W badaniu przedstawiono protokół oceny wpływu kurkuminy na zachowanie komórek siatkówczaka poprzez modulację szlaku Wnt / β-kateniny i ekspresję miR-22.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
* These authors contributed equally
W badaniu przedstawiono protokół oceny wpływu kurkuminy na zachowanie komórek siatkówczaka poprzez modulację szlaku Wnt / β-kateniny i ekspresję miR-22.
Siatkówczak (RB) jest powszechnym nowotworem złośliwym wewnątrzgałkowym dotykającym niemowlęta i dzieci, jednak jego dokładna etiologia i patogeneza pozostają nie w pełni poznane. Kurkumina, bioaktywny polifenol, hamuje progresję guza poprzez modulację kaskady sygnalizacyjnej Wnt / β-kateniny za pośrednictwem mikroRNA. Badanie to miało na celu wyjaśnienie, w jaki sposób kurkumina pośredniczy w działaniu przeciwnowotworowym w RB poprzez zbadanie jej regulacji ekspresji miRNA-22 (miR-22) i zbadanie podstawowych mechanizmów molekularnych. Dwa zwalidowane modele siatkówczaka (SO-RB50/WERI-Rb-1) leczono kurkuminą w różnych stężeniach. Aby nakreślić regulację miR-22 sygnalizacji Wnt / β-kateniny, komórki docelowe transdukowano albo lentiwirusem mimicznym miR-22, albo niefunkcjonalnym lentiwirusem kontrolnym. Modele guza ksenoprzeszczepu stworzono u myszy przy użyciu ludzkich komórek RB w celu obserwacji wpływu kurkuminy in vivo na wielkość guza, ekspresję miR-22 i poziomy białka Wnt / β-kateniny. Proliferację, inwazję i apoptozę komórkową oceniano odpowiednio za pomocą testu podwójnego barwienia CCK-8, Transwell i Annexin V-APC-PI. Poziomy miR-22 określono ilościowo za pomocą RT-PCR, a profile ekspresji Wnt1 i β-kateniny określono za pomocą analizy Western blot. Leczenie kurkuminą spowodowało zmniejszenie proliferacji i inwazyjności w komórkach RB, przy jednoczesnym zwiększeniu apoptozy i podniesieniu ekspresji miR-22. Hamowanie miR-22 zmniejszyło wpływ kurkuminy na szlak sygnałowy Wnt / β-kateniny. W badaniach ksenoprzeszczepów kurkumina znacznie zmniejszyła rozmiar guza i zwiększyła ekspresję miR-22 w guzach, skutecznie hamując sygnalizację Wnt / β-kateniny. Odkrycia te pokazują, że kurkumina hamuje proliferację i inwazyjność komórek RB, jednocześnie promując apoptozę, głównie za pośrednictwem regulacji w górę miR-22, a następnie hamowania szlaku Wnt / β-kateniny.
Retinoblastoma (RB), nowotwór złośliwy u dzieci o wysokiej agresywności powstający w tkankach siatkówki, stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia, zwłaszcza dla dzieci poniżej piątego roku życia. Mutacje genetyczne, szczególnie te dotyczące genu RB1, są ściśle związane z rozwojem tej choroby1. Biorąc pod uwagę znaczne rozpowszechnienie siatkówczaka (RB) wśród niemowląt i dzieci, w połączeniu z faktem, że rocznie zgłasza się około 9000 nowych przypadków, głównie w krajach o niskich dochodach i rozwijających się, kompleksowe zrozumienie mechanizmów choroby jest niezbędne do opracowania skutecznych strategii terapeutycznych i poprawy wyników leczeni....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki i Dobrostanu Zwierząt (AEWC) Szpitala Okulistycznego w Tianjin (nr zatwierdzenia. NKYY-DWLL-2023-054). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Hodowla komórkowa
Komórki ludzkich linii siatkówczaka WERI-Rb-1 i SO-RB50 hodowano w zmodyfikowanym pożywce Eagle firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny. Komórki wysiewano w odpowiedniej gęstości w kolbach hodowlanych i utrzymywano w temper....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zależne od dawki antyproliferacyjne i przeciwinwazyjne działanie kurkuminy na ludzkie komórki siatkówczaka, któremu towarzyszy dezaktywacja szlaku Wnt / β-kateniny
Ludzkie komórki RB traktowano różnymi dawkami kurkuminy przez okres 24 godzin. Odkrycia ujawniły zależny od dawki spadek żywotności i inwazji komórek, w połączeniu ze wzrostem apoptozy. W szczególności, gdy stężenie kurkuminy wzrosło z 10 do 50 μM, proliferacja komórek zmniejszała się stopniowo zarówno w liniach komórkowych SO-Rb50, jak i W.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Kurkumina, polifenol pochodzący z kłączy Curcuma longa, jest znana ze swoich właściwości przeciwzapalnych, antyangiogennych, antyproliferacyjnych i przeciwutleniających23,24. Dodatkowo ma właściwości przeciwnowotworowe, w szczególności zdolność do indukowania apoptozy w komórkach nowotworowych25. Chociaż wcześniejsze badania podkreślały hamujące wzrost działanie kurkuminy na komórki RB 22,26,27, nadal istnieje ograniczone zrozumienie dokła.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (82271218); Fundusz Naukowy Szpitala Okulistycznego w Tianjin (projekt ogólny ykyb1908).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw do podwójnego barwienia Annexin V-APC/PI | Solarbio (Słoneczna Biologia) | Zobacz materiał CA1020 | ilościowa ocena apoptozy w komórkach RB za pomocą cytometrii przepływowej |
| Zestaw testowy CCK-8 | Beyotime | Zobacz materiał C0038 | Pomiar absorbancji przy długości fali 490 nm w celu oceny zdolności proliferacyjnej komórek |
| Inkubator CO2 | Eppendorf powiedział: | utrzymywać optymalne warunki hodowli (37° C, 5% CO2 i wilgotność nasycona) do propagacji komórek RB | |
| Kurkumina | Sigma | Zobacz materiał C1386 | Badanie przeciwnowotworowego działania kurkuminy na siatkówczaka (RB) |
| Podłoże chemiluminescencyjne ECL | Życiorys (Życiorys) | Nr kat. C05-07004 | wizualizacja pasm białkowych w analizie Western blot |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Komórka VivaCell | C04001-500 C04002-500 | Hodowla komórkowa |
| Cytometria przepływowa | Beckman Coulter | Gallios (Wyspa Gallios) | Ilościowa analiza szybkości apoptozy komórek |
| Oprogramowanie ImageJ | Narodowe Instytuty Zdrowia | Wersja 6 | Analiza pasma Western blot, ocena poziomów ekspresji białek |
| Mikroskop odwrócony | Olympus | CKX53 powiedział: | obserwuj i licz komórki inwazyjne 400 razy; powiększenie w teście Transwell |
| Lipofektamina 3000 | Invitrogen | L3000015 | Transfekcja komórek |
| Czytnik mikropłytek | Thermo | Zobacz materiał K3 | kwantyfikacja testu immunoenzymatycznego (ELISA) |
| miR-22 naśladuje lentiwirusa | Hanheng Biotechnologia | has-miR-22 powiedział: | ustanowić stabilnie transfekowaną linię komórkową do doświadczeń na zwierzętach |
| Multipleksowy system PCR w czasie rzeczywistym | Bio-Rad | Zobacz materiał CFX384 | wykonać ilościowy RT-PCR (QRT-PCR) w celu precyzyjnej analizy ekspresji genów |
| Penicylina-Streptomycyna (PS) | Abbkine powiedział: | BMC1030 | Dodawany do pożywek do hodowli komórkowych w celu zapobieżenia skażeniu bakteryjnemu |
| Zestaw do ekstrakcji białek | Solarbio (Słoneczna Biologia) | Zobacz materiał BC3640-50T | izolacja białek z próbek komórkowych i tkankowych |
| Wektor psiCHECK-2 | promega powiedział: | JR20110328 | skonstruować plazmidy reporterowe Wnt1-WT (typ dziki) i Wnt1-MUT (zmutowany) do badania interakcji między miR-22 a Wnt1 3'UTR |
| Membrana PVDF | Merck | ISEQ00010 | białkiem |
| Przeciwciało drugorzędowe królika IgG | Technologie sygnalizacji komórkowej | 14708 | Wykrywanie Western blot poprzez wiązanie się z przeciwciałem pierwszorzędowym |
| Oprogramowanie statystyczne SPSS | IBM | SPSS 20.0 | przeprowadzanie analizy statystycznej na danych eksperymentalnych |
| Zestaw SuperScript III do syntezy pierwszej nici SuperMix | Invitrogen | 11752-050 | odwrotna transkrypcja RNA do cDNA w celu późniejszej analizy RT-PCR |
| Zestaw SYBR Premix Ex Taq II | Życiorys TaKaRa | Przekaźnik RR820A | Do RT-PCR do ilościowego wykrywania ekspresji Wnt1, β-aktyny i innych genów docelowych |
| Odczynnik TRIzol | Invitrogen | 12183-555 | Ekstrakcja RNA zarówno z próbek komórkowych, jak i tkankowych |
| Spektrofotometr UV | Beckman | DU800 | określić stężenie i czystość próbek RNA |
| Przeciwciało Wnt1 | Księga Abcam | ab15251 powiedział: | Analiza Western blot w celu wykrycia ekspresji białka Wnt1 |
| β-aktyna przeciwciało | Księga Abcam | ab8227 powiedział: | używany jako wewnętrzne odniesienie do normalizacji obciążenia białkami w analizie Western blot |
| β-katenina przeciwciało | Technologie sygnalizacji komórkowej | 37447 | Analiza Western blot w celu wykrycia ekspresji białka beta;-kateniny |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.