mL penicyliny/streptomycyny, 2 mM l-glutaminy oraz 1,5 μg/mL puromycyny.
  2. Inkubuj komórki przez 13-15 godzin w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5%CO2 , aby umożliwić prawidłową adhezję i proliferację. Komórki powinny osiągnąć około 80% konfluencji do następnego dnia.
  3. W dniu obrazowania, tuż przed eksperymentem, delikatnie zamień medium w każdej studni na 350 μL świeżego, wolnego od fenolu czerwonego medium kompletnego.
  4. Równolegle przygotować roztwór roboczy VHH-mCherry w końcowym stężeniu 2,5 μg/mL (około 50 nM) w podgrzanym medium bez czerwieni fenolowej. Utrzymuj roztwór w temperaturze 37 °C do użycia.
  5. Po uruchomieniu zautomatyzowanego systemu obrazowania z żywymi komórkami (np. FEI MORE lub Nikon Ti2 X-Light V3), podgrzej komorę inkubacyjną mikroskopu do 37 °C przy stężeniu 5%CO2 , a następnie przenieś komorę mikroskopową ibidi na mikroskop i skonfigurować ustawienia akwizycji w następujący sposób.
    1. Wybierz U PlanS Apo 100x NA 1.4 i dodaj komorę mikroskopową ibidi na etapie mikroskopu.
    2. Ustaw dwa kanały z odpowiednią długością fali wzbudzenia i filtrami emisji jednopasmowej dla EGFP (np. 470/20 nm, em: 517/20 nm) i mCherry (np. 550/15 nm, em: 590/20 nm).
    3. Wybierz krótki czas naświetlania i niską intensywność oświetlenia, aby uniknąć fotobielenia (np. 50 ms i 5% mocy dla EGFP, 160 ms i 25% dla mCherry). Ważne jest, aby wybrane wartości były utrzymywane na stałym poziomie we wszystkich eksperymentach.
    4. Dla każdego warunku (=well) zapisz współrzędne 10 różnych pól widzenia z 3-4 komórkami w centrum w liście punktów.
    5. Wyobraz sobie każdą pozycję z tej listy punktów raz za pomocą jednego zdjęcia. To są zdjęcia referencyjne sprzed dodania VHH-mCherry.
    6. Aby rozpocząć pobieranie przez endocyty, delikatnie dodaj 350 μL wcześniej podgrzanego roztworu VHH-mCherry do każdego dołka, zapewniając minimalne zakłócenia monowarstwy komórki. Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
    7. Obrazuj każdy punkt na liście punktów wielokrotnie w eksperymencie time-lapse przez 100 klatek z 36-sekundowym opóźnieniem między klatkami przy temperaturze 37 °C przy 5%CO2.
    8. Aby zmniejszyć wybielanie foto, należy najpierw zlecić pobieranie kanałów na obrazowanie mCherry, a następnie EGFP.
    9. Aby zwiększyć przepustowość, zlec najpierw zdobywaniu wszystkich pozycji kolejno i powtarzaj to dla każdego punktu czasu.

7. Analiza obrazów endocytarnego VHH-mCherry

  1. Wstępne przetwarzanie obrazów po akwizycji i ekstrakcja danych na Fidżi.
    1. Załaduj obraz timelapse za pomocą wtyczki importera Bio-Formats z włączoną opcją podziału kanałów.
    2. Koryguj dryf boczny za pomocą wtyczki MultiStackReg. Użyj kanału EGFP jako odniesienia i zastosuj transformację także do kanału mCherry.
    3. Na komórkę narysuj obszar zainteresowania (ROI) narzędziem wielokątowym (np. wokół obszaru okołojądrowego) i dodaj go do menedżera ROI.
    4. Dla obu kanałów mierz średnią intensywność we wszystkich ROI i punktach czasowych za pomocą funkcji Multi Measure w menedżerze ROI i zapisz powstałą tabelę jako plik tekstowy.
    5. Otwórz odpowiadający obraz referencyjny i powtórz pomiar dla każdego ROI.
  2. Analiza danych w celu określenia krzywych absorpcji endocytów
    1. Otwórz plik tekstowy i odejmij każdą liczbę klatki o 1, aby zaczynały się od 0, a następnie pomnóż każdą liczbę klatki przez opóźnienie między klatkami w s (czyli 36).
    2. Dla każdego ROI należy odejmować średnią intensywność w kanale VHH-mCherry obrazu referencyjnego od każdej klatki odpowiadającego obrazu poklatkowego w kanale VHH-mCherry, aby usunąć autofluorescencję i tło.
    3. Dla każdej klatki i zwrotu z inwestycji podziel intensywność VHH-mCherry odejmowaną przez tło przez średnią intensywność kanałów EGFP, aby uwzględnić wahania intensywności w ramach ROI inne niż VHH-mCherry, np. ruch Golgiego, skurcz komórek, dryf z lub niestabilności oświetlenia.
    4. Normalizuj powstałą krzywą do jej własnego maksimum.
    5. Wybierz zakres klatek, aby wykluczyć wszelkie artefakty na początku (np. dodawanie mediów) lub na końcu (np. dryf, wybielanie) timelapse.
    6. Dopasuj dane krzywej do pojedynczej funkcji wykładniczego zaniku modelującej proces kinetyczny pierwszego rzędu:
      figure-protocol-1
      gdzie I(t) to znormalizowana intensywność w czasie t, a t0 uwzględnia opóźnienie czasowe między dodawaniem VHH-mCherry a rozpoczęciem zapisu. Na podstawie stałej szybkości k oblicz okres półtrwania τ1/2 procesu jako:
      figure-protocol-2
      UWAGA: Podczas eksperymentu z kilkoma kolejnymi obrazami pola widzenia (FOV) w jednym punkcie czasowym, każde odpowiadające mu t0 może się nieco różnić, ale powinno się zwiększać z jednego FOV na drugie.
    7. Powtórz procedurę dla wszystkich zbiorów danych i raportuj wartości okresu półtrwania w wykresach pudełkowych.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać wsteczny transport białek do różnych przedziałów wewnątrzkomórkowych, niedawno uruchomiliśmy narzędzie oparte na nanociałkach anty-GFP do oznaczania i śledzenia rekombinowanych białek fuzji z powierzchni komórki17. Tutaj opisujemy bakteryjną produkcję takich derivatyzowanych nanociał i pokazujemy ich przydatność w monitorowaniu endocytów za pomocą obrazowania żywych komórek. W połączeniu z fluorescencyjnym reporterem rezydentnym w Golgi, protokół ten oferuje solidną platformę do ilościowego badania wstecznego transportu wybranych białek cargo do sieci trans-Golgiego (TGN) w czasie rzeczywistym.

Wygenerowaliśmy zbiór odrębnych, funkcjonalizowanych nanociał anty-GFP, które dzielą wspólną modułową architekturę, wykorzystując standardowe techniki klonowania molekularnego17. Chociaż obecne badanie koncentruje się na fluorescencyjnym wariancie VHH-mCherry, dodajemy także dodatkowe derivatyzowane nanociała, aby zilustrować wszechstronność tego zestawu narzędzi i podkreślić ich potencjał do przyszłych zastosowań. Nasza najprostsza konstrukcja, VHH-std (standardowa std), obejmuje domenę VHH, epitopy T7 i HA do wykrywania na bazie przeciwciał, C-końcowy znak heksahistidyny (His6) do oczyszczania oraz sekwencję akceptorów biotyny (BAP) umożliwiającą enzymatyczną biotinylację i testy pulldown oparte na streptawidynie o wysokiej afinitetności (Rysunek 1A). Z tego rdzenia opracowano różne pochodne nano, które ułatwiają badania endocytów i retrogradacji poprzez analizę biochemiczną, obrazowanie komórek stałych i żywych oraz mikroskopię elektronową.

Do obrazowania transportu endocytarnego w żywych komórkach zaprojektowaliśmy fluorescencyjną anty-GFP nanonobody zawierającą fluorofor z widmami wzbudzenia i emisji odmiennymi od tych GFP, zapewniając tym samym optymalną separację widmowę podczas mikroskopii fluorescencyjnej. Na podstawie jego lepszych właściwości fałdowania u E. coli indukowanego przez IPTG oraz dobrze scharakteryzowanych właściwości fotofizycznych, wybraliśmy mCherry jako flagowy tag z wyboru. Inne fluorofory przesunięte ku czerwieni, takie jak monomeryczne białko fluorescencyjne czerwonego (mRFP), również byłyby odpowiednimi alternatywami w teorii, ale mCherry okazał się szczególnie wytrzymały i skuteczny w tym układzie.

Jaki jest potencjał innych funkcjonalizowanych nanociał niż VHH-mCherry? Aby zbadać transport białek z błony plazmatycznej do sieci trans-Golgiego (TGN), wykorzystaliśmy specyficzną lokalizację TPST specyficzną dla przedziałów, które występują wyłącznie w TGN i cisternae trans-Golgiego. W tym celu zmodyfikowaliśmy VHH-std za pomocą tandemowego motywu sulfatacji tyrozyny (2xTS) pochodzącego z procholecystokininy29 szczurów, umożliwiając tym samym biochemiczny odczyt przybycia ładunku do tych przedziałów. Podczas gdy fuzja VHH-std z mCherry umożliwia bezpośrednią wizualizację transportu retrogradacyjnego za pomocą obrazowania komórek stałych lub żywych, funkcionalizacja peroksydazami takimi jak APEX230 umożliwia lokalizację ultrastrukturalną za pomocą mikroskopii elektronowej, celowanej ablacji cytochemicznej lub testów biotynylizacji opartych na bliskości. Ponadto włączenie miejsca rozszczepienia proteazy wirusa wystrawionego tytoniu (TEV) w rusztowaniu nanononoioidów zapewnia biochemiczny sposób rozróżniania między zinternalizowanymi a powierzchniowymi nanociałkami (Rysunek 1A). Wcześniej stosowaliśmy konstrukcję VHH-tev do monitorowania kinetyki recyklingu nanociał związanych z EGFP-CDMPR i TfR-EGFP17. Ponowne pojawienie się receptorów oznaczonych nanociałami na powierzchni komórki można było łatwo wykryć poprzez zastosowanie rekombinowanej proteazy TEV pozakomórkowej, co skutkowało specyficzną utratą kasety epitopu C-końcowego nanociała. Analogicznie, włączenie miejsca rozszczepienia TEV w przedstawionym mCherry funkcionalyzowanym nanoniku, VHH-mCherry umożliwia dynamiczną ocenę recyklingu raportu EGFP za pomocą obrazowania żywych komórek. Funkcjonalizację z alternatywnymi domenami białkowymi – takimi jak dodatkowe fluorofory, znaczniki enzymatyczne lub motywy sekwencji do modyfikacji posttranslacyjnej – można łatwo osiągnąć poprzez subklonowanie pożądanych insertów do szkieletu VHH-std przez miejsca restrykcyjne SpeI i EcoRI. Wszystkie funkcjonalizowane konstrukcje nanononikowe anty-GFP użyte w oryginalnym badaniu17 zostały zdeponowane w Addgene do publicznej dystrybucji.

Korzystając z opisanego powyżej protokołu, wszystkie warianty nanono, przedstawione tutaj, zostały oczyszczone do wysokiej wydajności i czystości (rysunek 1B). Tylko fuzja mCherry wykazała niewielkie przecięcie domen białkowych po oczyszczeniu (Rysunek 1B, ścieżka 5). Dwa obserwowane produkty degradacji najprawdopodobniej odpowiadają poszczególnym domenom VHH i mCherry, co można wywnioskować na podstawie ich pozornych mas cząsteczkowych i potwierdzić detekcją immunoblotową specyficzną dla epitopu (rysunek 1C). W przypadku braku współekspresyjnego BirA, VHH-mCherry zazwyczaj odzyskiwał wydajność około 20 mg na preparat. Na podstawie naszych doświadczeń, współekspresja BirA konsekwentnie zmniejsza wydajność nano-aA o około 1/3do 1/2. Biotynowalacja była dość kompletna, ponieważ nanociała z mieszaniny 1:1 z BSA zostały w pełni odzyskane przez streptawidynę-agarozę (Rysunek 1D).

Aby ocenić przydatność tego zestawu narzędzi nanono-do badania transportu endocytowego, stworzyliśmy stabilne linie komórkowe HeLa ekspresujące białka receptorów powierzchniowych oznaczone tagowaniem EGFP o wyraźnych szlakach transportu wewnątrzkomórkowego. Wśród nich były TfR, które cykluje między błoną plazmatyczną a wczesnymi (sortującymi i recyklingowymi) endosomami; TGN46, który komunikuje się między błoną plazmatyczną a TGN za pomocą wczesnych endosomów; oraz oba MPR, które przemieszczają się między TGN, błoną plazmatyczną oraz zarówno wczesnym, jak i późnym endosomem17. EGFP został zfuzowany z domeną zewnątrzkomórkową każdego receptora – konkretnie wstawiony pomiędzy peptyd sygnałowy a sekwencję receptorową dla CDMPR, CIMPR i TGN46 – oraz z końcowym punktem C TfR. Ten projekt zachował natywne domeny cytoplazmatyczne, zapewniając, że wszystkie znane sygnały sortujące pozostały nienaruszone, a tag EGFP był dostępny do wiązania przez zewnętrzne nanociała anty-GFP (Rysunek 1E). Dla CIMPR, którego domena zewnątrzkomórkowa jest wyjątkowo duża, zastosowano wersję skróconą, zgodnie z wcześniejszymi badaniami wykazującymi, że takie skracanie zachowuje normalne zachowanie transportu31,32.

Stabilne linie komórkowe zostały ustanowione przez transdukcję retrowirusową, a następnie przez fluorescencyjne aktywowane sortowanie komórek (FACS), aby wyizolować jednorodne populacje komórek o umiarkowanym i porównywalnym poziomie ekspresji. Warto zauważyć, że EGFP-CDMPR konsekwentnie występował jako podwójny pas u immunoblotów, podobnie jak jego endogenny odpowiednik33, co wskazuje na heterogenną glikozylację. Aby ocenić, czy białka fuzyjne EGFP odtwarzają wzorce lokalizacji i ekspresji endogennych białek w stanie stacjonarnym, komórki stabilnie ekspresujące zostały współhodowane z komórkami HeLa macierzystymi i przeanalizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej konfokalnej (Rysunek 2B). Sygnał EGFP wiernie odzwierciedlał rozkład odpowiadających im endogennych białek. Jak można się spodziewać, CDMPR, CIMPR i ich wersje oznaczone tagowaniem EGFP lokalizowały się głównie w obszarze okołojądrowym – odzwierciedlając TGN i późne przedziały endosomalne – z dodatkowym oznakowaniem w endosomach obwodowych. Zarówno endogenne, jak i tagowane EGFP-tagowane TGN46 występowały niemal wyłącznie w TGN okołojądrowym, podczas gdy TfR i TfR-EGFP wykazywały charakterystyczny wczesny rozkład endosomów, z wyraźnym sortowaniem obwodowym i recyklingiem okojądrowym. Chociaż użyte przeciwciała wykrywały zarówno endogenne, jak i oznaczone EGFP (z wyjątkiem CIMPR), ogólna intensywność barwienia nie wzrosła znacząco w komórkach ekspresujących białka fuzyjne, co sugeruje, że konstrukty EGFP nie były znacząco nadekspresowane. Uwzględniliśmy EGFP-TGN46 i EGFP-CIMPR na Rysunku 2B dla bezpośredniego porównania z EGFP-CDMPR i TfR-EGFP. Protokoły stosowane do utrwalania komórek i obrazowania mikroskopią fluorescencyjną zostały opisane w poprzednich badaniach 17,19.

Za pomocą VHH-mCherry transport endocytowy białek raportujących oznaczonych EGFP można monitorować za pomocą obrazowania komórek żywych. Do tego celu użyliśmy jako przykładów komórek wyrażających EGFP-CDMPR i TfR-EGFP. Komórki były obrazowane w czasie za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego po dodaniu VHH-mCherry do medium (Wideo 1 i Wideo 2). Na rysunku 3 pokazano zdjęcia z różnych momentów czasowych. Absorpcję określono poprzez pomiar sygnału w kanale mCherry, odejmowanie tła autofluorescencji i normalizację do sygnału EGFP, aby wyeliminować fluktuacje spowodowane ruchem oznakowanych przedziałów lub potencjalnymi niewielkimi przesunięciami płaszczyzny ogniskowej. Fluorescencja VHH-mCherry w ośrodku przy 25 nM była pomijalna i nie kolidowała z pomiarami. Analiza transportu reporterów z powierzchni komórki do ich przedziałów wewnątrzkomórkowych, do rozkładu stacjonarnego, dała te same wyniki kinetyczne co eksperymenty biochemiczne pokazane na Rysunku 2 poprzedniej publikacji17, z pozornym okresem półtrwania absorpcji ~9 min dla EGFP-CDMPR i ~4 min dla TfR-EGFP, a nasyceniem po ~43 min i ~20 min, odpowiednio. Wartości te były porównywalne z wynikami uzyskanymi z eksperymentów biochemicznych z użyciem testów immunoblottingowych17. Zasadniczo można również analizować kinetykę transportu wstecznego do obszarów podkomórkowych zainteresowania, takich jak obszar okołojądrowy o najwyższym stężeniu MPR. Jednak region okołojądrowy zawiera nie tylko Golgi/TGN, ale jest także wzbogacony o późne endosomy i endosomy recyklingowe. Kinetyka pochłaniania nano-nanicow do obszaru okołojądrowego nie jest wystarczająco precyzyjna, aby przeanalizować transport wsteczny do określonego organellu. Aby wiarygodniej ocenić transport z błony plazmatycznej do TGN, inne białko fluorescencyjne, białko transbłonowe obecne w TGN, musi być stabilnie współekspresowane wraz z białkiem reporterowym GFP, w taki sposób, aby nie dochodziło do spektralnego nakładania się właściwości fluoroforu. Wykorzystanie tego dodatkowego markera pozwala na wykrywanie VHH-mCherry importowanego przez reportera, analogicznego do sulfatacji tyrozyny pośredniczonej przez TPST, jak wcześniej udokumentowano19.

figure-results-1
Rysunek 1: Projektowanie i produkcja derivatyzowanych nanociał do śledzenia białek powierzchni komórek oznaczonych tagiem EGFP. (A) Schematyczny przegląd derivatyzowanych nanociał. Standardowy konstrukt nanoinoioidowy obejmuje domenę VHH specyficzną dla GFP, tagi epitopowe T7 i HA, akceptor biotyny (BAP) oraz C-końcowy znak heksahistidyny (His6) do oczyszczania. Dodatkowe warianty nanonoioidów obejmują modyfikacje z tandemowymi miejscami sulfatacji tyrozyny (2xTS), inżynieryjną peroksydazą APEX2 lub fluorescencyjnym białkiem mCherry. Pasek skali wskazuje długość aminokwasu (aa). (B) Nanociała o ekspresji bakteryjnej i oczyszczonej powinowactwie (20-50 μg) zostały przeanalizowane za pomocą gradientowego SDS-PAGE i zwizualizowane za pomocą barwienia Coomasie. Standardy masy cząsteczkowej (w kDa) są oznaczone po lewej stronie. Niewielkie przecięcie proteolityczne zaobserwowano tylko dla VHH-mCherry, prawdopodobnie występujące pomiędzy domenami VHH i mCherry. (C) Analiza immunoblowata preparatów nanonikowych (10 ng) z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom T7, HA lubHis 6 , lub wykrywana przez streptawidynę-HRP (SA-HRP) do oceny biotinylacji. (D) Zakres biotynylacji nanonanoplazmy oceniono poprzez inkubację nanociał w stosunku 1:1 z BSA, a następnie nastąpiło pulldown, granulowanie i mycie kulek przez streptawidynę-agarozę. Równoważne objętości supernatantu (S) i materiału z kulkami (B) zostały następnie przeanalizowane za pomocą barwienia SDS-PAGE i Coomasie. Ilościowe odzyskanie nanoników w frakcji związanej z kulkami wskazuje na całkowitą biotinylację. Obecność fragmentów VHH i mCherry w frakcji wiązanej sugeruje częściową degradację, prawdopodobnie podczas przygotowania próbki do analizy SDS-PAGE. Biała linia między pasami 2 i 3 oznacza usunięcie dwóch niepowiązanych pasów. Liczba ta została zmieniona z17. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Ekspresja i wewnątrzkomórkowa lokalizacja fluorescencyjnie oznakowanych receptorów cargo oznaczonych EGFP. (A) Schematyczne przedstawienie konstrukcji fuzji EGFP. Sekwencje pochodzące z białek sekretornych transbłonowych są przedstawione na czarno, a peptydy sygnałowe N terminalne i domeny transbłonowe wewnętrzne są podświetlone na żółto. Część EGFP jest zilustrowana na zielono. Dla CDMPR, TfR i TGN46 powstały pełnowymiarowe konstrukcje, natomiast dobrze scharakteryzowany wariant skrócony użyto dla CIMPR, aby zachować normalne zachowanie handlowe. Pasek skali wskazuje długość aminokwasu (aa). EGFP-CDMPR i TfR-EGFP zostały opisanewcześniej 17. (B) Aby ocenić lokalizację podkomórkową, komórki HeLa stabilnie wyrażające białka fuzyjne EGFP zostały współhodowane z komórkami HeLa macierzystymi i przeanalizowane mikroskopią fluorescencyjną. Pasek skali oznacza 10 μm. (C) komórki HeLa stabilnie wyrażające białka raportujące tagowane EGFP zostały zlikwidowane, a ekstrakty białkowe poddane SDS-PAGE, a następnie immunoblotting z użyciem przeciwciał przeciwko GFP i aktynie. Markery masy cząsteczkowej (w kDa) są oznaczone po prawej stronie. Liczba ta została zmieniona z17. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Obrazowanie kinetyki endocytów nano-komórek żywymi pośredniczone przez EGFP-CDMPR i TfR-EGFP. Obrazowanie żywymi komórkami wykonano po dodaniu 25 nM VHH-mCherry do komórek HeLa stabilnie wyrażających (A) EGFP-CDMPR lub (B) TfR-EGFP w kompletnym medium wolnym od fenolu w temperaturze 37 °C. Komórki były obrazowane w kanałach GFP i mCherry za pomocą półautomatycznego mikroskopu fluorescencyjnego szerokiego pola w odstępach 36 sekund. Pokazane są reprezentatywne połączone zdjęcia nieruchome, wraz z powiększonym widokiem obszaru okołojądrowego (powiększenie: 2,2x) w poszczególnych kanałach poniżej. (Pręty skalowe, 10 μm.) Zobacz także Wideo 1 i Wideo 2. Analiza ilościowa kinetyki pobierania nanonoenzymów w (C) EGFP-CDMPR i (D) TfR-EGFP została przeprowadzona na podstawie danych z trzech niezależnych eksperymentów, z których każdy obejmował około 40 pojedynczych komórek. Aby uwzględnić ruch organelli i zmienność płaszczyzny ogniskowej, intensywność fluorescencji mCherry została znormalizowana (normowa) do sygnału GFP i nakreślona jako średnia ± SD we wszystkich komórkach z trzech eksperymentów. Średni maksymalny sygnał pochwycenia został znormalizowany do 1. Kinetyka pochłaniania dla każdej komórki była indywidualnie dopasowana za pomocą modelu kinetycznego pierwszego rzędu. Wykresy przedstawiają uśrednione krzywe wyprowadzone ze średniej odpowiadających stałych prędkości. Liczba ta została zmieniona z17. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Film 1: Obrazowanie żywymi komórkami pobierania mCherry-nanonobody przez EGFP-CDMPR. Komórki HeLa stabilnie ekspresujące EGFP-CDMPR były inkubowane w temperaturze 37 °C w pełnym medium zawierającym 25 nM VHH-mCherry i obrazowane w kanałach fluorescencyjnych EGFP i mCherry co 36 sekund. Film był renderowany z częstotliwością odtwarzania 5 klatek/s, co odpowiada kompresji w czasie rzeczywistym 3 min/s. Ten film został zmodyfikowany z17. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 2: Obrazowanie żywymi komórkami pobierania mCherry-nanono-wychwytu przez TfR-EGFP. Komórki HeLa stabilnie ekspresujące TfR-EGFP były inkubowane w temperaturze 37 °C w pełnym medium uzupełnionym o 25 nM VHH-mCherry i obrazowane pod kątem fluorescencji EGFP i mCherry w odstępach 36 sekund. Film był renderowany z prędkością 5 klatek/s, co reprezentuje szybkość poklatkową 3 minut/s. Ten film został zmodyfikowany z17. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanociała stanowią szybko rozwijającą się klasę rusztowania wiążących białka, które oferują liczne zalety w porównaniu do konwencjonalnych przeciwciał: są małe, bardzo stabilne, monomeryczne, niesieciujące się, pozbawione wiązań dwusiarczkowych i mogą być selekcjonowane do wiązania o wysokiej afinitetności24. W naszym poprzednim badaniu opracowaliśmy i zastosowaliśmy funkcjonalizowane nanociała produkowane przez ekspresję bakterii do znakowania białek wystawionych na powierzchnię oraz monitorowania ich transportu wewnątrzkomórkowego do różnych przedziałów, ze szczególnym uwzględnieniem transportu wstecznego do sieci trans-Golgiego (TGN)17. Wykorzystaliśmy anty-GFP nanono, aby zapewnić wszechstronność, umożliwiając celowanie w białka fuzyjne oznaczone zewnętrznymi tagami GFP, YFP lub mCerulean – znacznikami fluorescencyjnymi szeroko dostępnymi i często już scharakteryzowanymi. Funkcjonalizacja nanoników anty-GFP z motywami sulfatacji mCherry, APEX2 lub tyrozyny pozwoliła nam wizualizować pobieranie ładunku za pomocą obrazowania stałego i żywego komórek, lokalizować przedziały transportu wstecznego na poziomie ultrastrukturalnym, przeprowadzić celowaną ablację przedziałów oraz ilościowo oceniać kinetykę transportu do TGN. Jednym z ograniczeń tego podejścia jest konieczność modyfikacji genetycznej docelowych linii komórkowych — poprzez stabilną nadekspresję lub endogenne oznaczanie — zanim funkcjonalizowane nanociała anty-GFP będą mogły być skutecznie stosowane. Jednak strategia ta może być łatwo dostosowana do rosnącego repertuaru nanociał skierowanych przeciwko nieoznakowanym, endogennym białkom docelowym generowanym poprzez szczepienia zwierząt lub selekcję in vitro z syntetycznych bibliotek VHH z wykorzystaniem technologii wyświetlania rybosomów lub fagów34. Ponadtow ostatnich latach opracowano nanociała skierowane do powszechnie używanych tagów epitopów, takich jak mCherry, V5 czy ALFA. Co istotne, niedawno wykorzystaliśmy nanobody odporny na sulfację anty-mCherry do badania retrogradacyjnego transportu CDMPR w komórkach HeLa uszczuconych GGA2 poprzez szybkie inaktywowaniefunkcjonalne 28. Małe znaczniki epitopowe oferują zaletę w zachowaniu rodzimej konformacji i funkcji docelowego białka, ponieważ rzadziej zakłócają kluczowe domeny strukturalne. Nanociała rozpoznawające te zwarte epitopy (np. ALFA, V5) mogą być płynnie zintegrowane z funkcjonalnym zestawem narzędzi nanono, aby zwiększyć jego użyteczność w badaniu mechanizmów endocytów i retrogradacji.

W niniejszym badaniu demonstrujemy zastosowanie VHH-mCherry w eksperymentach obrazowania z żywymi komórkami. Korzystając z EGFP-CDMPR i TfR-EGFP jako białek reporterowych, mogliśmy wizualizować receptorowo-specyficzne endocytarne pobieranie i ich postęp w kierunku dystrybucji stacjonarnej. Ilościowa analiza transportu tych reporterów z błony plazmatycznej do ich odpowiednich przedziałów wewnątrzkomórkowych wykazała kinetykę zgodną z tą uzyskaną za pomocą testów biochemicznych przedstawionych na Rysunku 2 wcześniejszego badania17. Stwierdziliśmy, że pozorny okres półtrwania był znacznie dłuższy dla EGFP-CDMPR (~9 min) niż dla TfR-EGFP (~4 min), a sygnały stały się nasycone odpowiednio po około 43 i 20 minutach. Te ilościowe wyniki dobrze pokrywają się z wcześniej opublikowanymi danymi dotyczącymi dynamiki handlu ludźmi MPR i TfR 38,39,40. Warto zauważyć, że konstrukcja VHH-mCherry zyskała znaczące zainteresowanie środowiska badawczego, o czym świadczy liczne wnioski o dystrybucję Addgene, i została już pomyślnie wdrożona w kilku niezależnych badaniach 28,41,42,43,44.

W zależności od konfiguracji mikroskopu lub wymagań eksperymentalnych, nanociała anty-GFP oznaczone tagiem mCherry nie zawsze są optymalne. W takich przypadkach alternatywne fluorofory lub warianty białka fluorescencyjnego mogą zapewniać bardziej odpowiednie właściwości spektralne w połączeniu z liniami komórkowymi raportującymi GFP. Aby temu zaradzić, utworzyliśmy bibliotekę funkcjonalizowanych nanociał zawierającą różnorodne białka fluorescencyjne, w tym mTagBFP2, mNeptune2.5, mCardinal2, TagRFP657 oraz iRFP670 (243764-68). Te dodatkowe konstrukcje nanobody będą dostępne przez Addgene. Zastosowanie spektralnie odróżnionych fluoroforów umożliwia wyraźne rozdzielenie sygnałów wzbudzenia i emisji, co umożliwia optymalne, na żywo, w czasie rzeczywistym obrazowanie do trzech kanałów fluorescencyjnych przy minimalnym nakładaniu się spektralnego.

Chociaż monitorowanie endocytów do stanu ustalonego może wydawać się proste, śledzenie transportu wstecznego białek do TGN stanowi większe wyzwanie eksperymentalne. Oprócz VHH-mCherry oraz białka reporterowego tagowanego GFP, do wizualizacji i ilościowości potrzebny jest dodatkowy marker fluorescencyjny lub barwnik-sprzężony TGN. Jednak niektóre białka rezydentów Golgiego wykazują częściową nieszczelność na powierzchnię komórki, co może być dodatkowo pogłębiane przez zaburzenia szlaków transportu wewnątrzkomórkowego, takie jak te wprowadzane przez eksperymentalną manipulację komponentami mechanizmów transportowych. TGN46, na przykład, jest powszechnie używany jako marker rezydentny w Golgi, mimo że pełni funkcję receptora ładunkowego pośredniczącego w transporcie TGN do powierzchni komórek niektórych ładunkówwydzielniczych 16,45. Podobnie w błonie plazmatycznej wykryto glikozylotransferazy, takie jak β-1,4-galaktosyltransferaza. Chociaż te białka mogą cyklować na powierzchnię, ich dominująca lokalizacja w stanie stacjonarnym pozostaje w TGN. Oznaczanie takich markerów spektralnie odrębnym białkiem fluorescencyjnym lub tagiem zgodnym z barwnikami (np. SNAP, Halo itp.) i stabilne współekspresowanie za pomocą transbłonowego reportera tagowanego GFP umożliwiłoby ilościowe obrazowanie przybycia TGN w żywych komórkach. Można to zmierzyć analogicznie do opisanego powyżej workflow, z ilościową ilością opartą na akumulacji sygnału mCherry w kanale fluorescencyjnym odpowiadającym białkowi fuzyjnemu rezydentnemu w Golgi. Obecne strategie badania handlu retrogradacyjnego w stałych lub żywych komórkach często opierają się na konstruktach receptorów chimerycznych w połączeniu z przeciwciałami IgG (np. CD8)46,47. Jednak ryzyko sieciowania krzyżowego, wynikające z dwuwalencji konwencjonalnych IgG podczas znakowania powierzchniowego, może znacząco zmienić losy wewnątrzkomórkowe oznakowanego białka, często kierując je w kierunku degradacji lizosomalnej po endocytozie 48,49. Natomiast nanociała, ze względu na swój monovalentyjny charakter i stechiometrię wiążącą 1:1, nie indukują sieciowania, zachowując tym samym fizjologiczne szlaki transportu docelowego białka. To sprawia, że podejścia oparte na nanociałach są szczególnie cenne do badania autentycznej retrogradacyjnej dynamiki transportu bez wprowadzania sztucznych artefaktów trasowania.

Optymalne działanie tego protokołu do obrazowania żywych komórek wymaga starannej dawkowania stężenia nano, ponieważ jego nadmierne ilości prowadzą do podwyższonej fluorescencji tła spowodowanej niewiązanymi nanonikami w ośrodku. Ponadto różnice w poziomach ekspresji linii komórkowych GFP reporterowych muszą być uwzględniane podczas miażdżenia, aby zapewnić dokładne porównania ilościowe. Do produkcji nanoników indukcja niskotemperaturowa w E. coli jest kluczowa, aby sprzyjać prawidłowemu składaniu domeny mCherry. Wyższe temperatury indukcji zazwyczaj powodują nieprawidłowo fałdowane lub degradowane białko i dlatego nie są zalecane.

Sukces tego protokołu zależy krytycznie od trzech kluczowych aspektów: po pierwsze, wysokiej wydajności ekspresji i czystości funkcjonalnych konstrukcji nanono, aby zapewnić spójne oznakowanie i minimalne tło; po drugie, wykorzystanie dobrze scharakteryzowanych linii komórkowych stabilnie ekspresujących białka reporterowe tagowane GFP z lokalizacją powierzchni komórki do rekapitulacji szlaków fizjologicznych transportu; oraz po trzecie, optymalne obsługiwanie i konfiguracja zestawu mikroskopii fluorescencyjnej, w tym parametry obrazowania i separacja spektralna, umożliwiająca dokładną ilościową i jakościową analizę dynamiki transportu ładunku.

Przedstawiona tutaj metoda i protokół, skupione na wykorzystaniu nanociał anty-GFP oznaczonych tagiem mCherry, umożliwiają zarówno ilościowe, jak i jakościowe śledzenie białek cargo od powierzchni komórki do przedziałów endocytów w hodowanych komórkach ssaków. W połączeniu z fluorescencyjnie oznakowanym markerem rezydentnym Golgiego, to podejście pozwala na dalszą analizę szlaków transportu wstecznego. W związku z tym narzędzie to stanowi potężną strategię monitorowania wewnątrzkomórkowego transportu białek transbłonowych i receptorów powierzchni komórek, które wcześniej były niedostępne do znakowania z powodu braku specyficznych ligandów lub kompatybilnych odczynników wiążących monomery.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Uniwersytet w Bazylei. Dziękujemy prof. Em. Dr Martin Spiess za tworzenie i rozmieszczenie figurek, Imaging Core Facility (IMCF) Biozentrum za wsparcie oraz PNAS za zgodę na ponowne wydanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała przeciw GFP Sigma-Aldrich118144600001Produkt dystrybuowany jest przez Sigma-Aldrich, ale produkowany przez Roche
Naczynia hodowlane komórek o średnicy 100 mmTPPTPP93100
Przeciwciała przeciwaktynoweEMD Millipore  MAB1501
Przeciwciało przeciw HAz laboratoriumpowstała z hybrydymy 12CA5
Przeciwciało Anti-His6Bethyl Laboratories A190-114A
Przeciwciało przeciw T7 & nbsp;Bethyl Laboratories A190-117A
BL21(DE3) Kompetencja E. coliNEBC2527H
Chlorek wapnia dwuwęglanMerck Millipore102382rozpuszczony w wodzie sterylnej, stan wynosi 1 M
Sól karbenicylina z dissodemApplichemA1491rozpuszczony w wodzie sterylnej, zapas wynosi 100 mg/mL
Coomassie-R (Jaskrawy niebieski)Sigma-AldrichB-0149
D-biotynaSigma-AldrichB4501rozpuszczony w sterylnym 500 mM NaH2PO4 lub DMSO
Jednorazowe kolumny odsalania PD10GE HealthcareGE17-0851-01
DMEM GlutaMAX-IThermo Fisher Scientific61965026
DMEM, wysoka glukoza, brak glutaminy, brak fenolu czerwonegoThermo Fisher Scientific31053028
DNaza IApplichemA3778rozpuszczony w wodzie sterylnej
Dulbecco' s fosforanem buforowana sól fizjologiczna (DPBS) bez Ca2+/Mg2+Sigma-AldrichD8537
Serum bydła płodu (FBS)Thermo Fisher ScientificA5256701
Filtropur S, PES, Porengrö ß e: 0,45 & mikro; mSarstedt83.1826
Odczynnik transfekcyjny FuGENE HDPromega E2311
Szklane pokrywki (nr 1.5H)VWR631-0153
Kozy antymyszy HRPSigma-AldrichA-0168
Kozy antykrólicze HRPSigma-AldrichA-0545
Jego zestaw buforowyCytvia11003400
Jego felietony GraviTrapCytvia11003399
ibidi &mikro;-Dobrze zrób slajd 4, ibiTreat80426-IBIIbidi
Izopropyl-β-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)ApplichemA1008rozpuszczony w wodzie sterylnej, stan wynosi 1 M
Siarczan kanamicynyApplichemA1493rozpuszczony w wodzie sterylnej, zapas wynosi 100 mg/mL
L-glutaminaApplichemA3704
Lysozym  Sigma-Aldrich18037059001Produkt dystrybuowany jest przez Sigma-Aldrich, ale produkowany przez Roche
Heksahydrat chlorku magnezuMerck Millipore105833rozpuszczony w wodzie sterylnej, stan wynosi 1 M
Mini-Protean TGX żele, 4-20%, 15-dołekBio-Rad4561096
Zmodyfikowane HeLa Kyotoz laboratorium
NEB5-alfa Kompetentna E. coliNEBC2987U
NucleoBond Xtra Midi Plus, 10 przygotowańMacherey-Nagel  740412.1
Penicylina/StreptomycynaBioconcept 4-01F00-H
Fenylosulfonylofluorek (PMSF)ApplichemA0999.0025rozpuszczony w 40% DMSO, 60% izopropanol, zapas w 500 mM
Linia komórkowa Phoenix amphoLaboratorium Nolana
Polibren (bromek heksadymetarynowy)Sigma-AldrichH9268
PuromycynaInvivogenANT-PR-1
Chlorek sodu Merck Millipore106404rozpuszczony w wodzie sterylnej, stan wynosi 5 M
Pirotrowęglan sodu & nbsp;Thermo Fisher Scientific11360039
Trans-Blot Turbo Pack, miniBio-Rad1704158
TryptonApplichemA1553
Ekstrakt drożdżowy  ApplichemA1552

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).">Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 568-579 (2006).">Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Endophilin marks and controls a clathrin-independent endocytic pathway. Nature. 517 (7535), 460-465 (2015).">Boucrot, E., et al. Endophilin marks and controls a clathrin-independent endocytic pathway. Nature. 517 (7535), 460-465 (2015).
  4. Endophilin-A2 functions in membrane scission in clathrin-independent endocytosis. Nature. 517 (7535), 493-496 (2015).">Renard, H. F., et al. Endophilin-A2 functions in membrane scission in clathrin-independent endocytosis. Nature. 517 (7535), 493-496 (2015).
  5. A CIE change in our understanding of endocytic mechanisms. Front Cell Dev Biol. 11, 1334798(2023).">Rioux, D. J., Prosser, D. C. A CIE change in our understanding of endocytic mechanisms. Front Cell Dev Biol. 11, 1334798(2023).
  6. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. J Cell Biol. 106 (3), 617-628 (1988).">Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. J Cell Biol. 106 (3), 617-628 (1988).
  7. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (3), 202-212 (2003).">Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (3), 202-212 (2003).
  8. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).">Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  9. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Dev Cell. 29 (3), 277-291 (2014).">Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Dev Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  10. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nat Cell Biol. 13 (8), 914-923 (2011).">Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nat Cell Biol. 13 (8), 914-923 (2011).
  11. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nat Cell Biol. 10 (2), 178-185 (2008).">Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nat Cell Biol. 10 (2), 178-185 (2008).
  12. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nat Commun. 9 (1), 3737(2018).">McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nat Commun. 9 (1), 3737(2018).
  13. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochim Biophys Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).">Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochim Biophys Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  14. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).">Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  15. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. J Cell Biol. 125 (2), 253-268 (1994).">Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. J Cell Biol. 125 (2), 253-268 (1994).
  16. Sorting of secretory proteins at the trans-Golgi network by human TGN46. Elife. 12, 91708(2024).">Lujan, P., et al. Sorting of secretory proteins at the trans-Golgi network by human TGN46. Elife. 12, 91708(2024).
  17. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (27), E6227-E6236 (2018).">Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  18. Protein sorting from endosomes to the TGN. Front Cell Dev Biol. 11, 1140605(2023).">Buser, D. P., Spang, A. Protein sorting from endosomes to the TGN. Front Cell Dev Biol. 11, 1140605(2023).
  19. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J Vis Exp. (144), e59111(2019).">Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J Vis Exp. (144), e59111(2019).
  20. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. J Cell Biol. 100 (3), 826-834 (1985).">Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. J Cell Biol. 100 (3), 826-834 (1985).
  21. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).">Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  22. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).">Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  23. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).">Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  24. Functionalized Protein Binders in Developmental Biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 40 (1), 119-142 (2024).">Schnider, S. T., Vigano, M. A., Affolter, M., Aguilar, G. Functionalized Protein Binders in Developmental Biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 40 (1), 119-142 (2024).
  25. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annu Rev Physiol. 50, 363-376 (1988).">Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annu Rev Physiol. 50, 363-376 (1988).
  26. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).">Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  27. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotech. 25 (5), 299-317 (2009).">Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotech. 25 (5), 299-317 (2009).
  28. Retrograde transport of CDMPR depends on several machineries as analyzed by sulfatable nanobodies. Life Sci Allianc. 5 (7), 202101269(2022).">Buser, D. P., Bader, G., Spiess, M. Retrograde transport of CDMPR depends on several machineries as analyzed by sulfatable nanobodies. Life Sci Allianc. 5 (7), 202101269(2022).
  29. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. J Biol Chem. 269 (11), 8115-8121 (1994).">Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. J Biol Chem. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  30. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Meth. 12 (1), 51-54 (2015).">Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Meth. 12 (1), 51-54 (2015).
  31. Visualization of TGN to endosome trafficking through fluorescently labeled MPR and AP-1 in living cells. Mol Biol Cell. 14 (1), 142-155 (2003).">Waguri, S., et al. Visualization of TGN to endosome trafficking through fluorescently labeled MPR and AP-1 in living cells. Mol Biol Cell. 14 (1), 142-155 (2003).
  32. A high-throughput siRNA screen identifies genes that regulate mannose 6-phosphate receptor trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5079-5092 (2014).">Anitei, M., et al. A high-throughput siRNA screen identifies genes that regulate mannose 6-phosphate receptor trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5079-5092 (2014).
  33. Purification and characterization of a cation-dependent mannose 6-phosphate receptor from murine P388D1 macrophages and bovine liver. J Biol Chem. 260 (22), 12008-12014 (1985).">Hoflack, B., Kornfeld, S. Purification and characterization of a cation-dependent mannose 6-phosphate receptor from murine P388D1 macrophages and bovine liver. J Biol Chem. 260 (22), 12008-12014 (1985).
  34. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nat Meth. 11 (12), 1253-1260 (2014).">Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nat Meth. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  35. The ALFA-tag is a highly versatile tool for nanobody-based bioscience applications. Nat Commun. 10 (1), 4403(2019).">Götzke, H., et al. The ALFA-tag is a highly versatile tool for nanobody-based bioscience applications. Nat Commun. 10 (1), 4403(2019).
  36. Development of a V5-tag-directed nanobody and its implementation as an intracellular biosensor of GPCR signaling. J Biol Chem. 299 (9), 105107(2023).">Zeghal, M., et al. Development of a V5-tag-directed nanobody and its implementation as an intracellular biosensor of GPCR signaling. J Biol Chem. 299 (9), 105107(2023).
  37. Overall Architecture of the Intraflagellar Transport (IFT)-B Complex Containing Cluap1/IFT38 as an Essential Component of the IFT-B Peripheral Subcomplex. J Biol Chem. 291 (21), 10962-10975 (2016).">Katoh, Y., et al. Overall Architecture of the Intraflagellar Transport (IFT)-B Complex Containing Cluap1/IFT38 as an Essential Component of the IFT-B Peripheral Subcomplex. J Biol Chem. 291 (21), 10962-10975 (2016).
  38. Quantitative analysis of transferrin cycling by automated fluorescence microscopy. Methods Mol Biol. 1270, 365-378 (2015).">Hirschmann, D. T., Kasper, C. A., Spiess, M. Quantitative analysis of transferrin cycling by automated fluorescence microscopy. Methods Mol Biol. 1270, 365-378 (2015).
  39. Kinetics of internalization and recycling of transferrin and the transferrin receptor in a human hepatoma cell line. Effect of lysosomotropic agents. J Biol Chem. 258 (16), 9681-9689 (1983).">Ciechanover, A., Schwartz, A. L., Dautry-Varsat, A., Lodish, H. F. Kinetics of internalization and recycling of transferrin and the transferrin receptor in a human hepatoma cell line. Effect of lysosomotropic agents. J Biol Chem. 258 (16), 9681-9689 (1983).
  40. The kinetics of mannose 6-phosphate receptor trafficking in the endocytic pathway in HEp-2 cells: the receptor enters and rapidly leaves multivesicular endosomes without accumulating in a prelysosomal compartment. Mol Biol Cell. 9 (4), 809-816 (1998).">Hirst, J., Futter, C. E., Hopkins, C. R. The kinetics of mannose 6-phosphate receptor trafficking in the endocytic pathway in HEp-2 cells: the receptor enters and rapidly leaves multivesicular endosomes without accumulating in a prelysosomal compartment. Mol Biol Cell. 9 (4), 809-816 (1998).
  41. A quantitative study of the Golgi retention of glycosyltransferases. J Cell Sci. 134 (20), 258564(2021).">Sun, X., Mahajan, D., Chen, B., Song, Z., Lu, L. A quantitative study of the Golgi retention of glycosyltransferases. J Cell Sci. 134 (20), 258564(2021).
  42. The exocyst complex is an essential component of the mammalian constitutive secretory pathway. J Cell Biol. 222 (5), 202205137(2023).">Pereira, C., et al. The exocyst complex is an essential component of the mammalian constitutive secretory pathway. J Cell Biol. 222 (5), 202205137(2023).
  43. A novel live-cell imaging assay reveals regulation of endosome maturation. Elife. 10, 70982(2021).">Podinovskaia, M., Prescianotto-Baschong, C., Buser, D. P., Spang, A. A novel live-cell imaging assay reveals regulation of endosome maturation. Elife. 10, 70982(2021).
  44. Small disulfide loops in peptide hormones mediate self-aggregation and secretory granule sorting. Life Sci Alliance. 5 (5), 202101279(2022).">Reck, J., Beuret, N., Demirci, E., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. Small disulfide loops in peptide hormones mediate self-aggregation and secretory granule sorting. Life Sci Alliance. 5 (5), 202101279(2022).
  45. A new class of carriers that transport selective cargo from the trans Golgi network to the cell surface. EMBO J. 31 (20), 3976-3990 (2012).">Wakana, Y., et al. A new class of carriers that transport selective cargo from the trans Golgi network to the cell surface. EMBO J. 31 (20), 3976-3990 (2012).
  46. CD8alpha-CI-M6PR Particle Motility Assay to Study the Retrograde Motion of CI-M6PR Receptors in Cultured Living Cells. Bio Protoc. 14 (9), e4979(2024).">Rawat, S., Sharma, M. CD8alpha-CI-M6PR Particle Motility Assay to Study the Retrograde Motion of CI-M6PR Receptors in Cultured Living Cells. Bio Protoc. 14 (9), e4979(2024).
  47. Image-based and biochemical assays to investigate endosomal protein sorting. Methods Enzymol. 534, 155-178 (2014).">Breusegem, S. Y., Seaman, M. N. Image-based and biochemical assays to investigate endosomal protein sorting. Methods Enzymol. 534, 155-178 (2014).
  48. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).">Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  49. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Rep. 21 (11), 3256-3270 (2017).">Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Rep. 21 (11), 3256-3270 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transport retrogradacyjnymikroskopia fluorescencyjnabia ka transb onowepuryfikacja nanociaznakowanie EGFPobrazowanie time lapsereceptor transferyny

Powiązane artykuły