Method Article

Wizualizacja dynamiki czasoprzestrzennej neuronów kory somatosensorycznej podczas elektroakupunktury za pomocą obrazowania in vivo z dwoma fotonami

DOI:

10.3791/69340

⸱

January 16th, 2026

 ,  ,  , 
1Traditional Chinese Medicine, School of Medicine, Acupuncture Research Institute, Jianghan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten integruje okna czaszkowe u myszy transgenicznych Thy1-GCaMP6f, standaryzowaną elektroakupunkturę oraz obrazowanie dwufotonowe w celu wizualizacji dynamiki zespołu korowego w skali milisekundy podczas stymulacji, ujawniając plastyczność specyficzną dla warstw.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten ustanawia kompleksowe ramy eksperymentalne do badania dynamiki obwodów korowych podczas stymulacji EA (elektroakupunktury). Metodologia integruje trzy kluczowe elementy: przewlekłe wszczepienie okna czaszkowego u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6f, standaryzowaną stymulację EA w punkcie akupunktowym ST36 przy użyciu impulsów bifazowych 2/100 Hz oraz wysokorozdzielcze obrazowanie wapnia dwufotonowe o wysokiej rozdzielczości. To zintegrowane podejście umożliwia wizualizację aktywności zespołu nerwowego w korze somatosensorycznej pierwotnej (S1) w czasie rzeczywistym z precyzją czasową milisekundy, rejestrując wcześniej niedostępne szczegóły odpowiedzi sieciowych na neuromodulację. Technika ta z powodzeniem ujawnia wyraźne, specyficzne dla warstw wzorce aktywacji oraz zmiany plastyczności podłużnej, dostarczając kluczowych informacji na temat mechanizmów korowych leżących u podstaw efektów EA. Przezwyciężając fundamentalne ograniczenia przestrzenno-czasowe charakterystyczne dla konwencjonalnych technik fMRI i elektrofizjologicznych, ta platforma o wysokiej rozdzielczości oferuje bezprecedensowe możliwości analityczne do mapowania dynamicznych obwodów nerwowych. Solidna konstrukcja protokołu i powtarzalne wyniki czynią go szczególnie cennym w optymalizacji terapii ukierunkowanej neuromodulacji oraz poszerzaniu naszej wiedzy o plastyczności obwodów w odpowiedzi na stymulację obwodową.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroakupunktura, nowoczesna adaptacja tradycyjnej akupunktury z kontrolowanymi prądami elektrycznymi stosowanymi za pomocą igieł w określonych punktach akupunkturowych, jest znana z modulacji obwodów nerwowych zaangażowanych w przetwarzanie bólu, kontrolę ruchową i autonomiczną funkcję. Uważa się, że jego efekty obejmują złożone kaskady sygnalizacyjne inicjowane przez obwodową aktywację nerwów czuciowych (głównie włókna Aδ i C), prowadzące do uwalniania neuroprzekaźników (np. opioidów, serotoniny, GABA) oraz późniejszej modulacji na poziomach kręgosłupa, pnia mózgu i korymózgowej 1,2. Kluczowe struktury zamieszane to kory somatosensoryczne. W korze S1, która przetwarza informacje dotykowe i nocyceptywne, EA prawdopodobnie wpływa zarówno na lokalne równowagi hamująco-pobudliwe, jak i na łączność długodystansową 3,4. Jednak dokładna sekwencja czasowa aktywacji/hamowania w różnych populacjach neuronów (np. neurony piramidalne, interneurony) oraz warstwach w S1 podczas i bezpośrednio po stymulacji EA pozostaje w dużej mierze nieodwzorowana ze względu na wspomniane wcześniej ograniczenia metodologiczne 5,6. Zrozumienie tych dynamik w czasie rzeczywistym jest kluczowe dla optymalizacji parametrów EA i przewidywania efektów terapeutycznych.

Tradycyjne metody badania neuromodulacyjnych efektów EA (elektroakupunktury) na obwody korowe, takie jak badania behawioralne i analizy pośmiertne, dostarczają cennych informacji, ale nie są w stanie uchwycić aktywności neuronowej w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością przestrzenno-czasową 7,8. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, in vivo dwufotonowe obrazowanie wapnia pojawia się jako potężna alternatywa, umożliwiająca bezpośrednią wizualizację dynamiki zespołu nerwowego podczas stymulacji 8,9. Ta technika zapewnia niezrównane zalety dla przewlekłych badań podłużnych, pozwalając badaczom obserwować – z rozdzielczością komórkową – szybką i rozproszoną aktywność w warstwach korowych u przytomnych, zachowujących się zwierząt. W przeciwieństwie do ostrej elektrofizjologii, która oferuje wysoką rozdzielczość czasową, ale ograniczone pokrycie przestrzenne, obrazowanie dwufotonowe umożliwia monitorowanie na dużą skalę setek do tysięcy neuronów jednocześnie w określonym polu widzenia 9,10. Ponadto, w porównaniu z funkcjonalnym rezonansem magnetycznym (fMRI), które doskonale pokrywa cały mózg, ale działa na wolniejszych skalach czasowych i nie wykazuje specyficzności komórkowej, dwufotonowe obrazowanie wapnia umożliwia precyzyjne wykrywanie aktywności określonych populacji neuronów w skali czasowej istotnej dla procesów synaptycznych i obwodowych11,12. W ten sposób obrazowanie dwufotonowe jest wyjątkowo przygotowane, by wypełnić kluczową lukę w naszym rozumieniu tego, jak bodźce obwodowe EA są tłumaczone na przestrzenno-czasowe wzorce aktywacji kory, szczególnie w obszarach takich jak pierwotna kora somatosensoryczna (S1). Jako główne centrum przetwarzania somatosensorycznego (w tym sygnałów z punktów akupunkturowych) i biorąc pod uwagę, że EA intensywnie moduluje swoją aktywność, S1 stanowi strategiczną bramę do badania dynamiki obwodów korowych indukowanej elektroakupunkturou.

Dwufotonowa laserowa mikroskopia skaningowa (2PLSM) w połączeniu z genetycznie kodowanymi wskaźnikami wapnia (GECI), takimi jak GCaMP6, stanowi rewolucyjne narzędzie w neurobiologii. Umożliwia przewlekłe, wysokorozdzielcze obrazowanie aktywności nerwowej in vivo z specyficznością komórkową i podkomórkową13. GECI fluorescencje są proporcjonalne do wewnątrzkomórkowych przejściowych elementów wapnia, pełniąc rolę wiarygodnego wskaźnika wyładowania neuronów14. Co istotne, wykorzystanie przez 2PLSM światła wzbudzonego w bliskiej podczerwieni zapewnia lepszą penetrację głębokości (setki mikronów) w porównaniu z konwencjonalną mikroskopią, umożliwiając wizualizację aktywności w warstwach powierzchownych, a nawet głębszych warstw kory (np. L2/3, L4, L5). Jego wrodzone optyczne przekrojowanie minimalizuje rozmyte fluorescencje i fotouszkodzenia, co czyni go idealnym do badań podłużnych przez tygodnie lub miesiące15, 16, 17. Ta technologia stanowi rewolucyjny postęp w badaniach nad EA, z potencjałem fundamentalnej transformacji naszego rozumienia jej, oferując możliwość śledzenia dynamiki setek do tysięcy pojedynczych neuronów w skali milisekundowej jednoczesnych w określonej objętości korowej podczas stymulacji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty obejmowały 8-12-tygodniowe transgeniczne myszy Thy1-GCaMP6f18. Wszystkie procedury eksperymentalne i protokoły opieki nad zwierzętami były przeprowadzane zgodnie z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Huazhong Science and Technology (IACUC; Numer zatwierdzenia protokołu: 3603). Podjęto wszelkie wysiłki, aby zminimalizować liczbę wykorzystywanych zwierząt i ich cierpienie. Schemat układu eksperymentalnego pokazano na Rysunku 1.

1. Przewlekła implantacja okna czaszkowego

  1. Indukcja znieczulenia i stabilizacja stereotakstyczna
    1. Rozpocznij znieczulenie, umieszczając 8-12-tygodniową mysz Thy1-GCaMP6f w komorze indukcyjnej z 4-5% izofluranem (vol/vol) w 100% tlenu medycznej jakości o przepływie 1 L/min.
    2. Po utracie odruchu prostowania (zazwyczaj w ciągu 2-3 minut) przenosi zwierzę na termostatycznie sterowaną poduszkę grzewczą (utrzymywaną w temperaturze 37 °C) zintegrowaną z cyfrową ramą stereotaksyjną.
    3. Zabezpiecz mysz za pomocą stożka nosowego, który dostarcza 1,5-2,0% izofluranu do konserwacji chirurgicznej. Nałóż maść okulistyczną (np. maść weterynaryjną puralube) na oba oczy, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
    4. Delikatnie wprowadzaj nieurazowe pręty uszne w zewnętrzny przewód słuchowy, zapewniając symetryczne ułożenie bez nadmiernego nacisku, który mógłby spowodować uszkodzenie tkanek lub pęknięcie błony bębenkowej19.
    5. Zabezpiecz podniebienie szczękowe zaciskiem nosowym, unikając niedrożności dróg oddechowych.
    6. Potwierdź głęboką znieczulenie przez brak odruchu cofania się pedałów do twardego uszczypania palca i stabilne, wolne oddychanie (80-120 oddechów/min). Stale monitoruj temperaturę ciała za pomocą sondy odbytniczej i odpowiednio reguluj poduszkę grzewczą.
    7. Podawaj podskórne (s.c.) środki przeciwbólowe prewencyjnie (np. karprofen, 5 mg/kg) oraz wsparcie płynów (sól fizjologiczna, 0,5-1 mL s.c.). Zweryfikować stabilne parametry fizjologiczne (SpO₂ > 95%, regularne oddychanie) podczas całego przygotowania.
  2. Chirurgiczne odsłonięcie czaszki
    1. Ogol grzbietową skórę głowy starannie za pomocą elektrycznych obcinaczek, a następnie nałóż chemiczny krem depilacyjny, aby całkowicie usunąć owłosienie. Dokładnie spłuknij sterylną solą fizjologiczną.
    2. Wykonaj sekwencyjną antysepsę: Szoruj odsłoniętą skórę trzy razy, na przemian pobierając wymazy z povidonem jodem (10%) a 70% alkoholem izopropylowym, kończąc roztworem chlorheksydyny glukonianu (2%).
    3. Używając sterylnych nożyczek mikro-sekcyjnych i cienkich kleszczy (Dumont #5), wykonaj nacięcie strzałkowe w linii środkowej (~15-20 mm długości) przez skórę i tkankę łączną pod spodem, zaczynając ~2 mm z tyłu od oczu i rozciągając się do połączenia międzyprzycieniowo-potylicznego.
    4. Użyj kleszczy mikrohemostatycznych lub kauteru dwubiegunowego (niskie ustawienie), aby kontrolować krwawienie z naczyń włosowatych wzdłuż krawędzi nacięcia. Delikatnie cofnij płaty skórne na boki, używając zakrzywionych mikro-retraktorów lub jedwabnych szwów 5-0 przymocowanych do otaczającej zasłony.
    5. Odsłonić całe grzbietowe kołnie, w tym kości czołowe, ciemieniowe i międzyprzyścienne. Za pomocą mikro-łyżki (#00) starannie zeskrobaj okost – włóknistą błonę naczyniową przylegającą do powierzchni kości – pod dużym powiększeniem (mikroskop chirurgiczny).
    6. Stosuj delikatne, styczne ruchy, aby uniknąć rozdrapań czaszki lub uszkodzenia szwów (bregma, lambda, strzałkowa, koronalna). Uzyskaj gładką, awakularną powierzchnię kości, niezbędną do precyzyjnej kraniotomii i późniejszego klejenia.
    7. Często nawadniaj pole sterylną, ciepłą (37 °C) solą fizjologiczną 0,9%, aby usunąć pył kostny i utrzymać nawilżenie tkanek.
  3. Stereotaksyjne celowanie w obszarze kończyny tylnej S1
    1. Używając precyzyjnego ramienia manipulatora stereotaksyjnego, umieść końcówkę precyzyjnego markera chirurgicznego lub mikrowiertła bezpośrednio nad punktem odniesienia anatomicznego (przecięciem szwów koronnych i strzałkowych). Potwierdź współrzędne pod wizualizacją mikroskopową (10x).
    2. Reguluj manipulator tak, aby marker przesunął dokładnie przed-posteriornie (AP) -1,5 mm (tylnie od bregmy) i środkowo-boczne (ML) +2,0 mm (prawa półkula) względem linii środkowej (szew strzałkowy).
      UWAGA: To miejsce odpowiada pierwotnemu obszarowi reprezentacji tylnej kończyny (S1HL) kory somatosensorycznej (S1).
    3. Delikatnie wytraw mały celownik (<0,5 mm) na odsłoniętej powierzchni kości ciemieniowej w tym miejscu, zapewniając widoczność bez penetracji kości.
    4. Zweryfikować brak głównych powierzchniowych naczyń przechodzących przez wyznaczone miejsce; jeśli obecne są znaczące naczynia, minimalnie dostosuj współrzędne ML (±0,1-0,2 mm), aby ich uniknąć, ponieważ naczynia oponowiowe mogą silnie krwawić w przypadku przebicia i utrudniać przejrzystość optyczną.
    5. Dokumentuj ostateczne skorygowane współrzędne.
  4. Precyzyjne wykonanie kraniotomii
    1. Precyzyjnie wyśrodkowaj sterylną, jednorazową cios biopsyjną o średnicy 3 mm na oznaczonej współrzędnej S1HL. Stosuj mocny, stały nacisk w dół, delikatnie obracając cios, aby całkowicie naciąć zewnętrzną warstwę kości korowej wokół obwodu. Usuń poncz.
    2. Używając szybkiej mikrochirurgicznej wiertła (np. z żarnem węglikowym o grubości 0,5-0,8 mm) przymocowanego do ramienia stereotaksyjnego pod stałym nawadnieniem solnym 0,9% (chłodzenie i usuwanie zanieczyszczeń), ostrożnie przerzedź kość wewnątrz naciętego okręgu.
    3. Wiercę w krótkich seriach, używając lekkiego, stycznego ruchu frezowania, systematycznie przesuwając się od obwodu w kierunku środka. Dokładnie monitoruj przezroczystość kości pod powiększeniem.
    4. Natychmiast przestań wiercić po zauważeniu subtelnego "rumieńca" na podłożu twardej matery, co wskazuje na minimalną grubość kości (<50 μm). Przełącz się na drobne mikrokleszcze (Dumont #5/45) i mikronożyczki, aby starannie podnosić i odklejać pozostałe cienkie fragmenty kości, pracując promieniowo na zewnątrz od środka.
    5. Zachowaj oponę twardą w nienaruszonym stanie – upewnij się, że wygląda na przezroczystą i lśniącą, bez rozdarć i znacznego krwawienia. Natychmiast kontroluj drobne krwawienia z kości twardowej, delikatnie naciskając sterylną piankową piankę pledget nasączoną 0,9% solą fizjologiczną lub trombinem.
    6. Obficie płukaj odsłoniętą oponę twardą ciepłym, sterylnym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF) lub solą fizjologiczną o stężeniu 0,9%, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia kościowe. Unikaj wysuszania17,20.
  5. Przewlekłe implantowanie okna czaszkowego i fiksacja pręta głowy
    1. Przygotuj sterylną szklaną pokrywkę o średnicy 3 mm i grubości #1 (ok. 150 μm). Opcjonalnie pokryj wewnętrzną powierzchnię cienką warstwą silikonowego elastomeru dla przejrzystości optycznej i zmniejszenia przyczepności.
    2. Umieść pokrywkę precyzyjnie nad kraniotomią za pomocą cienkich kleszczy. Przygotuj szybko utwardzający, lekko utwardzony cement dentystyczny (np. Metabond lub Charisma) zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Pracując szybko (<90 sekund pracy), nałóż cienką kroplę cementu wokół obwodu pokrywy, bezpośrednio na suchą, czystą powierzchnię czaszki. Upewnij się, że cement całkowicie uszczelnia krawędź pokrywy, ale nie przenika na durę pod spodem.
    4. Natychmiast utwardzaj cement za pomocą światła do utwardzania zębów (niebieskie światło, 450 nm) przez 20-30 sekund na kwadrant. Wzmocnij uszczelnienie kilkoma warstwami wolniej utwardzającego, 5 mL, samoutwardzającego się akrylowego cementu stomatologicznego (np. Jet Repair Acrylic lub Paladur), budując solidną, niskoprofilową (<2 mm wysokości) cementową pokrywę, która sięga kilka milimetrów poza kraniotomię na otaczającą czaszkę.
    5. Wbudowany w cementową pokrywę podczas początkowej fazy utwardzania wbuduj lekki, specjalnie wykonany główek ze stali nierdzewnej lub tytanu (np. 15-20 mm długości z centralnym otworem).
    6. Upewnij się, że belka głowowa jest ustawiona równolegle do szwu strzałkowego i wyśrodkowana nad szybą, zapewniając sztywne, zrównoważone punkty fiksacji dla przyszłego zabezpieczenia głowy pod mikroskopem, bez utrudniania dostępu optycznego.
    7. Pozwól cementowi całkowicie utwardzić (≥15 min). Zweryfikować pełną hemostazę i przejrzystość okna21.
  6. Pooperacyjna rekonwalescencja i monitorowanie
    1. Po utwardzeniu cementem ostrożnie zdejmij mysz z drążków usznych i zacisku nosowego. Odstaw izofluran i podawaj 100% tlenu, aż samoistne oddychanie całkowicie wróci.
    2. Podawaj buprenorfinę HCl (0,05-0,1 mg/kg s.c.) bezpośrednio po operacji w celu przeciwbólu. Przenieś zwierzę do wcześniej podgrzanej (30-32 °C) komory regeneracyjnej z dodatkiem tlenu, wyłożonej czystą papierową ściółką.
    3. Monitoruj to nieprzerwanie aż do odzyskania pozycji leżącej mostka i pełnego chodzenia (zazwyczaj 30-60 minut). Podaj drugą dawkę karprofenu (5 mg/kg s.c.) 24 godziny po operacji. W razie potrzeby podaj podgrzany, mleczany roztwór Ringera (1 mL s.c.) dla wsparcia nawodnienia.
    4. Trzymaj mysz pojedynczo w standardowej klatce wzbogaconej materiałem lęgowym, aby zapobiec uszkodzeniu implantu głowy w klatce. Utrzymuj warunki środowiskowe (22-24 °C, wilgotność 40-60%, cykl światła/ciemności 12:12 godzin) z dostępem do żywności i hydrożelu ad libitum.
    5. Obserwuj mysz co najmniej dwa razy dziennie przez 7 dni po operacji pod kątem objawów bólu/niepokoju (pochylona postawa, piloerekcja, zmniejszona aktywność, utrata wagi >15%), infekcja (gnojowa wydzielina, obrzęk, zaczerwienienie), deficyt neurologiczny lub poluzowanie głowy.
    6. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentalnych zabiegów (obrazowych lub EA) należy wytrzymać minimalny okres rekonwalescencji ≥7 dni, aby zapewnić ustąpienie ostrego zapalenia chirurgicznego, przywrócenie prawidłowego zachowania i czyszczenie glimfatyczne oraz stabilizację bazowej aktywności korowej. Waż zwierzę codziennie, aby śledzić regenerację22.

2. Stymulacja elektroakupunkturą

  1. Precyzyjna anatomiczna lokalizacja punktu akupunktowego ST36
    1. Celuj w punkt akupunktowy ST36 ("Zusanli") na podstawie ustalonych anatomicznych punktów orientacyjnych w tylnej kończynie myszy. Przed włożeniem igły należy dotknąć bliższej przedniej piszczeli, aby zidentyfikować guzkowość piszczeli – wyraźną kostną wypukłość znajdującą się tuż dalej od stawu kolanowego w miejscu umieszczenia więzadła rzepki.
    2. Za pomocą cienkich zacisków lub sterylnego markera zmierz 2 mm bocznie (w kierunku strzałki) i 2 mm ogonowe (tylne) względem środka guzki piszczeli. To miejsce odpowiada mięśniowi piszczelowemu przedniemu, powierzchownemu do głębokiej gałęzi nerwu przybrzuszkowego i bliższemu do rozgałęzienia tętnicy piszczelowej przedniej.
    3. W razie potrzeby potwierdzić brak głównych powierzchownych naczyń krwionośnych w miejscu za pomocą transiluminacji.
      UWAGA: Dokładność jest kluczowa, ponieważ drobne odchylenia (>0,5 mm) mogą znacząco zmienić stymulowane struktury nerwowe oraz późniejsze odpowiedzi korowe w S1. Identyfikacja zabytków powinna być konsekwentnie przeprowadzana przez wykwalifikowany personel, aby zminimalizować zmienność między operatorami23,24.
      UWAGA: Metody zapewnienia stabilności igły to: (i) Po wprowadzeniu i zafiksowaniu igły mysz ma okres adaptacji na aklimatyzację i zmniejszenie początkowych trudności. (ii) Częstotliwość drgań generowana przez stymulator elektroakupunktury (np. 2 Hz) jest z natury niska. Ponadto zastosowane cienkie igły (np. Φ0,16 mm) mają wystarczającą sztywność, by skutecznie wytrzymać te minimalne drgania. (iii) Przez cały czas trwania eksperymentu operator nieustannie monitoruje pozycję końcówki igły. Dane z badań zostaną wykluczone, jeśli zaobserwuje się istotne przesunięcie spowodowane ruchem zwierząt.
  2. Technika wprowadzania sterylnej igły
    1. Po dezynfekcji skóry (naprzemiennie 70% peelingu etanolem i chlorheksydyną) włożymy sterylną, jednorazową igłę do akupunktury ze stali nierdzewnej (nominalna średnica: 0,18 mm, odpowiadająca 36 gauge; długość: 13 mm) prostopadle do skóry na oznaczonych współrzędnych ST36.
    2. Przesuwaj igłę stopniowo przez skórę, tkankę podskórną i do mięśnia piszczelowego przedniego podskóru, wykonując płynny ruch obrotowy, aby zminimalizować uraz tkanek.
      UWAGA: Głębokość wniknięcia celu wynosi 3 mm od powierzchni skóry. Ta głębokość zapewnia optymalne zaangażowanie aferentów mięśniowych typu II/III (włókien Aδ) oraz potencjalnie somatycznych włókien o małej średnicy bez ryzyka kontaktu z leżącą u podstawy lub głębokimi wiązkami nerwowo-naczyniowymi.
    3. Mocno zabezpiecz piast igły za pomocą małej sterylnej poduszki klejącej lub specjalnego klipsa, aby zapobiec wysuwaniu się podczas kolejnej stymulacji elektrycznej i potencjalnym subtelnym ruchom kończyn.
    4. Zweryfikowaj stabilne umiejscowienie igły, obserwując niewielkie, przejściowe miejscowe napięcie mięśni po wkłuciu – fizjologiczne wskazanie prawidłowego ustawienia wewnątrzmięśniowego.
    5. Utrzymuj ścisłą technikę aseptyczną przez cały czas, aby zapobiegać infekcjom, szczególnie w paradygmatach przewlekłej stymulacji23.
  3. Parametryzacja i podanie stymulacji elektroakupunkturą
    1. Podłącz izolowany uchwyt włożonej igły do kanału wyjścia anodowego (+) programowalnego stymulatora elektroakupunktury (np. HANS Acupoint Nerve Stimulator, model LH202).
    2. Umieść elektrodę katodową (-), zazwyczaj małą stalową płytkę lub elektrodę klipsową pokrytą przewodzącym żelem, na tylnej łapie po ipsilateralnej stronie (np. powierzchnia podestowa blisko pięty).
    3. Zapewnij bezpieczny kontakt i niską impedancję (<5 kΩ) w obu miejscach. Zaprogramuj stymulator tak, aby dostarczał dwufazowe impulsy prostokątne (zrównoważone fazy dodatnie/ujemne), aby zminimalizować polaryzację elektrod i uszkodzenia tkanek.
    4. Ustaw paradygmat stymulacji na tryb gęsto-dyspersyjny: naprzemienne impulsy o częstotliwości 2 Hz (niska częstotliwość) przez 3 s, a następnie 100 Hz (wysoka częstotliwość) przez 3 s.
      UWAGA: Ten połączony wzór częstotliwości (często oznaczany jako 2/100 Hz) jest empirycznie wykazany jako skuteczniejszy w przypadku uwalniania endogennych opioidów (np. β-endorfin, enkefalina) i monoaminow (np. serotonina, noradrenalina) w OUN bardziej efektywnie niż same pojedyncze częstotliwości.
    5. Stopniowo dostosowuj intensywność prądu od 0,1 mA, aż do momentu wizualnego zaobserwowania łagodnego, rytmicznego drgnięcia łapy (zgięcia palców lub kostki) – zwykle osiągnięte do 1,0 mA u dorosłych myszy pod lekkim znieczuleniem lekkiem. Ten próg drgawczy wskazuje na wystarczającą rekrutację ruchowych eferentów i powiązanych dużych aferentów (włókien Aβ), potwierdzając aktywację fizjologiczną bez wywoływania stresu czy gwałtownego zmagania. Utrzymuj tę skalibrowaną intensywność przez całą 20-minutową sesję stymulacji25,26.
  4. Krytyczne proceduralne kontrole i monitorowanie fizjologiczne
    1. Łagodzenie artefaktów stymulacyjnych
      1. Fizycznie oddziel kable EA od sprzętu obrazującego/sceny głównej.
      2. Wprowadź solidne uziemienie: Podłącz zacisk uziemienia stymulatora do dedykowanego uziemienia i upewnij się, że ramka mikroskopu oraz matka grzewcza dla zwierząt mają wspólny punkt masowy.
      3. Zsynchronizuj impulsy stymulacyjne czasowo z sygnałem wygaszającym mikroskopu, jeśli jest dostępny, lub stosuj przetwarzanie sygnałów post-hoc, aby usunąć pozostałości artefaktów elektrycznych ze śladów wapnia.
    2. Stabilność fizjologiczna
      1. Stale monitoruj temperaturę ciała rdzenia (utrzymywaną na poziomie 37,0 ± 0,5 °C za pomocą termoforu sterowanego sprzężeniem zwrotnym), tempo oddechu (80-120 oddechów na minutę) oraz spO₂ (>95%) przez całą 20-minutową sesję EA.
      2. Utrzymuj lekką znieczulenie izofluranowym (1,0-1,5%) dla unieruchomienia podczas łączonego obrazowania i stymulacji. Nieustannie obserwuj wywołane drganie łapy; Jeśli się zmniejsza lub ustaje, sprawdź kontakt igły i impedancję oraz lekko dostosuj intensywność (przyrosty ≤0,1 mA), aby utrzymać stałą, łagodną aktywację ruchową.
      3. Natychmiast przerwij stymulację, jeśli pojawią się oznaki niepokoju (np. tachypneja, silne szarpanie).
    3. Powtarzalność
      1. Stosuj identyczny typ igły, głębokość włożenia, model stymulatora oraz metodę kalibracji (próg drgań łapy) we wszystkich zwierzętach i sesjach. Dokumentuj ostateczną intensywność bodźców użytą dla każdego uczestnika.
      2. Przed przerwaniem znieczulenia lubwykonaniem dodatkowych zabiegów należy odbyć co najmniej 5 minut po stymulacji.

3. Obrazowanie dwufotonowe podczas EA

  1. Przygotowanie zwierząt, fiksacja głowy i utrzymanie fizjologiczne
    1. Po ≥7 dniach pooperacyjnej rekonwalescencji można przymontować mysz Thy1-GCaMP6f za pomocą wszczepionej głowicy w specjalnie zaprojektowanym, tłumionym drganiach urządzeniu stabilizacyjnym zamontowanym na zmotoryzowanym stopniu XY.
    2. Umieść zwierzę wygodnie na cylindrycznej, niskotarciowej, smarowanej powietrzem bieżni, umożliwiającej swobodny ruch tylnych kończyn. Utrzymuj lekką znieczulenie chirurgiczne za pomocą podania izofluranu w stężeniu 0,5-0,8% izofluranu w 100% O₂. Obniżony poziom izofluranu minimalizuje tłumienie aktywności nerwowej, jednocześnie zapewniając nieruchomość wystarczającą do obrazowania w wysokiej rozdzielczości.
    3. Nieustannie monitoruj i rejestruj temperaturę ciała rdzenia (utrzymywaną na poziomie 37,0 ± 0,2 °C za pomocą termoforu kontrolowanego przez sprzężenie zwrotne), tempo oddychania (100-140 oddechów/min) oraz saturację tlenem w obwodach (SpO₂ > 95%).
    4. Stosuj żel okulistyczny zapobiegający wysychaniu rogówki podczas długotrwałych badań obrazowych. Upewnij się, że tylna kończyna po stronie ipsilateralnej od okna czaszkowego S1HL jest dostępna do włożenia igły EA w ST36.
    5. Przed rozpoczęciem obrazowania29 minut należy odczekać 15-20 minut na stabilizację fizjologiczną po fiksacji głowy.
  2. Celowanie optyczne i optymalizacja dla obrazowania warstw II/III
    1. Precyzyjnie określ płaszczyznę ogniskową, aby uzyskać wysokiej jakości sygnały neuronalne. Postępuj zgodnie z tą procedurą weryfikacji.
      1. Zmniejsz moc lasera do niskiego poziomu (zazwyczaj 10-20% mocy obrazowania, np. 5-10 mW), aby uniknąć niepotrzebnego fotobielenia i uszkodzeń foto podczas lokalizacji samolotu.
      2. Za pomocą napędu osi Z mikroskopu dwufotonowego przesuwaj obiektyw powoli w krokach mikronowych. Zacznij od powierzchni okna czaszki i przesuwaj się głębiej w tkankę mózgową.
      3. W trybie podglądu na żywo zidentyfikuj płaszczyznę ogniskową za pomocą tych wskaźników wizualnych, jak opisano w krokach 3.2.1.4 i 3.2.1.5.
      4. Aby uzyskać właściwą płaszczyznę ogniskową na warstwie neuronalnej somy: Sprawdź, czy obraz pokazuje wyraźne, jasne, punktowane struktury (neuronalne somaty) wyglądające okrągło lub owalnie z dobrym kontrastem tła. Upewnij się, że granice komórek są ostre i mają wyraźny wygląd "soli i pieprzu".
      5. Dla nieprawidłowej płaszczyzny ogniskowej: Jeśli obraz wydaje się rozmyty lub jednorodny bez wyraźnie określonych struktur punktowych, należy rozpoznać, że fokus znajduje się w obszarze pozbawionym somata. Jeśli widoczne są duże, ciemne, nieustrukturyzowane cienie naczyniowe, należy je zidentyfikować jako warstwę naczyń krwionośnych.
    2. Weryfikacja odpowiedniego poziomu wyjściowego fluorescencji
      1. Przed zastosowaniem jakiegokolwiek bodźca eksperymentalnego należy potwierdzić zdrowy i stabilny poziom bazowy dotyczący fluorescencji, aby zapewnić prawidłową interpretację kolejnych sygnałów wapnia (ΔF/F). Wykonaj kroki 3.2.2.2-3.2.2.4.
      2. Dostosuj moc lasera do formalnego poziomu obrazowania (np. 30-50 mW).
      3. Zrób zdjęcia przez kilka sekund w szybkim, niskorozdzielczym trybie podglądu.
      4. Obserwuj średnią intensywność fluorescencji wyświetlaną w czasie rzeczywistym (lub bezpośrednio monitoruj jasność obrazu). Sprawdź, czy sygnał pozostaje stabilny i nie wykazuje oznak szybkiego fotobielenia, zanim przystąpi do eksperymentalnego pozyskiwania danych.
    3. Wycentruj pole widzenia obrazujące w obrębie okna czaszki.
      1. Zastosowanie żelu ultradźwiękowego lub wody destylowanej między obiektywem a pokrywką do sprzęgania zanurzeniowego. Używając kontrastu gradientu Dodt w podczerwieni lub oświetlenia epifluorescencyjnego, zidentyfikuj naczynia powierzchniowe i wyrównuj pole widzenia (FOV), aby uniknąć dużych naczyń powierzchniowych (>20 μm średnicy).
      2. Przełącz się na tryb wzbudzenia dwufotonowego za pomocą regulowanego lasera Ti:Sapphire o impulsach femtosekundowych. Ustaw długość fali wzbudzenia na 920 nm – optymalnie do wzbudzania GCaMP6f (szczyt ~920 nm) przy jednoczesnym minimalizowaniu zielonej autofluorescencji i uszkodzeń foto w porównaniu do krótszych długości fal.
      3. Stopniowo zwiększać moc lasera (zazwyczaj 20-50 mW mierzona na próbce), skupiając ostrość przez przezroczystą oponęcię twardą na powierzchnię kory (pia mater). Reguluj pozycję Z obiektywu za pomocą piezoelektrycznego urządzenia nano-focus, aby osiągnąć głębokość 200 ± 10 μm poniżej powierzchni pial, odpowiadającą warstwie korowej II/III.
      4. Potwierdź głębokość na podstawie charakterystycznej gęstości neuronów i morfologii: gęsta populacja małych do średnich neuronów piramidalnych somata (średnica 10-15 μm) z widocznymi dendrytami wierzchołkowymi.
      5. Zoptymalizuj moc lasera i ustawienia wzmocnienia lampy fotopowielacza (PMT), aby uzyskać silną bazową fluorescencję GCaMP6f (F0) bez nasycenia (intensywność pikseli ~50-70% maksymalnego poziomu detektora) i minimalne tło30,31.
        UWAGA: Podczas obrazowania średnia moc lampy wzbudzającej 920 nm była precyzyjnie utrzymywana na poziomie 30-50 mW w celu. Ten poziom mocy został potwierdzony w pilotażowych eksperymentach na tkankach zwierzęcych poddanych identycznym zabiegom chirurgicznym, co zapewniło skuteczne pozyskiwanie sygnału przez czas skanowania do 25 minut przy minimalizacji fotouszkodzeń i fotobielenia fluorescencyjnego.
  3. Protokół szybkiego pobierania wapnia
    1. Konfiguruj skaner rezonansowy do szybkiego akwizycji klatek:
      Rozmiar klatki: 512 × 512 pikseli (typowe pole widzenia: ~450 × 450 μm, rozmiar piksela ~0,88 μm)
      Liczba klatek na sekundę: 7 klatek na sekundę (fps) uzyskane za pomocą skanowania dwukierunkowego (~14 kHz przepływność linii). Ta szybkość odpowiednio próbkuje kinetykę rozpadu GCaMP6f (τ~500 ms), jednocześnie równoważąc stosunek sygnału do szumu (SNR) i minimalizując fotobielenie.
      Czas zatrzymania pikseli: ~0,8 μs (zoptymalizowany pod SNR przy 7 Hz).
    2. Rozpocznij ciągłe pozyskiwanie czasopoklatkowe za pomocą oprogramowania do akwizycji (np. ScanImage, Prairie View). Zapisz 5-minutowy okres wyjściowy przed rozpoczęciem stymulacji EA, aby ustalić dynamikę aktywności nerwowej przed bodźcem (F₀).
    3. Dokładnie o t = 5 min, rozpocznij stymulację EA w ST36, podczas gdy obrazowanie trwa bez przerw. Zbieraj dane nieprzerwanie przez cały 20-minutowy okres stymulacji EA. Całkowity czas skanowania = 25 min (1500 s, ~10 500 klatek).
    4. Zapisz dane jako wielo-TIFF stos lub własnościowy format binarny z wbudowanymi znacznikami czasu zsynchronizowanymi z impulsami EA za pośrednictwem kanału wejściowego TTL.
    5. Monitorować stabilność mocy lasera i dryf ostrości (<2 μm) w czasie rzeczywistym; Krótka przerwa na ponowne ustawienie ostrości tylko wtedy, gdy wystąpi znaczący dryf (np. >5 μm), notując punktczasowy 32,33.
  4. Rygorystyczna korekcja ruchu i rejestracja przestrzenna
    1. Po akwizycji przetwarzaj surowy stos obrazowania za pomocą NoRMCorre (Non-Rigid Motion Correction) w MATLAB, aby wyeliminować artefakty przestrzenne wynikające z resztkowych mikroruchów (np. oddech, puls).
    2. Najpierw podziel stos na nakładające się fragmenty przestrzenne (np. 64 × 64 piksele, 50% nakładania się). Dla każdej poprawki oblicz szablon odniesienia, uśredniając klatki o wysokim poziomie SNR od okresu bazowego.
    3. Korzystając z korelacji krzyżowej opartej na Fourierze, oblicz przesunięcia translacyjne X-Y dla każdej klatki względem szablonu. Te przesunięcia stosuj przez interpolację subpikseli.
    4. Następnie zajmij się niesztywnymi deformacjami: modeluj lokalne zniekształcenia w łatkach za pomocą przekształceń afinicznych po części (translacja + ścinanie). Iteracyjnie aktualizuj szablon, aby poprawić dokładność rejestracji. Kluczowe parametry:
      max_shift: 20 pikseli (limit na tłumaczenie)
      max_dev: 3 piksele (maksymalne odchylenie niesztywne)
      bin_width: 50 klatek (binowanie czasowe dla aktualizacji szablonów)
    5. Wizualizuj skuteczność korekcji, analizując wykres korelacji klatka do klatki (powinien ustabilizować się w okolicach 1,0 po korekcie) i generując średnią mapę różnic projekcji obrazów (przed korektą vs. po korekcji). Zachowaj stos korekcjonowany ruchem na dalszą analizę. Ten krok jest kluczowy dla dokładnej analizy przejściowych zjawisk wapnia na piksel, zwłaszcza podczas subtelnych ruchów kończyn wywołanych przez EA.

4. Analiza dynamiki przestrzenno-czasowej

Stos obrazowania z korekcją ruchu poddawany jest automatycznej segmentacji neuronów i ekstrakcji sygnałów przy użyciu pipeline'u Suite2p (v0.12.3) w Pythonie. Kluczowe etapy przetwarzania to:

  1. Identyfikacja śladu przestrzennego
    1. Zastosuj ograniczone nieujemne rozkładanie macierzy (CNMF), aby rozłożyć stos na komponenty przestrzenne.
    2. Inicjalizuj obszary zainteresowania (ROI) za pomocą podejścia opartego na korelacji: połącz piksele z przestrzenną korelacją krzyżową > 0,7 i lokalnym SNR > 4 w kandydatów ROI. Rozróżnić somatyczne ROI od dendrytów/aksonów według rozmiaru (8-15 μm średnicy) oraz kołowości (próg zwartej >0,6).
  2. Korekcja zanieczyszczenia neuropilem
    1. Dla każdego ROI zdefiniuj koncentryczny pierścień neuropilu (promień wewnętrzny: 1,5× promień ROI, promień zewnętrzny: 2,5× promień ROI).
    2. Oblicz współczynnik neuropila (r_neuropil) za pomocą regresji najmniejszych kwadratów:
      F_corrected(t) = F_raw(t) - 0,7 × F_neuropil(t)
      (Współczynnik empirycznie zweryfikowany dla myszy Thy1-GCaMP6f).
  3. Dekonwolucja sygnału
    1. Wywnioskuj aktywność skoków za pomocą OASIS (l₁-regularizowana dekonwolucja) za pomocą modelu szumu AR(2), aby oszacować prawdopodobieństwo skoków S(t) na podstawie śladów ΔF/F:
      ΔF/F(t) = k ⋅ S(t) + b + ε
      gdzie 'k' to jądro wapniowe przejściowe, a ε to szum Gaussa.
  4. Kontrola jakości
    1. Wyklucz ROI z SNR <3, nakładaniem się przestrzennym >30% lub korelacją neuropilową >0,3. Weryfikacja wizualna odbywa się za pomocą Suite2p GUI34.
      Szczegółowe elementy operacji i interfejsu przedstawiono w Pliku Uzupełniającym 1. Plik TIFF z korekcją ruchu wygenerowany powyżej został bezpośrednio wprowadzony do pipeline'u Suite2p. Chociaż zintegrowane środowisko Suite2p zawiera własną sztywną korekcję ruchu, ten redundantny krok wewnętrzny został wyłączony, ponieważ zastosowano już bardziej precyzyjną, niesztywną korektę. Automatycznie ekstrahowane zwroty z inwestycji neuronalnych można znaleźć w Pliku Uzupełniającym 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka strukturalna kory S1 i bazowej aktywności nerwowej
Zaczęliśmy od ustanowienia wysokiej jakości bazy strukturalnej i funkcjonalnej dla naszych eksperymentów obrazowania. Analiza morfologii tkanek wykazała wyraźne różnice strukturalne między preparatami okien czaszkowych bez nakładania (Rysunek 2A) a pokrywkowym (Rysunek 2B). Chociaż zastosowanie pokrywy wprowadziło drobne artefakty kompresyjne (groty strzałek,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zniwelować krytyczną lukę w obserwowaniu efektów korowych elektroakupunktury (EA) w czasie rzeczywistym, przedstawiamy kompleksowy, zintegrowany protokół łączący przewlekłą implantację okna czaszkowego dla dostępu optycznego, standaryzowaną stymulację EA oraz podłużne obrazowanie wapnia dwufotonowe skierowane na pierwotną korę somatosensoryczną (S1).

Ten zintegrowany protokół oferuje kilka wyraźnych zalet w porównaniu z tradycyjnymi metodami badania efektów korowych EA. Po pierwsze, zapewn...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te zostały wsparte grantem od Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 82405550). Dziękujemy członkom laboratorium Zhang za pomocne dyskusje.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
KarprofenMCENie ma5 mg/kg na leki przeciwbólowe
Cyfrowa rama stereotaksowaNapęd na tylne kołaKopf Model 1900
Stymulator elektroakupunkturyHANS LH202 (impulsy bifazowe 2/100 Hz)Nie maHANS LH202 (impulsy bifazowe 2/100 Hz)
IzofluranNapęd na tylne kołaR510-22-10Medyczna klasa, 100% nośnik tlenu
System mikrowierceniaNapęd na tylne kołaZażarz węglika 0,5 mm, chłodzony solą fizjologiczną
Povidone-jodMCEHY-B2234Roztwór 10%
ScanImageScanImagehttps://scanimage.org/
Sól fizjologiczna sterylnaBeyuntianST341-500ml0,9% NaCl
Mikroskop chirurgicznyZeisshttps://www.zeiss.com/meditec/en/products/surgical-microscopes.html10-40 razy; Powiększenie
Transgeniczne myszy Thy1-GCaMP6fCygen55239788-12 tygodni, samiec/dziewczynka
Mikroskop dwufotonowyNikon A1MPNikon A1MPTi: Laser szafirowy (wzbudzenie 920 nm)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, X., et al. A central and peripheral dual neuromodulation strategy in pain management of zoster-associated pain. Sci Rep. 14 (1), 24672(2024).
  2. Xia, R., et al. Autonomic nervous system in bone remodeling: From mechanisms to novel therapies in orthopedic diseases. Orthop Surg. 17 (6), 1561-1576 (2025).
  3. Arvanitidis, M., Falla, D., Sanderson, A., Martinez-Valdes, E. Does pain influence force steadiness? A protocol for a systematic review. BMJ Open. 11 (1), e042525(2021).
  4. Urits, I., et al. An evidence-based review of galcanezumab for the treatment of migraine. Neurol Ther. 9 (2), 403-417 (2020).
  5. Barbeau, E. J., Chauvel, P., Moulin, C. J., Regis, J., Liegeois-Chauvel, C. Hippocampus duality: Memory and novelty detection are subserved by distinct mechanisms. Hippocampus. 27 (4), 405-416 (2017).
  6. Dannenberg, H., Young, K., Hasselmo, M. Modulation of hippocampal circuits by muscarinic and nicotinic receptors. Front Neural Circuits. 11 (7), 102(2017).
  7. Shang, Q., et al. Erp evidence for consumer evaluation of copycat brands. PLoS One. 13 (2), e0191475(2018).
  8. Shariff, S., et al. Advances in understanding the pathogenesis of epilepsy: Unraveling the molecular mechanisms: A cross-sectional study. Health Sci Rep. 7 (2), e1896(2024).
  9. Wahl, A. S. State-of-the-art techniques to causally link neural plasticity to functional recovery in experimental stroke research. Neural Plast. 2018 (1), 3846593(2018).
  10. Zheng, X. S., Yang, Q., Vazquez, A. L., Tracy Cui, X. Imaging the efficiency of poly(3,4-ethylenedioxythiophene) doped with acid-functionalized carbon nanotube and iridium oxide electrode coatings for microstimulation. Adv Nanobiomed Res. 1 (7), 2000092(2021).
  11. De Pasquale, F., et al. A cortical core for dynamic integration of functional networks in the resting human brain. Neuron. 74 (4), 753-764 (2012).
  12. Stamatakis, A. M., et al. Miniature microscopes for manipulating and recording in vivo brain activity. Microscopy (Oxf). 70 (5), 399-414 (2021).
  13. Gu, Z., Jamison, K., Sabuncu, M. R., Kuceyeski, A. Human brain responses are modulated when exposed to optimized natural images or synthetically generated images. Commun Biol. 6 (1), 1076(2023).
  14. Li, J., et al. Pedot:Pss-based bioelectronics for brain monitoring and modulation. Microsyst Nanoeng. 11 (1), 87(2025).
  15. Lee, C. R., Najafizadeh, L., Margolis, D. J. Investigating learning-related neural circuitry with chronic in vivo optical imaging. Brain Struct Funct. 225 (2), 467-480 (2020).
  16. Kirwan, P., et al. Development and function of human cerebral cortex neural networks from pluripotent stem cells in vitro. Development. 142 (18), 3178-3187 (2015).
  17. Gomez, J., Neco, P., Difranco, M., Vergara, J. L. Calcium release domains in mammalian skeletal muscle studied with two-photon imaging and spot detection techniques. J Gen Physiol. 127 (6), 623-637 (2006).
  18. Sylte, O. C., Muysers, H., Chen, H. L., Bartos, M., Sauer, J. F. Neuronal tuning to threat exposure remains stable in the mouse prefrontal cortex over multiple days. PLoS Biol. 22 (1), e3002475(2024).
  19. Imori, T., Matsuda, H., Tohjo, M., Kamata, Y. An experimental production of suppurative otitis media in dog, and a trial to evaluate the therapeutic effect of cefmetazole on this otitis media. Jpn J Antibiot. 35 (9), 2277-2287 (1982).
  20. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  21. Bray, M. A., et al. Cell painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nat Protoc. 11 (9), 1757-1774 (2016).
  22. Jirkof, P., et al. Assessment of postsurgical distress and pain in laboratory mice by nest complexity scoring. Lab Anim. 47 (3), 153-161 (2013).
  23. Fang, K., Cheng, W., Yu, B. Effects of electroacupuncture at varied frequencies on analgesia and mechanisms in sciatic nerve cuffing-induced neuropathic pain mice. J Mol Neurosci. 74 (4), 98(2024).
  24. Hsiao, I. H., Liao, H. Y., Lin, Y. W. Optogenetic modulation of electroacupuncture analgesia in a mouse inflammatory pain model. Sci Rep. 12 (1), 9067(2022).
  25. Han, J. S. Acupuncture: Neuropeptide release produced by electrical stimulation of different frequencies. Trends Neurosci. 26 (1), 17-22 (2003).
  26. Zeng, L. T., et al. Study on optimization of image processing parameters of pneumoconiosis by DR. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 41 (12), 897-900 (2023).
  27. Costa, F. F., et al. Identification of microRNAs as potential prognostic markers in ependymoma. PLoS One. 6 (10), e25114(2011).
  28. Gazerani, P., Aloisi, A. M., Ueda, H. Editorial: Differences in pain biology, perception, and coping strategies: Towards sex and gender specific treatments. Front Neurosci. 15, 697285(2021).
  29. Masamoto, K., Kanno, I. Anesthesia and the quantitative evaluation of neurovascular coupling. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1233-1247 (2012).
  30. Korsunsky, I., et al. sensitive and accurate integration of single-cell data with Harmony. Nat Methods. 16 (12), 1289-1296 (2019).
  31. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  32. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  33. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: Flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2 (1), 13(2003).
  34. Friedrich, J., et al. Multi-scale approaches for high-speed imaging and analysis of large neural populations. PLoS Comput Biol. 13 (8), e1005685(2017).
  35. Tidball, P., et al. Differential ability of the dorsal and ventral rat hippocampus to exhibit group I metabotropic glutamate receptor-dependent synaptic and intrinsic plasticity. Brain Neurosci Adv. 1 (1), 2398212816689792(2017).
  36. Yang, W., Yuste, R. Holographic imaging and photostimulation of neural activity. Curr Opin Neurobiol. 50 (1), 211-221 (2018).
  37. Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nat Commun. 8 (1), 2153(2017).
  38. Pfeffer, C. K., Xue, M., He, M., Huang, Z. J., Scanziani, M. Inhibition of inhibition in visual cortex: The logic of connections between molecularly distinct interneurons. Nat Neurosci. 16 (8), 1068-1075 (2013).
  39. Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, e28728(2018).
  40. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  41. Godenschweger, F., et al. Motion correction in MRI of the brain. Phys Med Biol. 61 (5), R32-R56 (2016).
  42. Hattori, R., Danskin, B., Babic, Z., Mlynaryk, N., Komiyama, T. Area-specificity and plasticity of history-dependent value coding during learning. Cell. 177 (7), 1858-1872.e15 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Somatosensory CortexTwo Photon ImagingElectroacupuncture StimulationNeural Circuit DynamicsCalcium ImagingCranial Window ImplantationThy1 GCaMP6f MiceSpatiotemporal DynamicsCortical PlasticityNeuromodulation

Related Articles