Ubikwitynacja jest kluczowym regulatorem funkcji białek wewnątrzkomórkowych. Tutaj opisujemy dwie metody lizy komórek do wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych w komórkach ssaków oraz porównujemy ich skuteczność w analizie poziomów ubikwitynacji. Nadekspresja białek w HEK293T komórkach została wywołana przejściową transfekcją, a białka ubikwitynowane wykryto analizą western blota.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Porównawcze strategie wykrywania ubiquitynacji w lizatach komórek ssaków z wykorzystaniem SMAD2/SMURF2 jako modelu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ubikwitynacja, modyfikacja potranslyczna, jest kluczowym regulatorem funkcjonowania białek wewnątrzkomórkowych. Ubikwitynacja moduluje funkcje białek poprzez promowanie degradacji proteasomalnej lub zmianę lokalizacji subkomórkowej poprzez sygnalizację zależną od łańcucha ubikwityny. Tutaj opisujemy dwie metody lizy komórek do wykrywania poziomów ubikwitynacji SMAD2 w komórkach HEK293T oraz porównamy ich skuteczność w analizie poziomów ubikwitynacji białek. Nadmierna ekspresja białek w komórkach została wywołana przez transfekcję przejściową. Plazmidy (HA-Ub, FLAG-SMAD2 i MYC-SMURF2) oraz odczynniki transfekcyjne zostały osobno dodane do ośrodka bazalnego, wymieszane, a mieszanina dodana do komórek. Przed pobraniem dodano MG132, aby hamować degradację proteasomalną i zwiększyć gromadzenie białek ubiquitinowanych. Główną różnicą między tymi dwoma podejściami eksperymentalnymi są metody lizy komórek – metoda kąpieli lodowej (wykonywana w 4 °C) oraz metoda obróbki cieplnej (inkubacja w 95 °C), co znacząco wpływa na efektywność lizy białek. Po zakończeniu analizy komórek wymieszano lizat komórkowy, koraliki agarozy oraz przeciwciało FLAG i wybudowano w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie białka ubikwitynowane były wykrywane analizą western blotem. Przed wykryciem białek ubikwitynowanych stosowano przeciwciało lekkie do inkubacji przeciwciał wtórnych. Następnie wykryto pasma ubiquitynacji. Wyniki pokazują, że zarówno metoda kąpieli lodowej, jak i metody obróbki cieplnej mogą być stosowane do wykrywania poziomów ubikwitynacji, podczas gdy metoda obróbki cieplnej może ułatwić wykrywanie ubikwitynacji SMAD2. Badanie to wyodrębnia i porównuje dwie metody lizy komórek do pomiaru poziomów ubikwitynacji w komórkach ssaków, wykorzystując SMURF2/SMAD2 jako model, aby pomóc naukowcom w wyborze bardziej odpowiednich metod wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych.
Wprowadzenie
Ubikwitynacja, niezbędna modyfikacja potranslacyjna, jest kluczowym regulatorem funkcji białek wewnątrzkomórkowych1. System ubikwitany-proteasomu (UPS), który pośredniczy w degradacji ponad 80% białek u eukariontów, składa się z ubikwityny (Ub), enzymów aktywujących E1, enzymów sprzężających E2, ligaz E3, enzymów deubikwitylujących (DUB) orazproteasomu 26S. System ten reguluje wymianę białek z dużą specyficznością, kontrolując tym samym kluczowe procesy komórkowe, takie jak progresja cyklukomórkowego 3, transdukcja sygnału 4,5 oraz odpowie....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie buforu lizyzowego i odczynników
UWAGA: Przygotuj wszystkie bufory w wskazanych stężeniach. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi proszków odczynników, aby uniknąć rozbieżności w stężeniach.
- Przygotuj bufor lizowy zawierający 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0) oraz 1% Triton X-100. W razie potrzeby dostosuj stężenie NaCl w zakresie 50-150 mM. Przygotuj wszystkie bufory za pomocą podwójnie destylowanego H₂O.
- Przygotuj roztwór roboczy, uzupełniając bufor lizowy koktajlem inhibitorów proteazy 1% (bez EDTA). Wymieszaj dokładnie i trzymaj na lodzie aż do ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Jako "molekularny posłaniec" w szlaku sygnalizacyjnym TGF-β, SMAD2, po fosforylacji przez receptory TGF-β, tworzy kompleks z SMAD3 i SMAD4, translokuje się do jądra i inicjuje transkrypcję genów docelowych30. Jest więc kluczową cząsteczką łączącą sygnały zewnątrzkomórkowe z ekspresją genów wewnątrzkomórkową. Jej degradację pośredniczi SMURF2, ligaza ubikwityna E3, która katalizuje poliubikwitynację białka docelowego, kierując go w ten sposób do degradacji proteasomalnej. Ta degradacja SMAD2 wywoła.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejsze badanie przedstawia i porównuje dwa szczegółowe protokoły lizy białek specjalnie zoptymalizowane do wykrywania ubikwitynacji substratu pośredniczonego przez ligazę E3. Aby zapewnić wykrywalność, zastosowaliśmy nadekspresję opartą na plazmidach (np. oznaczoną SMAD2, SMURF2 lub Ub) w komórkach, co zapewniło wystarczające poziomy białek do wizualizacji specyficznych sygnałów ubikwitynacji, co było kluczowe dla weryfikacji interakcji E3 z podłożem w tym badaniu. Przed pobieraniem komórek dodano MG132, silny inhibit.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.
Podziękowania
Badanie to zostało wsparte przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin, nr 82370647 (W.H.), nr 82170642 (J-X. Z), Nr 81801923 (X-F. Z), Nr 81670575 (J-X. Z), nr 81570570 (W.H.) oraz nr 81070355 (J-X. Z), oraz Program Akademickiej Młodzieżowej Drużyny HUST Frontier, Huazhong University of Science and Technology (2018QYTD02). Otwarta Fundacja Hubei Kluczowe Laboratorium Medycyny Regeneracyjnej i Interdyscyplinarnych Badań Translacyjnych (2022zsyx003). Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (2024YFA1107601).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL mikrorurki | Servicebio | EP-150-M | |
| Fermentowana misa 100 mm TC-otoczona | Servicebio | CCD-100 | |
| Dysk 6-dołkowy | Servicebio | CCP-6H | |
| Przeciwciała anty-FLAG | Proteintech | 20543-1-AP | Rozcieńczenie użyte 1:200 dla IP 1:10000 dla WB |
| Przeciwciała anty-GAPDH | Proteintech | MA5-15738 | rozcieńczenie stosowane w stosunku 1:10000 |
| Przeciwciała przeciw HA | Proteintech | 51064-2-AP | rozcieńczenie stosowane w stosunku 1:10000 |
| Przeciwciała anty-IgG | CST | #3900 | Rozcieńczenie stosowane w 1:200 dla IP |
| Przeciwciała anty-MYC | Proteintech | 60003-2-Ig | rozcieńczenie stosowane w stosunku 1:10000 |
| Przeciwciała przeciw SMAD2 | CST | #5339 | Rozcieńczenie użyte 1:200 dla IP 1:2000 dla WB |
| Błękit bromofenolowy | Servicebio | GC307006-5g | |
| EDTA (pH=8,0) | Servicebio | G1207-1L | |
| FBS | ABW | ||
| Glicerol | Sinopharm | 10010618 | |
| Sucha kąpiel podgrzewczo-chłodząca | Guocheng | ||
| HEK293T komórki | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM o wysokiej zawartości glukozy | Servicebio | G4515-500ML | |
| Łańcuch lekki IgG IgG z HRP sprzężony z HRP; | Abclonal | AS062 | Rozcieńczenie używane w stosunku 1:5000 |
| HRP-sprzężony myszy antykróliczy IgG lekki łańcuch | Abclonal | AS061 | rozcieńczenie stosowane w stosunku 1:10000 |
| Lipo8000 | Beyotime | C0533 | |
| MG132 | Aladyn | M421264 | |
| Mikrowirówka | Labgic | CF1524R | |
| Proszek NaCl | Servicebio | GC102004 | |
| PBS | Servicebio | G4202-500ML | |
| pCMV-FLAG-SMAD2 | Dla ekspresji ssaków | ||
| pCMV-HA-Ub | Dla ekspresji ssaków | ||
| pCMV-MYC | Dla ekspresji ssaków | ||
| pCMV-MYC-SMURF2 | Dla ekspresji ssaków | ||
| Penicylina-streptomycyna | Servicebio | G4003-100ML | |
| Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA | TargetMol | C0001 | |
| Białko A/G agarozowe koraliki | Beyotime | P2017 | |
| Membrana PVDF | Vayzme | E801 | |
| Proszek SDS | Solarbio | S8010-500g | |
| Sysytem SDS-PAGE | Aervicebio | BVE4-BVT4 | |
| Soniki | Komórka Uibra | ||
| Proszek Tris-HCl | Biotoped | HST-0372 | |
| Triton X-100 | Servicebio | GC204003-100ml | |
| Trypsyna | Servicebio | G4021-100ML | |
| Mieszacz wirowy | Uprzejmie przekazane przez Vayzme | ||
| β-merkaptoetanol | Aladyn | M301573 |
Bibliografia
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nat Med. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Han, D., Wang, L., Jiang, S., Yang, Q. The ubiquitin-proteasome system in breast cancer. Trends Mol Med. 29 (8), 599-621 (2023).
- Fulcher, L. J., Batley, C., ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
