Obrazowanie transportu endocytarnego na żywych komórkach z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

Endocytoza receptorów i innych białek transbłonowych (TM) z błony plazmatycznej do różnych przedziałów wewnątrzkomórkowych jest istotna dla utrzymania homeostazy błony ^1,2. Po internalizacji przez endocytozę zależną od klatryny lub niezależną, ładunki białkowe najpierw zapełniają wczesne endosomy, skąd są dalej sortowane wzdłuż układu endolizosomalnego, recyklingowane do błony plazmatycznej lub retrogradywnie wysyłane do sieci trans-Golgiego (TGN)^3,4,5. Recykling z endosomów i/lub powierzchni komórki do TGN jest częścią cyklu funkcjonalnego wielu transbłonowych receptorów ładunkowych, takich jak receptory manozy-6-fosforanu zależne od kationów i niezależne od kationów (CDMPR i CIMPR), dostarczające nowo syntetyzowane hydrolazy lizosomatowe z TGN do późnych endosomów i lizosomów ^6,7,8. Wntless (WLS) transportuje ligandy Wnt na powierzchnię komórki^9, 10,11,12, czyli TGN46, które eskortują rozpuszczalne białka wydzielnicze ładunku, w tym czynnik podwyższony (PAUF) i inne ładunki CARTS, z obszaru TGN 13,14,15,16. Podczas gdy wszystkie te receptory cargo przechodzą przez TGN w celu zbierania nowych białek klienckich, receptor transferynowy (TfR), który internalizuje transferrynę wiązaną żelazem, jest wyłączony z powrotu Golgiego 17,18,19,20,21.

Aby zbadać ruch endocytarny i retrogradacyjny, wcześniej opracowaliśmy zestaw narzędzi oparty na nanociałach, zaprojektowany do znakowania i śledzenia białek cargo od powierzchni komórki do przedziałów wewnątrzkomórkowych¹⁷. Nanocciała stanowią nową klasę wiążących białek pochodzących z homodymerycznych przeciwciał tylko na łańcuch ciężkich (hcAbs), naturalnie występujących u wielbłądów i ryb chrząstkowych^22,23. Reprezentują zmienną domenę łańcucha ciężkiego (VHH) hcAbs i oferują liczne zalety w porównaniu z konwencjonalnymi przeciwciałami (np. IgG): są monomeryczne, małe (~15 kDa), bardzo rozpuszczalne, pozbawione wiązań dwusiarczkowych, mogą być ekspresowane bakteriami i są podatne na selekcję do wiązania o wysokiej afinitecie²⁴. Aby zwiększyć wszechstronność i szerokie zastosowanie tego zestawu narzędzi nano, zastosowaliśmy funkcjonalizowane nanociała anty-GFP do znakowania powierzchniowego i śledzenia białek oznaczonych tagami GFP na ich domenach zewnętrznych lub lumenalnych. Poprzez rekombinowaną konjugację nanociał z mCherry, peroksydazą askorbianową 2 (APEX2) lub sekwencjami sulfatacji tyrozyny, retrogradacyjny transport prawdziwych białek transbłonowych ładunków można analizować za pomocą stałej i żywej mikroskopii fluorescencyjnej, mikroskopii elektronowej lub testów biochemicznych z użyciem autoradiografii. Biorąc pod uwagę, że sulfatacja tyrozyny, katalizowana przez tyrozyloproteinowe sulfotransferazy TPST1 i TPST2, jest modyfikacją posttranslacyjną ograniczoną do trans-Golgi/TGN, ta strategia umożliwia bezpośrednią ocenę dynamiki transportu i kinetyki z powierzchni komórki do przedziału Golgiego 25,26,27. Ostatnio rozszerzyliśmy ten repertuar funkcjonalizowanych wiążących białek o derywowane nanociała anty-mCherry. Te odczynniki okazały się kluczowe w rozkładaniu maszynowo zależnych szlakow transportowych MPR, szczególnie CDMPR^17,28, do TGN poprzez analizy biochemiczne.

Podczas gdy poprzednie badanie koncentrowało się głównie na zastosowaniu nanociał modyfikowanych sekwencjami sulfatacji tyrozyny do biochemicznej oceny przybycia TGN za pomocą autoradiografii¹⁹, ten artykuł metodyczny opisuje generowanie fluorescencyjnie oznakowanych, funkcjonalizowanych nanociał (VHH-mCherry) oraz linii komórkowych raportujących do obrazowania komórek żywych transportu endocytów. W połączeniu z dodatkowym fluorescencyjnym białkiem reporterowym rezydenta Golgiego, protokół ten może być dalej adaptowany, aby służyć jako solidny workflow do ilościowej analizy obrazowania obrazowania komórek żywych transportu z endosomu do TGN wybranych białek cargo.

Przed zastosowaniem tego protokołu badacze powinni upewnić się, że docelowe białko jest wyrażane jako konstrukcja fuzji oznaczona tagiem GFP, zazwyczaj generowana standardowymi metodami klonowania molekularnego. Funkcjonalizowane nanociała można łatwo wytwarzać w bakteriach przy wydajności wystarczającej do eksperymentów z oznakowaniem powierzchniowym, przy czym stężenia robocze w niskim zakresie nanomolowych są odpowiednie do większości testów obrazowania komórek żywych. Użytkownicy powinni również pamiętać, że kinetyka transportu może się różnić między białkami cargo, co wymaga regulacji czasu znakowania lub częstotliwości obrazowania, aby optymalizować transport endocytów lub endosomów do TGN.

1. Transformacja bakteryjna z użyciem VHH-mCherry

UWAGA: Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem ekspresji, oczyszczania i analizy funkcjonalizowanych nanociał anty-GFP, jak opisano^{wcześniej 17}. Poniższe kroki zostały dostosowane do VHH-mCherry i są zgodne z wcześniejszym raportem metodologicznym¹⁹.

1. Rozmrażają bakterie chemokompetentne (50-100 μL) odpowiednie do ekspresji białek (np. komórki Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3), umieszczając je w lodzie.
   UWAGA: Przygotuj komórki bakteryjne chemokompetentne zgodnie ze standardowymi protokołami laboratoryjnymi. Do tego celu można stosować komercyjnie dostępne ogniwa BL21 (DE3) firmy NEB.
2. Dodaj 50 ng plazmidu kodującego funkcjonalizowaną konstrukcję VHH-mCherry (Addgene #109421). Aby zapewnić efektywną biotynylację specyficzną dla miejsca reportera nano-reportera podczas ekspresji bakterii, współtransformuj się z potrójną ilością (150 ng) plazmidu kodującego bakteryjną biotynową ligazę BirA (Addgene #109424). Delikatnie przekręć rurkę 4-5 razy, aby wymieszać komórki z plazmidowym DNA.
   UWAGA: Współtransformacja z plazmidem kodującym BirA nie jest konieczna, jeśli nie jest wymagana biotynowa biotyna akceptorowa peptydowa (BAP).
3. Inkubuj mieszankę na lodzie przez 30 minut. Unikaj pobudzenia podczas tego etapu.
4. Komórki bakteryjne wywołujące szok cieplny, umieszczając je dokładnie na 20 sekund w kąpieli wodnej lub bloku grzewczym na dokładnie 20 sekund w temperaturze 42 °C.
5. Dodaj 1 ml podłoża z bulionu Luria (LB) w temperaturze pokojowej (RT) i inkubuj przekształcone bakterie w termoshakerze (250-500 rpm) przez 1 godzinę w 37 °C, aby umożliwić fenotypową ekspresję genów oporności na antybiotyki.
   UWAGA: Aby przygotować 1 l LB medium, dodaj 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g tryptonu, 10 g NaCl, uzupełnij objętość wodą i sterylizuj przez autoklaw.
6. Rozpyl bakterie przez wirowanie w 11 000 x g przez 1 minutę, a następnie ponownie zawiesij granulat w 100 μL świeżego medium LB. Dokładnie wymieszaj przez pipetowanie.
7. Nakładanie zawieszonych bakterii na wcześniej podgrzane płytki LB zawierające odpowiednie antybiotyki (np. z 50 μg/mL kanamycyny; jeśli są współtransformowane z BirA, należy również uwzględnić 50 μg/mL karbancycyliny, patrz krok 1.2).
8. Inkubuj płytki LB uzupełnione antybiotykiem do góry nogami w temperaturze 37 °C przez 13-15 godzin.
   UWAGA: Protokół można zatrzymać tutaj. Płytki z rozwiniętymi koloniami można przechowywać w temperaturze 4 °C i uszczelniać przepuszczalną folią, aby zapobiec wysychaniu.

2. Hodowla bakteryjna w cieczy i indukcja ekspresji VHH-mCherry

1. Wybierz pojedynczą kolonię bakteryjną z płytki transformacyjnej i zaszczep ją w kolbie Erlenmeyera zawierającej 20 mL podłoża LB z antybiotykami. Inkubuj hodowlę w inkubatorze potrząsającym przez 13-15 godzin w temperaturze 37 °C (patrz także krok 1.7 dotyczący antybiotyków selekcyjnych).
2. Następnego dnia rozcieńcz nocną pochówkę bakteryjną o pojemności 20 mL do świeżej kolby zawierającej 1 L podłoża LB z odpowiednimi antybiotykami selekcyjnymi.
3. Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 °C, aż hodowla osiągnie gęstość optyczną 600 nm (OD₆₀₀) wynoszącą 0,6-0,7.
   UWAGA: Pozwól hodowli ostygnąć do RT lub do 16 °C przed indukcją ekspresji białek.
4. Indukować ekspresję VHH-mCherry (oraz BirA, jeśli jest współekspresjony) poprzez dodanie 1 mL 1 mL izopropyl-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG), aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM induktora (rozcieńczenie 1:1000). Jeśli przeprowadzono współtransformację z plazmidem ekspresyjnym BirA, uzupełnić hodowlę 10 mL 20 mM roztworu zapasowego D-biotyny, co daje końcowe stężenie 200 μM D-biotyny w podłożu wzrostowym. Ułatwia to biotinylację epitopu akceptora biotyny (BAP) obecnego w konstrukcji VHH-mCherry.
   UWAGA: Przygotuj zapas D-biotyny w ddH₂O i rozpuszczaj go stopniowo dodając 500 mM NaH₂PO₄.
5. Inkubuj hodowlę 1 L indukowaną IPTG przez 13-15 godzin w temperaturze 16 °C, aby sprzyjać optymalnemu fałdowaniu i wydajności białek.
   UWAGA: Warunki ekspresji dla nowo zaprojektowanych konstrukcjonów nanono-innych z innymi znacznikami fluorescencyjnymi mogą wymagać empirycznej optymalizacji przez badacza.
6. Przełóż hodowlę do butelki do wirowania o pojemności 1 l i pozyskaj komórki przez wirowanie w stężeniu 5 000 x g w 4 °C przez 45 minut. Zrzuć supernatant do odpowiednich ciekłych odpadów biologicznych i przystąpić do etapów oczyszczania.
   UWAGA: Protokół można w tym momencie zatrzymać, przechowywając granulat bakteryjny w temperaturze -80 °C. Pellet VHH-mCherry zazwyczaj wygląda na różowy, co wskazuje na prawidłowe składanie fluorescencyjnego białka fuzyjnego.

3. Oczyszczanie VHH-mCherry oparte na IMAC

1. W razie potrzeby rozmroz zamrożony granulat bakteryjny na lodzie (patrz także krok 2.6).
2. Dodaj 30 mL buforu wiążącego lodowato (20 mM imidazolu w 1x PBS) do osadu komórek bakteryjnych i dokładnie zawiesaj, pipetując w górę i w dół. Przełóż zawiesinę do oznaczonej rurki wirówki o pojemności 50 mL.
3. Uzupełnić ponownie zawiesowane komórki lizozymem 200 μg/mL, DNazę I 20 μg/mL, 1 mM MgCl₂ oraz 1 mM fenylometylosulfonylowofluorek (PMSF). Inkubuj mieszankę przez 10 minut w RT, a następnie 1 godzinę w 4 °C na rotatorze end-over-end.
   UWAGA: PMSF jest toksyczne. Przygotowywanie i obsługa roztworów w kapturze chemicznej, w rękawiczkach, fartuchu laboratoryjnym i ochronie oczu; utylizować odpady zawierające PMSF w pojemnikach na halogenowane odpady organiczne. Do eksperymentów stosowano roztwór 0,1 M, który dodatkowo rozcieńczono.
4. Mechanicznie rozbijaj komórki bakteryjne za pomocą sonikatora na końcówce włożonego bezpośrednio do zawiesiny. Stosuj stałe trzy impulsy sonifikacyjne trwające po 1 minutę, pozwalając na 1-minutowy odstęp chłodzenia między każdym impulsem przy określonych ustawieniach sonikatora (rozmiar końcówki sondy: 6 mm, końcówka stała; Amplituda 40%; Cykl pracy (tryb impulsowy): 1 s WŁĄCZONY/1 s WYŁĄCZONY)
5. Lizat należy klarować przez wirowanie w 15 000 x g w 4 °C przez 45 minut, aby rozpylić zanieczyszczenia komórek bakteryjnych i nienaruszone bakterie.
   UWAGA: Lizat można przelać do butelki wirówki lub zastosować do probarek 5 mL do wirowania stołowego.
6. Ostrożnie przelej powstały supernatant do nowej probówki 50 mL i wyrzuć granulat do odpowiednich odpadów biologicznych.
7. Trzymaj wyczyszczony lizat na lodzie, przygotowując się do chromatografii powinowactwa unieruchomionego metalu (IMAC). Do izolacji nanociał oznaczonych histydyną wykorzystaj gotowe, jednorazowe kolumny oczyszczające His-tag, zoptymalizowane do pracy w przepływie grawitacji.
8. Przymocuj kolumny Ni-NTA (niklowo-nitrilotrioctowy kwas) na metalowym stojaku lub odpowiednim uchwytie na kolumny.
   1. Opróżnij bufor magazynowy z kolumn i wyrównuj z 10 mL buforu wiążącego (20 mM imidazolu w 1x PBS).
   2. Pozwól buforowi przechodzić przez niego grawitacją; Usuwać przepływ jako odpady biologiczne.
9. Stopniowo nakładaj usunięty lizat bakteryjny (~30 mL) na kolumnę. Pozwól mu przepływać grawitacją i odrzuć przepływ.
10. Przemyj kolumnę dwoma kolejnymi objętościami po 10 mL buforu wiążącego (20 mM imidazolu w 1x PBS).
11. Elutuj związane nanociała 2 mL buforu elucijnego (500 mM imidazolu w 1x PBS) do rurki mikrowirówki o pojemności 2 mL.
12. Wykonaj wymianę bufora.
    1. Wyrównaj kolumnę odsalaniającą umieszczoną w adapterze rurki 50 mL, płucząc 5 mL z 5 mL 1x PBS.
    2. Pozwól buforowi całkowicie wejść do upakowanej żywicy; Usuń przepływ. Po końcowym płukaniu PBS wiruj kolumnę w 1000 x g przez 2 minuty.
    3. Usuń przepływ. Załóż kolumnę z adapterem na nową rurkę 50 mL. Załaduj 2 mL eluowanego funkcjonalizowanego nanonu (od kroku 3.11) na kolumnę odsolania wyrównaną przez PBS i obróć z 1000 x g przez 2 minuty, zbierając eluat.
       UWAGA: Dializa może być stosowana alternatywnie do wymiany.
13. Ilościowo określić stężenie oczyszczonego białka VHH-mCherry za pomocą kwasu bicynchoninowego (BCA) lub testu Bradforda, zgodnie z protokołami producenta.
    UWAGA: Dla efektywnego pobierania nanoenzymatów w aplikacjach obrazowania komórek żywych zaleca się końcowe stężenie w bazie 5-10 mg/ml.

4. Weryfikacja ekspresji i czystości VHH-mCherry (barwienie Coomasie)

1. Przygotuj żel dodecylosiarczanu sodu i poliakrylamidu o stężeniu 10% (SDS-PAGE) zgodnie z ustalonymi protokołami laboratoryjnymi.
   UWAGA: Alternatywnie można stosować komercyjnie dostępne prefabrykowane żele gradientowe firmy Bio-Rad dla wygody i powtarzalności.
2. Zachowaj 20 μg oczyszczonego VHH-mCherry w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i odkurz przez gotowanie w buforze próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
3. Załaduj zdenaturowaną próbkę nanonomidu na żel SDS-poliakrylamid i wykonuj elektroforezę zgodnie ze standardowymi procedurami PAGE, aż barwnik śledzący (np. bromofenolowy błękit) dotrze do dna żelu rozdzielającego.
4. Kontynuuj barwienie i odbarwianie żelu przez Coomasie.
   1. Ostrożnie usuń żel z kasety i zanurz go w roztworze barwiącym Coomassie (5% z 10 g/l materiału Coomassie Brilliant Blue w 10% kwasie octowym i 45% metanolu w ddH₂O) przez 20-30 minut w RT na delikatnie potrząsającej platformie. Upewnij się, że żel jest całkowicie zanurzony w roztworze barwiącym.
   2. Żel odbarwić za pomocą roztworu odbarwiacza (7,5% kwasu octowego i 15% metanolu w_ddH2O), wykonując 2-3 kolejne płukania po 1 godzinę w RT. Aby optymalne zredukować tło, pozostawić żel na 13-15 godzin w świeżym roztworze odbarwiającym.
      UWAGA: Nadmiar barwnika można skutecznie wchłonąć, umieszczając ręczniki papierowe wokół żelu podczas procesu odbarwiania. Roztwory barwiące i odbarwiające zawierają łatwopalny metanol oraz drażniący kwas octowy. Używaj w okapie oparowym, noś rękawiczki i gogle oraz zbieraj zużyte roztwory w wyznaczonych pojemnikach na łatwopalne ciecze.
5. Wyobraź sobie żel za pomocą systemu dokumentacji żelowej lub wybranego aparatu.
   UWAGA: Aby dodatkowo potwierdzić ekspresję nanono, można wykonać immunobbloting z użyciem przeciwciał specyficznych dla epitopu (patrz także Rysunek 1C).

5. Generowanie linii komórkowych HeLa oznaczonych GFP za pomocą transdukcji retrowirusowej

UWAGA: Różne linie komórkowe GFP HeLa α Kioto (tutaj po prostu HeLa lub HeLa α) zostały wcześniej wygenerowane¹⁷. Do demonstracji testu obrazowania komórek żywych stosuje się jako reprezentatywne białka cargo tagowane GFP lub TfR. Podczas gdy białka TM o topologii typu I są oznaczone tagiem GFP na skrajnym końcu N, białka TM o topologii typu II wymagają fuzji GFP na końcu C.

1. Geny kodujące EGFP-CDMPR (Addgene #182642) lub TfR-EGFP (#243763) zostały wcześniej subsklonowane do wektora retrowirusowego pQCXIP przy użyciu standardowych technik klonowania enzymów restrykcyjnych¹⁷. Po przekształceniu w chemokompetentny E. coli przygotować plazmidowe DNA o wysokiej czystości przy użyciu zestawów przygotowawczych midi (np. od Macherey-Nagel).
   UWAGA: Komórki bakteryjne dla chemokompetentnych należy przygotować zgodnie ze standardowymi protokołami laboratoryjnymi. NEB 5-alfa Kompetentna E. coli z NEB może być stosowana do klonowania i oczyszczania plazmidów.
2. Aby uzyskać stabilne linie komórkowe GFP reporter HeLa, cząstki retrowirusowe są produkowane przez transfekcję linii komórkowej opakowania Phoenix ampho. Wszystkie prace hodowlane komórek prowadzone są w warunkach laminarnego przepływu BSL2.
   1. Dzień przed transfekcją zasiej 2,0-3,0 x 10 6 komórek Phoenix ampho do naczynia o średnicy 10 cm w 10 mL medium, aby osiągnąć 60%-80% konfluencję do następnego dnia. Amphomorfomorfy Phoenix są utrzymywane w DMEM wysokoglukozowym GlutaMAX-I z 10% płodowej surowicy bydła (FBS), 100 jednostkami/ml penicyliny/streptomycyny oraz 1 mM pirowierianianu sodu.
   2. W dniu transfekcji zamień podłoże na 10 ml świeżego, kompletnego podłoża.
   3. W mikrowirówce o pojemności 1,5 mL połącz 1 mL bezsurowiczego i suplementacyjnego DMEM o wysokiej glukozie GlutaMAX-I z 10 μg pQCXIP-EGFP-CDMPR lub pQCXIP-TfR-EGFP oraz 30 μL odczynnika transfekcyjnego FuGENE HD. Dokładnie wymieszaj przez pipetowanie.
   4. Inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby umożliwić powstawanie kompleksów odczynników DNA.
   5. Całą mieszankę transfekcyjną dodaj krople do kultury ampho-feniksa. Delikatnie mieszaj talerzem, aby równomiernie rozłożyć złożoności.
   6. Inkubować transfekowane komórki amphomorfomorfów Feniksa przez 13-15 godzin w temperaturze 37 °C z 5%_CO2.
      UWAGA: Można stosować alternatywne linie komórkowe pakowania, pod warunkiem że są one kompatybilne z systemem wektorowym Retro-X Q.
3. Następnego dnia wyrzuć podłoże transfekcyjne i zastąp go 7 ml świeżego, kompletnego medium, aby zwiększyć produkcję wirusa.
4. Po 48 godzinach i opcjonalnie 72 godzinach po transfekcji pobierz supernatant hodowli (~7 mL) zawierający cząstki wirusa za pomocą pipety. Monitorowanie ekspresji GFP w transekowanych komórkach ampfonii feniksa za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub systemu obrazowania (np. Bio-Rad ZOE).
   UWAGA: Ponownie, manipulacje retrowirusowe wymagają izolacji BSL-2. Wszystkie prace wykonuj w certyfikowanej szafie bioasekuracyjnej, zakładaj rękawiczki, fartuch laboratoryjny i ochronę oczu, a powierzchnie dekontaminuj 1% heksakwartem, a następnie 70% etanolem przed utylizacją odpadów przez autoklaw.
5. Filtruj zebrany wirusowy supernatant przez filtr o rozmiarze 0,45 μm. Filtrowany supernatant może być używany natychmiast (patrz krok 5.7) lub przechowywany w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego użytku lub w -80 °C do długotrwałego przechowywania. Należy zauważyć, że miary wirusa mogą spaść po zamrożeniu.
6. Aby ustanowić stabilne komórki raportujące GFP HeLa, należy przejść do transdukcji retrowirusowej z użyciem filtrowanego supernatantu wirusowego. Wszystkie procedury muszą być wykonywane w warunkach BSL2.
   1. Dzień przed transdukcją należy zasiać około 2,0-3,0 x 10^{komórek HeLa} α w naczyniu o średnicy 10 cm z 10 ml podłoża, aby osiągnąć łączność 60%-80% do następnego dnia. Hodowla komórek HeLa α hodowana jest w DMEM o wysokiej glukozie GlutaMAX-I, uzupełnionej 10% FBS oraz 100 U/mL penicyliny/streptomycyny.
   2. Zmieszaj filtrowany supernatant wirusowy z polibrenem o stężeniu 15 μg/mL (bromek heksadymetrów), aby zwiększyć skuteczność infekcji.
      UWAGA: Polibren jest drażniącym – podczas przygotowania materiału obchodz się z nim w rękawiczkach i ochronie oczu, unikaj powstawania aerozoli oraz utylizuj roztwory zawierające polibren jako niebezpieczne odpady chemiczne.
   3. Następnego dnia zamień standardowy podłoże do wzrostu nierozcieńczonym supernatantem wirusowym zawierającym polibren, zapewniając, że cała powierzchnia naczynia jest pokryta.
   4. Inkubuj komórki HeLa α pod transdukcją przez 13-15 godzin w temperaturze 37 °C z 5%_CO2.
      UWAGA: Aby określić miana wirusa, można przeprowadzić seryjne rozcieńczanie i testy infekcji na komórkach HeLa α. W tym przypadku titrowanie jest opcjonalne, ponieważ retrowirusy infekują tylko komórki dzielące się.
7. Dzień po transdukcji wyrzuć podłoże wirusowe do odpadów BSL2 i zastąp je 10 mL świeżego, kompletnego HeLa α medium. Inkubuj przez 13-15 godzin w temperaturze 37 °C z 5%_CO2.
8. Następnego dnia rozpocznij selekcję, zastępując podłoże kompletnym medium zawierającym 1,5 μg/mL puromycyny.
9. Utrzymuj presję selekcyjną przez 2-3 tygodnie, przepuszczając komórki w razie potrzeby. Przed przeniesieniem genetycznie modyfikowanych komórek do środowiska BSL1 upewnij się, że są wolne od cząstek wirusa zdolnych do replikacji.
10. Aby uzyskać jednorodną populację, stosuje się izolację klonalną z użyciem pierścieni klonujących lub cylindrów albo sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). FACS można wykonać na transdukowanych komórkach HeLa α przy użyciu FACSAria III lub fuzji (BD Biosciences), aby wzbogacić ją dla populacji o jednolitej ekspresji GFP opartej na intensywności fluorescencji.
    UWAGA: Ekspresję raportu GFP w komórkach HeLa α można dodatkowo zweryfikować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej stałych komórek lub immunoblotingu z użyciem przeciwciał przeciw GFP (patrz także Rysunek 2C).

6. Wychwyt VHH-mCherry przez hodowlane komórki do obrazowania żywych komórek

UWAGA: Wszystkie procedury hodowli komórek przeprowadzane są w warunkach sterylnych w warstwie laminarnej przed mikroskopią żywych komórek.

1. 6.1 W sterylnym przepływie laminarnym w każdej jamie μ-szkiełkowego szkła ibiTreat komory ibiTreat zasiewa około 50 000 do 110 000 komórek HeLa stabilnie wyrażających raport CDMPR lub TfR tagowany GFP. Użyj 700 μL kompletnego pożywki hodowlanego zawierającej antybiotyki (DMEM wysokoglukozowe, bez fenolu czerwonego), uzupełnionej 10% FBS, 100 U/mL penicyliny/streptomycyny, 2 mM l-glutaminy oraz 1,5 μg/mL puromycyny.
2. Inkubuj komórki przez 13-15 godzin w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5%_CO2 , aby umożliwić prawidłową adhezję i proliferację. Komórki powinny osiągnąć około 80% konfluencji do następnego dnia.
3. W dniu obrazowania, tuż przed eksperymentem, delikatnie zamień medium w każdej studni na 350 μL świeżego, wolnego od fenolu czerwonego medium kompletnego.
4. Równolegle przygotować roztwór roboczy VHH-mCherry w końcowym stężeniu 2,5 μg/mL (około 50 nM) w podgrzanym medium bez czerwieni fenolowej. Utrzymuj roztwór w temperaturze 37 °C do użycia.
5. Po uruchomieniu zautomatyzowanego systemu obrazowania z żywymi komórkami (np. FEI MORE lub Nikon Ti2 X-Light V3), podgrzej komorę inkubacyjną mikroskopu do 37 °C przy stężeniu 5%_CO2 , a następnie przenieś komorę mikroskopową ibidi na mikroskop i skonfigurować ustawienia akwizycji w następujący sposób.
   1. Wybierz U PlanS Apo 100x NA 1.4 i dodaj komorę mikroskopową ibidi na etapie mikroskopu.
   2. Ustaw dwa kanały z odpowiednią długością fali wzbudzenia i filtrami emisji jednopasmowej dla EGFP (np. 470/20 nm, em: 517/20 nm) i mCherry (np. 550/15 nm, em: 590/20 nm).
   3. Wybierz krótki czas naświetlania i niską intensywność oświetlenia, aby uniknąć fotobielenia (np. 50 ms i 5% mocy dla EGFP, 160 ms i 25% dla mCherry). Ważne jest, aby wybrane wartości były utrzymywane na stałym poziomie we wszystkich eksperymentach.
   4. Dla każdego warunku (=well) zapisz współrzędne 10 różnych pól widzenia z 3-4 komórkami w centrum w liście punktów.
   5. Wyobraz sobie każdą pozycję z tej listy punktów raz za pomocą jednego zdjęcia. To są zdjęcia referencyjne sprzed dodania VHH-mCherry.
   6. Aby rozpocząć pobieranie przez endocyty, delikatnie dodaj 350 μL wcześniej podgrzanego roztworu VHH-mCherry do każdego dołka, zapewniając minimalne zakłócenia monowarstwy komórki. Kontynuuj inkubację w temperaturze 37 °C z 5%_CO2.
   7. Obrazuj każdy punkt na liście punktów wielokrotnie w eksperymencie time-lapse przez 100 klatek z 36-sekundowym opóźnieniem między klatkami przy temperaturze 37 °C przy 5%_CO2.
   8. Aby zmniejszyć wybielanie foto, należy najpierw zlecić pobieranie kanałów na obrazowanie mCherry, a następnie EGFP.
   9. Aby zwiększyć przepustowość, zlec najpierw zdobywaniu wszystkich pozycji kolejno i powtarzaj to dla każdego punktu czasu.

7. Analiza obrazów endocytarnego VHH-mCherry

1. Wstępne przetwarzanie obrazów po akwizycji i ekstrakcja danych na Fidżi.
   1. Załaduj obraz timelapse za pomocą wtyczki importera Bio-Formats z włączoną opcją podziału kanałów.
   2. Koryguj dryf boczny za pomocą wtyczki MultiStackReg. Użyj kanału EGFP jako odniesienia i zastosuj transformację także do kanału mCherry.
   3. Na komórkę narysuj obszar zainteresowania (ROI) narzędziem wielokątowym (np. wokół obszaru okołojądrowego) i dodaj go do menedżera ROI.
   4. Dla obu kanałów mierz średnią intensywność we wszystkich ROI i punktach czasowych za pomocą funkcji Multi Measure w menedżerze ROI i zapisz powstałą tabelę jako plik tekstowy.
   5. Otwórz odpowiadający obraz referencyjny i powtórz pomiar dla każdego ROI.
2. Analiza danych w celu określenia krzywych absorpcji endocytów
   1. Otwórz plik tekstowy i odejmij każdą liczbę klatki o 1, aby zaczynały się od 0, a następnie pomnóż każdą liczbę klatki przez opóźnienie między klatkami w s (czyli 36).
   2. Dla każdego ROI należy odejmować średnią intensywność w kanale VHH-mCherry obrazu referencyjnego od każdej klatki odpowiadającego obrazu poklatkowego w kanale VHH-mCherry, aby usunąć autofluorescencję i tło.
   3. Dla każdej klatki i zwrotu z inwestycji podziel intensywność VHH-mCherry odejmowaną przez tło przez średnią intensywność kanałów EGFP, aby uwzględnić wahania intensywności w ramach ROI inne niż VHH-mCherry, np. ruch Golgiego, skurcz komórek, dryf z lub niestabilności oświetlenia.
   4. Normalizuj powstałą krzywą do jej własnego maksimum.
   5. Wybierz zakres klatek, aby wykluczyć wszelkie artefakty na początku (np. dodawanie mediów) lub na końcu (np. dryf, wybielanie) timelapse.
   6. Dopasuj dane krzywej do pojedynczej funkcji wykładniczego zaniku modelującej proces kinetyczny pierwszego rzędu:
      
      gdzie I(t) to znormalizowana intensywność w czasie t, a t₀ uwzględnia opóźnienie czasowe między dodawaniem VHH-mCherry a rozpoczęciem zapisu. Na podstawie stałej szybkości k oblicz okres półtrwania τ_1/2 procesu jako:
      
      UWAGA: Podczas eksperymentu z kilkoma kolejnymi obrazami pola widzenia (FOV) w jednym punkcie czasowym, każde odpowiadające mu t0 może się nieco różnić, ale powinno się zwiększać z jednego FOV na drugie.
   7. Powtórz procedurę dla wszystkich zbiorów danych i raportuj wartości okresu półtrwania w wykresach pudełkowych.

Aby zbadać wsteczny transport białek do różnych przedziałów wewnątrzkomórkowych, niedawno uruchomiliśmy narzędzie oparte na nanociałkach anty-GFP do oznaczania i śledzenia rekombinowanych białek fuzji z powierzchni komórki17. Tutaj opisujemy bakteryjną produkcję takich derivatyzowanych nanociał i pokazujemy ich przydatność w monitorowaniu endocytów za pomocą obrazowania żywych komórek. W połączeniu z fluorescencyjnym reporterem rezydentnym w Golgi, protokół ten oferuje solidną platformę do ilościowego badania wstecznego transportu wybranych białek cargo do sieci trans-Golgiego (TGN) w czasie rzeczywistym.

Wygenerowaliśmy zbiór odrębnych, funkcjonalizowanych nanociał anty-GFP, które dzielą wspólną modułową architekturę, wykorzystując standardowe techniki klonowania molekularnego17. Chociaż obecne badanie koncentruje się na fluorescencyjnym wariancie VHH-mCherry, dodajemy także dodatkowe derivatyzowane nanociała, aby zilustrować wszechstronność tego zestawu narzędzi i podkreślić ich potencjał do przyszłych zastosowań. Nasza najprostsza konstrukcja, VHH-std (standardowa std), obejmuje domenę VHH, epitopy T7 i HA do wykrywania na bazie przeciwciał, C-końcowy znak heksahistidyny (His6) do oczyszczania oraz sekwencję akceptorów biotyny (BAP) umożliwiającą enzymatyczną biotinylację i testy pulldown oparte na streptawidynie o wysokiej afinitetności (Rysunek 1A). Z tego rdzenia opracowano różne pochodne nano, które ułatwiają badania endocytów i retrogradacji poprzez analizę biochemiczną, obrazowanie komórek stałych i żywych oraz mikroskopię elektronową.

Do obrazowania transportu endocytarnego w żywych komórkach zaprojektowaliśmy fluorescencyjną anty-GFP nanonobody zawierającą fluorofor z widmami wzbudzenia i emisji odmiennymi od tych GFP, zapewniając tym samym optymalną separację widmowę podczas mikroskopii fluorescencyjnej. Na podstawie jego lepszych właściwości fałdowania u E. coli indukowanego przez IPTG oraz dobrze scharakteryzowanych właściwości fotofizycznych, wybraliśmy mCherry jako flagowy tag z wyboru. Inne fluorofory przesunięte ku czerwieni, takie jak monomeryczne białko fluorescencyjne czerwonego (mRFP), również byłyby odpowiednimi alternatywami w teorii, ale mCherry okazał się szczególnie wytrzymały i skuteczny w tym układzie.

Jaki jest potencjał innych funkcjonalizowanych nanociał niż VHH-mCherry? Aby zbadać transport białek z błony plazmatycznej do sieci trans-Golgiego (TGN), wykorzystaliśmy specyficzną lokalizację TPST specyficzną dla przedziałów, które występują wyłącznie w TGN i cisternae trans-Golgiego. W tym celu zmodyfikowaliśmy VHH-std za pomocą tandemowego motywu sulfatacji tyrozyny (2xTS) pochodzącego z procholecystokininy29 szczurów, umożliwiając tym samym biochemiczny odczyt przybycia ładunku do tych przedziałów. Podczas gdy fuzja VHH-std z mCherry umożliwia bezpośrednią wizualizację transportu retrogradacyjnego za pomocą obrazowania komórek stałych lub żywych, funkcionalizacja peroksydazami takimi jak APEX230 umożliwia lokalizację ultrastrukturalną za pomocą mikroskopii elektronowej, celowanej ablacji cytochemicznej lub testów biotynylizacji opartych na bliskości. Ponadto włączenie miejsca rozszczepienia proteazy wirusa wystrawionego tytoniu (TEV) w rusztowaniu nanononoioidów zapewnia biochemiczny sposób rozróżniania między zinternalizowanymi a powierzchniowymi nanociałkami (Rysunek 1A). Wcześniej stosowaliśmy konstrukcję VHH-tev do monitorowania kinetyki recyklingu nanociał związanych z EGFP-CDMPR i TfR-EGFP17. Ponowne pojawienie się receptorów oznaczonych nanociałami na powierzchni komórki można było łatwo wykryć poprzez zastosowanie rekombinowanej proteazy TEV pozakomórkowej, co skutkowało specyficzną utratą kasety epitopu C-końcowego nanociała. Analogicznie, włączenie miejsca rozszczepienia TEV w przedstawionym mCherry funkcionalyzowanym nanoniku, VHH-mCherry umożliwia dynamiczną ocenę recyklingu raportu EGFP za pomocą obrazowania żywych komórek. Funkcjonalizację z alternatywnymi domenami białkowymi – takimi jak dodatkowe fluorofory, znaczniki enzymatyczne lub motywy sekwencji do modyfikacji posttranslacyjnej – można łatwo osiągnąć poprzez subklonowanie pożądanych insertów do szkieletu VHH-std przez miejsca restrykcyjne SpeI i EcoRI. Wszystkie funkcjonalizowane konstrukcje nanononikowe anty-GFP użyte w oryginalnym badaniu17 zostały zdeponowane w Addgene do publicznej dystrybucji.

Korzystając z opisanego powyżej protokołu, wszystkie warianty nanono, przedstawione tutaj, zostały oczyszczone do wysokiej wydajności i czystości (rysunek 1B). Tylko fuzja mCherry wykazała niewielkie przecięcie domen białkowych po oczyszczeniu (Rysunek 1B, ścieżka 5). Dwa obserwowane produkty degradacji najprawdopodobniej odpowiadają poszczególnym domenom VHH i mCherry, co można wywnioskować na podstawie ich pozornych mas cząsteczkowych i potwierdzić detekcją immunoblotową specyficzną dla epitopu (rysunek 1C). W przypadku braku współekspresyjnego BirA, VHH-mCherry zazwyczaj odzyskiwał wydajność około 20 mg na preparat. Na podstawie naszych doświadczeń, współekspresja BirA konsekwentnie zmniejsza wydajność nano-aA o około 1/3do 1/2. Biotynowalacja była dość kompletna, ponieważ nanociała z mieszaniny 1:1 z BSA zostały w pełni odzyskane przez streptawidynę-agarozę (Rysunek 1D).

Aby ocenić przydatność tego zestawu narzędzi nanono-do badania transportu endocytowego, stworzyliśmy stabilne linie komórkowe HeLa ekspresujące białka receptorów powierzchniowych oznaczone tagowaniem EGFP o wyraźnych szlakach transportu wewnątrzkomórkowego. Wśród nich były TfR, które cykluje między błoną plazmatyczną a wczesnymi (sortującymi i recyklingowymi) endosomami; TGN46, który komunikuje się między błoną plazmatyczną a TGN za pomocą wczesnych endosomów; oraz oba MPR, które przemieszczają się między TGN, błoną plazmatyczną oraz zarówno wczesnym, jak i późnym endosomem17. EGFP został zfuzowany z domeną zewnątrzkomórkową każdego receptora – konkretnie wstawiony pomiędzy peptyd sygnałowy a sekwencję receptorową dla CDMPR, CIMPR i TGN46 – oraz z końcowym punktem C TfR. Ten projekt zachował natywne domeny cytoplazmatyczne, zapewniając, że wszystkie znane sygnały sortujące pozostały nienaruszone, a tag EGFP był dostępny do wiązania przez zewnętrzne nanociała anty-GFP (Rysunek 1E). Dla CIMPR, którego domena zewnątrzkomórkowa jest wyjątkowo duża, zastosowano wersję skróconą, zgodnie z wcześniejszymi badaniami wykazującymi, że takie skracanie zachowuje normalne zachowanie transportu31,32.

Stabilne linie komórkowe zostały ustanowione przez transdukcję retrowirusową, a następnie przez fluorescencyjne aktywowane sortowanie komórek (FACS), aby wyizolować jednorodne populacje komórek o umiarkowanym i porównywalnym poziomie ekspresji. Warto zauważyć, że EGFP-CDMPR konsekwentnie występował jako podwójny pas u immunoblotów, podobnie jak jego endogenny odpowiednik33, co wskazuje na heterogenną glikozylację. Aby ocenić, czy białka fuzyjne EGFP odtwarzają wzorce lokalizacji i ekspresji endogennych białek w stanie stacjonarnym, komórki stabilnie ekspresujące zostały współhodowane z komórkami HeLa macierzystymi i przeanalizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej konfokalnej (Rysunek 2B). Sygnał EGFP wiernie odzwierciedlał rozkład odpowiadających im endogennych białek. Jak można się spodziewać, CDMPR, CIMPR i ich wersje oznaczone tagowaniem EGFP lokalizowały się głównie w obszarze okołojądrowym – odzwierciedlając TGN i późne przedziały endosomalne – z dodatkowym oznakowaniem w endosomach obwodowych. Zarówno endogenne, jak i tagowane EGFP-tagowane TGN46 występowały niemal wyłącznie w TGN okołojądrowym, podczas gdy TfR i TfR-EGFP wykazywały charakterystyczny wczesny rozkład endosomów, z wyraźnym sortowaniem obwodowym i recyklingiem okojądrowym. Chociaż użyte przeciwciała wykrywały zarówno endogenne, jak i oznaczone EGFP (z wyjątkiem CIMPR), ogólna intensywność barwienia nie wzrosła znacząco w komórkach ekspresujących białka fuzyjne, co sugeruje, że konstrukty EGFP nie były znacząco nadekspresowane. Uwzględniliśmy EGFP-TGN46 i EGFP-CIMPR na Rysunku 2B dla bezpośredniego porównania z EGFP-CDMPR i TfR-EGFP. Protokoły stosowane do utrwalania komórek i obrazowania mikroskopią fluorescencyjną zostały opisane w poprzednich badaniach 17,19.

Za pomocą VHH-mCherry transport endocytowy białek raportujących oznaczonych EGFP można monitorować za pomocą obrazowania komórek żywych. Do tego celu użyliśmy jako przykładów komórek wyrażających EGFP-CDMPR i TfR-EGFP. Komórki były obrazowane w czasie za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego po dodaniu VHH-mCherry do medium (Wideo 1 i Wideo 2). Na rysunku 3 pokazano zdjęcia z różnych momentów czasowych. Absorpcję określono poprzez pomiar sygnału w kanale mCherry, odejmowanie tła autofluorescencji i normalizację do sygnału EGFP, aby wyeliminować fluktuacje spowodowane ruchem oznakowanych przedziałów lub potencjalnymi niewielkimi przesunięciami płaszczyzny ogniskowej. Fluorescencja VHH-mCherry w ośrodku przy 25 nM była pomijalna i nie kolidowała z pomiarami. Analiza transportu reporterów z powierzchni komórki do ich przedziałów wewnątrzkomórkowych, do rozkładu stacjonarnego, dała te same wyniki kinetyczne co eksperymenty biochemiczne pokazane na Rysunku 2 poprzedniej publikacji17, z pozornym okresem półtrwania absorpcji ~9 min dla EGFP-CDMPR i ~4 min dla TfR-EGFP, a nasyceniem po ~43 min i ~20 min, odpowiednio. Wartości te były porównywalne z wynikami uzyskanymi z eksperymentów biochemicznych z użyciem testów immunoblottingowych17. Zasadniczo można również analizować kinetykę transportu wstecznego do obszarów podkomórkowych zainteresowania, takich jak obszar okołojądrowy o najwyższym stężeniu MPR. Jednak region okołojądrowy zawiera nie tylko Golgi/TGN, ale jest także wzbogacony o późne endosomy i endosomy recyklingowe. Kinetyka pochłaniania nano-nanicow do obszaru okołojądrowego nie jest wystarczająco precyzyjna, aby przeanalizować transport wsteczny do określonego organellu. Aby wiarygodniej ocenić transport z błony plazmatycznej do TGN, inne białko fluorescencyjne, białko transbłonowe obecne w TGN, musi być stabilnie współekspresowane wraz z białkiem reporterowym GFP, w taki sposób, aby nie dochodziło do spektralnego nakładania się właściwości fluoroforu. Wykorzystanie tego dodatkowego markera pozwala na wykrywanie VHH-mCherry importowanego przez reportera, analogicznego do sulfatacji tyrozyny pośredniczonej przez TPST, jak wcześniej udokumentowano19.

Rysunek 1: Projektowanie i produkcja derivatyzowanych nanociał do śledzenia białek powierzchni komórek oznaczonych tagiem EGFP. (A) Schematyczny przegląd derivatyzowanych nanociał. Standardowy konstrukt nanoinoioidowy obejmuje domenę VHH specyficzną dla GFP, tagi epitopowe T7 i HA, akceptor biotyny (BAP) oraz C-końcowy znak heksahistidyny (His6) do oczyszczania. Dodatkowe warianty nanonoioidów obejmują modyfikacje z tandemowymi miejscami sulfatacji tyrozyny (2xTS), inżynieryjną peroksydazą APEX2 lub fluorescencyjnym białkiem mCherry. Pasek skali wskazuje długość aminokwasu (aa). (B) Nanociała o ekspresji bakteryjnej i oczyszczonej powinowactwie (20-50 μg) zostały przeanalizowane za pomocą gradientowego SDS-PAGE i zwizualizowane za pomocą barwienia Coomasie. Standardy masy cząsteczkowej (w kDa) są oznaczone po lewej stronie. Niewielkie przecięcie proteolityczne zaobserwowano tylko dla VHH-mCherry, prawdopodobnie występujące pomiędzy domenami VHH i mCherry. (C) Analiza immunoblowata preparatów nanonikowych (10 ng) z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko epitopom T7, HA lubHis 6 , lub wykrywana przez streptawidynę-HRP (SA-HRP) do oceny biotinylacji. (D) Zakres biotynylacji nanonanoplazmy oceniono poprzez inkubację nanociał w stosunku 1:1 z BSA, a następnie nastąpiło pulldown, granulowanie i mycie kulek przez streptawidynę-agarozę. Równoważne objętości supernatantu (S) i materiału z kulkami (B) zostały następnie przeanalizowane za pomocą barwienia SDS-PAGE i Coomasie. Ilościowe odzyskanie nanoników w frakcji związanej z kulkami wskazuje na całkowitą biotinylację. Obecność fragmentów VHH i mCherry w frakcji wiązanej sugeruje częściową degradację, prawdopodobnie podczas przygotowania próbki do analizy SDS-PAGE. Biała linia między pasami 2 i 3 oznacza usunięcie dwóch niepowiązanych pasów. Liczba ta została zmieniona z17. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Ekspresja i wewnątrzkomórkowa lokalizacja fluorescencyjnie oznakowanych receptorów cargo oznaczonych EGFP. (A) Schematyczne przedstawienie konstrukcji fuzji EGFP. Sekwencje pochodzące z białek sekretornych transbłonowych są przedstawione na czarno, a peptydy sygnałowe N terminalne i domeny transbłonowe wewnętrzne są podświetlone na żółto. Część EGFP jest zilustrowana na zielono. Dla CDMPR, TfR i TGN46 powstały pełnowymiarowe konstrukcje, natomiast dobrze scharakteryzowany wariant skrócony użyto dla CIMPR, aby zachować normalne zachowanie handlowe. Pasek skali wskazuje długość aminokwasu (aa). EGFP-CDMPR i TfR-EGFP zostały opisanewcześniej 17. (B) Aby ocenić lokalizację podkomórkową, komórki HeLa stabilnie wyrażające białka fuzyjne EGFP zostały współhodowane z komórkami HeLa macierzystymi i przeanalizowane mikroskopią fluorescencyjną. Pasek skali oznacza 10 μm. (C) komórki HeLa stabilnie wyrażające białka raportujące tagowane EGFP zostały zlikwidowane, a ekstrakty białkowe poddane SDS-PAGE, a następnie immunoblotting z użyciem przeciwciał przeciwko GFP i aktynie. Markery masy cząsteczkowej (w kDa) są oznaczone po prawej stronie. Liczba ta została zmieniona z17. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Obrazowanie kinetyki endocytów nano-komórek żywymi pośredniczone przez EGFP-CDMPR i TfR-EGFP. Obrazowanie żywymi komórkami wykonano po dodaniu 25 nM VHH-mCherry do komórek HeLa stabilnie wyrażających (A) EGFP-CDMPR lub (B) TfR-EGFP w kompletnym medium wolnym od fenolu w temperaturze 37 °C. Komórki były obrazowane w kanałach GFP i mCherry za pomocą półautomatycznego mikroskopu fluorescencyjnego szerokiego pola w odstępach 36 sekund. Pokazane są reprezentatywne połączone zdjęcia nieruchome, wraz z powiększonym widokiem obszaru okołojądrowego (powiększenie: 2,2x) w poszczególnych kanałach poniżej. (Pręty skalowe, 10 μm.) Zobacz także Wideo 1 i Wideo 2. Analiza ilościowa kinetyki pobierania nanonoenzymów w (C) EGFP-CDMPR i (D) TfR-EGFP została przeprowadzona na podstawie danych z trzech niezależnych eksperymentów, z których każdy obejmował około 40 pojedynczych komórek. Aby uwzględnić ruch organelli i zmienność płaszczyzny ogniskowej, intensywność fluorescencji mCherry została znormalizowana (normowa) do sygnału GFP i nakreślona jako średnia ± SD we wszystkich komórkach z trzech eksperymentów. Średni maksymalny sygnał pochwycenia został znormalizowany do 1. Kinetyka pochłaniania dla każdej komórki była indywidualnie dopasowana za pomocą modelu kinetycznego pierwszego rzędu. Wykresy przedstawiają uśrednione krzywe wyprowadzone ze średniej odpowiadających stałych prędkości. Liczba ta została zmieniona z17. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Film 1: Obrazowanie żywymi komórkami pobierania mCherry-nanonobody przez EGFP-CDMPR. Komórki HeLa stabilnie ekspresujące EGFP-CDMPR były inkubowane w temperaturze 37 °C w pełnym medium zawierającym 25 nM VHH-mCherry i obrazowane w kanałach fluorescencyjnych EGFP i mCherry co 36 sekund. Film był renderowany z częstotliwością odtwarzania 5 klatek/s, co odpowiada kompresji w czasie rzeczywistym 3 min/s. Ten film został zmodyfikowany z17. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 2: Obrazowanie żywymi komórkami pobierania mCherry-nanono-wychwytu przez TfR-EGFP. Komórki HeLa stabilnie ekspresujące TfR-EGFP były inkubowane w temperaturze 37 °C w pełnym medium uzupełnionym o 25 nM VHH-mCherry i obrazowane pod kątem fluorescencji EGFP i mCherry w odstępach 36 sekund. Film był renderowany z prędkością 5 klatek/s, co reprezentuje szybkość poklatkową 3 minut/s. Ten film został zmodyfikowany z17. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.