Artykuł metodologiczny

Izolacja protoplastów wysokiej jakości specyficznych dla tkanek do analiz pojedynczych komórek w Arabidopsis

DOI:

10.3791/69330

⸱

6 lutego 2026

 ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie przedstawia rozszerzony protoplast izolujący tkanki korzeni, liści, łodygi i kwiatów Arabidopsis thaliana. Wykorzystuje zoptymalizowane etapy trawienia i oczyszczania enzymów, aby zminimalizować uszkodzenia komórek i zanieczyszczenia, zwiększając wydajność i uzyskując wysokiej jakości protoplasty do metod jednokomórkowych, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie pojedynczokomórkowego RNA (scRNAseq) stało się kluczowym narzędziem w biologii roślin do pozyskiwania wysokorozdzielczych informacji o ekspresji genów specyficznych dla typu komórek, dynamice rozwoju oraz tkankowych odpowiedziach na czynniki środowiskowe. Głównym wyzwaniem technicznym przy stosowaniu scRNAseq do roślin jest efektywna i powtarzalna izolacja żywotnych pojedynczych komórek bez ścian komórkowych, co odzwierciedla heterogeniczność tkanek roślinnych. Izolacja protoplastu, polegająca na enzymatycznym usuwaniu ściany komórkowej, aby uzyskać pojedyncze, żywe komórki roślinne, jest szeroko stosowanym rozwiązaniem do tego celu. Jednak skuteczna izolacja protoplastu wymaga starannej optymalizacji, aby utrzymać żywotność komórek i zachować profile transkryptomu specyficzne dla typu komórki. Przedstawiamy tutaj solidny i powtarzalny protoprotofiks izolujący wysokiej jakości protoplasty z wielu tkanek Arabidopsis thaliana , w tym powierzchniowych (liście, łodygi, kwiaty) oraz tkanek korzeniowych. Protokół ten uwzględnia unikalne właściwości fizjologiczne typów tkanek, optymalizując warunki trawienia enzymatycznego i etapy oczyszczania, aby zapewnić wysoką wydajność i szeroką reprezentację różnorodnych typów komórek. Powstałe protoplasty nadają się do zastosowań takich jak scRNAseq, cytometria przepływowa (FACS) oraz analiza ekspresji genów przejściowych. Umożliwia generowanie zawiesin jednokomórkowych z różnych typów tkanek. Przedstawiona metoda wspiera badania heterogeniczności komórkowej i zwiększa wiarygodność podejść jednokomórkowych w badaniach roślin.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNAseq) zrewolucjonizowało biologię roślin, umożliwiając analizę ekspresji genów z niespotykaną dotąd rozdzielczością. scRNAseq dostarcza informacji transkryptomowych o heterogeniczności komórek, trajektoriach rozwojowych oraz reakcjach na bodźce środowiskowe z rozdzielczością specyficzną dla typu komórki 1,2,3.

W przeciwieństwie do systemów zwierzęcych, sztywna ściana komórkowa roślin oraz złożoność strukturalna tkanek roślinnych stanowią istotne bariery dla efektywnej izolacji pojedynczych komórek do analizy transkryptomicznej. Wśród dostępnych metod szeroko stosowaną metodą jest enzymatyczne usuwanie ściany komórkowej w celu produkcji protoplastów, opracowaną ponad 60 lat temu 4,5,6. Pomimo szerokiego zastosowania, izolacja protoplastów pozostaje technicznie wymagającą procedurą, wymagającą optymalizacji tkankowej w celu zrównoważenia wydajności komórek, żywotności i stabilności transkryptomu. Alternatywne metody, takie jak sekwencjonowanie RNA pojedynczego jądra (snRNA-seq), unikają potrzeby trawienia ściany komórkowej poprzez izolację jąder7. Jednak odbywa się to kosztem utraty informacji o dojrzałych transkrypcjach obecnych w cytoplazmie. Inne metody fizycznej dysocjacji, takie jak mikrosekcja mechaniczna i wspomagana laserowo, unikają trawienia ściany komórkowej enzymatyczne, ale często są podatne na zanieczyszczenia krzyżowe i mogą prowadzić do niższej żywotności komórek oraz ograniczonej przepustowości 8,9,10.

W ostatnich latach opracowano wiele atlasów komórek roślinnych, szczególnie dla Arabidopsis, dostarczających istotnych informacji o krajobrazach transkryptomicznych różnych tkanek 2,11,12,13,14,15,16,17,18 . Jednak atlasy te opierają się głównie na roślinach w stadium młodocianym lub siewkowym, koncentrując się głównie na tkankach korzeniowych lub liściowych. Protokoły stosowane w tych badaniach wymagają optymalizacji dla starszych tkanek Arabidopsis, takich jak dojrzałe liście, kwiaty i łodygi. Dodatkowo, aż do zastosowania badań sekwencjonowania specyficznych dla typu komórek, takich jak scRNAseq czy Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS), połączonych z sekwencjonowaniem RNA, zmiany transkryptomu spowodowane izolacją protoplastów nie były w pełni uwzględniane.

Przedstawiona tutaj metoda opiera się na wcześniejszych próbach, wprowadzając kilka kluczowych ulepszeń: uwzględnia zmienność fizjologiczną i anatomiczną w tkankach roślinnych poprzez optymalizację stężenia buforów zarówno dla tkanek korzeniowych, jak i nadziemnych (liści, łodygi, kwiaty) oraz wprowadza delikatne kroki oczyszczania, aby zminimalizować uszkodzenia komórkowe i poprawić czystość protoplastów. W porównaniu z podejściami opartymi na jądrach, metoda ta ma potencjał do zatrzymywania transkryptomu całej komórki, umożliwiając uzyskanie informacji o wyższej rozdzielczości dojrzałych cząsteczek mRNA obecnych w cytosolu. Co ważne, procedura ta zapewnia wysoką żywotność protoplastów, heterogeniczność oraz powtarzalne stężenia w tkankach, od około 9,8 × 103 komórek /mg w kwiatach do 2,2 × 102 komórek /mg w liściach.

Głównym celem przedstawionej metody jest przedstawienie solidnego i powtarzalnego protokołu izolacji protoplastów dostosowanego do wielu tkanek Arabidopsis thaliana, odpowiadając na krytyczną potrzebę wysokiej jakości danych obejmujących różnorodne typy komórek dla badań pojedynczych komórek roślin.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie bufora

  1. Przygotuj odpowiedni bufor izolacyjny protoplastu17,18 zgodnie z Tabelą 1 w probówce wirówki o pojemności 15 mL; Bufor izolacyjny protoplastu korzeniowego dla tkanki korzeniowej lub bufor izolacyjny protoplastów kwiatów/łodygi/liści dla tkanek nadziemnych.
    UWAGA: Przybliżona ilość buforu izolacyjnego protoplastu wymagana dla pięciu zebranych roślin kwiatowych Arabidopsis thaliana (stadium 11-12 z zamkniętymi pąkami): Korzeń (~ 375 mg): 7 mL, liść (~930 mg): 5 mL, łodyga (~215 mg): 3 mL, kwiat (~10 mg): 2 mL.
  2. Dodaj 2% (w/v) celulazy RS i 1% (w/v) Macerozyme R10 na świeżo przed użyciem buforu izolującego korzenie/liście. Dobrze wymieszaj, umieszczając bufor izolujący protoplast na rotatorze, aż proszek całkowicie się rozpuści (około 10 minut w 25 °C). Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza i upewnij się, że w buforze nie pozostały żadne grudki proszku.

2. Trawienie tkanek

  1. Przed użyciem przefiltruj odpowiedni bufor izolacyjny protoplastu przez filtr 0,2 μm. Użyj standardowej szalki Petriego (100 mm x 15 mm) do liści i korzeni, a małej szalki Petriego (30 mm x 15 mm) do niewielkich ilości tkanek, takich jak kwiaty. Dodaj kilka kropli buforu izolacyjnego protoplastu do szalki Petriego przed przeniesieniem tkanek.
  2. Przenieś odpowiednie tkanki do szalki Petriego i pokroić je na mniejsze kawałki pionowymi pociągnięciami żyletką tak drobno i szybko, jak to możliwe (Rysunek 1A).
    UWAGA: Zawsze używaj różnych ostrzy i pęsety do każdej próbki, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Noszę rękawice ochronne podczas obsługi żyletki.
  3. Dodaj pozostałą izolację protoplastu do odpowiedniej szalki Petriego, aby zanurzyć pokrojoną tkankę i inkubuj w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę. Tkanki nadziemne trzymaj na stole (bez drgania) i przenieś tkanki korzeniowe na platformę wstrząsową oczodołu (60 obr./min).

3. Filtracja

  1. Próbka korzenia po inkubacji:
    1. Za pomocą pipety Pasteura przenieś protoplasty z szalki Petriego do sito komórkowego o pojemności 40 μm, umieszczone na wstępnie schłodzonej, otwartej rurce wirówki o pojemności 50 mL.
    2. Aby pozyskać pozostałe protoplasty, należy dodać dokładnie taką samą objętość roztworu W5 (2 mM MES pH 5,7, 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl) do tej samej szalki Petriego, aby zebrać protoplasty przyklejone do podstawy szalki Petriego. Przenieś protoplasty zawieszone ponownie w roztworze W5 do tego samego 40 μm sitnika komórkowego, umieszczonego na wstępnie schłodzonej otwartej rurce wirówki 50 mL.
    3. Przepuszcz je ponownie przez nowy sitko komórkowe o pojemności 40 μm do nowej, wstępnie schłodzonej rurki wirówki 50 mL. Od teraz trzymaj próbki na lodzie i bądź bardzo delikatny podczas obchodzenia się z protoplastami.
  2. Próbki naziemne po inkubacji:
    1. Za pomocą pipety Pasteura przenieś protoplasty z szalki Petriego do sito komórek o pojemności 70 μm, umieszczone na wierzchu wstępnie schłodzonej, otwartej rurki wirówki o pojemności 50 mL.
    2. Aby pozyskać pozostałe protoplasty, należy dodać dokładnie taką samą objętość roztworu W5 (2 mM pH MES 5,7, 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl) do tej samej szalki Petriego, aby zebrać protoplasty przyklejone do podstawy szalki Petriego. Przenieś protoplasty zawieszone ponownie w roztworze W5 do tego samego sito komórkowego o pojemności 70 μm, umieszczonego na wstępnie schłodzonej, otwartej rurce wirówki 50 mL. Od teraz trzymaj próbki na lodzie i bądź bardzo delikatny wobec protoplastów.

4. Pranie i oczyszczanie Ficoll

  1. Wstępnie schłodzić wirówkę do 4 °C i zbierać (pelletować) protoplasty przez 5 minut przy 500 × g z zerowym ustawieniem hamowania wirówki.
  2. Próbka korzenia po wirówce:
    1. Usuń supernatant, nie naruszając osadu protoplastu.
    2. Delikatnie ponownie zawiesz protoplasty w schłodzonym (4 °C) buforze resuspendacji korzeniowej o pojemności 600-700 μL (równe części buforu izolacyjnego protoplastu korzeniowego bez enzymów) oraz roztworu W5) za pomocą pipety Pasteur lub pipety Gilsona o pojemności 1 mL z końcówką cięcia, aby uniknąć ścinania.
    3. Przenieś zawieszenie do 1,5 mL wstępnie schładzonych (4 °C) rur.
  3. Próbki naziemne po wirówce:
    1. Wyrzuć supernatant, nie naruszając granulki.
    2. Delikatnie ponownie zawiesz pellet w schłodzonym (4 °C) buforze na kwiaty/łodygi/liście, 600-700 μL (równe części bufora izolacyjnego protoplastu kwiatów/łodygi/liści bez enzymów) oraz roztworu W5) za pomocą pipety Pasteur lub pipety Gilsona o pojemności 1 mL z końcówką ciętą, aby uniknąć ścinania.
    3. Przenieś zawieszenie do 1,5 mL wstępnie schładzonych (4 °C) rur.
    4. Przygotuj 300 μL roztworu Ficoll PM 400 o pojemności 13,3 % (w/v) w probówce o pojemności 1,5 mL. Wymieszaj i trzymaj na lodzie.
    5. Stopniowo nakładaj próbkę protoplastu (600-700 μL) na przygotowany roztwór Ficoll, nie dotykając ani nie mieszając warstwy Ficoll.
    6. Wirówka w 4 °C przez 5 minut przy 700 × g z ustawieniem zerowego rozbicia wirówki.
    7. Zbierz protoplasty obecne w warstwie środkowej (interfejs) razem z górną fazą (pierwszą warstwą) (rysunek 1B). Uważaj, aby nie zebrać dolnej trzeciej warstwy, która zawiera Ficoll i oddzielone odłamy. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego użytku.

5. Liczenie i kontrola jakości

  1. Użyj 10 μL roztworu protoplastu, aby policzyć liczbę izolowanych protoplastów za pomocą hemocytometru Neubauer.
    OPCJONALNIE: 1% (w/v) barwnika Evans Blue można dodać do oceny żywotności protoplastów (Rysunek 1C).
  2. Rozcieńcz roztwór protoplastu do wymaganego stężenia protoplastów/mL za pomocą wcześniej schłodzonego (4 °C) bufora resuspendacyjnego (wyjaśnionego w kroku 4.2.2 dla korzenia i kroku 4.3.2 dla tkanek nadziemiowych) odpowiedniej tkanki.
  3. Przekonuj zamierzony eksperyment tak szybko, jak to możliwe, np. sekwencjonowanie pojedynczokomórkowego RNA i/lub FACS15,19.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowane protokoły izolacji protoplastów dla tkanek nadziemnych i korzeniowych skutecznie umożliwiają efektywne trawienie ściany komórkowej oraz uwalnianie nienaruszonych pojedynczych komórek ze wszystkich tkanek Arabidopsis thaliana. Wśród testowanych typów tkanek, obejmujących kwiaty, łodygi, liście i korzenie, proces trawienia enzymatycznego dał dobrze rozdzielone protoplasty z minimalną liczbą niestrawionych grup komórkowych (Rysunek 2A-D). Testy barwnika Evans Blue potwierdziły, że protoplasty wykazujące morfologię sferyczną z gładkimi granicami błony plazmatycznej są komórkami żywotnymi (Rysunek 1C). Dla każdego typu tkanki liczono protoplasty sferyczne. Kwiaty zawierały średnio 97 875 ± 7 531 (9 788 komórek/mg, n = 3), łodygi 119 025 ± 22 508 (550 komórek/mg, n = 4), liście 210 483 ± 15 572 (225 komórek/mg, n = 3) oraz korzenie 225 363 ± 52 561 (599 komórek/mg, n = 4).

Zawiesina protoplastów wykazała szeroki rozkład rozmiarów komórek oraz obecność zielonych lub jasnych plastidów, co odzwierciedla heterogeniczny skład komórkowy każdej pobranej tkanki (Rysunek 3A-D). Aby to potwierdzić, przeprowadzono izolację protoplastów z transgeniczną, specyficzną dla komórek towarzyszących linią reporterową YFP, a zawiesina zawierała żywotne małe protoplasty z sygnałem YFP reprezentującym komórki towarzyszące (Rysunek 3E). Podkreśla to, że stosowany protoplast izolacyjny jest odpowiedni dla trudno izolowalnych komórek naczyniowych o sztywnych ścianach komórkowych.

Dzięki przedstawionej zoptymalizowanej metodzie można wyizolować dużą liczbę żywotnych protoplastów przy minimalnej ilości zanieczyszczeń z różnych tkanek dorosłych roślin. Aby poprawić oczyszczanie próbek powierzchniowych, wprowadziliśmy etap czyszczenia poduszek Ficoll, aby usunąć uwolnione organelle i inne zanieczyszczenia komórkowe z trawionych próbek, przy jednoczesnym zachowaniu jakości transkryptomu (Rysunek 4).

W bibliotekach cDNA scRNAseq generowanych z protoplastów, wysoko ekspremowane transkrypty housekeeping, takie jak ACTIN2, oraz transkrypty rzadki/nisko ekspresyjne, takie jak homeodomenowy czynnik transkrypcjonalny KNAT1, marker specyficzny dla komórek kambialnych i meristematycznych, a także markery komórkowe towarzyszące SUC2 i PARCL1, zostały wykryte za pomocą specyficznych testów cDNA PCR15 (Rysunek 5). Wskazuje to na szeroką reprezentację typu komórek oraz heterogeniczność uzyskanej populacji protoplastów, co zostało dodatkowo potwierdzone analizą danych scRNAseq uzyskanych tą metodą15.

figure-results-1
Rysunek 1: Przepływ kroków izolacji protoplastu. Pokazano sześć głównych kroków: (1) przygotowanie buforu, (2) trawienie tkanek, (3) filtracja, (4) oczyszczanie i oczyszczanie Ficoll, (5) liczenie i kontrola jakości oraz (6) kontynuacja dalszych eksperymentów. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Obrazy etapów przygotowania protoplastu. (A) Reprezentatywny obraz etapu cięcia próbki liścia (Krok 2.1). Górny obraz pokazuje pobraną tkankę z kilkoma kroplami buforu w standardowej szalce Petriego oraz żyletką do siekania. Poniższy obrazek, po lewej, przedstawia tkankę po kilku pionowych pociągnięciach żyletką (patrz strzałka). Poniższy obrazek, po prawej, przedstawia pociętą próbkę, gotową do kolejnego kroku. (B) Obraz poduszki Ficoll po wirowaniu w probówce 1,5 mL (Krok 4.3.7). Biała strzałka wskazuje warstwę środkową, która zawiera protoplasty. (C) Reprezentatywne zdjęcie mikroskopowe protoplastów liści inkubowanych w barwniku Evans Blue. Skala: 250 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

figure-results-3
Rysunek 3: Mikroskopowe obrazy generowanych protoplastów. Wyświetlane są obrazy protoplastów z każdego typu tkanki. (a) kwiat, (b) łodyga, (c) liść, (d) korzeń. Skala: 250 μm. (E) obrazy mikroskopem konfokalnym linii reporterskiej specyficznej dla komórek towarzyszących. Pierwszy obraz (po lewej) przedstawia ekspresję reportera komórek towarzyszących YFP w naczyniach liścia (kolor zielony). Drugi obraz (po prawej) przedstawia protoplasty z komórek wyrażających raport YFP (sygnał zielony). Fioletowo-niebieski kolor symbolizuje autofluorescencję chloroplastów. Skala 10 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Mikroskopowe obrazy protoplastów liści przed (A) i po (B) czyszczeniu poduszek Ficoll. Skala: 250 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

figure-results-5
Rysunek 5: PCR kontroli jakości bibliotek scRNAseq. Reprezentatywne obrazy żelowe PCR kontroli jakości bibliotek RNAseq korzeniowych i nadziemnych tkanek. Testowano genySUC2, PARCL, KNAT1, ACT2 (odpowiednio A do D) oraz dla każdej tkanki: kwiat, łodygę, liść, korzeń od lewej do prawej, odpowiednio. cDNA (+) jest stosowane jako kontrola dodatnia, a woda jako kontrola ujemna. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Bufor Protoplasting RootBufor protoplasting kwiatów/łodyg/liści
600 mM Mannitol400 mM Mannitol
2 mM MgCl2-
0,1% BSA0,1% BSA
2 mM CaCl210 mM CaCl2
2 mM pH MES 5,720 mM pH MES 5,7
10 mM KCl20 mM KCl
Jeśli trzeba, dostosuj pH do 5,5 z bazą tris 1MJeśli trzeba, dostosuj pH do 5,5 z bazą tris 1M

Tabela 1: Skład buforu izolacyjnego protoplastu. Dostępne są przepisy buforowe izolujące protoplast dla tkanek korzeniowych i naziemnych (kwiat, łodyga, liści).

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten zoptymalizowany protokół izolowania protoplastów z różnych tkanek Arabidopsis został dostosowany do zastosowań scRNAseq, analizując cały transkryptom obecny w cytoplazmie i jądrach. Optymalizacja buforów specyficzna dla tkanek oraz dodatkowe kroki trawienia i oczyszczania skutkowały solidnymi i powtarzalnymi wydajnościami w różnych tkankach. Konkretnie, protoplasty kwiatowe miały średnio ~98 000 komórek na próbkę (~9 788 komórek na mg tkanki), protoplasty macierzyste ~119 000 komórek (~550 komórek na mg), protoplasty liściowe ~210 500 komórek (~225 komórek na mg), a protoplasty korzeniowe ~225 000 komórek (~599 komórek na mg), co odzwierciedla różnorodność strukturalną i fizjologiczną tych tkanek.

Kluczowym udoskonaleniem tego protokołu było zastosowanie poduszki opartej na Ficollu zamiast częściej stosowanych gradientów/poduszek na bazie sacharozy do oczyszczania. W przeciwieństwie do sacharozy, która jest pobierana przez komórki i ma istotny wpływ na transkryptom 13,20,21, Ficoll jest osmotycznie obojętny i nieprzepuszczalny przez błonę, dzięki czemu zachowuje integralność RNA podczas izolacji 22. Ten krok zmniejszył również liczbę wolnych organelli, takich jak chloroplasty, pochodzących z uszkodzonych komórek i resztek komórkowych w zawiesinach. Obecność takich zanieczyszczeń może zakłócać powstawanie kropelek poprzez zatykanie kanałów urządzeń mikrofluidycznych lub skutkować obecnością więcej niż jednej komórki w powstałych kroplach, co przyczynia się do skażenia RNA otoczenia. Wszystkie te czynniki mogą prowadzić do błędnych wniosków lub błędów w analizie danych scRNA-seq.

Wykazano, że izolacja protoplastów może zmieniać transkryptom komórek roślinnych 2,15,16,19. Kluczową strategią w tym protokole, mającą na celu zminimalizowanie tego artefaktu, jest utrzymywanie protoplastów w temperaturze 4 °C (na lodzie) po trawieniu enzymatycznym, co spowalnia aktywność metaboliczną i transkrypcyjną, a tym samym zmniejsza zmiany transkrypcyjne znane z izolacją protoplastów. Ponadto kluczowe jest utrzymanie spójności czasu pobierania tkanek we wszystkich replikach i dopasowanie go do celu badania, ponieważ wykazano, że różnice w czasie wpływają zarówno na geny indukowane protoplastem, jak i transkrypcje regulowane okołodobowo wykryte w zbiorach danych scRNA-seq15.

W tej metodzie, oprócz produkcji pojedynczych komórek z minimalną ilością zanieczyszczeń, bardzo ważnym aspektem było zachowanie heterogeniczności tkanek, aby potencjalnie reprezentować wszystkie typy komórek. Różnorodność zawiesin protoplastów została potwierdzona przez wykrycie różnych morfologii protoplastów, w tym o różnych rozmiarach oraz obecności sygnałów z linii reporterów specyficznych dla typu komórki w obrębie uzyskanej populacji (Rysunek 2). Dodatkowo populacja protoplastów została oceniona poprzez wykrywanie rzadkich i specyficznych dla typu komórek oraz transkryptów housekeeping w bibliotekach cDNA scRNA-seq za pomocą PCR (Rysunek 4). Wśród nich były rzadkie geny markerów apikalnego meristemu pędu oraz markery komórek towarzyszących15. Udane przechwycenie tych transkryptów potwierdza, że przedstawiona metoda pozwala na izolację różnorodnych typów komórek o wysokiej integralności, co czyni ją cennym narzędziem do rozwoju badań nad pojedynczymi komórkami u roślin. Oprócz scRNAseq, metoda ta może być wykorzystywana także do cytometrii przepływowej, analizy ekspresji genów przejściowych oraz testów regeneracji roślin.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zadeklarowali konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy artykuł jest częścią projektu, który otrzymał finansowanie od Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu badawczo-innowacyjnego Horyzont 2020 Unii Europejskiej (Umowa Grantowa nr 810131).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Celulaza RS Duchefa BiochemieC8003
Model wirówki 5810REppendorf5810000010
Ficoll PM 400 Sigma-Aldrich26873-85-8
Macerozyme R10Duchefa BiochemieM8002
Model mikrowirówki 5417REppendorfWycofane z produkcji
Filtr strzykawkowy Puradisc 30, 0,2 i mikro; mCytiva10462200Określane jako 0.2 & micro; Filtr m w protokole
Sterile Cell Strainer 40 & micro; m Nylon Mesh Fisherbrand22363547
Sterylne sitko komórkowe 70 & mikro; m Nylon Mesh Fisherbrand22363548

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  2. Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Dev Cell. 48 (6), 840-852.e5 (2019).
  3. Tenorio Berrío, R., et al. Dual and spatially resolved drought responses in the Arabidopsis leaf mesophyll revealed by single-cell transcriptomics. New Phytol. 246 (3), 840-858 (2025).
  4. Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
  5. Zhai, Z., Jung, H., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J Vis Exp. (30), e1149(2009).
  6. Adedeji, O. S., Naing, A. H., Kim, C. K. Protoplast isolation and shoot regeneration from protoplast-derived calli of Chrysanthemum cv. White ND. Plant Cell Tissue Organ Cult. 141 (3), 571-581 (2020).
  7. Wang, K., et al. An optimized FACS-free single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) method for plant science research. Plant Sci. 326, 111535(2023).
  8. Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
  9. Brandt, S., Walz, C., Schad, M., Pavlovic, N., Kehr, J. A simple, chisel-assisted mechanical microdissection system for harvesting homogenous plant tissue suitable for the analysis of nucleic acids and proteins. Plant Mol Biol Report. 21 (4), 417-427 (2003).
  10. Berkowitz, O., et al. RNA-seq analysis of laser microdissected Arabidopsis thaliana leaf epidermis, mesophyll and vasculature defines tissue-specific transcriptional responses to multiple stress treatments. Plant J. 107 (3), 938-955 (2021).
  11. Jean-Baptiste, K., et al. Dynamics of gene expression in single root cells of Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 31 (5), 993-1011 (2019).
  12. Ryu, K. H., Huang, L., Kang, H. M., Schiefelbein, J. Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells. Plant Physiol. 179 (4), 1444-1456 (2019).
  13. Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Rep. 27 (7), 2241-2247.e4 (2019).
  14. Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), eaay4970(2020).
  15. Apelt, F., et al. Shoot and root single-cell sequencing reveals tissue- and daytime-specific transcriptome profiles. Plant Physiol. kiab537. , (2021).
  16. Kim, J. -Y., et al. Distinct identities of leaf phloem cells revealed by single-cell transcriptomics. Plant Cell. 33 (3), 511-530 (2021).
  17. Zhang, T. -Q., Chen, Y., Wang, J. -W. A single-cell analysis of the Arabidopsis vegetative shoot apex. Developmental Cell. 56 (7), 1056-1074.e8 (2021).
  18. Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Dev Cell. 57 (4), 543-560.e9 (2022).
  19. Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
  20. Aghdasi, M., Smeekens, S., Schluepman, H. Microarray analysis of gene expression patterns in Arabidopsis seedlings under trehalose, sucrose and sorbitol treatment. Int J Plant Prod. 2 (4), 309-320 (2008).
  21. Nakayama, Y., Kusano, M., Kobayashi, M., Manabe, R., Watanabe, M. Catabolic reprogramming of Brassica rapa leaf mesophyll protoplasts during the isolation procedure. Plant Growth Regul. 99 (2), 337-357 (2023).
  22. Grgac, R., Rozsypal, J., Des Marteaux, L., Štětina, T., Koštál, V. Stabilization of insect cell membranes and soluble enzymes by accumulated cryoprotectants during freezing stress. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (41), e2211744119(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Single Cell AnalysisArabidopsis ThalianaSingle Cell RNAseqTissue Specific IsolationEnzymatic DigestionCell ViabilityFlow CytometryGene Expression AnalysisPlant Cell Suspension

Powiązane artykuły