Protokół ten został opracowany, aby stworzyć niezawodny i łatwo dostępny system do rejestrowania swobodnie poruszającego się EEG gryzoni.
Artykuł metodologiczny
* These authors contributed equally
Protokół ten został opracowany, aby stworzyć niezawodny i łatwo dostępny system do rejestrowania swobodnie poruszającego się EEG gryzoni.
Elektroencefalografia (EEG) pełni rolę podstawowego narzędzia do śledzenia aktywności elektrycznej w mózgu i zyskuje coraz większe znaczenie zarówno w diagnostyce klinicznej, jak i badaniach przedklinicznych na zwierzętach. Chociaż EEG gryzoni stanowi potężną platformę do modelowania ludzkich zaburzeń neurologicznych, długoterminowe nagrania często są ograniczone przez wysokie koszty, inwazję lub złożoność techniczną istniejących systemów. Przedstawiamy tutaj niezawodny, dostępny, ekonomicznie opłacalny i minimalnie inwazyjny protokół do przewlekłego, wielomiejscowego pobierania EEG kory u swobodnie poruszających się myszy. Technika polega na wytwarzaniu drutów platynowo-irydowych z elektrodami śrubowymi połączonymi z uniwersalnym interfejsem magistrali szeregowej (USB), które są mocowane znieczulenie zewnątrzoponowo za pomocą śrub kostnych i zabezpieczane klejem oraz cementem dentystycznym. System umożliwia stabilne przechwytywanie sygnału przez kilka miesięcy, co wykazano u myszy typu dzikiego typu C57BL/6J z 85% wskaźnikiem przeżycia po operacji (n = 20). EEG było próbkowane przy częstotliwości 1 000 Hz i filtrowane między 1 Hz a 500 Hz przy użyciu wzmacniacza różnicowego. Aby zweryfikować działanie układu, podano pentylenetetrazol (20 mg/kg), aby wywołać aktywność przypominającą napady, co doprowadziło do wyraźnego wzrostu wydzielin międzypadaczkowych – z 2-5 na początku do 20-51 zdarzeń po wstrzyknięciu – z dodatkiem zwiększonej amplitudy sygnału. Wyładowania zostały zidentyfikowane na podstawie morfologii fali i charakterystyk sygnału odpowiadających uznanym kryteriom elektrofizjologicznym. Konfiguracja jest kompatybilna z behawioralnym śledzeniem wideo oraz otwartymi analizami i wspiera integrację z badaniami farmakologicznymi, genetycznymi lub neuromodulacyjnymi. Ta metoda zapewnia stabilną i adaptowalną platformę do badania dynamiki sieci mózgowych w modelach gryzoni, z zastosowaniami w badaniach nad padaczką i poza nią.
Elektroencefalografia (EEG) dostarcza bezpośredniego pomiaru aktywności elektrycznej mózgu i jest szeroko stosowana w diagnozowaniu padaczki1. W ostatnich latach techniki EEG są coraz częściej adaptowane do zastosowań w modelach małych zwierząt do badania zaburzeń neurologicznych, fizjologii snu oraz dynamiki sieci mózgowych 2,3,4. Wraz z pojawieniem się genetycznie modyfikowanych modeli myszy i znaczącym postępem w technologiach rejestracji, EEG gryzoni stało się niezbędnym narzędziem badań przedklinicznych, oferując cenne informacje na temat mechanizmów translacyjnych istotnych dla zdrowia ludzkiego mózgu 5,6.
Jednoczesne wychwytywanie i manipulowanie aktywnością neuronową jest kluczowe dla badania dynamiki mózgu zarówno na poziomie makro- jak i mikroobwodowym. To podwójne podejście umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym sieci neuronowych zaangażowanych w inicjowanie i postęp napadów. Padaczka, charakteryzująca się nawracającymi i często nieprzewidywalnymi napadami, powstaje w wyniku zakłóceń w złożonych obwodach mózgowych4. Pomimo szeroko zakrojonych badań, mechanizmy regulujące rozprzestrzenianie się i jej wystąpienie pozostają niedo do końca poznane, częściowo z powodu ograniczonego wykorzystania technologii umożliwiających jednoczesne nagrywanie w wielu obszarach mózgu7.
Zapisy EEG z modeli zwierzęcych, które odtwarzają ludzkie zaburzenia neurologiczne, ujawniły skoki międzykręgowe, wyładowania falowe i wzorce napadów, które bardzo przypominają te obserwowane u pacjentów 8,9, co pogłębia naszą wiedzę o zmianach elektrofizjologicznych zachodzących w ludzkim mózgu. Podobnie nieprawidłowości EEG wykryte w modelach choroby Alzheimera, zaburzeń ze spektrum autyzmu i schizofrenii dostarczają kluczowych informacji o zaburzonej aktywności oscylacyjnej nerwowej i wskazują potencjalne cele terapeutyczne10.
Pomimo różnic w anatomii i skali mózgu, EEG myszy i człowieka wykazują uderzające podobieństwa 2,11. Oba wykazują charakterystyczne pasma częstotliwości oscylacyjnych — delta, theta, alfa, beta i gamma — z widmami mocy zazwyczaj według rozkładu 1/f 2,11. Przejścia między stanami mózgu, takie jak pojawienie się aktywności delta podczas snu o nieszybkim ruchu oczu (NREM) czy zwiększona synchronizacja gamma podczas zadań związanych z uwagą i pamięcią, są zachowane we wszystkich gatunkach. Ponadto aktywność padaczki, w tym oscylacje wysokoczęstotliwościowe (HFO) i wzorce krodłowe, wykazują porównywalne profile czasowe i spektralne zarówno u myszy, jak i ludzi7.
Zachowane cechy EEG gryzoni i ludzi sprawiają, że modele myszy są wysoce translacyjne do badania zaburzeń mózgu. EEG myszy umożliwia inwazyjne, wysokorozdzielcze nagrania, umożliwiające szczegółową analizę na poziomie obwodów12. Wspiera także testowanie strategii neuromodulacyjnych, w tym środków farmakologicznych, kontroli optogenetycznej oraz stymulacji zamkniętejpętli 13,14, które można łączyć z narzędziami behawioralnymi i molekularnymi do precyzyjnego badania dysfunkcji nerwowych.
Niemniej jednak należy zachować ostrożność przy ekstrapolacji wniosków. Mniejszy rozmiar i prostsza struktura korowa mózgu myszy mogą wpływać na propagację sygnału, a potencjały związane z wydarzeniami poznawczymi (ERP) mogą być mniej widoczne w porównaniu z ludźmi15. Zapewnienie spójności w rozmieszczeniu elektrod, referencjach sygnałowych i analizach jest kluczowe dla poprawy powtarzalności i ważności w laboratoriach16.
Rejestrowanie EEG u małych zwierząt niesie ze sobą zarówno możliwości, jak i wyzwania. EEG myszy jest zazwyczaj wykonywane za pomocą przewlekle wszczepionych elektrod umieszczonych znieczuleniem zewnątrzoponowym na powierzchni czaszki lub jako elektrody głębokie wprowadzane do struktur podkorowych17,18. Elektrody powierzchniowe, takie jak elektrody śrubowe lub druciane umieszczane na sura mater, są mało inwazyjne i nadają się do długoterminowych, podłużnych nagrań. Takie elektrody znajdują się poniżej kości, co zapewnia wysoką barierę impedancyjną podczas nagrywania. W związku z tym elektrody twardówkowe u gryzoni można uznać za bardziej porównywalne z elektrokortykografią (eCoG) niż z EEG. Elektrody głębokościowe, w przeciwieństwie do nich, oferują wyższą rozdzielczość przestrzenną i umożliwiają dostęp do głębokich obszarów mózgu, takich jak hipokamp, wzgórze czy ciało migdałowate, ułatwiając badania nad sieciami napadowymi i oscylacyjnym sprzężeniem między obszarami rozkładu 2,11.
Nowoczesne systemy EEG dla gryzoni obsługują nagrywanie wielokanałowe o wysokiej rozdzielczości czasowej i często są łączone z monitoringiem wideo w celu korelacji behawioralnej18. Dodatkowo, bezprzewodowe systemy EEG umożliwiają nieuwięzione, w czasie rzeczywistym akwizycję zwierząt zachowujących się swobodnie, minimalizując ograniczenia ruchowe i stres19. Chociaż z czasem te modernizacje stały się dostępne komercyjnie, są albo bardzo drogie, albo zbyt inwazyjne, by móc badać model gryzoni przez dłuższy czas.
Aby wypełnić tę lukę, przedstawiamy wszechstronny i opłacalny protokół wielomiejscowego pozyskiwania EEG w modelach gryzoni, odpowiedni do długoterminowych badań przy minimalnej inwazji. To podejście do rejestracji EEG jest szczególnie odpowiednie do badań wymagających wysokiej rozdzielczości oceny aktywności korowej u myszy w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych. Najlepiej stosować je, gdy (i) zwierzę jest w stanie znieść krótką anestezję podczas implantacji elektrody i całkowicie się regeneruje, (ii) stabilne ustawienie głowy lub minimalny ruch podczas nagrań, (iii) pożądane jest długoterminowe lub powtarzane monitorowanie aktywności nerwowej oraz (iv) projekt eksperymentalny umożliwia rejestrację pojedynczego lub ograniczonego udziału wielu zwierząt, w zależności od pojemności wzmacniacza. Badacze powinni wziąć pod uwagę te ograniczenia, aby ustalić, czy metoda ta odpowiada ich celom eksperymentalnym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół ten uzyskał zgodę Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Augusta. Na każdym etapie eksperymentu stosowano Przewodnik Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczący opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Wprowadzono wszystkie możliwe środki, aby zminimalizować liczbę zwierząt zaangażowanych w to badanie. Myszy użyte do tego badania to dwumiesięczne dzikie typy C57Bl6J. Czas potrzebny na wykonanie każdego kroku jest uwzględniony w odpowiednich etapach.
1. Przygotowanie pinów wtyczek za pomocą elektrod (5 min)
2. Implantacja elektrod (30 min)
3. Nagrywanie EEG (65 min)
4. Interpretacja danych
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Elektrody zostały wszczepione 20 myszom na tle C57Bl6J, w tym 5 dzikich myszy typu C57Bl6J, z utrzymywanym wskaźnikiem przeżycia pooperacyjnego na poziomie 85% do 6 miesięcy po operacji (rysunek 4B). Po 6 miesiącach nasadki głowy zaczęły się odłączać, a wszystkie myszy zostały uśpione w wieku 8 miesięcy. Średnia masa zespołu głowic, włącznie z złączem i śrubami, wynosiła 1,13 g (n = 20). Myszy odzyskały przytomność w ciągu 30 minut po operacji i wróciły do normalnego ruchu oraz wpatrywania s...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W tym badaniu opracowaliśmy i zweryfikowaliśmy solidny, opłacalny i minimalnie inwazyjny protokół do przewlekłego, wielomiejscowego rejestrowania EEG u swobodnie poruszających się myszy. Pomyślna implantacja elektrod śrubowych oraz specjalnie wykonanych elektrod platynowo-irydowych przylutowanych do złącza USB, wraz z obserwowanym wskaźnikiem przeżycia i jakością zapisów, świadczą o wykonalności i niezawodności tej techniki w przewlekłych nagraniach. Co istotne, protokół ten umożliwia precyzyjne zbieranie danych elektrof...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
DTB jest płatnym konsultantem Alfred Mann Foundation. Autorzy nie mają konkurujących interesów finansowych ani innych konfliktów interesów wynikających z tej pracy.
DTB jest wspierany przez granty NEI R01EY036089 oraz NIA grant RF1AG060754. XF był wspierany grantami z James Fickel Alzheimer's Disease Research Fund, EY028158 i EY032488.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Drut platynowy irydu 0,003" | Systemy AM | 777000 | |
| Śruby kostne 1,5 mm | Specjalności Antrin Miniature | 000-120X1/16 WIĄZANIE SL MS SST | |
| Wzmacniacz AC | Systemy AM | ||
| Karprofen | Covetrus | 11695-6935-1 | |
| Akrylowa podstawa protez Coldpac | Firma Yates Motloid | https://www.yates-motloid.com/collections/coldpac/denture-base | |
| Wiertarka dentystyczna 1,4 mm | Volvere GX | Nie ma | |
| Deksametazon | VEDCO | 50989-437-12 | |
| Lubrykant do oczu | Optix Care | https://theoptixcare.com/ | |
| Nadtlenek wodoru | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | |
| NIDAQ USB | Instrumenty narodowe | https://www.ni.com/en/shop/data-acquisition/entry-level-usb-daq.html | Akwizycja danych i kondycjonowanie sygnału USB |
| Pentylenetetrazol | Caymen Chemicals | 18682 | |
| Pasta topnika do lutowania kalafonii i inkas; | Weller | https://www.weller-tools.com/us/en/consumer/products/soldering-accessories/ | |
| Przewód lutowniczy 0,32" | Radio Shack | Nie ma | |
| Superglue | Loctite | Nie ma | |
| Wtyczki żeńskie USB typu B | Sprzedawca QM | X00292ABU9 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie