Ubikwitynacja jest kluczowym regulatorem funkcji białek wewnątrzkomórkowych. Tutaj opisujemy dwie metody lizy komórek do wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych w komórkach ssaków oraz porównujemy ich skuteczność w analizie poziomów ubikwitynacji. Nadekspresja białek w HEK293T komórkach została wywołana przejściową transfekcją, a białka ubikwitynowane wykryto analizą western blota.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Porównawcze strategie wykrywania ubiquitynacji w lizatach komórek ssaków z wykorzystaniem SMAD2/SMURF2 jako modelu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ubikwitynacja, modyfikacja potranslyczna, jest kluczowym regulatorem funkcjonowania białek wewnątrzkomórkowych. Ubikwitynacja moduluje funkcje białek poprzez promowanie degradacji proteasomalnej lub zmianę lokalizacji subkomórkowej poprzez sygnalizację zależną od łańcucha ubikwityny. Tutaj opisujemy dwie metody lizy komórek do wykrywania poziomów ubikwitynacji SMAD2 w komórkach HEK293T oraz porównamy ich skuteczność w analizie poziomów ubikwitynacji białek. Nadmierna ekspresja białek w komórkach została wywołana przez transfekcję przejściową. Plazmidy (HA-Ub, FLAG-SMAD2 i MYC-SMURF2) oraz odczynniki transfekcyjne zostały osobno dodane do ośrodka bazalnego, wymieszane, a mieszanina dodana do komórek. Przed pobraniem dodano MG132, aby hamować degradację proteasomalną i zwiększyć gromadzenie białek ubiquitinowanych. Główną różnicą między tymi dwoma podejściami eksperymentalnymi są metody lizy komórek – metoda kąpieli lodowej (wykonywana w 4 °C) oraz metoda obróbki cieplnej (inkubacja w 95 °C), co znacząco wpływa na efektywność lizy białek. Po zakończeniu analizy komórek wymieszano lizat komórkowy, koraliki agarozy oraz przeciwciało FLAG i wybudowano w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie białka ubikwitynowane były wykrywane analizą western blotem. Przed wykryciem białek ubikwitynowanych stosowano przeciwciało lekkie do inkubacji przeciwciał wtórnych. Następnie wykryto pasma ubiquitynacji. Wyniki pokazują, że zarówno metoda kąpieli lodowej, jak i metody obróbki cieplnej mogą być stosowane do wykrywania poziomów ubikwitynacji, podczas gdy metoda obróbki cieplnej może ułatwić wykrywanie ubikwitynacji SMAD2. Badanie to wyodrębnia i porównuje dwie metody lizy komórek do pomiaru poziomów ubikwitynacji w komórkach ssaków, wykorzystując SMURF2/SMAD2 jako model, aby pomóc naukowcom w wyborze bardziej odpowiednich metod wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych.
Wprowadzenie
Ubikwitynacja, niezbędna modyfikacja potranslacyjna, jest kluczowym regulatorem funkcji białek wewnątrzkomórkowych1. System ubikwitany-proteasomu (UPS), który pośredniczy w degradacji ponad 80% białek u eukariontów, składa się z ubikwityny (Ub), enzymów aktywujących E1, enzymów sprzężających E2, ligaz E3, enzymów deubikwitylujących (DUB) orazproteasomu 26S. System ten reguluje wymianę białek z dużą specyficznością, kontrolując tym samym kluczowe procesy komórkowe, takie jak progresja cyklukomórkowego 3, transdukcja sygnału 4,5 oraz odpowiedzi stresowe 6,7. Ubikwitynacja to wieloetapowy proces enzymatyczny. E1 hydrolizuje ATP, aby adenylować końcowy punkt C Ub, tworząc pośredni Ub-AMP. Następnie aktywowany Ub jest przenoszony z E1 do cysteiny w miejscu aktywnym enzymu sprzęgającego E2, tworząc wiązanie tioesterowe. Na koniec ligaza E3 rekrutuje zarówno kompleks E2-Ub, jak i białko docelowe, katalizując transfer Ub z E2 do reszty lizyny na substratie8.
Ubikwityna może tworzyć różnorodne łańcuchy poliubikwityny poprzez sprzężenie w siedmiu resztach lizyny (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48, Lys63) lub Met1(M1)4. Każdy typ sprzężenia wyznacza różne wyniki biologiczne: łańcuchy sprzężone K48 głównie celują w białka do degradacji proteasomalnej9, łańcuchy sprzężone z K63 regulują sygnalizację i naprawę DNA10,11, a łańcuchy powiązane z M1 są kluczowe dla wrodzonej odpowiedzi immunologicznej12. Ubikwitynacja i deubikwitynacja to kluczowe procesy modyfikacji potranslacyjnej, które kontrolują różnorodne zdarzenia komórkowe, od degradacji białek po transdukcję sygnałów. Na przykład w raku jelita grubego nieprawidłowa aktywacja ubikwitynacji p53 wywołanej przez MDM2 prowadzi do nadmiernej degradacji p53, co osłabia jego zdolność do wywołania zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy, a tym samym napędza postęp guza i chemiooporcję13,14. W urazie niedokrwienia wątroby i reperfuzji OTUD1 stabilizuje NRF2 poprzez usunięcie poliubikwitynacji wiązanej z K48, łagodząc tym samym poziomy stresu oksydacyjnegowewnątrzkomórkowego 15,16. Szereg inhibitorów proteasomu, takich jak bortezomib, karfilzomib i ixazomib, stopniowo weszł do praktyki klinicznej w leczeniu chorób takich jak szpiczak mnogi 17,18,19.
Obecnie istnieje wiele metod wykrywania białek ubikwitynowanych, w tym western blotting, testy radioaktywności oraz testy fluorescencyjne20. Jednak w badaniach naukowych western blot pozostaje preferowaną metodą wykrywania ubikwitynacji białek ze względu na stosunkowo szybki i prosty protokół. Tradycyjne metody wykrywania białek ubikwitynowanych są podobne do technologii koimmunoprecipitacji (co-IP): używają buforu lizy do inkubacji i lizują granulki komórkowe w niskiej temperaturze, aby uwalniać białka, a następnie używają przeciwciał do wykrywania ubikwikwitynacji białek substratowych21,22. Jednak ten protokół eksperymentalny często wymaga dużej liczby komórek. Dodatkowo, ponieważ stosunkowo łagodna metoda lizy w niskiej temperaturze nie może całkowicie zakłócić interakcji białek, zwiększa to prawdopodobieństwo fałszywie pozytywnych wyników w wykrytym ubikwitynacji. Podgrzewanie i stosowanie SDS mogą znacząco zakłócić strukturę białek, wywołując ich całkowitą denaturację, co skutecznie zmniejsza liczbę fałszywie pozytywnych wyników wywołanych interakcjami białko-białko 23,24,25. Podobnie komórki przechodzą wystarczającą lizę po podgrzaniu i leczeniu SDS, uwalniając więcej białek i odpowiednio zmniejszając liczbę komórek potrzebnych do eksperymentu. Podsumowując, zarówno metoda kąpieli lodowej, jak i metoda obróbki cieplnej lizują komórki i wykrywają poziomy ubikwitynacji białek substratu poprzez inkubację przeciwciał. Jednak metoda podgrzewania prowadzi do większej lizy komórek i silniejszej denaturacji białek.
TGF-β odgrywa podwójną rolę w procesach patofizjologicznych różnych chorób 26,27. SMAD2 jest kluczowym czynnikiem transkrypcyjnym TGF-β. Ubiquitinacja SMAD2 za pośrednictwem SMURF2 celuje w degradację proteasomalną, tym samym precyzyjnie dostroiła intensywność sygnalizacji TGF-β28. Badanie to wyodrębnia i porównuje dwie metody lizy komórek do pomiaru poziomu ubikwitynacji w komórkach ssaków, wykorzystując SMURF2/SMAD2 jako model. Tutaj nadekspresja białek w komórkach HEK293T została wywołana przez transientną transfekcję plazmidami HA-Ub, FLAG-SMAD2 i MYC-SMURF2. Komórki były lizowane odpowiednio metodą kąpieli lodowej i metodą obróbki cieplnej. Białka ubikwitynowane zostały wykryte przez analizę Western blot. Stwierdziliśmy, że zarówno metoda kąpieli lodowej, jak i metody obróbki cieplnej mogą być stosowane do wykrywania poziomów ubiquitinacji, a metoda obróbki cieplnej może ułatwić wykrywanie ubikwitynacji SMAD2. Protokół ten stanowi nową alternatywę dla wykrywania białek ubikwitynowanych. Ponadto, dla niektórych białek substratowych silnie związanych z ubikwitynacją, metoda obróbki cieplnej zapewnia lepszą skuteczność lizy białek, co ułatwia wykrywanie ubikwitynacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie buforu lizyzowego i odczynników
UWAGA: Przygotuj wszystkie bufory w wskazanych stężeniach. Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi proszków odczynników, aby uniknąć rozbieżności w stężeniach.
- Przygotuj bufor lizowy zawierający 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0) oraz 1% Triton X-100. W razie potrzeby dostosuj stężenie NaCl w zakresie 50-150 mM. Przygotuj wszystkie bufory za pomocą podwójnie destylowanego H₂O.
- Przygotuj roztwór roboczy, uzupełniając bufor lizowy koktajlem inhibitorów proteazy 1% (bez EDTA). Wymieszaj dokładnie i trzymaj na lodzie aż do użycia.
- Przygotuj 10% SDS, rozpuszczając 1 g proszku SDS w 10 mL PBS. Mieszaj, aż całkowicie się rozpuści. Przechowuj w temperaturze pokojowej.
- Przygotuj bufor obciążający białkiem 5× zawierający 250 mM Tris-HCl (pH 6,8), 10% SDS, 50% glicerol, 0,5% błękit bromofenolu oraz 5% β-merkaptoetanol. Rozpuszczaj składniki w podwójnie destylowanym H2O. Dokładnie wymieszaj przed użyciem.
UWAGA: Obchodz się z SDS i β-merkaptoetanolem w okapie wyparowym, nosząc odpowiedni sprzęt ochronny. Utylizacja zanieczyszczonych materiałów zgodnie z wytycznymi dotyczącymi odpadów chemicznych instytucji.
2. Przygotowanie komórek
- Utrzymuj HEK293T komórki w wysokoglukozowym DMEM, uzupełnionym 10% FBS i 1% penicylin-streptomycyną. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ w warunkach sterylnych. Komórki przejściowe mają około 90% zbiegu się.
- Komórki nasienne w płytkach 6-dołkowych po 5 × 10⁵ komórek na dołek. Zgrupuj komórki z dwóch studni, aby wygenerować jedną próbkę.
- Przygotuj mieszaniny transfekcyjne, które będą stanowić 10% całkowitej objętości hodowli i wykorzystaj ubikwitynację SMAD2 jako model eksperymentalny. Połącz 1 μg plazmidu HA-Ub, 1 μg plazmidu FLAG-SMAD2 oraz 0,5 μg plazmidu pustego wektora lub MYC-SMURF2 w 100 μL bezsurowicowego DMEM. W osobnej probówce rozcieńcz 3,75 μL odczynnika transfekcyjnego w 100 μL DMEM wolnego od surowic. Dodaj mieszaninę odczynników kropelo do roztworu plazmidowego, inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej i równomiernie rozprowadzaj na komórkach.
- Po 6-8 godzinach wymień podłoże transfekcyjne na 2 mL świeżego, kompletnego DMEM na odwiert. Inkubuj komórki przez 48 godzin.
- Traktuj komórki 5 μM MG132 przez 12 godzin przed pobraniem.
UWAGA: Obchodz się z MG132 w szafce zabezpieczeń biologicznych, mając na sobie rękawiczki. Utylizacja skażonych materiałów zgodnie z procedurami bezpieczeństwa instytucjonalnego.
3. Zbieranie komórek
- Pobieraj komórki przy 90-100% łączności (~3 × 10⁶ komórki). Aspiruj medium i przemyj każdy dołek 1 mL schłodzonego PBS. Całkowicie usuń PBS.
- Dodaj 1 mL PBS do każdego dołka i delikatnie zawiesz komórki. Przełóż zawieszenie do rurki 1,5 mL i umieść na lodzie.
- Wiruj w 380 × g przez 5 minut w 4 °C. Usuń supernatant i zachowaj granulat.
4. Przygotowanie koralików agarozowych
- Przenieś 50 μL białka A/G agarozowych koralików na próbkę do nowej probówki. Myj koraliki 3 razy z 1 mL buforu lizy. Wiruj w 100 × g przez 1 minutę w 4 °C między płukaniami.
- Usuń resztki buforu bez naruszania granulki. Dodaj 100 μL roztworu roboczego i 5 μL przeciwciał anty-FLAG. Inkubuj przez 6 godzin w temperaturze 4 °C z delikatnym obracaniem.
5. Liza komórek
- Metoda kąpieli lodowej
- Dodaj 500 μL wstępnie schłodzonego roztworu roboczego do pelletu. Inkubuj na lodzie przez 30 minut.
- Sonikować przy 2 W, stosując 4 sekundy włączenia/4 sekundy wyłączenia przez pięć powtórzeń. Trzymaj próbki na lodzie podczas sonifikacji. Zwrócić próbki do lodu na resztę inkubacji.
UWAGA: W przypadku słabych interakcji białkowych zmniejsz stężenie NaCl do 50-75 mM i pomiń sonikację.
- Metoda obróbki cieplnej
- Dodaj 45 μL roztworu roboczego do pelletu. Dodaj 5 μL 10% SDS podczas ciągłego mieszania.
- Krótko podgrzej i podgrzej do 95 °C, aż zawieszenie stanie się przezroczyste i całkowicie spłynione. Odwracaj przerywanie, aby zapewnić równomierną denaturację.
- Dodaj 450 μL roztworu roboczego. Sonikować przy 2 W, stosując cykle 4 sekundy włączenia/4 sekundy wyłączenia przez pięć powtórzeń, trzymając próbki na lodzie.
UWAGA: Upewnij się, że końcowe stężenie SDS pozostaje <0,1%. Powierdź pełną lizę, potwierdzając zniknięcie widocznych granulek i jednolitą klarowność roztworu.
6. Immunoprecipitacja i wykrywanie ubikwitynacji
- Lizaty w wirówce podawaj 13 680 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przelej supernatant do nowej rurki.
- Zarezerwuj 60 μL lizatu i dodaj 15 μL bufora obciążenia 5×. Podgrzej w 95 °C przez 15 minut i oznacz jako wejście.
- Do pozostałego lizatu dodano 100 μL kulek sprzężonych przeciwciałami (końcowy objętość 540 μL). Inkubuj w temperaturze 4 °C przez 8-12 godzin z rotacją.
- Kulki do wirówki nadają się na 100 × g przez 1 minutę w 4 °C i wyrzucają supernatant. Myj koraliki 3 razy z buforem lizatycznym. Dodaj 75 μL bufora ładowania 1× SDS i podgrzej go w temperaturze 95 °C przez 15 minut, aby wylučować białka. Oznacz jako IP.
- Wykrywanie białek ubikwitynowanych przez western blot zgodnie ze standardowym protokołem JoVE.
UWAGA: Szczegółowe procedury transferu i wykrywania należy zapoznać się z protokołem Western Blot29 . Pełne nieprzycięte plamy z oznacznikami masy cząsteczkowej są dostępne w Pliku Uzupełniającym 1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Jako "molekularny posłaniec" w szlaku sygnalizacyjnym TGF-β, SMAD2, po fosforylacji przez receptory TGF-β, tworzy kompleks z SMAD3 i SMAD4, translokuje się do jądra i inicjuje transkrypcję genów docelowych30. Jest więc kluczową cząsteczką łączącą sygnały zewnątrzkomórkowe z ekspresją genów wewnątrzkomórkową. Jej degradację pośredniczi SMURF2, ligaza ubikwityna E3, która katalizuje poliubikwitynację białka docelowego, kierując go w ten sposób do degradacji proteasomalnej. Ta degradacja SMAD2 wywoła...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejsze badanie przedstawia i porównuje dwa szczegółowe protokoły lizy białek specjalnie zoptymalizowane do wykrywania ubikwitynacji substratu pośredniczonego przez ligazę E3. Aby zapewnić wykrywalność, zastosowaliśmy nadekspresję opartą na plazmidach (np. oznaczoną SMAD2, SMURF2 lub Ub) w komórkach, co zapewniło wystarczające poziomy białek do wizualizacji specyficznych sygnałów ubikwitynacji, co było kluczowe dla weryfikacji interakcji E3 z podłożem w tym badaniu. Przed pobieraniem komórek dodano MG132, silny inhibit...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.
Podziękowania
Badanie to zostało wsparte przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin, nr 82370647 (W.H.), nr 82170642 (J-X. Z), Nr 81801923 (X-F. Z), Nr 81670575 (J-X. Z), nr 81570570 (W.H.) oraz nr 81070355 (J-X. Z), oraz Program Akademickiej Młodzieżowej Drużyny HUST Frontier, Huazhong University of Science and Technology (2018QYTD02). Otwarta Fundacja Hubei Kluczowe Laboratorium Medycyny Regeneracyjnej i Interdyscyplinarnych Badań Translacyjnych (2022zsyx003). Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (2024YFA1107601).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL mikrorurki | Servicebio | EP-150-M | |
| Fermentowana misa 100 mm TC-otoczona | Servicebio | CCD-100 | |
| Dysk 6-dołkowy | Servicebio | CCP-6H | |
| Przeciwciała anty-FLAG | Proteintech | 20543-1-AP | Rozcieńczenie użyte 1:200 dla IP 1:10000 dla WB |
| Przeciwciała anty-GAPDH | Proteintech | MA5-15738 | rozcieńczenie stosowane w stosunku 1:10000 |
| Przeciwciała przeciw HA | Proteintech | 51064-2-AP | rozcieńczenie stosowane w stosunku 1:10000 |
| Przeciwciała anty-IgG | CST | #3900 | Rozcieńczenie stosowane w 1:200 dla IP |
| Przeciwciała anty-MYC | Proteintech | 60003-2-Ig | rozcieńczenie stosowane w stosunku 1:10000 |
| Przeciwciała przeciw SMAD2 | CST | #5339 | Rozcieńczenie użyte 1:200 dla IP 1:2000 dla WB |
| Błękit bromofenolowy | Servicebio | GC307006-5g | |
| EDTA (pH=8,0) | Servicebio | G1207-1L | |
| FBS | ABW | ||
| Glicerol | Sinopharm | 10010618 | |
| Sucha kąpiel podgrzewczo-chłodząca | Guocheng | ||
| HEK293T komórki | ATCC | CRL-3216 | |
| DMEM o wysokiej zawartości glukozy | Servicebio | G4515-500ML | |
| Łańcuch lekki IgG IgG z HRP sprzężony z HRP; | Abclonal | AS062 | Rozcieńczenie używane w stosunku 1:5000 |
| HRP-sprzężony myszy antykróliczy IgG lekki łańcuch | Abclonal | AS061 | rozcieńczenie stosowane w stosunku 1:10000 |
| Lipo8000 | Beyotime | C0533 | |
| MG132 | Aladyn | M421264 | |
| Mikrowirówka | Labgic | CF1524R | |
| Proszek NaCl | Servicebio | GC102004 | |
| PBS | Servicebio | G4202-500ML | |
| pCMV-FLAG-SMAD2 | Dla ekspresji ssaków | ||
| pCMV-HA-Ub | Dla ekspresji ssaków | ||
| pCMV-MYC | Dla ekspresji ssaków | ||
| pCMV-MYC-SMURF2 | Dla ekspresji ssaków | ||
| Penicylina-streptomycyna | Servicebio | G4003-100ML | |
| Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA | TargetMol | C0001 | |
| Białko A/G agarozowe koraliki | Beyotime | P2017 | |
| Membrana PVDF | Vayzme | E801 | |
| Proszek SDS | Solarbio | S8010-500g | |
| Sysytem SDS-PAGE | Aervicebio | BVE4-BVT4 | |
| Soniki | Komórka Uibra | ||
| Proszek Tris-HCl | Biotoped | HST-0372 | |
| Triton X-100 | Servicebio | GC204003-100ml | |
| Trypsyna | Servicebio | G4021-100ML | |
| Mieszacz wirowy | Uprzejmie przekazane przez Vayzme | ||
| β-merkaptoetanol | Aladyn | M301573 |
Bibliografia
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nat Med. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Han, D., Wang, L., Jiang, S., Yang, Q. The ubiquitin-proteasome system in breast cancer. Trends Mol Med. 29 (8), 599-621 (2023).
- Fulcher, L. J., Batley, C., Sobajima, T., Barr, F. A. Time as a danger signal promoting G1 arrest after mitosis. Trends Cell Biol. 36 (2), 142-153 (2025).
- Gao, L., et al. The mechanism of linear ubiquitination in regulating cell death and correlative diseases. Cell Death Dis. 14 (10), 659(2023).
- Serratore, V., Lucibello, M., Malanga, D., Viglietto, G., De Marco, C. Akt and DUBs: A bidirectional relationship. Cell Mol Biol Lett. 30 (1), 77(2025).
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends Biochem Sci. 42 (11), 873-886 (2017).
- Liu, J. Z., et al. BDH2 triggers ROS-induced cell death and autophagy by promoting NRF2 ubiquitination in gastric cancer. J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 123(2020).
- Cappadocia, L., Lima, C. D. Ubiquitin-like protein conjugation: Structures, chemistry, and mechanism. Chem Rev. 118 (3), 889-918 (2018).
- Li, J., et al. ATRA upregulates OTUD6B to recruit CD8+ T cells to suppress colorectal liver metastasis by stabilizing DDX5/STAT3/CXCL11 axis. Cell Death Dis. 16 (1), 521(2025).
- Niu, K., et al. USP33 deubiquitinates PRKN/Parkin and antagonizes its role in mitophagy. Autophagy. 16 (4), 724-734 (2020).
- Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. J Cell Mol Med. 22 (10), 4558-4567 (2018).
- Guo, Y., Zhao, Y., Cong, Y. S. Met1-linked ubiquitination in cell signaling regulation. Biophys Rep. 10 (4), 230-240 (2024).
- Di, Y., et al. The c-Myc-WDR43 signalling axis promotes chemoresistance and tumour growth in colorectal cancer by inhibiting p53 activity. Drug Resist Updat. 66, 100909(2023).
- Liebl, M. C., Hofmann, T. G. The role of p53 signaling in colorectal cancer. Cancers (Basel). 13 (9), 2125(2021).
- Oikawa, D., et al. OTUD1 deubiquitinase regulates NF-κB- and KEAP1-mediated inflammatory responses and reactive oxygen species-associated cell death pathways. Cell Death Dis. 13 (8), 694(2022).
- Zhang, Q., et al. The deubiquitinase OTUD1 stabilizes NRF2 to alleviate hepatic ischemia/reperfusion injury. Redox Biol. 75, 103287(2024).
- Moreau, P., et al. Oral ixazomib, lenalidomide, and dexamethasone for multiple myeloma. N Engl J Med. 374 (17), 1621-1634 (2016).
- Stewart, A. K., et al. Carfilzomib, lenalidomide, and dexamethasone for relapsed multiple myeloma. N Engl J Med. 372 (2), 142-152 (2015).
- Zhu, Y., et al. Targeting gut microbial nitrogen recycling and cellular uptake of ammonium to improve bortezomib resistance in multiple myeloma. Cell Metab. 36 (1), 159-175.e8 (2024).
- De Silva, A. R. I., Page, R. C. Ubiquitination detection techniques. Exp Biol Med (Maywood). 248 (15), 1333-1346 (2023).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of protein ubiquitination. J Vis Exp. (30), e1293(2009).
- Worboys, J. D., Palazón-Riquelme, P., López-Castejón, G. Method to measure ubiquitination of NLRs. Methods Mol Biol. 2696, 105-114 (2023).
- DeCaprio, J., Kohl, T. O. Denaturing lysis of cells for immunoprecipitation. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 098616(2020).
- Bass, J. J., et al. An overview of technical considerations for western blotting applications to physiological research. Scand J Med Sci Sports. 27 (1), 4-25 (2017).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and troubleshooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Crane, J. L., Cao, X. Bone marrow mesenchymal stem cells and TGF-β signaling in bone remodeling. J Clin Invest. 124 (2), 466-472 (2014).
- Gough, N. R., Xiang, X., Mishra, L. TGF-β signaling in liver, pancreas, and gastrointestinal diseases and cancer. Gastroenterology. 161 (2), 434-452.e15 (2021).
- Tzavlaki, K., Moustakas, A. TGF-β signaling. Biomolecules. 10 (3), 487(2020).
- The western blot. J vis exp. , e5065(2025).
- Wu, M., Chen, G., Li, Y. P. TGF-β and BMP signaling in osteoblast, skeletal development, and bone formation, homeostasis and disease. Bone Res. 4, 16009(2016).
- Jeon, S., et al. The miR-15b-SMURF2-HSP27 axis promotes pulmonary fibrosis. J Biomed Sci. 30 (1), 2(2023).
- Zhang, W., et al. SMURF2 predisposes cancer cell toward ferroptosis in GPX4-independent manners by promoting GSTP1 degradation. Mol Cell. 83 (23), 4352-4369.e8 (2023).
- Pi, Y., et al. Loss of SMURF2 expression enhances RACK1 stability and promotes ovarian cancer progression. Cell Death Differ. 30 (11), 2382-2392 (2023).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
