Protokół ten ustala obiektywną definicję wystarczającej ilości przeszczepu na podstawie dziennej ilości moczu oraz wartości panelowych funkcji nerek w surowicy, aby reproducowalnie i obiektywnie scharakteryzować, czy przeszczep jest samodzielnie zdolny do utrzymania homeostazy bez uzależnienia od dializ w ciągu pierwszych 7 dni po przeszczepie.
Artykuł metodologiczny
Standaryzowany protokół autotransplantacji nerki świńskiej do badania opóźnionej funkcji przeszczepu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opóźniona funkcja przeszczepu (DGF) jest powszechnie definiowana jako konieczność dializ w ciągu 7 dni po przeszczepie nerki; jednak obecne definicje często opierają się na subiektywnej ocenie klinicznej i nie mają ustandaryzowanych kryteriów dokładnie opisujących wystarczającą ilość przeszczepów. Ta niespójność utrudnia diagnozę i porównania badań. Protokół ten ustala obiektywne progi dla DGF, wykorzystując ilościowe wartości wydzieliny moczu i funkcji nerek w surowicy, aby obiektywnie opisać wystarczającość przeszczepu oraz niezależną zdolność do utrzymania homeostazy. Badania nad modelami świń są trudne ze względu na brak konsensusowych diagnostycznych punktów końcowych dla DGF oraz trudności w przeprowadzaniu dializ przez dłuższy czas. Aby temu zaradzić, wprowadzamy jasno określony protokół definiowania i indukowania DGF w autotransplantacji nerki wieprzowej po 30 minutach izolowanej gorącej niedokrwi nerki, symulując zabieg podobny do śmierci dawcy (DCD). Opisujemy nieinwazyjne cewnikowanie metodą Foleya, centralny dostęp żylny oraz monitorowanie linii tętniczych u samic świń, umożliwiające dokładne pomiary wydzielania moczu, codzienne badania laboratoryjne oraz monitorowanie wewnątrzoperacyjne. Techniki te są szczegółowo opisane, aby zapewnić przejrzystość i powtarzalność, tworząc standaryzowany punkt końcowy badań DGF u świń, który odzwierciedla fenotyp kliniczny.
Wprowadzenie
Lista oczekujących na przeszczep nerki w USA przekracza 90 000 pacjentów. Z powodu niedoboru przeszczepów rocznie wykonuje się mniej niż 30 000 przeszczepów nerek, podczas gdy podobna grupa nowych pacjentów dołącza do listy oczekujących1. Aby sprostać pogarszającemu się niedoborowi, coraz częściej wybiera się nerki DCD z powodu uszkodzenia niedokrwiennego. W rzeczywistości od 2023 roku 50% nerek przeszczepionych w USA pochodziło od dawców DCD. Nerki DCD wiążą się z wysokim wskaźnikiem opóźnionej funkcji przeszczepu (DGF). DGF jest przez większość definiowana jako wymóg dializy w ciągu 7 dni po przeszczepie nerki. Chociaż DGF jest tymczasową niewystarczalnością przeszczepu, wiąże się ze zwiększonym wskaźnikiem wczesnego i późnego odrzucenia szczepu oraz krótszą medianą przeżycia szczepu wynoszącą 8-12lat. Jako w dużej mierze subiektywna definicja kliniczna, DGF jest trudna do badania w modelach świń ze względu na brak obiektywnej, standaryzowanej definicji oraz wyzwania związane z długoterminową dializą u świń. W ramach tych prac opracowaliśmy obiektywny, ustandaryzowany protokół definiujący wystarczającość przeszczepu i indukując DGF w autotransplantacji nerki świnki. Ze względu na potwierdzone przez ksenotransplantację podobieństwa w funkcjonowaniu nerek wieprzowych i ludzkich, protokół ten można przełożyć na przeszczep nerki u człowieka. Autotransplantacja nerek wieprzowych została wybrana dla tego modelu głównie ze względu na wyizolowanie efektu uszkodzenia niedokrwieniowo-reperfuzyjnego jako zmiennej kontrolującej wczesną niewydolność przeszczepu oraz neutralizującej toksyczność alloimmunologiczną lub immunosupresyjną jako czynniki zakłócające.
Definicja opóźnionej funkcji szczepu: Aby pokonać dwa główne wyzwania: 1) obiektywne zdefiniowanie wystarczającej ilości przeszczepu oraz 2) określenie tymczasowego charakteru fenotypu w przypadku braku wsparcia dializacyjnego jako mostu do funkcjonalnej regeneracji przeszczepu, użyliśmy obiektywnych wartości z zakresu wydzielania moczu i funkcji nerek, aby zdefiniować chorobę. Standaryzując reanimację objętościową, kryteria autotransplantacji oraz brak uszkodzenia zespolenia (tętnica, żyła lub moczowód), wyklucza trwałą, anatomiczną przyczynę niewydolności przeszczepu. Zdefiniowaliśmy opóźnioną funkcję przeszczepu w autotransplantacji świń jako: Wczesną tymczasową niewydolność przeszczepu spowodowaną przedłużającą się anurią (<100 mL/dzień) przekraczającą 3 dni, prowadzącą do zmiennych poziomów BUN, kreatyniny i potasu do osiągnięcia humanitarnego końcowego poziomu K ≥ 8 mEq/L (wysokie ryzyko arytmii serca i obiektywne wskazanie do pilnej/nagłej dializy) przy braku zaburzeń anastomotycznych. Na podstawie tej definicji, funkcjonalny przeszczep generuje wystarczającą ilość moczu, aby utrzymać równowagę elektrolitową oraz spadające BUN i kreatyninę. Natomiast niewystarczająca ilość przeszczepu nie produkuje wystarczającej ilości moczu do wydalania BUN i kreatyniny oraz powoduje zagrażającą życiu hiperkaliemię wymagającą dializy (lub humanitarnej eutanazji w jego braku), z powodu odwracalnego urazu niedokrwiennego niedokrwienia i reperfuzji, a nie nieodwracalnego uszkodzenia lub odrzucenia anastomotycznego.
Protokół
Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Duke'a (IACUC). W tym modelu stosuje się świnie Yorkshire tylko dla samic (do nieinwazyjnego wkładania cewnika Foleya) o wadze 40-50 kg (dla wygodnych średnic nerek, naczyniowych i cewek moczowych do kanilowacji). Protokół ten mógł być realizowany przez zespół czterech osób: chirurga, asystenta, perfuzjonistę organowego oraz kierownika badania (do pobierania próbek, materiałów i danych).
1. Dzień pooperacyjny (POD) -1 (pobieranie nerek)
- Znieczulenie
- Należy podawać zwierzętom domięśniowe (IM) zastrzyki ketaminy (22 mg/kg) i midazolamu (0,5 mg/kg).
UWAGA: Rozpoczęcie od stosunkowo wyższej dawki ketaminy bezpiecznie zmniejsza potrzebę izofluranu podczas zabiegu. - Najpierw podawaj izofluran przez stożek pyska w wysokości 1-1,5% (maksymalnie 2,5%), aż szczęka i górne drogi oddechowe zostaną rozluźnione i umożliwić intubację. Ustaw objętość pływową na 7-7,5 mL/kg, a wentylację na 18-20 oddechów na minutę, aby utrzymać poziom saturacji tlenem i PCO2. Delikatnie nałóż maść do oczu i/lub zaklej powieki taśmą, aby chronić oczy przed drapaniem lub wysuszaniem.
- Należy podawać zwierzętom domięśniowe (IM) zastrzyki ketaminy (22 mg/kg) i midazolamu (0,5 mg/kg).
- Tunelowe umieszczenie linii centralnej
- Umieść centralną linię Hickmana o sile 9,6 Fr o pojemności pojedynczego lumenu, wychodzącą ze skóry z tyłu świnie między łopatkami, aby umożliwić bezbolesne pobieranie krwi na żądanie, jednocześnie pozwalając jej leżeć na boku przy minimalnym stresie i przy niskim ryzyku uszkodzenia cewnika centralnego (Rysunek 1).
- Po przygotowaniu skóry, używając skalpela z 11 ostrzami, wykonaj trzy powierzchowne nacięcia skórne przez skórę do warstwy tłuszczu podskórnej, między łopatkami, na karku oraz po prawej przedniej stronie szyi.
- Użyj tunelera tkankowego, aby stworzyć podskórny tunel łączący trzy nacięcia. Podczas leżenia na brzuchu przewlecz cewnik między łopatkami do prawej przedniej części szyi.
- Aby wprowadzić cewnik centralny w żyłę szyjną prawą zewnętrzną (EJ), obróć świnię do pozycji leżącej Trendelenburga i użyć igły wykrywacza 18 G, aby aspirować EJ za pomocą techniki triangulacji anatomicznej Flourneya i Maniego3. Przeprowadź przewód do lumenu technikąSeldingera 4, użyj introduktora peel-away do rozszerzenia przewodu, przewlecz cewnik Hickmana do lumen EJ i zabezpiecz centralną żyłkę z tyłu. Po potwierdzeniu powrotu krwi heparyna blokuje linię i powtarza po każdym użyciu5. Jeśli dostęp do prawego EJ okaże się trudny, użyj tunelera tkankowego, aby przedłużyć kanał podskórny przed tchawicą i podać cewnik na lewą stronę szyi w celu wprowadzenia do lewego EJ.
- Umieść centralną linię Hickmana o sile 9,6 Fr o pojemności pojedynczego lumenu, wychodzącą ze skóry z tyłu świnie między łopatkami, aby umożliwić bezbolesne pobieranie krwi na żądanie, jednocześnie pozwalając jej leżeć na boku przy minimalnym stresie i przy niskim ryzyku uszkodzenia cewnika centralnego (Rysunek 1).
- Umieszczenie Foleya (trzy metody zwiększania inwazyjnej w przypadku niepowodzenia wszczepienia)
- Podejście ręczne
- Połóż zwierzę na plecach na stole operacyjnym. Przygotuj skórę wokół sklepienia pochwy betadyną i zalać sklepienie pochwy 10 mL betadyny (aby zmniejszyć obciążenie drobnoustrojami i ryzyko zakażenia dróg moczowych).
UWAGA: Nawet po pełnym napompowaniu balony o pojemności 5 ml mają tendencję do wysuwania się. - Ręcznie włóż nawilżony cewnik Foleya o średnicy 12-14 Fr, usztywniony drutem, wyczuwając otwór cewki moczowej głęboki 4-5 cm w otwór pochwy na przedniej (brzusznej) ścianie pochwy.
- Połóż zwierzę na plecach na stole operacyjnym. Przygotuj skórę wokół sklepienia pochwy betadyną i zalać sklepienie pochwy 10 mL betadyny (aby zmniejszyć obciążenie drobnoustrojami i ryzyko zakażenia dróg moczowych).
- Podejście wziernikowe: Jeśli podejście ręczne się nie powiedzie, użyj nawilżonego wziernika, aby zobaczyć otwór cewki moczowej wewnątrz pochwy. Użyj długich kleszczy DeBakey ze sterylną gazą, aby delikatnie osuszyć Betadine i włóż balonowy cewnik Foley o pojemności 12-14 Fr, 10 mL, z lub bez drutu wzmacniającego pod bezpośrednią wizualizacją. Balon nadmuchuj dopiero po potwierdzeniu powrotu moczu.
- Podejście chirurgiczne: Jeśli podejście wziernikowe (krok 1.3.2) również się nie powiedzie, należy chirurgicznie założyć cewnik Foleya na przewod. Po laparotomii należy włożyć igłę 18 G do pęcherza, włożyć drut o długości 0,035" o długości około 1 m do cewki moczowej przez pęcherz, a następnie przeprowadzić cewnik Foleya do pęcherza i napompować balon. Przeciągnij przewód przez pochwę (aby uniknąć zanieczyszczenia brzucha) i zamknij mały otwór po igle w pęcherzu jednowarstwowym zamknięciem 6-0 Prolene w kształcie ósemki. Przyszyj ciało Foleya i 1 L worek na mocz do skóry świni (Rysunek 1).
- Podejście ręczne
- Leki przednacięte
- Pierwszą z dziennej dawki przeciwpłytek aspiryny 81 mg doustnie do policzka podaj do woreczka policzkowego, następnie ceftiofur depot domięśniowo, 1 g cefazoliny dożylnie przez centralną linię do profilaktyki SSI, dożylnie buprenorfinę (0,005-0,01 mg/kg) w celu kontroli bólu oraz rozpocznij łącznie 1 L zrównoważonego roztworu elektrolitowego w stałej dawce 250 mL/h.
2. Autotransplantacja nerki DCD u wieprzi podtrzymujące życie
- Pobór nerek
- Przygotuj i okryj skórę brzucha. Wykonaj laparotomię środkową od ksylofoidu do łonowa.
UWAGA: Istnieją 1-2 duże żyły przecinające linię środkową podskórną w okolicach łonowa, które po przecięciu obficie krwawią, ale są łatwe do kontroli elektrokauterą. - Ustaw retraktor Bookwalter (lub dwa retraktory Balfoura pod kątem 90°) z czterema łopatkami ściany ciała trzymającymi obie strony ściany brzucha skierowanymi do góry, aby zapobiec wyciekowi jelita cienkiego z jamy brzusznej przy późniejszym ucisku żylnym i limfatycznym oraz obrzękowi jelit.
- Używając dwóch ciepłych ręczników chirurgicznych zwilżonych solą fizjologiczną, aby cofnąć jelito na lewą stronę jamy brzusznej i założyć retraktory nad nimi, delikatnie odsłaniając prawą otrzewną z prawą nerką.
UWAGA: Pewien stopień pozycji Trendelenburga (głowa w dół) może również pomóc przy cofaniu jelit. - Otwórz tylną otrzewną po bocznej stronie nerki (aby uniknąć uszkodzenia prawego moczowodu przed jego wizualizacją). Rozdziel prawy moczowód od tylnej otrzewnej i od prawej tętnicy nerkowej i podziel go na dwa jedwabne wiązki 2-0 na dolnym biegunie prawej nerki. Pozostawić dłuższy ogonek szwowy na pozostałym mocowodu dla łatwiejszej identyfikacji podczas implantacji (24 godziny później). Pozostawić resztę moczowowodu przykrytą jego wyściółką otrzewną, aby zmniejszyć bliznowactwo i konieczność rozległego przecięcia podczas operacji drugiego implantu.
UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić dwóch żył lędźwiowych łączących się z dożylnicą bezpośrednio pod odłączeniem prawej tętnicy nerkowej od aorty (anatomia specyficzna dla świń różni się od ludzkiej anatomii zaotrzewnej). Wiązanie i dzielenie tych żył lędźwiowych to również bezpieczna opcja. - Rozciąć tętnicę nerkową z dala od żyły nerkowej i wzdłuż jej przebiegu pod IVC do jej źródła aortowego, aby uzyskać maksymalną dostępną długość tętnicy. Krótko uciśnij dożylną i przewiń ją w kierunku lewej części zaotrzewnejowej, aby odsłonić początek prawej tętnicy nerkowej przepływającej pod nią po jej oderwaniu od aorty brzusznej.
UWAGA: U świń zazwyczaj 1-2 węzły chłonne związane z tętnicą nerkową ją zasłaniają; jednak tętnica nerkowa staje się dobrze szkieletowana po rozcięciu i usunięciu tych węzłów. - Przeciąć prawą żyłę nerkową z dala od prawego nadnercza czaszkowo. Aby uzyskać kilka milimetrów luzu między prawą żyłą nerkową a nadnerczami, ostrożnie unieś tylną wyściełkę otrzewną od prawej żyły nerkowej, aż widać widoczność większych żył drenażowych nadnerczy wchodzących do dożylnicy.
- Aby zasymulować proces pobierania DCD, podaj 500 U/kg heparyny przez centralną linię i pozwól jej krążyć przez 5 minut, następnie podwójnie podwiązuj tętnicę nerkową, a następnie żyłę nerkową u jej początku (maksymalna długość) za pomocą jedwabnych wiązań 2-0 lub większych (3-0 jedwabne wiązki są zbyt cienkie i kruche dla tej elastycznej tkanki i często się ślizgają) i zacznij obserwować stoper na 30 minut pracy in-situ Izolowany czas niedokrwienny nerek w ciepłym niedokrwiennym stanie. W czasie ciepłej niedokrwienności użyj nożyczek do tenotomii lub elektrokauteryzacji na ustawieniu cięcia, aby szkieletyzować i oddzielić tętnicę nerkową i żyłę od siebie dla późniejszego ułatwienia implantacji.
UWAGA: Skeletyzacja naczyń in situ podczas ciepłego czasu niedokrwiennego wykorzystuje kontrolę naczyniową w zapobieganiu utracie krwi w przypadku uszkodzenia naczyń krwionośnych, jednocześnie pozwalając naczyniom wypełnionym krwią ujawnić wszelkie drobne nieszczelności naczyniowe, które można naprawić poprzez krwawienie z izolowanego krążenia nerek połączonego do symulacji urazu niedokrwiennego. - Po upływie ciepłego czasu niedokrwiennego podziel naczynia i moczowód, a tętnicę nerkową prostą kaniulą o średnicy 3 mm i podaj 250 mL lodowatego roztworu Belzer University of Wisconsin przez tętnicę nerkową.
UWAGA: Prosta kanula o średnicy 5 mm jest zbyt duża i może prowadzić do uszkodzenia intymnego oraz powstawania płatów. - Zachowaj przeszczep poprzez hipotermiczną, nienatlenioną perfuzję maszynową przez 24 godziny. Płucz brzuch 1 L zrównoważonego roztworu elektrolitowego i zamykaj powięzi ciągłymi szwami 1-0 Prolene w pętlach. Przepłukaj ranę i zamknij skórę zszywkami.
- Ekstubuj świnię i wracaj do terrarium i wyjdź z narkozą przez 24 godziny. W celu kontroli bólu podskórnie podaj Bupivakainę (dawkowanie oparte na obciążeniu) na krawędziach rany i podawaj domięśniowo przedłużoną dawkę buprenorfiny (dawkowanie oparte na masie).
UWAGA: Paracetamol również może być podawany bez wpływu na GFR (w przeciwieństwie do NLPZ).
- Przygotuj i okryj skórę brzucha. Wykonaj laparotomię środkową od ksylofoidu do łonowa.
- Implantacja nerki
UWAGA: Implantacja nerki odbywa się wewnątrzotrzewkowo po zmodyfikowanym podejściu Starzla, polegającym na implantacji nerki bezpośrednio na aortę brzusznej i dożylnicy przy anastomozzie moczowodu6. Prawa nerka jest wysadzana i ponownie wszczepiała się w niższą pozycję, odwrócona w prawej części otrzewnejowej, zgodnie z techniką Simforoosh7. Czas operacji implantu wynosi od 3 do 5 godzin, a czas szycia implantu od 20 do 40 minut, w zależności od poziomu wykształcenia lub doświadczenia oraz złożoności anatomii.- Po 24 godzinach rekonwalescencji należy zastosować leki, intubować, przygotować i ponownie owinąć odwłok świni na sali operacyjnej (Rysunek 2).
- Umieszczenie żyłek tętnicznych (trzy metody w przypadku niepowodzenia włożenia)
- Linia tętnicza uszna: Aby monitorować hemodynamikę wewnątrzoperacyjną oraz prowadzić resuscytację płynem i lizatorem, zwłaszcza po reperfuzji, aby wspierać zwierzę podczas zespołu reperfuzji i nie powodować wtórnego, niskoprzepływowego ostrego uszkodzenia nerek (AKI), umieść tętnicą tętniczą o stężeniu 22 G angiocath w tętnicy usznej poprzez palpację tętnicy po tylnej stronie każdego ucha świnie.
- Tętnica tętnicza szyjna: Jeśli insercja uszna nie zadziała, alternatywnie można wykonać nacięcie środkowe w linii szyi aż do tchawicy. Rozcinaj tkankę łączną przylegającą do tchawicy i cofaj ją za pomocą samoopornego retraktora Weitlanera lub Gelpi. Po wizualizacji otocz tętnicę szyjną jedwabnym wiązaniem 2-0. Umieść przeskórną linię szyjną 4 Fr Cordis techniką Seldingera bez konieczności rozszerzania tętnic. Zwiąż dalszy koniec tętnicy i pozostawij jedwabne wiązanie 2-0, aby związać bliższy koniec po operacji po usunięciu linii tętnicznej, a następnie zszyć zszywkowo zamkniętą skórę.
- Linia tętnicza udowa. Alternatywnie, żyłka udowa może być wprowadzona przezskórnie lub przez cięcie.
UWAGA: Linia kości udowej zostanie tymczasowo niefunkcjonalna podczas zaciskania aorty w celu zespolenia tętnictwa podczas implantacji.
- Umieszczenie żyłek tętnicznych (trzy metody w przypadku niepowodzenia włożenia)
- Leki przednacięte
- Podaj drugą dawkę dziennie przeciwpłytkowej, aspirynę 81 mg doustnie w policzku, następnie 1 g cefazoliny dożylnie przez centralną linię w celu zapobiegania SSI, dożylnie buprenorfinę (0,005-0,01 mg/kg) w celu kontroli bólu i rozpocznij łącznie 4 litry zrównoważonego roztworu elektrolitowego w stałej dawce 250 mL/h.
- Rozpocznij stałą, niemiarkowalną infuzję dopaminy przez linię centralną w dawce 2 μg∙kg-1∙min-1 oraz wlew noradrenaliny miarkowalny do maksymalnie 0,4 μg∙kg-1∙min-1 , dla docelowego MAP 80-100 mmHg.
UWAGA: Szybkość podawania płynów może być tymczasowo zwiększona do 1 L/h lub więcej za pomocą worka ciśnieniowego tuż przed reperfuzją, aby zapewnić lepsze wsparcie hemodynamiczne, jeśli niedociśnienie podczas zespołu reperfuzji jest szczególnie trudne.
- Ponownie otwórz odwłok, usuwając zszywki skórne i przecinając szwy powięziowe, a następnie ponownie wprowadź retraktor Bookwaltera.
- Rozciąć osłonę otrzewną okrężnicy zstępującej na linii środkowej nad aortą i domięśniem (u świń jelita zstępująca jest przymocowana krótszą osłoną otrzewną do linii środkowej nad aortą i dożynkową od lewego naczynia nerkowego do tętnicy krezkowej dolnej, aby odsłonić aortę i dołną część krwi w zaotrzewnowej (miejsce wszczepienia przeszczepu nerki)8.
UWAGA: Należy uważać, aby dzielić tylko przyczep otrzewnowy jelita grubego bezpośrednio nad naczyniami grubymi i nie odwaźniać krwi zstępującej przez podział łukowitej arterii krezkowej górnej i dolnej bliżej ściany jelita grubego.
Podczas tego manewru nie zaobserwowano przepukliny wewnętrznej, co potwierdzają sekcje zwłok, które wykazały, że przestrzeń ta już się sama zabliznowała i zamknęła do 7. dnia po operacji. - Rozciąć aortę i kocię śródkocznicową od bocznego przyłączenia otrzewnej do mięśni lędźwiowych obustronnie. Następnie rozciągnij aortę i dożylną część kości położonej od siebie, aż zobaczysz tętnice lędźwiowe i żyły. Opcjonalnie: pozwolić na maksymalne uniesienie i oświetlenie aorty w zacisku Satinsky'ego podczas szycia, rozcinać, związać i dzielić 1-2 tętnice i żyły kręgowe, które zwykle występują w tym odcinku naczyń dużych (od lewego naczynia nerkowego do tętnicy krezkowej dolnej) w tym odcinku aorty lędźwiowej między 2-0 jedwabnymi wiązkami. Zresetuj część lędźwiową aorty z jej ciężkiej, przystępnej powłoki, aby przygotować ją do implantacji.
UWAGA: Nie zaobserwowano powikłań kręgosłupa podczas tego manewru. - Podaj 100 U/kg heparyny systemowo przez centralną linię i pozwól jej krążyć przez 5 minut. Jednocześnie poprosić zespół anestezjologów o tymczasowe zwiększenie szybkości infuzji zrównoważonego roztworu elektrolitowego z 250 mL/h do 1 L/h oraz rozpoczęcie stopniowego podawania noradrenaliny w razie potrzeby do maksymalnie 0,4 μg∙kg-1∙min-1 , aby osiągnąć MAP 80-100 mmHg w przygotowaniu do zespołu reperfuzyjnego.
- Zacisnąć dołko zaciskiem Satinsky'ego z boku, ustawionym pod kątem kaudalnym (żeby nie przeszkadzać ręciom chirurga szyjącego po lewej stronie świni) i wykonać venotomię, ssać/przepłukać wnętrze dożyny.
- Usuń nerkę z lodu lub z perfuzji maszynowej, przepłucz ją 250 mL lodowato zrównoważonego roztworu elektrolitowego i przynieś do pola operacyjnego, co oznacza początek drugiego ciepłego czasu niedokrwiennego (szycia).
- Odwróć autograft prawej nerki do góry nogami (technika Simforoosh), tak aby moczowód był skierowany ku górze, tętnica przyśrodkowa, a żyła boczna, umieszczona po prawej stronie brzucha, skierowana w stronę aorty podnercznej 7,9.
- Zespolenie żylne: Użyj dwóch dwuramionowych szwów Prolene 6-0 do przeprowadzenia przebiegającej anastomozy żylnej. Załóż zacisk bulldog na żyłę nerkową i usuń zacisk Satinsky'ego. Niezależnie od czasu zszycia żyły, trzymaj zacisk Satinsky na dożylnicy przez ustandaryzowane 25 minut, aby umożliwić uporządkowane uszkodzenie niedokrwienne przeszczepu.
- Zespolenie tętniczne: Po 25-minutowym zacisku dożylnym i 5-minutowym zatrzymaniu między naczyniami ponownie użyj zacisku Satinsky'ego, aby całkowicie zacisnąć aortę. Wykonaj nacięcie i poszerz je za pomocą okrągłego wybiwarka 4,0 mm, aby zabezpieczyć czyste otwarcie. Użyj dwuramionowego szwu Prolene 6-0 do wykonania skoku spadochronowego lub znoszenia tętnic od udrężki do palca. Podobnie, niezależnie od szybkości zakończenia anastomozy tętniczej, trzymaj zacisk Satinksy przez 25 minut na aorcie, aby ujednolicić łączny czas szycia na poziomie 55 minut.
UWAGA: Całkowity czas ciepłego niedokrwiennego (30 minut symulujących dawstwo i 55 minut symulujących manipulacji implantami doprowadził do indukcji DGF). - Reperfuzja przeszczepu: Po łącznym ustandaryzowanym 55 minutach szycia ciepłego niedokrwiennego czasu najpierw usuń zacisk bulldog na żyłę nerkową, następnie zacisk Satinksy na aortę i sprawdź reperfuzję przeszczepu oraz hemostazę. Utrzymuj agresywną resuscytację płynów i noradrenaliny, aby osiągnąć MAP 80-100 mmHg przez około godzinę po reperfuzji, aby wspierać zwierzę podczas zespołu reperfuzji.
UWAGA: Nie zapomnij kontrolować miejsc biopsji igły 18 G – jeśli są wykonywane – przy użyciu ciśnienia i wysokiej koagulacyjnej elektrokauterii powierzchniowej. - Anastomoza moczowodu: Szkieletonizuj pozostałe i moczowody przeszczepu, usuwając 1 cm otaczającej tkanki tłuszczowej. Łopatka 1 cm moczowowodu przeszczepu i pozostałego prawego moczowodu. Użyj dwóch dwuramionych szwów Prolene 6-0 (PDS przy planowaniu długoterminowego przeżycia, aby zmniejszyć ryzyko powstawania kamienia), aby je przybliżyć. Przeciągnij stent moczowodowcowy o wymiarach 7F x 24 cm podwójnej litery J przez świeżą anastomozę i zakończ anastomozę szwami biegającymi.
- Nefrektomia przeciwległa
- Aby umożliwić, by przeszczepiona nerka była nerką podtrzymującą życie, usuń nerkę przeciwległą (lewą).
- Zamknięcie brzucha
- Po sprawdzeniu hemostazy i liczeń płucz brzuch 1 L zrównoważonego roztworu elektrolitowego i zamknij powięź 1-0 pętlowym Prolene, a następnie iryguj skórę i zamykaj zszywaczem. Wszczepić 0,25% bupivakainy do linii szwów, aby zapewnić znieczulenie miejscowe, oraz wstrzyknąć SQ o przedłużonym uwalnianiu w celu kontroli bólu. Ekstubuj świnkę i odłóż ją do osobnego terrarium za pomocą szklanych lub plastikowych barier, aby nie gryzła się nawzajem w centralne żyłki i cewniki Foley.
- Po 24 godzinach rekonwalescencji należy zastosować leki, intubować, przygotować i ponownie owinąć odwłok świni na sali operacyjnej (Rysunek 2).
- Codzienna opieka pooperacyjna
- Sprawdź świnie na obchódach QID głównie po to, by upewnić się, że worek do pobierania moczu nie zostanie przepełniony, co może powodować iatrogenną niedrożność ponenerki oraz pęknięcia pęcherza lub moczowodu.
- Rano podaj doustnie 81 mg aspiryny antypłytkowej, pobierz próbkę krwi z centralnego kanotyku i zrób blokadę wątroby, a następnie zmierz wydzielanie moczu w worku i próbkę moczu.
UWAGA: Nie zaleca się dalszego podawania płynów dożylnych ani leków, ponieważ świnie zwykle odzyskują apetyt i funkcję jelit po POD1.
- Ofiara
- Po zakończeniu badania na POD7, lub wcześniej, dla humanitarnego celu, ponownie umieścić świnkę w ogólnej znieczuleniu tchawicowej i zbadać przeszczep za pomocą USG pod kątem integralności anastomotycznej, a następnie ponownie otworzyć jamę brzuszną, jak opisano wcześniej.
- Zbadaj przeszczep pod kątem oznak perfuzji i obejrzyj trzy rozloty pod kątem przechodu. Usuń przeszczep z trzema anastomozami w całości i rozłóż je na całej długości, aby potwierdzić ich integralność wewnętrzną i przechodność.
- Biopsję miądziaszka nerki za pomocą pistoletu do biopsji 18G.
Wyniki
Natychmiastowa a opóźniona funkcja przeszczepu. Wykonaliśmy n = 5 autoprzeszczepów DCD u świń po 30 minutach po 24 godzinach hipotermicznej, nienatlenionej maszyny konserwacyjnej przy użyciu (MAP = 40 mmHg) oraz monitorowaliśmy fenotyp odzyskiwania przeszczepu i funkcjonowanie w pierwszym tygodniu po przeszczepie, używając codziennych próbek krwi i całkowitej ilości moczu. Zaobserwowaliśmy dwa fenotypy po powrocie do zdrowia. Pierwszy fenotyp to natychmiastowa/wczesna regeneracja przeszczepu/wystarczalność. Trzy z pięciu świń wszczepionych symulowanymi przeszczepami DCD (60%) miało powrót produkcji moczu (dzienne wydzielanie moczu > 500 mL/dzień) przez POD 2-3, co pozwalało na ciągłą homeostazę elektrolitów bez interwencji (dializy, chelatacja potasu lub przesunięcie wewnątrzkomórkowe podsycane insuliną) (Rysunek 3). Drugim fenotypem była opóźniona funkcja przeszczepu (DGF), charakteryzująca się utrzymującą się anurią powyżej POD 3, związaną z nagromadzeniem surowicy BUN, kreatyniny oraz rozwojem hiponatremie i hiperkaliemii, co byłoby obiektywnym wskazaniem klinicznym do dializ. Anuria i hiperkaliemia postępowały, powodując zmiany EKG (szczytowe fale T) około K ≥ 8 mEq/L. Było to pilnym wskazaniem do dializy i traktowano je jako humanitarny cel. Po osiągnięciu tego celu przeprowadzono eutanazję w znieczuleniu ogólnym, aby wykluczyć inne przyczyny niewydolności/niewydolności przeszczepu spowodowanej uszkodzeniem anastomotycznym lub innymi powikłaniami chirurgicznymi. Według tej definicji DGF, wieprzowe nerki DCD z 30 minutami ciepłej niedokrwistości in-situ , następnie 24 godzinami hipotermicznej konserwacji nienatlenionej maszyny i 55 minutami szycia ciepłej niedokrwiennej niedokrwiennej w czasie niedokrwiennym rozwinęły DGF w tempie 40% (dwie na pięć świń). Ten wskaźnik DGF odzwierciedla zgłoszony wskaźnik przeszczepów nerki DCD u ludzi1.
Rysunek 1: Tunelowana centralna żyłka i umiejscowienie cewnika Foleya. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Autotransplantacja nerki DCD u świnki podtrzymującego życie. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Opóźniona funkcja szczepu w modelu wieprzowym. Różnica w wydzielaniu moczu (A) między natychmiastowymi a opóźnionymi przeszczepami; (B) poziomy potasu między natychmiastowym a opóźnionym przeszczepem; (C) dzienne poziomy kreatyniny w surowicy pomiędzy natychmiastowymi a opóźnionymi przeszczepami. Wszystkie wartości są reprezentowane jako średnia + SEM, z wartościami podawanymi jako LOCF i analizowane za pomocą analizy modeli mieszanych. Skrót: LOCF = ostatnia obserwacja przenoszona dalej. N=5 świń na ramię. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Dyskusja
Opóźniona funkcja przeszczepu negatywnie wpływa na przebieg kliniczny po przeszczepie nerki. We wczesnym okresie po przeszczepie wiąże się to z przedłużoną hospitalizacją, wyższym wskaźnikiem inwazyjnych zabiegów oraz zwiększonym ryzykiem odrzucenia. W dłuższej perspektywie DGF wiąże się również z krótszym przeżywalstwem przeszczepu. DGF jest objawem ciężkiego urazu niedokrwieniowo-reperfuzyjnego (I/RI), o czym świadczy wyższa częstość występowania w przeszczepach DCD w porównaniu do DBD lub przeszczepów nerki od żywego dawcy. Ostre uszkodzenie nerek (AKI) jest wtórne do ostrej martwicy rurówek spowodowanej przez I/RI i uważa się za najczęstszą przyczynę natychmiastowej niefunkcji przeszczepu. Klinicznie DGF definiuje się jako konieczność dializy w pierwszym tygodniu po przeszczepie. W modelach dużych zwierząt DGF było trudne do zdefiniowania i badania ze względu na brak ustandaryzowanej definicji wystarczającej ilości szczepienia oraz niemożność przeprowadzenia dializ, by ustalić tymczasowy charakter tego stanu przy dializach jako pomostzie do funkcjonalnej regeneracji szczepów.
W tym protokole wybrano model wieprzowy, ponieważ powszechnie akceptuje się, że ściśle odpowiada fizjologii nerek u człowieka (co udowodniła niedawna udana ksenotransplantacja)10,11. Autotransplantacja została wybrana, aby wyeliminować odpowiedź alloimmunologiczną, odrzucenie oraz potrzebę i zakłócanie toksycznych efektów inhibitorów kalcyneuriny. Definicja DGF opiera się na przedłużającej się anurii (<100 mL moczu dziennie) po POD3, prowadzącej do ciężkich zmian EKG związanych z hiperkaliemią. Cewnikowanie Foleya umożliwia precyzyjne pobieranie moczu, co zakotwiczy definicję opóźnionej funkcji przeszczepu i jej wystarczalności w funkcjonalnym wyniku, jakim jest jakość i ilość moczu. Codzienne pobieranie krwi umożliwia codzienne monitorowanie tradycyjnych parametrów panelu funkcji nerek, zapewniając kompleksowy obraz homeostazy elektrolitów.
Ustanowienie wiarygodnego i powtarzalnego modelu zwierzęcego opóźnionej funkcji przeszczepu, naszym zdaniem, przyspieszyłoby badania nad skutecznymi terapiami opóźnionej funkcji przeszczepu i ostatecznie doprowadziło do poprawy wyników przeszczepu nerki. Podsumowując, protokół ten ustanawia powtarzalny model autotransplantacji nerki wieprzowinki, który umożliwia obiektywną charakterystykę opóźnionej funkcji przeszczepu przy użyciu ilościowego wydzielania moczu oraz parametrów biochemicznych surowicy po kontrolowanym ciepłym urazie niedokrwiennym. Poprzez uwzględnienie standaryzowanych warunków chirurgicznych, nieinwazyjnego pobierania moczu oraz seryjnego monitorowania laboratoryjnego, podejście to zapewnia praktyczne ramy do badania DGF bez dializ i ułatwia porównanie z klinicznie istotnymi fenotypami dysfunkcji przeszczepu po przeszczepie 12,13,14,15.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.
Podziękowania
Dziękujemy laboratorium perfuzji narządów w Toronto (Top lab) za podzielenie się wiedzą podczas szkolenia z zakresu przeszczepu nerki świni. Dziękujemy również Michelle Mendiola Pla za podzielenie się swoją wiedzą na temat inwazyjnej inserwacji Foley u wieprz.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Podstawienie Foleya na plecach | |||
| 12 Ojciec Foley | Pobieranie moczu | ||
| Chirurgiczny lubrykant | Wprowadzenie Foleya | ||
| 1 litr woreczka na mocz | Pobieranie moczu | ||
| Szew nylonowy 2-0 | Zabezpieczenie linii foley i centralnej linii | ||
| Spekulum i Długie DeBakey & Światło | Wprowadzenie Foleya | ||
| Probówki do pobierania mocy (50 ml stożkowe) | Pobieranie próbek moczu | ||
| Kartridże CG8 + Chem 8 + Piccolo | Codzienne laboratoria | ||
| prolezliwe do leżące włożenie centralnej żyłki | |||
| 9.6 Fre Jednolumenowa tacka cewnika Hickmana | Codzienne laboratoria | ||
| Ostrze 10 | Nacięcia kłute przy zakładaniu CVC | ||
| Centralna lina bez bezwładnego nasadka luer-lock | |||
| Worek z solą fizjologiczną z wątroby (1 litr soli fizjologicznej + 10 fiolek z hepariną) | heplock CVC | ||
| Eksplant | |||
| Pakiet po laparotomii | |||
| Bovie | |||
| Sterylne uchwyty światła | |||
| Opakowanie gąbkowe | |||
| Ręczniki OR – białe 17x23 cale (4 w paczce) | |||
| Remis 2-0 w jedwabiu | Kontrola naczyń | ||
| 1 litr plazmalitu | Zrównoważony roztwór elektrolitów | ||
| Sterylna taca do ogólnej laparotomii | |||
| Ciepła sól fizjologiczna do mokrych ręczników jelit | Obsługa jelita | ||
| Skrzynka do zarządzania igłą | |||
| Retraktor Bookwalter | |||
| Backtable | |||
| Worki na narządy sterylne – 2 na nerkę | |||
| 1 litr krystaloidowej torby na slushy | |||
| Roztwór UW - 250 ml na nerkę | |||
| Rurka spłukiwana | |||
| Angiocath 14 gauge | |||
| maszynowe osłony | |||
| Waga organowa (waga + misa + sterylna torba organowa) | |||
| Perfuzja maszynowa | |||
| Maszyna do perfuzji | Transporter nerek Lifeport | ||
| Komora organowa jednorazowego użytku | Transporter nerek Lifeport | ||
| Roztwór perfuzji | Rozwiązanie KPS-1 | ||
| implant | |||
| Rurka ssąca | |||
| Końcówka ssąca Yankauer | |||
| Kanister ssący | |||
| Gumowe buty | |||
| 4 mm wybijacz aortalny | Zespolenie tętnic | ||
| Narzędzia mikrochirurgiczne + zacisk | |||
| Przewód przewodowy moczowodu | |||
| Stent moczowodu - 4,8 fr x 12 mm | Anastomoza moczowowodu | ||
| Zamknięcie brzucha | |||
| 1 pętla prolene | |||
| Bupivacaine | |||
| Zszywacze skórne | |||
| Próbki | |||
| Tacka na próbki | |||
| Pistolet do biopsji 14 G | |||
| Słoiki do biopsji NBF | |||
| Lampy Eppendorfa | |||
| Zielone rurki z krwią na górze | |||
| 15 mL stożkowców | |||
| leki | |||
| Fiolka z noradrenaliną | |||
| Fiolka dopaminy | |||
| 1 L plazmalitu | Zrównoważony roztwór elektrolitów | ||
| Tabletki aspiryny 81 mg dziennie dziennie | |||
| Fiolka z cefazoliną | |||
| Exceed | |||
| Jednostki Heparin 10K |
Bibliografia
- Lentine, K. L., et al. OPTN/SRTR 2023 annual data report: kidney. Am J Transplant. 25 (2 Suppl 1), S22-S137 (2025).
- Zwaini, Z., et al. Comparative analysis of risk factors in declined kidneys from donation after brain death and circulatory death. Medicina (Kaunas). 56, (2020).
- Flournoy, W. S., Mani, S. Percutaneous external jugular vein catheterization in piglets using a triangulation technique. Lab Anim. 43, 344-349 (2009).
- Seldinger, S. I. Catheter replacement of the needle in percutaneous arteriography: a new technique. Acta Radiol. 39, 368-376 (1953).
- Abraham, N., et al. Subnormothermic oxygenated machine perfusion (24 h) in DCD kidney transplantation. Transplant Direct. 10 (6), e1633(2024).
- Starzl, T. E., Marchioro, T. L., Morgan, W. W., Waddell, W. R. A technique for use of adult renal homografts in children. Surg Gynecol Obstet. 119, 106-108 (1964).
- Simforoosh, N., et al. Right laparoscopic donor nephrectomy and the use of inverted kidney transplantation: an alternative technique. BJU Int. 100, 1347-1350 (2007).
- Abraham, N., et al. Orthotopic transplantation of the full-length porcine intestine after normothermic machine perfusion. Transplant Direct. 8, e1390(2022).
- Kawamura, M., et al. Normothermic ex vivo kidney perfusion preserves mitochondrial and graft function after warm ischemia and is further enhanced by AP39. Nat Commun. 15, 8086(2024).
- Kawai, T., et al. Xenotransplantation of a porcine kidney for end-stage kidney disease. N Engl J Med. 392, 1933-1940 (2025).
- Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. N Engl J Med. 386, 1889-1898 (2022).
- Siedlecki, A., Irish, W., Brennan, D. C. Delayed graft function in the kidney transplant. Am J Transplant. 11, 2279-2296 (2011).
- Mannon, R. B. Delayed graft function: the AKI of kidney transplantation. Nephron. 140, 94-98 (2018).
- Kim, D. W., et al. Financial impact of delayed graft function in kidney transplantation. Clin Transplant. 34, e14022(2020).
- Schröppel, B., et al. Peritransplant eculizumab does not prevent delayed graft function in deceased donor kidney transplant recipients: results of two randomized controlled pilot trials. Am J Transplant. 20, 564-572 (2020).
Przedruki i uprawnienia
