Method Article

Zoptymalizowana ilościowa ocena stabilności RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

DOI:

10.3791/69325

⸱

November 21st, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten ilościowo mierzy stabilność i okres półtrwania intergenowych i intragenowych RNA wzmacniających w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą leczenia aktinomycyną D, RT-qPCR oraz analizy regresji nieliniowej. Stosuje się strategie normalizacji specyficzne dla pozycji, aby dokładnie modelować dynamikę rozpadu eRNA w sposób zależny od kontekstu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA wzmacniające (eRNA) to niekodujące transkrypty produkowane z obszarów wzmacniających aktywność transkrypcyjną i coraz częściej uznawane są za kluczowe regulatory ekspresji genów. Pomimo ich funkcjonalnego znaczenia, dynamika stabilności i degradacji eRNA pozostaje słabo scharakteryzowana, szczególnie w embrionalnych komórkach macierzystych (ESC), gdzie programy transkrypcyjne są wysoce dynamiczne i zależne od kontekstu. Protokół ten przedstawia ilościową metodę oceny kinetyki rozpadu oraz okresu półtrwania intergenowych i wewnątrzgenowych eRNA w mysich ESC. Transkrypcja jest hamowana za pomocą aktinomycyny D, a całkowite RNA jest zbierane w wielu określonych punktach czasowych. cDNA jest syntetyzowane zarówno przy użyciu przypadkowych heksamerów, jak i oligo(dT) primerów, co umożliwia wykrywanie zarówno polyadenylowanych, jak i niepoliadenylowanych transkryptów. W przypadku intergenowych eRNA normalizacja przeprowadza się za pomocą genu housekeeping lub wartości Ct w czasie 0 min. W przypadku intragenowych eRNA stosuje się podwójne podejście normalizacyjne, aby zminimalizować interferencje wynikające z nakładających się pre-mRNA. Krzywe rozpadu analizuje się za pomocą jednofazowego modelu wykładniczego rozpadu, co umożliwia dokładne oszacowanie okresu półtrwania. Protokół ujawnia, że eRNA w mESC wykazują szybką rotację, z okresem półtrwania około 2-3 minut. Ta metodologia zapewnia solidne i powtarzalne ramy do badania stabilności eRNA, oferując wgląd w aktywność wzmacniacza i dynamikę RNA w kontekstach pluripotentnych komórek macierzystych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzmacniacze to elementy cis-regulacyjne (CRE), które regulują ekspresję genów specyficzną dla tkanek i bodźców, pełniąc rolę platform wiążących dla czynników transkrypcyjnych oraz współregulatorów 1,2,3,4,5,6. Chociaż wzmacniacze mogą być zlokalizowane daleko od swoich docelowych genów na poziomie genomu liniowego, mechanizmy pętli chromatyny umożliwiają przestrzenną bliskość do promotorów, ułatwiając regulację transkrypcyjną. Aktywne wzmacniacze są dwukierunkowo transkrybowane przez polimerazę RNA II (Pol II), tworząc długie, niekodujące RNA zwane RNA wzmacniającymi (eRNA), które zazwyczaj mają medianę długości około 1 kb 1,2,7,8,9. Ekspresja eRNA jest silnie skorelowana z aktywacją pobliskich genów docelowych 10,11,12, a badania funkcjonalne konsekwentnie wykazują, że wyczerpanie eRNA zmniejsza transkrypcję ich genów docelowych, co sugeruje, że eRNA działają jako regulatory funkcjonalne, a nie produkty uboczne transkrypcji 13,14,15,16,17 . Pomimo ich funkcjonalnego znaczenia, protokoły eksperymentalne umożliwiające niezawodne wykrywanie i ilościowe określenie eRNA pozostają ograniczone.

W komórkach macierzystych aktywność wzmacniacza odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu pluripotencji i napędzaniu przejść rozwojowych18,19. Wzmacniacze mogą znajdować się w regionach międzygenowych (wzmacniacze intergenowe lub ekstragenowe) lub być osadzone w ciałach genów jako wzmacniacze wewnątrzgenowe8. Chociaż wzmacniacze intergenowe były szeroko badane w różnych typach komórek, intrageniczne wzmacniacze pozostają stosunkowo słabo zbadane ze względu na wyzwania techniczne, takie jak nakładanie się transkrypcji z pre-mRNA genu gospodarza oraz obecność modyfikacji histonów związanych z wydłużeniem transkrypcji20,21. Niemniej jednak najnowsze badania wykazały, że zarówno wzmacniacze międzygenowe, jak i intragenowe przyczyniają się do sieci regulacyjnych genów zaangażowanych w pluripotencję22,23 oraz wczesną różnicację24 w ESC. Co istotne, prawie połowa wszystkich anotowanych wzmacniaczy jest intragenowych20,25, a ich aktywność różni się w zależności od etapów rozwojowych, często wzrastając w zróżnicowanych tkankach 8,26,27,28. Jednak częstość występowania i funkcjonalne role wzmacniaczy wewnątrzgenowych w ESC pozostają niedo do końca poznane. W szczególności, podczas gdy intergenowe eRNA są transkrybowane między genami, intragenowe eRNA są transkrybowane w obrębie ciał genów i mogą nakładać się na transkrypcje pre-mRNA. Ta różnica pozycyjna wymaga odrębnych podejść analitycznych przy interpretacji i ilościowości intergenowych i intragenowych eRNA.

W przeciwieństwie do mRNA, eRNA zazwyczaj nie mają 3′ poli(A) ogona, co skutkuje niską stabilnością i szybką degradacją 1,2,7,8,9. Ta niestabilność wewnętrzna utrudnia analizę ekspresji eRNA, zwłaszcza w eksperymentach z przebiegiem czasu. W neuronach wykazywano okres półtrwania eRNA zaledwie 7,5 min17. Jednak nadal nie jest jasne, czy ta niestabilność jest spójna w różnych typach komórek, szczególnie w ESC, gdzie zarówno aktywność wzmacniacza, jak i transkrypcja eRNA są wysoce specyficzne dla typu komórki 7,17,29,30. ESC opierają się na dynamicznych programach regulacji genów, aby utrzymać pluripotencję lub inicjować różnicowanie, co czyni je unikalnym systemem do badania rotacji eRNA31,32. Biorąc pod uwagę szybkie zmiany transkrypcyjne w ESC, zrozumienie rozpadu eRNA w tym kontekście może ujawnić, jak aktywność wzmacniacza jest regulowanaczasowo17. Ponadto różnice między intergenowymi a intragenicznymi eRNA, takie jak nakładanie się z transkrypcjami genów gospodarza, wymagają odrębnych podejśćanalitycznych 20. Pomimo znaczenia tych pytań, istnieje niewiele ustandaryzowanych metod pomiaru okresu półtrwania eRNA w ESC lub porównywania dynamiki rozpadu różnych typów eRNA.

Badanie przedstawia protokół ilościowy oceniający stabilność i okres półtrwania eRNA transkrybowanych z wzmacniaczy intergenowych i wewnątrzgenowych w mESC. Hamowanie transkrypcyjne osiąga się przy użyciu aktinomycyny D (ActD) w określonych odstępach czasowych, po czym następuje ilościowe PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) oraz analiza regresji nieliniowej w celu ilościowego określenia rozpadu eRNA. Aby zniwelować różnice pozycyjne między wzmacniaczami intergenowymi a intragenowymi, metoda wykorzystuje odrębne strategie normalizacji, umożliwiając systematyczne i dokładne porównanie dynamiki degradacji eRNA. To uporządkowane ramy analityczne dostarczają cennych informacji na temat wymiany eRNA w komórkach macierzystych pluripotentnych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty w tym badaniu przeprowadzono z użyciem myszy embrionalnych komórek macierzystych (mESC; E14Tg2A), które nie zostały wygenerowane bezpośrednio w naszym laboratorium, lecz pochodzą z ustalonej linii komórkowej, która jest również dostępna komercyjnie w ATCC (CRL-1821). Dlatego prace opisane w tym artykule nie wymagają przeglądu przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC) na Uniwersytecie Narodowym w Chungnam. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Hodowla komórkowa mESC

  1. Przed powleknięciem płytek hodowli komórek 6-dołkowych zawierających 0,1% żelatyny (2 mL na dołek). Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
  2. Aspiruj żelatynę i przemyj każdą dołek raz 1 ml PBS. Sterylizuj płytki napromieniowaniem UV przez co najmniej 15 minut.
  3. Nasiaj mESC na płytkach pokrytych żelatyną, używając pełnych 2 mL pożywki hodowli komórkowej (Tabela 1).
    UWAGA: Dodaj LIF świeżo do podłoża w wymaganym stężeniu tuż przed użyciem, w zależności od całkowitej objętości medium potrzebnej do eksperymentu.
KomponentyOstateczna koncentracjaUżyte objętości
Minimalne niezbędne medium (GMEM) w Glasgow-500 mL
Zamiennik serum KnockOut™ (KOSR)10%50 mL
Penicylina-streptomycyna0.50%2,5 mL
Serum bydła płodu (FBS)1%5 mL
Pirorotroczan sodu0,1 mM / 1%5 mL
Roztwór aminokwasów nieistotnych MEM (MnEA)0,1 mM/1%5 mL
2-merkaptoetanol0,1 mM910 uL
Czynnik hamujący białaczkę (LIF)1000 U/mL-

Tabela 1: Skład medium kultury mESC. Składniki i ich końcowe stężenia używane do przygotowania pożywki hodowlanej mESC. Typowe objętości są podawane na 500 ml całościowego medium.

  1. Utrzymuj komórki w standardowych warunkach hodowli w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z zawartością 5%CO2 (Rysunek 1A).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Projekt eksperymentalny do analizy stabilności eRNA. (A) Schemat eksperymentu zatrzymania transkrypcji. Komórki były powłaszczane na płytkach 6-dołkowych pokrytych żelatyną o stężeniu 0,1% i traktowane actD (końcowe stężenie: 5 μg/mL) w wskazanych momentach (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min i 30 min) po zbiorze. (B) Układ testu RT-qPCR. Całkowite RNA zostało przepisane odwrotnie za pomocą przypadkowych heksamerów lub oligo(dT) primerów. próbki cDNA z każdego punktu czasowego analizowano za pomocą RT-qPCR dla wskazanych celów: Tbp_mRNA, intergenowego eRNA oraz intragenowego eRNA. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

2. Leczenie aktinomycyną D (ActD)

  1. Rozpuszcz actD w DMSO, aby przygotować roztwór zapasowy w stężeniu 1 mg/mL33.
    UWAGA: Chociaż aktinomycyna D jest tutaj stosowana do krótkotrwałej transkrypcji hamowania, w przyszłych badaniach mogą być stosowane alternatywne inhibitory, takie jak triptolid, które blokują inicjację transkrypcji. Ponieważ zarówno aktinomycyna D, jak i DMSO są światłoczułe, przygotuj roztwór w bursztynowych mikrorurkach, chroń go przed światłem i przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  2. Dwa dni po wysiewie komórek (lub w dniu zbioru) dodaj roztwór stockowy actD do podłoża hodowlanego do końcowego stężenia 5 μg/mL33. Pobierać próbki w ciągu 0 minut, 5 minut, 10 minut, 15 minut, 20 i 30 minut po zabiegu (Rysunek 1A).
    UWAGA: Podczas gdy większość eRNA wykazuje szybki rozpad w zakresie 0-30 minut, niektóre eRNA mogą wykazywać dłuższy okres półtrwania. W zależności od charakterystyki miejsca docelowego, dodatkowe próbkowanie w dłuższych punktach czasowych (np. 1 godzina, 3 godziny lub 6 godzin) może być uwzględnione w celu dokładniejszego uchwycenia kinetyki rozpadu. W tym badaniu Actinomycyna D była stosowana w stężeniu 5 μg/mL do krótkotrwałej (≤30 min) blokady transkrypcyjnej; jednak przy dłuższych inkubacjach (>1 h) zaleca się zmniejszenie stężenia do 1-2 μg/mL, aby zminimalizować reakcje stresowe komórek. Ponieważ samo DMSO może wpływać na aktywność transkrypcyjną, należy również uwzględnić kontrolę wyłącznie DMSO.

3. Ekstrakcja RNA i synteza cDNA

  1. Usuń podłoże komórkowe przez ssanie i dodaj 1 ml odczynnika Trizol do każdego dołka. Inkubuj płytki na shakerze przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT)34,35, a następnie przelej lizat do nowej probówki 1,5 mL.
    UWAGA: Po leczeniu TRIzol próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do tygodnia przed ekstrakcją RNA. Ponieważ odczynnik TRIzol zawiera fenol i izotiocyjanian guanidinu, które są wysoce toksyczne i, należy obchodzić się z nimi z dużą ostrożnością. Wszystkie odpady TRIzol powinny być zbierane w wyznaczonym pojemniku na odpady z rozpuszczalnikami organicznymi w celu prawidłowej utylizacji.
  2. Do każdej próbki dodaj 500 μL chloroformu. Energicznie potrząśnij rurkami i inkubuj w RT przez 3 minuty.
  3. Wiruj próbki w 13 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Ostrożnie przelej fazę wodną do nowej probówki o pojemności 1,5 mL zawierającej równą objętość izopropanolu. Inkubuj mieszaninę w RT przez 10 minut, aby zwiększyć wytrącanie RNA.
    UWAGA: Ostrożnie przelewaj tylko przezroczystą górną fazę wodną, aby uniknąć skażenia interfazą. Aby zwiększyć wydajność RNA, inkubuj próbki w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę do nocy (O/N) po dodaniu izopropanolu. W przypadku próbek o niskim wkładzie dodaj glikogen (ostateczne 10-20 μg/mL) lub GlycoBlue tuż przed dołączeniem izopropanolu, aby poprawić widoczność pelletów RNA i efektywność wydobycia. Izopropanol jest wysoce łatwopalny i potencjalnie szkodliwy dla zdrowia ludzi; Wdychanie oparów lub kontakt ze skórą lub oczami może powodować podrażnienie, ból głowy, zawroty głowy lub depresję ośrodkowego układu nerwowego. Postępuj ostrożnie i zbieraj wszystkie pozostałe roztwory do zatwierdzonego pojemnika na odpady rozpuszczalne organiczne, aby prawidłowo się utylizować.
  5. Ponownie wiruj próbki w 13 500 × g przez 10 minut w 4 °C i wyrzucaj supernatant.
  6. Powstały pellet RNA przemyj 1 mL etanolu 75%. Wirówka w 6 800 × g przez 5 minut w 4 °C.
    UWAGA: Po dodaniu etanolu delikatnie odwróć rurkę, aby podnieść pellet.
  7. Ostrożnie usuń supernatant i susz go na powietrzu przez 10 minut w temperaturze 42 °C. Ponownie zawiesz wysuszony pellet w wodzie wolnej od RNazy i inkubuj w 55 °C przez 10 minut.
    UWAGA: Gdy czystość RNA jest wysoka, biała granulka może stać się przezroczysta podczas procesu suszenia na powietrzu. Unikaj nadmiernego suszenia pelletu przez więcej niż 10 minut, ponieważ nadmierne suszenie może obniżyć efektywność ponownego zawieszenia.
  8. Zmierz stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop.
  9. Syntetyzuj cDNA z μg RNA za pomocą zestawu M-MLV do syntezy cDNA, zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela 2).
KomponentyUżyte objętości
10X M-MLV RT bufor2 uL
dNTP2 uL
Podkład (Random / Olido dT)1uL
M-MLV RT1uL
Inhibitor RNAZY0,5 uL
Próbka RNA2ug (objętość skorygowana na podstawie stężenia próbki RNA)
DWObjętość dostosowująca się w zależności od stężenia próbki RNA (aby uzupełnić końcową objętość)
Całkowity wolumen20 uL

Tabela 2: Skład reakcji syntezy cDNA (M-MLV transkryptoza). Szczegółowe objętości i odczynniki używane do odwrotnej transkrypcji 2 μg całkowitego RNA z wykorzystaniem zestawu M-MLV do syntezy cDNA. Objętość próbki RNA została dostosowana w zależności od stężenia, a do tego dodano wolną od nukleazy DW, aby końcowa objętość reakcji wyniosła 20 μL.

  1. Inkubuj reakcję cDNA w 37 °C przez 2 godziny, a następnie inaktywuj enzym cieplnym w 85 °C przez 5 minut.
    UWAGA: Przechowuj syntetyzowane cDNA w temperaturze -20 °C. Typowe stężenie cDNA wynosi około 100 ng/μL. Aby wykryć intragenowe eRNA, syntetyzuj cDNA z tej samej próbki RNA, używając zarówno przypadkowych primerów heksamerowych, jak i oligo(dT) primerów.

4. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)

  1. Przygotuj mieszaninę reakcji o pojemności 10 μL zawierającą 15 ng cDNA, 5 μL mieszanki głównej Power SYBR Green PCR, 5 pmol każdego podkładu oraz wodę destylowaną (DW).
    UWAGA: loci eRNA często zawierają lub są sąsiadujące z powtarzalnymi sekwencjami, co wymaga starannego projektowania startera. Używaj sekwencji maskowanych powtarzającymi się do ograniczenia regionów kandydatów i weryfikacji specyficzności par primerów w całym genomie za pomocą BLAST. Jeśli to możliwe, uwzględnij pobliskie obszary kontrolne, aby wykluczyć niespecyficzne wzmocnienie36.
  2. Wykonaj amplifikację za pomocą systemu PCR w czasie rzeczywistym przy następujących warunkach cyklu termicznego: początkowy etap aktywacji i denaturacji w 50 °C przez 2 minuty oraz 95 °C przez 10 minut, następnie 40 cykli denaturacji w 95 °C przez 15 sekund oraz wyżarzanie, rozciąganie i pomiar fluorescencji w 60 °C przez 1 minutęi 34 minuty, 37 (Tabela 3).
ScenaKrokTemperatura (°C)GodzinaCykl
Etap utrzymaniaTranskrypcja odwrotna502 min1
Początkowa denaturacja9510 min1
Etap PCRDenaturacja9515 s40
Wyżarzanie/Przedłużenie601 min40
Etap krzywej topnieniaDenaturacja9515 s1
Wyżarzanie601 min1
Dysocjacja (krzywa topnienia)9515 s1

Tabela 3: Warunki cyklu termicznego dla RT-qPCR. Podsumowujące warunki temperatury, czasu i cyklu dla transkrypcji odwrotnej, 40-cyklowego qPCR (reakcja 10 μL) oraz standardowej analizy krzywej stopienia.

  1. Do ilościowej identyfikacji eRNA wewnątrzgenowej analizuj zarówno Tbp (lub inny gen kontrolujący utrzymanie/kontrolę), jak i region wzmacniający downętrzny, używając cDNA syntetyzowanego z primerami oligo(dT). Dla intergenowych eRNA używaj wyłącznie cDNA syntetyzowanego z przypadkowymi primerami heksamerów (Tabela 4 i Rysunek 1B).
    UWAGA: Każdą próbkę uruchamiaj w technicznych duplikatach (dwóch studniach), aby umożliwić uśrednianie podczas analizy danych.
Nazwa genuSonda zapalnikaSekwencja (5'-3')Rozmiary ampliconów
Do ustaleniaNaprzódTGACTCCTGGAATTCCCATC122 bp
RewersTTGCTGCTGCTGTGTGTGTGTGTT
Nsun2_mRNANaprzódGGATGAAGCAGTGATCGCAG93 BP
RewersATCCACTTCAGTCCTGGCAA
Pou5f1_mRNANaprzódTCCCTACAGCAGATCACTCAC80 BP
RewersCGCCGGTTACAGAACCATAC
Sox2_mRNANaprzódACAGATGCAACCGATGCACC105 BP
RewersTGGAGTTGTACTGCAGGGCG
Nsun2_eRNANaprzódCCTGAGAGGTGTTTGCTTTGT110 bp
RewersAGGTTAACACATCAGCCCCA
Pou5f1_eRNANaprzódCACTTCTGGGGTCTCTGG107 bp
RewersCCAGGACAAGACAGCCATTG
Sox2_eRNANaprzódAGTCAGCTACATGGGCAGAG119 bp
RewersCCCCTCTTCTCACCGTACAG
Nsun2_negative kontrolęNaprzódCCCCGTGTTTAAGGAATGA88 bp
RewersACTGAGAACAACCCACTAGCA

Tabela 4: Sekwencje primerów do analizy RT-qPCR. Sekwencje zapalników do przodu i wstecznie używane do specyficznej amplifikacji każdego docelowego genu w eksperymentach RT-qPCR. Te startery zostały zoptymalizowane, aby zapewnić dokładną ilościową identyfikację ekspresji mRNA i eRNA.

5. Analiza danych stabilności eRNA 22

  1. Przeanalizuj wszystkie dane metodą ΔCt i normalizuj względne poziomy eRNA do Tbp_mRNA (Plik uzupełniający 1 i Rysunek 2A).
    UWAGA: Jeśli różnica wartości Ct między dwoma replikami technicznymi przekracza 0,5, wyklucz dane z dalszej analizy. Oblicz względne poziomy ekspresji genów metodą ΔCt, odejmując wartość Ct genu kontrolnego (np. Tbp_mRNA) od wartości genu docelowego (ΔCt = Control_Ct - Target_Ct). Wyrażenie względne można wtedy obliczyć jako 2^-ΔCt (plik uzupełniający 2B).
  2. Dla ilościowej ilościowości eRNA wewnątrzgenowej normalizuj wartości ekspresji, dzieląc wartości z cDNA syntetyzowanego za pomocą losowych heksamerów przez te z cDNA syntetyzowanego przy użyciu starterów oligo(dT).
    UWAGA: Wszystkie reakcje qPCR wykonuj przy użyciu trzech niezależnych replikatów biologicznych (n = 3).
  3. Normalizuj poziom wyrażenia każdego punktu czasowego (uzyskany metodąΔCt) do wartości 0 min i narysuj krzywą zaniku.
    UWAGA: Chociaż protokół ten stosuje krótkie leczenie aktinomycyną D, długotrwała ekspozycja na inhibitory transkrypcji (np. ActD) może również zmniejszyć ekspresję genów w zachowaniu obowiązków. Dla precyzyjniejszej ilościowej analizy zalecamy dodanie egzogenicznego RNA spike-in (np. ERCC) na etapie lizy komórek, aby skorygować różnice w efektywności ekstrakcji RNA, efektywności transkrypcji odwrotnej oraz dokładności pipetowania, co umożliwi bardziej spójną normalizację w próbkach38,39.
  4. Nakreśl normalizowane poziomy eRNA w czasie i dopasuj je za pomocą modelu regresji nieliniowej (jednofazowy rozkład wykładniczy) w GraphPad Prism (Plik Uzupełniający 3).
  5. Oszacuj okres półtrwania eRNA na podstawie pojedynczych biologicznych replikacji.
    1. Otwórz GraphPad Prism i wybierz Create > XY (Opcje: X = Liczby; Y = Wprowadź i wykreśl pojedynczą wartość Y dla każdego punktu).
    2. Wprowadź punkty czasowe (0, 5, 10, 15, 20 i 30 min) jako wartości na osi X.
    3. Na osi Y (Grupa) wypisz nazwy próbek i wprowadź odpowiadającą im pojedynczą wartość danych dla każdego punktu czasowego.
    4. Wybierz Analizuj > regresji i krzywych > regresji nieliniowej (dopasowanie krzywej).
    5. W zakładce wykładniczo wybierz model jednofazowego zaniku .
    6. W arkuszu Tabela do Wyników oblicz średnią i odchylenie standardowe wartości okresu półtrwania dla każdej próbki za pomocą Excela lub podobnego oprogramowania. Wykreśl uzyskane wartości.
  6. Dopasowanie krzywych spadku z 95% przedziałami ufności
    1. Otwórz GraphPad Prism i wybierz Create > XY (Opcje: X = Liczby; Y = Wprowadź 3 wartości replikacji w podkolumnach ustawionych obok siebie).
    2. Wprowadź punkty czasowe (0, 5, 10, 15, 20 i 30 min) jako wartości na osi X.
    3. Na osi Y (grupa) wpisz nazwy próbek i wprowadź trzy wartości replikacyjne dla każdej próbki eRNA do odpowiedniej karty danych.
    4. Wybierz Analizuj > regresji i krzywych > Regresji nieliniowej (dopasowanie krzywej).
    5. W zakładce Wykładniczo wybierz model jednofazowego zaniku do analizy.
    6. W arkuszu Tabela do Wyników wyodrębnimy wartości 95% przedziału ufności (CI) uzyskane z analizy próbek potrójnych.
      UWAGA: Użyj następującego równania rozpadu: Y = (Y0 - Plateau) • e-kt + Plateau, gdzie Y to względny poziom eRNA w czasie t, Y0 to początkowy poziom eRNA, a k to stała rozpadu. Nie utrwalaj plateau do zera podczas dopasowania krzywej eRNA, ponieważ wcześniejsze badania pokazują, że eRNA może się utrzymywać i nie ulegać całkowitemu rozkładowi w czasie17,40. Jednak podczas analizy rozpadu mRNA należy ustalić plateau do zera, zgodnie z wcześniejszymi protokołami mRNA41,42. Pozwól GraphPad Prism automatycznie obliczać okres półtrwania eRNA (t₁/₂) według wzoru: t1/2 = In(2)/ k. Wpisz czas w min; Raportuj powstałe wartości półtrwania w min.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ocenić stabilność RNA po zatrzymaniu transkrypcji, mESC poddano actD, a całkowite RNA zebrano w określonych momentach (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min). Po syntezie cDNA wykonano RT-qPCR w celu ilościowego określenia intragenowego eRNA Nsun2 i Sox2, intergenowego eRNA Pou5f1 oraz odpowiadających im mRNA. Dane te zostały wykorzystane do generowania krzywych degradacji zależnych od czasu (Rysunek 2). W udanych ekspery...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten określa wiarygodną i powtarzalną metodę pomiaru stabilności eRNA w mESC. Kluczowe kroki eksperymentalne, w tym hodowla komórek, leczenie aktinomycyną D, ekstrakcja RNA oraz ilościowa identyfikacja RT-qPCR, są wyraźnie przedstawione na rysunkach i plikach uzupełniających, aby prowadzić użytkowników przez proces pracy. Ponadto szczegółowe procedury analityczne, takie jak modelowanie regresji nieliniowej oraz interpretacja przedziałów ufności, zostały przedstawione w Pliku Uzupełniającym 4 , ws...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało wsparte przez fundusz badawczy Chungnam National University [2024-0991-01 (S.-K.K.)]; Program Badań Podstawowych Nauk [RS-2023-00209842 (S.-K.K.)] oraz Program Rozwoju Technologii Bioi i Medycznych [RS-2025-02305916 (S.-K.K.)] Narodowej Fundacji Badawczej (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-merkaptoetanolGibco21985023
Aktinomycyna DSigma-AldrichA9415
chloroformChemikalia Daejung2548-4105
DMSOGenDEPOTD2680
Serum bydła płodu (FBS)Sigma-AldrichF0392
ŻelatynaSigma-AldrichG1890-100G
Glasgow' s Minimalne Niezbędne Medium (GMEM)Gibco11710035
GraphPad Prism (wersja 9)Oprogramowanie GraphPad
IzopropanolChemikalia Daejung5035-4105
Zamiennik serum KnockOut (KOSR)Gibco, 10828028
Czynnik hamujący białaczkę (LIF)MerckESG1106
Roztwór aminokwasów nieistotnych MEM (MnEA)WelgeneLS005
M-MLV zestaw do syntezy cDNA  EnzynomikaEZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus KLAB01-QI685-M-16-C
Penicylina-streptomycynaWelgeneLS202-02
Power SYBR-Green PCR master mix Biosystemy stosowane4368708
QuanStudio1 System PCR w czasie rzeczywistym (Real-Time)Biosystemy stosowaneA40425
Pirorotroczan soduWelgeneLS013
TRIzol Invitrogen15596018

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  2. Gorbovytska, V., et al. Enhancer RNAs stimulate Pol II pause release by harnessing multivalent interactions to NELF. Nat Commun. 13 (1), 2429(2022).
  3. Joo, J. -Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. -K. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers. Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).
  4. Levine, M. Transcriptional enhancers in animal development anfd evolution. Curr Biol. 20 (17), R754-R763 (2010).
  5. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  6. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).
  7. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biol. 8 (5), e1000384(2010).
  8. Kim, T. -K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  9. Songyue, G., et al. The roles of enhancer, especially super-enhancer-driven genes in tumor metabolism and immunity. Int J Biol Macromol. 308 (1), 142414(2025).
  10. Kim, S. H., et al. Epigenetic regulation of IFITM1 expression in lipopolysaccharide-stimulated human mesenchymal stromal cells. Stem Cell Res Ther. 11, 1-12 (2020).
  11. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: Recent insights and future perspectives. Nat Rev Genet. 17 (4), 207-223 (2016).
  12. Sartorelli, V., Lauberth, S. M. Enhancer RNAs are an important regulatory layer of the epigenome. Nat Struct Mol Biol. 27 (6), 521-528 (2020).
  13. Lam, M. T., et al. Rev-Erbs repress macrophage gene expression by inhibiting enhancer-directed transcription. Nature. 498 (7455), 511-515 (2013).
  14. Li, W., et al. Functional roles of enhancer RNAs for oestrogen-dependent transcriptional activation. Nature. 498 (7455), 516-520 (2013).
  15. Melo, C. A., et al. eRNAs are required for p53-dependent enhancer activity and gene transcription. Mol Cell. 49 (3), 524-535 (2013).
  16. Mousavi, K., et al. eRNAs promote transcription by establishing chromatin accessibility at defined genomic loci. Mol Cell. 51 (5), 606-617 (2013).
  17. Schaukowitch, K., et al. Enhancer RNA facilitates NELF release from immediate early genes. Mol Cell. 56 (1), 29-42 (2014).
  18. Göttgens, B., et al. Establishing the transcriptional programme for blood: The SCL stem cell enhancer is regulated by a multiprotein complex containing Ets and GATA factors. The EMBO J. 21 (12), 3039-3050 (2002).
  19. Wang, H. F., et al. Defining essential enhancers for pluripotent stem cells using a features-oriented CRISPR-Cas9 screen. Cell Rep. 33 (4), 108309(2020).
  20. Cinghu, S., et al. Intragenic enhancers attenuate host gene expression. Mol Cell. 68 (1), 104-117.e106 (2017).
  21. Hobson, D. J., Wei, W., Steinmetz, L. M., Svejstrup, J. Q. RNA polymerase II collision interrupts convergent transcription. Mol Cell. 48 (3), 365-374 (2012).
  22. Moon, J., et al. Embryonic stem cell-specific intragenic enhancer RNA essential for NSUN2-mediated stem cell fate regulation. Int J Biol Macromol. 319, 145470(2025).
  23. Tata, P. R., Tata, N. R., Kühl, M., Sirbu, I. O. Identification of a novel epigenetic regulatory region within the pluripotency associated microRNA cluster, EEmiRC. Nucleic Acids Res. 39 (9), 3574-3581 (2011).
  24. Sohni, A., et al. Dynamic switching of active promoter and enhancer domains regulates Tet1 and Tet2 expression during cell state transitions between pluripotency and differentiation. Mol Cell Biol. 35 (6), 1026-1042 (2015).
  25. Borsari, B., et al. Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions. Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).
  26. Bressin, A., et al. High-sensitive nascent transcript sequencing reveals BRD4-specific control of widespread enhancer and target gene transcription. Nat Commun. 14 (1), 4971(2023).
  27. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).
  28. Pérez-Molina, R., et al. An intronic Alu element attenuates the transcription of a long non-coding RNA in human cell lines. Front Genet. 11, 928(2020).
  29. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  30. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  31. Atlasi, Y., Stunnenberg, H. G. The interplay of epigenetic marks during stem cell differentiation and development. Nat Rev Genet. 18 (11), 643-658 (2017).
  32. Young, R. A. Control of the embryonic stem cell state. Cell. 144 (6), 940-954 (2011).
  33. Ratnadiwakara, M., Änkö, M. -L. mRNA stability assay using transcription inhibition by actinomycin D in mouse pluripotent stem cells. Bio Protoc. 8 (21), e3072-e3072 (2018).
  34. Kim, S. -K., et al. Functional coordination of BET family proteins underlies altered transcription associated with memory impairment in fragile X syndrome. Sci Adv. 7 (21), eabf7346(2021).
  35. Peterson, S. M., Freeman, J. L. RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis. J Vis Exp. (30), e1470(2009).
  36. Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134(2012).
  37. Kim, S. -K., et al. SET7/9 methylation of the pluripotency factor LIN28A is a nucleolar localization mechanism that blocks let-7 biogenesis in human ESCs. Cell Stem Cell. 15 (6), 735-749 (2014).
  38. Lugowski, A., Nicholson, B., Rissland, O. S. DRUID: A pipeline for transcriptome-wide measurements of mRNA stability. RNA. 24 (5), 623-632 (2018).
  39. Lugowski, A., Nicholson, B., Rissland, O. S. Determining mRNA half-lives on a transcriptome-wide scale. Methods. 137, 90-98 (2018).
  40. Tsai, P. F., et al. A muscle-specific enhancer rna mediates cohesin recruitment and regulates transcription in trans. Mol Cell. 71 (1), 129-141.e128 (2018).
  41. Woolley, C. R., et al. Full-length mRNA sequencing resolves novel variation in 5' UTR length for genes expressed during human CD4 T-cell activation. Immunogenetics. 77 (1), 14(2025).
  42. Zhang, H., et al. Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity. Nature. 621 (7978), 396-403 (2023).
  43. Kim, T. -K., Shiekhattar, R. Architectural and functional commonalities between enhancers and promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enhancer RNAsRNA StabilityMouse Embryonic Stem CellseRNA DecayActinomycin DRT qPCRIntergenic Enhancer RNAIntragenic Enhancer RNARNA Half LifeTranscriptional Arrest

Related Articles