Artykuł metodologiczny

Inżynieria epigenetyczna komórek K562: Dwuwektorowa strategia episomalna dla stabilnej, celowanej metylacji DNA z wykorzystaniem białek fuzji dCas9-DNMT3A i -HDAC1

DOI:

10.3791/69328

⸱

31 października 2025

 ,  ,  , 
1Biology Laboratory, School of Science and Technology, Hellenic Open University, 2Division of Pharmacology and Biosciences, Department of Pharmacy, School of Health Sciences, University of Patras

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje nieintegracyjny, episomalny system oparty na CRISPR/dCas9 do celowanej edycji epigenetycznej w komórkach K562, łączący efektory dCas9-DNMT3A i dCas9-HDAC1 ze specyficznymi sgRNA, aby precyzyjnie indukować metylację DNA specyficzną dla locus, z ograniczoną efektem pozacelową.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie dokładnej roli metylacji DNA w regulacji transkrypcji genów oraz opracowywanie terapii ukierunkowanych na konkretne wzorce metylacji genów stwarzają poważne wyzwania ze względu na niedobór wszechstronnych narzędzi zdolnych do indukowania specyficznych miejscowo i długoterminowych modyfikacji epigenetycznych w celu modulacji ekspresji genów. Celem badania było opracowanie i zweryfikowanie innowacyjnego systemu episomalnego ułatwiającego stabilną metylację DNA w docelowym locus genu, potencjalnie przydatnego zarówno do podstawowych badań epigenetycznych, jak i zastosowań terapeutycznych. Aby to osiągnąć, linia komórkowa K562 została współtransfekowana dwoma odrębnymi wektorami episomalnymi. Oba typy wektorów zostały zaprojektowane tak, aby wyrażać RNA prowadzące (gRNA) celujące w obszar niemetylowany o długości 367 bp w obrębie wyspy CpG 326, położonej powyżej genu ZBTB7A . Każdy wektor kodował dezaktywowaną formę endonukleazy Cas9 (martwą lub dCas9), związaną z domeną katalityczną metylotransferazy DNA DNMT3A (dCas-DNMT3A-CD) lub pełną długością histonową deacetylazą HDAC1 (dCas-HDAC1). Sekwencja dCas zawierała dwa sygnały lokalizacyjne jądra (NLS), aby zapewnić import jądra białka. Ta kaseta ekspresyjna z podwójnym układem promuje stan chromatyny potencjalnie sprzyjający długotrwałemu wyciszaniu epigenetycznemu, obiecując solidne i trwałe efekty epigenetyczne. To pośrednie podejście do epigenomu gospodarza, poprzez wykorzystanie samoreplikujących się wektorów episomalnych, oferuje kilka zalet: utrzymanie i ekspresję wektorów przy niskiej liczbie kopii podczas wielu podziałów komórkowych bez integracji z genomem gospodarza, co minimalizuje efekty poza celem i zachowuje integralność genomu. Raportujemy precyzyjny i istotny wzrost metylacji DNA na docelowej wyspie ZBTB7A CpG 326. Wyniki potwierdzają, że inżynierowane systemy episomalne CRISPR/dCas mogą wywoływać trwałą, specyficzną dla miejsca metylację DNA. Dlatego ten system jest cennym narzędziem badawczym do oceny funkcjonalnych efektów ukierunkowanych zmian metylacji oraz obiecującą platformą do opracowywania przyszłych terapii epigenetycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regulacja epigenetyczna, w tym metylacja DNA i modyfikacje histonów, odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu ekspresji genów, różnicowania komórek oraz stabilności genomu. Dysregulacja tych mechanizmów często jest zaangażowana – zarówno jako przyczyna, jak i konsekwencja – w różnych stanach patologicznych, szczególnie w nowotworach, zaburzeniach neurologicznych oraz zespołach imprintingu 1,2,3. Co istotne, poprzez precyzyjną interwencję w krajobraz epigenetyczny na określonych loci genomowych za pomocą technologii edycji epigenomu Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), można osiągnąć poziomy represji genów porównywalne z tymi obserwowanymi w modelach knock-out genów, bez zmiany podstawowej sekwencji DNA4. W rezultacie ukierunkowana edycja epigenetyczna stała się obiecującą strategią rozcinania mechanizmów regulacji genów i rozwoju precyzyjnych terapii.

Inhibitory metylotransferazy DNA (DNMT) oraz inhibitory deacetylazy histonowej (HDAC) to terapie epigenetyczne obecnie zatwierdzone do zastosowań klinicznych. Jednak te środki nieselektywnie celują w markery epigenetyczne w genomie, zmieniając globalne stany chromatyny, powodując efekty pozacelowe i toksyczność u pacjentów5. Aby złagodzić ograniczenia tradycyjnych środków zmiany epigenetycznej, opracowano programowalne edytory epigenetyczne oparte na katalistycznie martwym Cas9 (dCas9) fuzjonowanym z domenami efektorowymi, takimi jak metylotransferazy DNA (np. DNMT3A), demetylazy (np. TET1), acetylotransferazy histonowe (np. p300) czy deacetylazy (np. HDAC3) 6,7,8,9 . System efektorów dCas9 pozwala na modyfikację epigenomu specyficzną dla locus prowadzoną przez małą cząsteczkę RNA, znaną jako jedno-przewodnikowe RNA (sgRNA), bez wprowadzania podwójnych pęknięć w sekwencji docelowej. Najnowsze badania wykazały ich zastosowanie w modyfikowaniu ekspresji genów, przebudowywaniu dostępności chromatyny, a nawet przeprogramowaniu: fenotypów komórkowych 10,11,12.

Pomimo szybkich postępów, systemy inżynierii epigenomu oparte na dCas9 nadal napotykają pewne ograniczenia. Najczęstszym wyzwaniem są efekty pozacelowe ze względu na niespecyficzność epigenetycznych domen efektorowych, zwłaszcza przy silnej lub długotrwałej ekspresji narzędzi fuzji dCas913,14. Dodatkowo, duże rozmiary fuzji dCas9 stwarzają poważne wyzwania w dostarczaniu danych. Rozmiar sekwencji Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) wynosi około 4,2 kb15, co jest porównywalne z maksymalną pojemnością wektorów wirusów adenogenozowych (AAV). Chociaż wektory lentiwirusowe mają stosunkowo dużą pojemność (~12-1 kb), umożliwiając dostarczanie pełnowymiarowego SpCas9 połączonego z epigenetycznymi efektorami, nadal zachowują możliwość losowej integracji genomowej, co ryzykuje mutagenezę insercyjną i ogranicza ich zastosowania kliniczne16. Z drugiej strony, podejścia niewirusowe, takie jak transfekcja plazmidów, cierpią na słabą retencję w komórkach dzielących się. Metody dostarczania przejściowe lub "hit-and-run" wykluczają możliwość integracji genomowej, ale często nie utrzymują zmian metylacji między podziałami komórkowymi, chyba że są połączone z remodelerami chromatyny lub efektorami kooperacyjnymi 17,18,19.

Aby sprostać tym wyzwaniom, zastosowaliśmy niecałkowity, samoreplikujący się system wektorów episomalnych (pEPI-S/MAR) do dostarczania efektorów epigenetycznych fuzowanych z dCas9. Wektor ten utrzymuje się poza chromosomem w komórkach dzielących się przy niskiej liczbie kopii (~1-2 na komórkę), umożliwiając utrzymującą, ale umiarkowaną ekspresję, aby zminimalizować niepożądane funkcje związane z nadekspresją20,21. Element Obszaru Przyłączenia Szatby/Matrixu (S/MAR) episomu oddziałuje z matrycą jądrową, przyczyniając się do stabilnego utrzymania episomu w jądrze komórek podczas podziału komórki 22,23. Ponadto system wektorów pEPI eliminuje ryzyko związane z integracją wirusów i umożliwia dostarczanie konstrukcji bez przekraczania limitów opakowań.

Najnowsze badania wykazały, że obszary promotorowe oznaczone aktywnymi modyfikacjami histonowymi, szczególnie acetylacją H3K27 (H3K27ac), często są odporne na metylację DNA z inżynierią. Metody kombinatoryczne, które usuwają lub dodają znaki histonowe za pomocą pisarzy lub gumek modyfikacji histonowych, a jednocześnie wprowadzają metylację DNA za pomocą DNMT3A, wykazują zwiększenie stabilności i trwałości represji genów, nawet w podejściach przejściowych19,24. Na podstawie tych wniosków wysunęliśmy hipotezę, że współdostarczanie dCas9-HDAC1 i dCas9-DNMT3A oraz celowanie w sąsiednie obszary genetyczne sprzyja przebudowie chromatyny oraz umożliwia bardziej efektywną i trwałą metylację w docelowych elementach regulacyjnych.

W tym badaniu naszym celem było zaprojektowanie i zbudowanie systemu zdolnego do dostarczania ukierunkowanej i stabilnej metylacji DNA na wyspie CpG 326 ZBTB7A, regionie charakteryzującym się niską endogenną metylacją i nieprawidłowymi znakami H3K27ac w komórkach K562. Celem tego badania było dostarczenie dwóch episomalnych konstrukcji kodujących dCas9, połączonych z każdym z różnych epigenetycznych efektorów, wraz z sgRNA, celujących w region regulacyjny bogaty w CpG położony powyżej genu ZBTB7A , wykorzystując niskoekspresyjny, stabilny, niecałkowany system pEPI. Jak pokazano na Rysunku 1, współtransfekcja komórek K562 z tymi episomami umożliwia podwójną rekrutację kompleksów edycyjnych na interesującą wyspę CpG, gdzie HDAC1 usuwa lokalną acetylację histonów, aby umożliwić późniejszą metylację DNA przez DNMT3A, co skutkuje skoordynowaną i specyficzną dla miejsca modyfikacją epigenetyczną.

System opisany tutaj jest odpowiedni do zastosowań, gdzie dostarczanie wirusa nie jest możliwe ze względu na rozmiar konstrukcji, obawy o bezpieczeństwo lub ograniczenia kosztowe. Obsługuje modułowe klonowanie różnych sgRNA i fuzji efektorów, co pozwala dostosować go do różnych miejsc docelowych. Obecnie najlepiej nadaje się do badań in vitro lub przedklinicznych linii komórkowych tolerujących transfekcję plazmidów i selekcję antybiotyków. W naszej implementacji dostarczanie episomów w komórkach K562 było osiągane przy użyciu odczynników opartych na lipofektaminie i utrzymywane w selekcji G-418.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie sgRNA

  1. Zidentyfikuj pożądane wyspy CpG lub regulacyjne miejsca CpG w regionie promotorowym interesującego genu za pomocą przeglądarki genomu (np. przeglądarki genomu UCSC). Tutaj projekt został zastosowany na wyspie CpG 326 (GRCh38) genu ZBTB7A .
  2. Projektuj pojedyncze RNA przewodnikowe (sgRNA) za pomocą internetowej platformy projektowania sgRNA CRISPR [np. narzędzie CHOPCHOP (wersja 3)]. Projektując sgRNA, należy stosować się do poniższych zaleceń, aby zapewnić wysoką aktywność na celu i minimalne efekty poza celem:
    1. Wybierz białko SpCas9 jako endonukleazę, używając 5'-NGG-3' jako motywu sąsiadującego protospacer na końcu 3' (PAM-3').
    2. Wybierz długość sgRNA na 20 bp (oprócz sekwencji PAM). Pozwól na trafienia poza celem, gdzie w sekwencji protospacer występują tylko trzy niedopasowania.
    3. Wybierając celowanie w konkretny region genu, wybierz opcję 'Promotor' i zdefiniuj zakres upstream (np. od 1500 bp do 3000 bp upstream dla wyspy CpG 326), aby umieścić sgRNA w obszarze regulacyjnym.
    4. Do oceny aktywności sgRNA wykorzystaj wyniki efektywności na cel, takie jak te opracowane przez Doencha i in.25.
  3. Wybierając sgRNA do zastosowań eksperymentalnych, należy uwzględnić następujące kryteria:
    1. Uszereguj wszystkie kandydaty sgRNA według efektywności dla regionu docelowego. Wybierz sgRNA w górnych 10-20% przewidywanej efektywności. Przy wyborze unikaj sgRNA z niedopasowaniami (MM0, MM1, MM2, MM3) w potencjalnie niecelowanych miejscach.
    2. Wybieraj sgRNA, które celują pierwotnie niemetylowane lub słabo metylowane obszary do represji transkrypcyjnej z użyciem dCas9-DNMT. W przypadku represji transkrypcyjnej z użyciem dCas9-HDAC, celuj w obszary silnie acetylowane dla zwiększenia efektywności. Korzystaj z baz danych online (np. ChIP-Atlas), aby potwierdzić metylację DNA i znaki acetylacji histonów w komórkach K562 na docelowych lociach.
    3. Użyj wielu sgRNA, aby pokryć docelowe obszary większe niż 100-200 bp26.
      UWAGA: Modyfikacje epigenetyczne (metylacja i deacetylacja) wpływają na obszary powyżej i poniżej miejsca wiązania sgRNA, a efekty te mogą być ograniczone do krótkich okresów genomowych.
    4. Wybieraj sgRNA o zawartości GC między 40% a 80%.
      UWAGA: Zawartość GC w sgRNA jest ważna, ponieważ wyższa zawartość GC poprawia stabilność RNA i wiązanie dCas.
    5. Unikaj sgRNA zawierających fragmenty czterech lub więcej thymidyn (T) i wybieraj sgRNA z nukleotydami adeniny lub tyminy, znajdujących się cztery zasady powyżej miejsca PAM.
      UWAGA: Cztery lub więcej testosteronów mogą prowadzić do przedwczesnego zakończenia transkrypcji. sgRNA z A lub T zlokalizowanymi cztery bazy powyżej miejsca PAM mogą wykazywać silniejsze wiązanie dCas.
    6. Sprawdzanie i unikanie sgRNA o wysokiej samokomplementarności, aby zminimalizować ryzyko powstawania struktury wtórnej.
    7. Sfinalizuj wybór kilku sekwencji sgRNA.
      UWAGA: Zaprojektowano cztery sgRNA obejmujące wyspę CpG 326. Sekwencje celów sgRNA1-4 oraz pozycje celów na wyspie CpG 326 przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej 1.
  4. Przekształcić wybraną sekwencję sgRNA (z wyłączeniem tripletu PAM) na jej odwrotny dopełnienie. Dodaj GATCG do końca 5' sekwencji forward i G do końca 3', AAAAC do 5' końca sekwencji komplementarnej odwrotnej i C do końca 3'. Zamów dwa ostatnie oligonomyny dla każdego sgRNA od komercyjnego dostawcy oligonosy.

2. Klonowanie

UWAGA: Ta sekcja opisuje dostosowanie plazmidów pEPI-1 do generowania wektorów episomalnych zawierających zarówno fuzję efektora dCas-epigenetycznego, jak i kasety ekspresyjne sgRNA. Zobacz Rysunek 2 , aby uzyskać kompleksowy przegląd workflow klonowania i architektury wektorowej. Wszystkie opisane poniżej reakcje trawienia restrykcyjnego i wiązania zostały przeprowadzone zgodnie z zalecanymi protokołami producenta dla każdego enzymu i odczynnika, a specyfikacje reakcji są szczegółowo opisane w Tabeli Uzupełniającej 2.

  1. Trawić plazmid pEPI-1 za pomocą AgeI i BspEI, które otaczają sekwencję kodującą eGFP (wzmocnione zielone fluorescencyjne białko). Po strawieniu restrykcyjnym stłumić powstałe wyzwisenia za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy DNA I. Swiązać szkielet plazmidów za pomocą ligazy DNA T4, aby wygenerować wektor usunięty eGFP.
    UWAGA: Delecja genu eGFP jest wykonywana w celu zmniejszenia całkowitej wielkości wektora. Większy rozmiar wektora może ograniczać dalsze kroki klonowania i transfekcji.
  2. Uzyskaj sekwencje kodujące dla domeny katalitycznej (CD) genu DNMT3A oraz pełną długość genu HDAC1 . Dodaj kodon stopowy na końcu 3' (w dół przepływu) każdej sekwencji kodującej. Dodaj miejsca ograniczające BglII (5') i AseI (3') flankujące sekwencje.
  3. Digestuj wektor pEPI-1 usunięty przez eGFP za pomocą BglII i AseI. Oddzielnie trawić przygotowane sekwencje kodujące DNMT3A(CD) i HDAC1 tymi samymi enzymami. Wykonaj dwie niezależne reakcje ligacyjne:
    1. Związać fragment DNMT3A(CD) z trawionym wektorem, aby wygenerować konstrukcję pEPI-1-DNMT3A.
    2. Związać fragment HDAC1 z wektorem strawionym, aby wygenerować konstrukcję pEPI-1-HDAC1.
      UWAGA: Miejsca BglII i AseI umieszczają inserty poniżej promotora pCMV i powyżej elementu S/MAR dla optymalnego wyrażenia.
  4. Przekształcić chemicznie kompetentne Escherichia coli (np. NEB 5-alfa Kompetentny E. coli, wysoka sprawność) za pomocą produktów ligacji z każdego wektora osobno. Powłokuj przekształcone komórki na agarze LB zawierającym kanamycynę (50 μg/mL) i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C. Wybieraj pozytywne kolonie i izoluj plazmidowe DNA za pomocą metody szybkiego gotowania miniprep27,28.
  5. Uzyskaj sekwencję kodującą katalistycznie martwy SpCas9 (dCas9). Wprowadź następujące elementy w określonej kolejności:
    1. Na końcu 5': miejsce restrykcyjne AscI, sekwencja konsensusu Kozaka i start kodon (ATG).
    2. Na końcu 3' jest NLS, opcjonalnie HA-tag, a następnie miejsce z ograniczeniami BamHI.
  6. Trawić zarówno wektory pEPI-1-DNMT3A, jak i pEPI-1-HDAC1 za pomocą AscI i BamHI. Wykonaj takie samo trawienie na wkładce dCas9. Sliguj fragment dCas9 z każdym odpowiednim wektorem.
    UWAGA: Stacje AscI/BamHI zapewniają, że dCas9 jest wstawiany przed DNMT3A lub HDAC1, bezpośrednio poniżej promotora pCMV. Upewnij się, że między dCas9 a epigenetycznym efektorem znajduje się krótki łącznik lub kilka nukleotydów, aby utrzymać prawidłową ramę odczytu.
  7. Przekształcić końcowe produkty ligacji w wysokowydajne, kompetentne szczepy E. coli z precyzyjną kontrolą ekspresji plazmidów (np. NEB 5-alfa F'Iq Competent E. coli, wysoka wydajność). Wybierz transformanty na płytkach kanamycyny. Przygotować wysokiej jakości plazmidowe DNA z pozytywnych klonów za pomocą metody szybkiego gotowania miniprep.
  8. Sekwencjonowanie końcowych konstrukcji plazmidów (pEPI-1-dCas9-DNMT3A i pEPI-1-dCas9-HDAC1) za pomocą sekwencjonowania nanoporów, aby potwierdzić prawidłowy montaż wszystkich komponentów, zweryfikować ramkę odczytu za pomocą narzędzia do tłumaczenia online (np. narzędzie Expasy translate 3.0) oraz sprawdzić potencjalne mutacje lub zdarzenia rekombinacji za pomocą narzędzia do wyrównania online (np. narzędzie BLAST alignment tool).
    UWAGA: Duże wektory są bardziej podatne na rekombinację i mogą kumulować mutacje. Dlatego dokładna walidacja sekwencji jest niezbędna.
  9. Fosforyluj grupy hydroksylowe 5' zarówno oligonukleotydów sgRNA przednich, jak i odwrotnych, używając kinazy polinukleotydowej T4. Hybrydyzuj dwie komplementarne nici, podgrzewając mieszaninę do 90 °C przez kilka minut, aby denaturować struktury wtórne, a następnie pozwól stopniowo chłodzić do temperatury pokojowej przez noc, aby całkowicie wyżarzać ją do dwuniciowego DNA.
  10. Straw wybrany wektor ekspresji pGuide sgRNA za pomocą BamHI i Esp3I. Lizać wyżarzany fragment dwuniciowego sgRNA z linearyzowanym wektorem za pomocą ligazy DNA T4.
  11. Za pomocą specyficznych primerów PCR (Tabela Uzupełniająca 3) amplifikuj pełną kasetę ekspresyjną gRNA, składającą się z (1) promotora U6, (2) sklonowanej sekwencji sgRNA oraz (3) rusztowania sgRNA. Użyj polimerazy DNA o wysokiej jakości i wysokiej jakości, która nie generuje 3' wylęgów (czyli polimerazy korekty), aby zapewnić czyste, zakończenia PCR produkty odpowiednie do dalszego klonowania.
  12. Powtórz kroki 2.9-2.11 dla każdego pojedynczego gRNA zaprojektowanego w sekcji 1. Upewnij się, że każda kaseta gRNA jest przygotowana i amplifikowana osobno, aby zachować specyficzność docelową.
  13. Wektory pEPI-1-dCas9-DNMT3A i pEPI-1-dCas9-HDAC1 za pomocą SacII strawione. Stęp lepkie końcówki za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy DNA I. Sklonuj wcześniej amplifikowane kasety promotor-sgRNA U6 do tych wektorów za pomocą ligazy T4.
    UWAGA: W fazie eksperymentalnej skonstruowano kilka kombinacji efektorów gRNA-epigenetycznych (np. sgRNA1-dCas9-DNMT3A, sgRNA2-dCas9-HDAC1 itd.). Jednak tylko dwie wybrane kombinacje zostały wykorzystane w eksperymentach przedstawionych w kolejnych sekcjach.
  14. Przekształcić końcowe produkty ligacji w wysokowydajne, kompetentne szczepy E. coli z precyzyjną kontrolą ekspresji plazmidów. Wybierz transformanty na płytkach kanamycyny. Przygotować wysokiej jakości plazmidowe DNA z pozytywnych klonów za pomocą metody szybkiego gotowania miniprep.
  15. Sekwencjonowanie końcowych konstrukcji plazmidów za pomocą sekwencjonowania nanoporów, weryfikacja ramy odczytu oraz sprawdzanie potencjalnych mutacji lub zdarzeń rekombinacji.

3. Hodowla komórkowa i transfekcja

  1. Utrzymuj komórki K562 w kolbach hodowlanych T-75 w temperaturze 37 °C, przy temperaturze 5%CO2 i wilgotności. Stosuj Zmodyfikowane Medium Eagle (DMEM) firmy Dulbecco z dodatkiem 10% surowicy płodowej bydłej (FBS), 1× roztworu penicyliny/streptomycyny (Pen/Streptokok).
  2. Przygotowanie plazmidów do transfekcji:
    1. Stosuj 8 μg całkowitego DNA plazmidowego na transfekcję, a więc 4 μg każdego plazmidu do współtransfekcji dwóch plazmidów. Ilościowo określ DNA za pomocą absorpcji na 260 nm, a następnie rozcieńcz wymaganą ilość w 90 μL ultraczystej wody.
    2. Dodaj 10 μL roztworu octanu sodu o pojemności 3 M oraz 2,5 objętości 100% etanolu do rozcieńczonego DNA.
    3. Dokładnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze -20 °C przez noc, aby wytrącić DNA.
      UWAGA: Podczas współtransfekcji dwóch plazmidów z różnymi kombinacjami efektorów gRNA-epigenetycznych (np. gRNA1-dCas9-DNMT3A i gRNA2-dCas9-HDAC1) zaleca się łączenie obu plazmidów w tej samej probówce wydzielającej, aby ułatwić obsługę podczas dalszych procedur.
    4. Następnego dnia wiruj rurki do wydzielania DNA w temperaturze 11 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Wszystkie kolejne etapy wykonuj w warunkach sterylnych w szafie bezpieczeństwa biologicznego, ponieważ ten etap obejmuje także obsługę żywych komórek.
    5. Ostrożnie wyrzuć supernatant. Dodaj 500 μL etanolu 70% do przemycia pelletu. Wirówka w 11 000 × g przez 5 minut w 4 °C.
    6. Całkowicie usuń supernatant etanolu. Pozwól granulatowi wyschnąć na powietrzu, aż nie pozostanie żaden widoczny etanol.
    7. Dokładnie ponownie zawiesz wysuszony pellet DNA w 50 μL DMEM. Utrzymuj roztwór plazmid-DMEM w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
    8. Przeprowadź 400 ng przygotowanego episomalnego DNA (około 2,5 μL roztworu zawieszonego na nowo) na żelu agarozowym o stężeniu 1%, aby potwierdzić skuteczność oczyszczania i integralności DNA przed transfekcją.
  3. Przygotuj komórki:
    1. Pobieraj komórki K562 z kolby T-75, gdy hodowle osiągną 50-60% konfluencji, aby zapewnić efektywność transfekcji.
    2. Liczyć komórki za pomocą hemocytometru. Przenieś objętość zawierającą 2 × 105 komórek do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm zawierającego 900 μL DMEM bez FBS lub antybiotyków.
      UWAGA: Na wszystkich etapach procedury transfekcji stosuj bezsurowicowy DMEM. Pełne warunki hodowli podłoża wznowi dopiero po zakończeniu okresu inkubacji transfekcji.
    3. Umieść naczynie w inkubatorze (37 °C, 5%CO2), aby komórki były gotowe do transfekcji.
  4. Do dostarczania plazmidów używaj zestawu transfekcyjnego na bazie lipofektaminy. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi konkretnego zestawu, dostosowując głośność w razie potrzeby.
    1. Dodaj 3 μL odczynnika P3000 (dostarczonego w zestawie transfekcyjnym) do przygotowanego roztworu plazmid-DMEM. Delikatnie wymieszaj i inkubuj mieszankę odczynników plazmid-P3000 w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    2. Dodaj 5 μL odczynnika Lipofektamin 3000 (dołączonego w zestawie transfekcyjnym) wraz z wystarczającą ilością DMEM, aby osiągnąć całkowitą objętość reakcji 100 μL. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    3. Dodaj pełną mieszaninę transfekcyjną 100 μL do naczynia zawierającego komórki o średnicy 35 mm. Delikatnie potrząśnij talerzem, aby rozprowadzić mieszankę, a następnie wróć miskę do inkubatora.
  5. Po 24 godzinach po transfekcji należy dodać 3 mL pełnego medium (DMEM uzupełnionego o 10% FBS i 1× Pen/Strep) do każdej 35-milimetrowej miseczki, aby zainicjować proliferację transfekowanych komórek. Po 72 godzinach po transfekcji rozpocznij procedurę selekcji, dodając antybiotyk G-418 do końcowego stężenia 1 mg/mL.
  6. Gdy selekcja zostanie odpowiednio ustalona, a całkowita liczba komórek przekroczy 1 × 106, przystąpić do izolacji pojedynczych klonów (Rysunek 3A) za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS):
    1. Komórki pobierz przez wirowanie w 300 × g przez 6 minut w 25 °C. Raz przemyj 1× sterylną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS, pH ~7,4) i ponownie wiruj w tych samych warunkach.
    2. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w 1× PBS i określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru. Rozcieńcz zawieszenie do 1× 106 komórek /mL, zapewniając dokładną rezabiesinę.
    3. Ustaw FCS skrócony do trybu pojedynczej komórki (zapewnia 1 komórkę na kroplę), używając płytki z 96-dołkami do posiewu tkanek jako urządzenia do pobierania. W razie potrzeby dostosuj ustawienia oprogramowania, w zależności od używanego instrumentu (rysunek 3B).
    4. Brama populacji głównej na podstawie przewidywanej wielkości (FSC) i szczegółowości (SSC). Wyklucz zanieczyszczenia (niskie FSC/SSC) oraz bardzo ziarnisty lub martwy materiał (wysoki poziom SSC). Do bramowania singletów używaj wykresów kropkowych FSC-A vs. FSC-H lub FSC-H vs. FSC-H.
    5. Wstępnie napełni płytę z 96 dołkami 100 μL pełnego medium zawierającego 1 mg/mL G-418 na odwór. Podgrzej talerz w inkubatorze przed sortowaniem.
    6. Sortowanie wykonuj w trybie pojedynczej komórki, utrzymując szybkość sortowania poniżej 300 zdarzeń na sekundę, aby zwiększyć dokładność sortowania.
    7. Po sortowaniu obejrzyj doły pod mikroskopem, aby potwierdzić obecność jednej komórki na dołek. Włóż talerz do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5%CO2.
  7. Pozwól klonom pojedynczych komórek na indywidualne rozszerzanie się w płycie 96-dołkowej. Po ustaleniu wzrostu klonalnego zmniejsz stężenie G-418 do 400 μg/mL, aby utrzymać selekcję.
  8. Kolejno przenosi dobrze rosnące klony na płytki z 12 dołkami, następnie do kolb T-25, a na końcu T-75 w razie potrzeby, aż każdy klon osiągnie ~1 × 106 komórek .
  9. Zbieraj granulki dwukomórkowe w regularnych odstępach. Przechowuj pellet w temperaturze -20 °C w celu ekstrakcji genomowej DNA. Dodatkowo przechowywać granulkę ujednoliconą w 500 μL odczynnika Trizol w temperaturze -20 °C do ekstrakcji RNA i syntezy cDNA.
    UWAGA: Odczynnik Trizol należy obchodzić się ostrożnie ze względu na jego toksyczność i korozję w okapie chemicznym podczas noszenia środków ochrony osobistej, a zanieczyszczone materiały muszą być oznaczone do utylizacji odpadów niebezpiecznych.
  10. Ekstrakcja genomowego DNA z wybranych klonów za pomocą tradycyjnej ekstrakcji fenol-chloroformowej, a następnie wytrącenia etanolem.
    UWAGA: Fenol:chloroform jest toksyczny i i należy go obchodzić w okapu chemicznym podczas noszenia środków ochrony osobistej. Odpady zawierające fenol i chloroform utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.
  11. Upewnij się, że DNA jest całkowicie zawieszone w wodzie wolnej od nukleazy lub buforze TE. Zmierz stężenie i czystość DNA za pomocą spektrofotometru przed przystąpieniem do dalszych zastosowań.
    UWAGA: To DNA będzie wykorzystywane w eksperymentach dalszych, takich jak PCR i pirosekwencjonowanie, aby ocenić efektywność edycji epigenetycznej.
  12. Ekstrahować całkowite RNA z pelletów komórkowych za pomocą odczynnika Trizol, a następnie wytrącać izopropanol29. Ostrożnie obchodzić się z próbkami RNA, dbając o odczynniki wolne od RNazy i jednorazowe materiały oraz utrzymując próbki w temperaturze 4 °C podczas zabiegu.
    UWAGA: Całkowite RNA będzie wykorzystywane do syntezy cDNA przy użyciu zestawu do transkrypcji odwrotnej.

4. PCR w celu potwierdzenia obecności obu episomów w klonach

  1. Z każdego klona hodowli należy pobrać około 5 ×10 5 komórek po dokładnym ponownym zawieszeniu komórek. Wirować w 7 000 x g przez 3 minuty w 25 °C. Wyrzuć medium supernatantowe.
  2. Umyj komórkę, ponownie zawieszając ją w 1× PBS. Ponownie wiruj w tych samych warunkach.
  3. Usuń supernatant, pozostawiając niewielką objętość tuż powyżej poziomu granulek. Użyj 1 μL zawiesiny ogniwowej bezpośrednio jako szablonu do PCR.
  4. Alternatywnie, można użyć 200 ng oczyszczonego DNA genomowego wyekstrahowanego z transfekowanych klonów.
    UWAGA: Bezpośrednie PCR z wypłukanych komórek zapewnia szybką metodę przesiewania, ale może dawać różne wyniki. Dla większej swoistości i czułości użyj oczyszczonego DNA genomowego jako szablonu.
  5. Przygotuj mieszankę PCR zgodnie z Tabelą 1.
  6. Używaj dwóch zestawów starterów, z jednym wspólnym starterem wyprzedzonym skierowanym na sekwencję dCas9 oraz oddzielnymi odwrotnymi primerami specyficznymi dla każdego epigenetycznego wektora efektora (Tabela Uzupełniająca 3).
  7. Stosuj się do warunków rowerowych przedstawionych w Tabeli 2.
  8. Wykonaj produkty PCR na żelu agarozowym lub przeanalizuj za pomocą kapilarnej elektroforezy w celu weryfikacji rozmiarów produktu: 230 bp dla wektora zawierającego DNMT3A i 205 bp dla wektora zawierającego HDAC1 (Rysunek 3C). Uwzględnić dodatnią kontrolę (mieszankę obu plazmidów w stężeniu 10-20 ng) w celu potwierdzenia oczekiwanych rozmiarów pasm i zweryfikowania efektywności PCR. Dołącz system bez szablonu (NTC).
OdczynnikOstateczne stężenie/ilość
10× Bufor1×
Przedni zapłon1 μΜ
Zapalniki odwrócone0,5 μM
DNA200 ng
Polimeraza1.25 U
dNTP200 μM każdy
Woda, wolna od nukleazydo 50 μL

Tabela 1: mieszanka reakcji PCR do weryfikacji episomów.

KrokTemperatura, °CGodzinaLiczba cykli
Początkowa denaturacja953 min1
Denaturacja95Lata 3030
Wyżarzanie58Lata 30
Rozszerzenie721 min
Ostateczne przedłużenie725 min1

Tabela 2: Warunki cykliczne PCR do weryfikacji episomów.

5. Analiza ukierunkowanego pirosesekwencjonowania

  1. Traktuj gDNA (1,5 μg) wyekstrahowanego z transfekowanych klonów zestawem konwersyjnym bisulfitowym zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Primery projektowe flankujące stanowiska CpG w obszarze regulacyjnym objętym konstrukcjami. Użyj dedykowanego narzędzia do projektowania podkładów bisulfite. Postępuj zgodnie z tymi wytycznymi projektowymi:
    1. Przekształcić wyspę CpG lub obszar regulacyjny CpG na wersję przekształconą w dwusiarczyn.
    2. Zaprojektuj zapalnik do przodu i tyłu do amplifikacji PCR DNA przekształconego w bisulfity. Na jednym podkładzie (zwykle odwrotnie) należy umieścić etykietę biotyny do unieruchomienia na kulkach pokrytych streptawidyną.
    3. Zaprojektuj primer sekwencjonujący (18-25 bp) wewnętrzny dla produktu PCR, umieszczony przed pierwszym interesującym CpG. Jako region docelowy wybierz okno 100 bp powyżej lub poniżej miejsca wiązania sgRNA, aby ocenić potencjalne lokalne modyfikacje epigenetyczne.
    4. Unikaj miejsc CpG w sekwencjach starterów, aby zapewnić bezstronne wzmocnienie.
    5. Wybierz parę primerów z oceną Assay Design powyżej 75% oraz oceną jakości 'wysoka' (niebieska), co oznacza, że analiza oprogramowania nie wykazała żadnych problemów ani wątpliwości.
      UWAGA: W przypadku sekwencji zapalników zaprojektowanych do celowania w wyspę CpG 326, zapoznaj się z Tabelą Uzupełniającą 3. Startery zostały zaprojektowane tak, aby wiązać się w obszarach przylegających do miejsc wiązania sgRNA1 i sgRNA2, umożliwiając sekwencjonowanie miejsc CpG otaczających docelowe lokusy.
  3. Uruchom reakcję PCR z wysoko-wierną polimerazą DNA hot-start, zoptymalizowaną pod kątem matryc bisulfitowych.
  4. Procedura pirosesekwencjonowania:
    1. Związać biotynowo wykonane produkty PCR z paciorkami sepharozowymi pokrytymi streptawidyną i izolować jednoniciowe DNA za pomocą stacji roboczej do pirosesekwencjonowania.
    2. Dodaj primer sekwencjonujący do jednoniciowego DNA w buforze wyżarzającym. Podgrzej mieszankę do 80 °C przez 2 minuty, a następnie pozwól stopniowo ostygnąć do temperatury pokojowej.
    3. Przeprowadz reakcje sekwencjonowania za pomocą instrumentu pirosesekwencjonującego oraz kolejności dozy zdefiniowanej podczas projektowania zapalnika.
  5. Analiza danych:
    1. Użyj dedykowanego oprogramowania do pirosesekwencjonowania do ilościowego określenia procentowej metylacji w każdym miejscu CpG.
    2. Porównaj poziomy metylacji między transfekcowanymi a nietransfekowanymi klonami. Oceń efektywność edycji (Rysunek 3D). Rozważ wykonanie dwustronnego niesparowanego testu T, aby porównać poziomy metylacji między nieleczonymi kontrolami a każdym transfekowanym klonem w każdym pojedynczym miejscu CpG.

6. synteza cDNA i cyfrowa analiza PCR do analizy ekspresji dCas

  1. Przygotuj całkowite RNA (1 100 ng na reakcję) wyekstrahowane z transfekowanych klonów w 12 μL wody wolnej od RNazy. Trzymaj próbki na lodzie.
  2. Złóż mieszankę eliminacyjną DNA genomowej na lodzie: zmieszaj 2 μL buforu gDNA wipeout, próbkę RNA zawierającą 1 100 ng całkowitego RNA oraz wodę wolną od RNazy do końcowej objętości 14 μL. Inkubuj przez 2 minuty w 42 °C, następnie umieść w lodzie.
  3. Przygotuj miks master do transkrypcji odwrotnej na lodzie: wymieszaj 4 μL buforu RT z 1 μL starterów RT i dodaj 1 μL transkryptozy odwrotnej.
  4. Połącz 14 μL mieszanki eliminacyjnej DNA genomowej z 6 μL mieszanki głównej transkrypcji odwrotnej, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 20 μL. Delikatnie mieszać i inkubować w 42 °C przez 15 minut. Inaktywuj transkryptozawę odwrotną przez podgrzewanie w 95 °C przez 3 minuty.
    UWAGA: Przechowuj cDNA w temperaturze -20 °C do dalszego użycia.
  5. Rozcieńcz cDNA ze wszystkich próbek w proporcji 1:1 wodą wolną od nukleazy. Wykorzystaj rozcieńczone cDNA do dalszej analizy cyfrowej PCR, używając cyfrowego systemu PCR z primerami specyficznymi dla dCas (Tabela Uzupełniająca 3):
    1. Przygotuj miks 4× Master i Reaction zgodnie z Tabelą 3. Dodaj rozcieńczone cDNA do mieszanki i delikatnie pipetuj, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
      UWAGA: Ustaw reakcje przynajmniej w duplikatach dla wszystkich klonów. Uwzględnij negatywną kontrolę (cDNA z nieleczonych komórek K562) oraz NTC.
    2. Załaduj 9 μL mieszanki reakcyjnej do każdej jamki płyty PCR. Skonfiguruj system PCR z wykorzystaniem warunków cyklicznych przedstawionych w Tabeli 4.
    3. Wybierz kanał barwnika FAM do wykrywania i rozpocznij rozgrywkę.
    4. Po zakończeniu pobierania próbek i analizowania danych.
      UWAGA: Cyfrowe PCR raportuje wyniki jako kopie na μL reakcji.
    5. Pomnóż podaną wartość (kopie/μL) przez objętość reakcji (10 μL), aby uzyskać łączną liczbę kopii na reakcję. Podziel tę wartość przez ilość cDNA w reakcji, aby uzyskać kopie na ng cDNA (równoważne wejściu ng RNA).
      UWAGA: Jeśli stosuje się dokładny protokół, każda próbka zaczyna się od 1 100 ng RNA w reakcji RT 20 μL (55 ng/μL). Po rozcieńczeniu 1:1 stężenie robocze wynosi 27,5 ng/μL, a ponieważ do każdej reakcji PCR dodaje się 1 μL, odpowiada to 27,5 ng cDNA (równoważnika RNA) na reakcję.
Master mix (4×)
OdczynnikOstateczne stężenie/ilość
25× SYBR Zielony barwnik2×
5× Cyfrowa mieszanka PCR4×
Woda, wolna od nukleazydo 100 μL
Mieszanka reakcji
OdczynnikOstateczne stężenie/ilość
4× Master mix1×
Przedni zapłon1 μΜ
Odwrócony zapalnik1 μΜ
cDNA (rozcieńczone)1 μL
Woda, wolna od nukleazydo 10 μL

Tabela 3: 4× Mieszanka główna i reakcyjna mieszanka do cyfrowej analizy PCR ekspresji dCas.

KrokTemperatura, °CGodzinaLiczba cykli
Początkowa denaturacja9610 min1
Denaturacja965 s40
Wyżarzanie/Przedłużenie6015 s

Tabela 4: Warunki cykliczne dla cyfrowego PCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać, czy nasze ukierunkowane narzędzia do edycji epigenetycznej mogą indukować zmiany metylacji DNA specyficzne dla konkretnego miejsca na wyspie ZBTB7A CpG 326, najpierw wygenerowaliśmy wektory episomalne kodujące dCas9 zfuzowane z DNMT3A(CD) lub HDAC1, wraz z różnymi sgRNA zaprojektowanymi z miejscami docelowymi na wyspie CpG 326. Początkowo współtransfekowaliśmy komórki K562 za pomocą kombinacji tych plazmidów, aby ocenić, czy jednoczesne dostarczanie modułów sgRNA i efektorów może prowadzić do powtarz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z najważniejszych etapów tego protokołu jest projektowanie wysoce specyficznych sgRNA. Efekty poza celem są znanym ograniczeniem systemów edycji epigenetycznych opartych na CRISPR, które często wynikają z niewierności wiązania dCas9 oraz niespecyficznej aktywności domen efektorowych. Aby to zminimalizować, sgRNA muszą być projektowane z wykorzystaniem narzędzi bioinformatycznych, które optymalizują wysoką aktywność na celu i minimalne wiązanie poza celem30. Zaleca się stosowanie narzędzi pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurujących interesów finansowych ani niefinansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Irene Dereki i Vasiliki Chondrou są wspierane przez trzyletnie stypendium (Grant nr 80706) ze Specjalnego Konta Funduszy Badawczych (ELKE) Hellenic Open University.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Absolute Q DNA Digital PCR Master Mix (5x)Biosystemy stosowaneA52490
Wiek I-HF NEBR3552
AscINEBR0558
ASEINEBR0526
BamHI-HFNEBR3136
Sorter komórek melodyjnych BD FACSBD
BglllNEBR0144
BspEINEBR0540
Mieszanka roztworu deoksynukleotydu (dNTP) (po 10 mM każda)NEBN0447
DMEM Wysoka glukoza ze stabilną glutaminą, z medium pirorosrowęglanu soduBiowestL0103
Polimeraza DNA I, duży fragment (Klenowa)NEBM0210
DNMT3A (CD), sekwencje HDAC1IDT
DreamTaq polimeraza DNA Thermo ScientificEP0712
EpiTectQiagen59104Zestaw do konwersji bisulfitowej  
Zestaw Bisulfite EpitectQiagen59104
Esp3INEBR0734
Serum bydlęce płodoweGibcoA5256701
Selektywny antybiotyk genetycyny (siarczan G418)Gibco11811031
Zestaw transfekcyjny lipofektaminy 3000InvitrogenL3000015
NEB®   5-alfa Competent E. coli  (Wysoka wydajność)NEBC2987I
NEB®   5-alfa F'Iq  Kompetentne E. coli  (Wysoka wydajność)NEBC2992H
Tkanka nukleospinowa Macherey-Nagel740952.50
PBS, 10x roztwór, pH 7,4LonzaBE17-517Q
Roztwór penicyliny-streptomycyny 100xBiowestL0022
wektor pGuideOriGene TechnologiesGE100042
Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy 25:24:1 Nasycony 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTASigma-AldrichP2069
Primery, sgRNA Eurofiny
PyroMark Assay Design QiagenWersja 2.0Narzędzie do projektowania podkładów bisulfitowych 
Odczynniki PyroMark Gold Q24Qiagen970802
Zestaw PCR PyroMark Qiagen978703
PyroMark Q24 MDxQiagenStanowisko robocze do pyrosequencingu 
PyroMark Q24 Software Qiagenv2.0.8Oprogramowanie do pirosesekwencjonowania 
Q5® Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNEBM0491
Zestaw do odwrotnej transkrypcji QuantiTectQiagen205311
Zestaw płyt QuantStudio Absolute Q MAP16Biosystemy stosowaneA52865System cyfrowy PCR  
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain, 10 000x koncentrat w DMSOInvitrogenS7563
Ligaza DNA T4NEBM0202
Polinukleotydowa kinaza T4NEBM0201
Odczynnik TRIzolInvitrogen15596026

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Firdaus, Z., Li, X. Epigenetic explorations of neurological disorders, the identification methods, and therapeutic avenues. Int J Mol Sci. 25 (21), 11658(2024).
  2. Yu, X., et al. Cancer epigenetics: from laboratory studies and clinical trials to precision medicine. Cell Death Discov. 10 (1), 1-12 (2024).
  3. Wang, S. E., Jiang, Y. -H. Novel epigenetic molecular therapies for imprinting disorders. Mol Psychiatry. 28 (8), 3182-3193 (2023).
  4. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  5. Ptak, C., Petronis, A. Epigenetics and complex disease: from etiology to new therapeutics. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 48 (1), 257-276 (2008).
  6. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Res. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  7. Sapozhnikov, D. M., Szyf, M. Unraveling the functional role of DNA demethylation at specific promoters by targeted steric blockage of DNA methyltransferase with CRISPR/dCas9. Nat Commun. 12 (1), 5711(2021).
  8. Kwon, D. Y., Zhao, Y. -T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nat Commun. 8 (1), 15315(2017).
  9. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5615-5628 (2016).
  10. Giehrl-Schwab, J., et al. Parkinson's disease motor symptoms rescue by CRISPRa-reprogramming astrocytes into GABAergic neurons. EMBO Mol Med. 14 (5), e14797(2022).
  11. Moreno, A. M., et al. In situ gene therapy via AAV-CRISPR-Cas9-mediated targeted gene regulation. Mol Ther. 28 (8), 1931(2020).
  12. Sokka, J., et al. CRISPR activation enables high-fidelity reprogramming into human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 17 (2), 413-426 (2022).
  13. Galonska, C., et al. Genome-wide tracking of dCas9-methyltransferase footprints. Nat Commun. 9 (1), 1-9 (2018).
  14. Lin, L., et al. Genome-wide determination of on-target and off-target characteristics for RNA-guided DNA methylation by dCas9 methyltransferases. GigaScience. 7 (3), 1-19 (2018).
  15. Kennedy, M. E., Cullen, R. B. Bacterial CRISPR/Cas DNA endonucleases: a revolutionary technology that could dramatically impact viral research and treatment. Virology. 479 - 480, 213-220 (2015).
  16. Rothe, M., Modlich, U., Schambach, A. Biosafety challenges for use of lentiviral vectors in gene therapy. Curr Gene Ther. 13 (6), 453-468 (2013).
  17. Cappelluti, M. A., et al. Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing. Nature. 627 (8003), 416-423 (2024).
  18. Hanzawa, N., et al. Targeted DNA demethylation of the Fgf21 promoter by CRISPR/dCas9-mediated epigenome editing. Sci Rep. 10 (1), 1-14 (2020).
  19. O'Geen, H., Tomkova, M., Combs, J. A., Tilley, E. K., Segal, D. J. Determinants of heritable gene silencing for KRAB-dCas9 + DNMT3 and Ezh2-dCas9 + DNMT3 hit-and-run epigenome editing. Nucleic Acids Res. 50 (6), 3239-3253 (2022).
  20. Sgourou, A., Routledge, S., Spathas, D., Athanassiadou, A., Antoniou, M. N. Physiological levels of HBB transgene expression from S/MAR element-based replicating episomal vectors. J Biotechnol. 143 (2), 85-94 (2009).
  21. Lazaris, V. M., et al. Non-viral episomal vector mediates efficient gene transfer of the β-globin gene into K562 and human haematopoietic progenitor cells. Genes. 14 (9), 1774(2023).
  22. Mulia, G. E., Picanço-Castro, V., Stavrou, E. F., Athanassiadou, A., Figueiredo, M. L. Advances in the development and the applications of nonviral, episomal vectors for gene therapy. Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1076-1095 (2021).
  23. Piechaczek, C., Fetzer, C., Baiker, A., Bode, J., Lipps, H. J. A vector based on the SV40 origin of replication and chromosomal S/MARs replicates episomally in CHO cells. Nucleic Acids Res. 27 (2), 426-428 (1999).
  24. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503-2519.e17 (2021).
  25. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  26. Brezgin, S., Kostyusheva, A., Kostyushev, D., Chulanov, V. Dead Cas systems: types, principles, and applications. Int J Mol Sci. 20 (23), 6041(2019).
  27. Holmes, D. S., Quigley, M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. Anal Biochem. 114 (1), 193-197 (1981).
  28. Harwood, A. J. The rapid boiling method for small-scale preparation of plasmid DNA. Methods Mol Biol. 58, 265-367 (1996).
  29. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), (2010).
  30. Labuhn, M., et al. Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications. Nucleic Acids Res. 46 (3), 1375-1385 (2018).
  31. Hofacker, D., et al. Engineering of effector domains for targeted DNA methylation with reduced off-target effects. Int J Mol Sci. 21 (2), 502(2020).
  32. Yang, Q., et al. EpiCas-DL: predicting sgRNA activity for CRISPR-mediated epigenome editing by deep learning. Comput Struct Biotechnol J. 21, 202-211 (2023).
  33. Mu, W., et al. Machine learning methods for predicting guide RNA effects in CRISPR epigenome editing experiments. bioRxiv. , (2024).
  34. Batra, S. S., et al. Predicting the effect of CRISPR-Cas9-based epigenome editing. bioRxiv. , (2025).
  35. Stavrou, E. F., et al. Episomal vectors based on S/MAR and the β-globin replicator, encoding a synthetic transcriptional activator, mediate efficient γ-globin activation in haematopoietic cells. Sci Rep. 9 (1), 19765(2019).
  36. Stavrou, E. F., et al. The β-globin replicator greatly enhances the potential of S/MAR based episomal vectors for gene transfer into human haematopoietic progenitor cells. Sci Rep. 7 (1), 40673(2017).
  37. Hagedorn, C., Antoniou, M. N., Lipps, H. J. Genomic cis-acting sequences improve expression and establishment of a nonviral vector. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (8), e118(2013).
  38. Stehle, I. M., Rupprecht, S., Cremer, T., Jackson, D. A., Lipps, H. J. Establishment and mitotic stability of an extra-chromosomal mammalian replicon. BMC Cell Biol. 8, 33(2007).
  39. Lufino, M. M. P., Manservigi, R., Wade-Martins, R. An S/MAR-based infectious episomal genomic DNA expression vector provides long-term regulated functional complementation of LDLR deficiency. Nucleic Acids Res. 35 (15), e98(2007).
  40. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  41. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).
  42. Ewaisha, R., Anderson, K. S. Immunogenicity of CRISPR therapeutics-critical considerations for clinical translation. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1138596(2023).
  43. Raghavan, R., et al. Rational engineering of minimally immunogenic nucleases for gene therapy. Nat Commun. 16 (1), 105(2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

dCas9 HDAC1wektory episomalnemetylacja celowanaepigenetyka CRISPRcytometria przep ywowaregulacja gen w

Powiązane artykuły