Interferometria warstwowa do badania wiązania białka membranowego z inhibitorem: Mutacja TACAN i GsMTx4 jako system modelowy

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół optymalizacji i przeprowadzania eksperymentów Bio-Layer Interferometry (BLI) w celu badania interakcji białko-ligand dla białek membranowych uwolnionych przez detergenty. Korzystając z interakcji pomiędzy mutantem TMEM120A M207A a inhibitorem peptydowym GsMTx4 jako modelu, ten przepływ pracy opisuje przygotowanie białka, ładowanie biosensora i pozyskiwanie danych kinetycznych.

Streszczenie

Interferometria warstwowa biologiczna (BLI) to wydajna technika biofizyczna, która umożliwia rzeczywistego czasu, ilościową analizę interakcji biomolekularnych. Chociaż często stosuje się ją do białek rozpuszczalnych, ich zastosowanie do białek błonowych pozostaje wyzwaniem z powodu hydrofobowości i uzależnienia od detergentów. Niniejsze badanie przedstawia zoptymalizowany protokół BLI do charakteryzacji interakcji między białkiem błonowym uwolnionym detergentem a inhibitorem peptydowym.

Jako system modelowy, peptyd modyfikujący przepływ Grammostola mechanotoxin 4 (GsMTx4) został przetestowany na multifunkcyjnym białku błonowym mutantnym TMEM120A M207A. Wariant TMEM120A z etykietą FLAG został unieruchomiony na bioczujnikach przeciwko FLAG-reprezentujących zestaw oparty na etykiecie, ale bez fluorescencji i enzymatycznego znacznika-i wystawiony na kolejne rozcieńczenia GsMTx4 w celu zmierzenia szybkości skojarzenia i dysocjacji.

Protokół integruje optymalizację detergentu za pomocą Lauryl Maltose Neopentyl Glycol (LMNG) oraz uzupełniającą charakteryzację za pomocą fotometrii masowej i różnicowej fluorimetrii skanującej (DSF). Ten przepływ pracy umożliwia niezawodne pomiary kinetyczne i jest kompatybilny z przesiewowym badaniem średniego przepływu. Podejście to może być stosowane do innych systemów białko-liganda błonowego, gdzie utrzymana jest stabilność detergentu. Ogólnie, badanie podkreśla kluczowe parametry wpływające na efektywność unieruchamiania i dostarczanie analitów, wspierając potencjalne zastosowanie BLI w profilowaniu inhibitorów i badaniach mechanistycznych interakcji białek błonowych.

Wprowadzenie

Białka błonowe odgrywają kluczową rolę w istotnych procesach fizjologicznych, w tym w przekaźnictwie sygnałowym, transporcie jonów i metabolitów oraz organizacji błony. Biorąc pod uwagę ich udział w komunikacji komórkowej i homeostazie, stanowią znaczną część celów terapeutycznych w rozwoju klinicznym. Zrozumienie interakcji białko-ligand w błonach jest kluczowe dla wyjaśnienia funkcji i wskazań terapeutycznych. Jednak amfipatyczna natura tych białek i ich zależność od środowisk lipidowych stanowią znaczące wyzwania dla ich oczyszczania, stabilizacji i charakteryzacji biofizycznej.

Rezonans plazmowy powierzchniowy (SPR) i kalorymetria izotermiczna (ITC) to szeroko stosowane techniki do badania kinetyk i termodynamiki interakcji białko-ligand w błonach^1,2. Przy odpowiedniej optymalizacji, obie metody mogą dostarczyć szczegółowych ilościowych informacji, nawet dla zdezaktywowanych detergentem lub rekonstytuowanych białek błonowych. Mikroskalowa termoforezy (MST) została również z powodzeniem zastosowana do oceny powinności wiązania w warunkach prawie naturalnych, szczególnie dla białek błonowych³. Niemniej jednak, te podejścia mogą być ograniczone przez znaczne zużycie próbek, trudności w utrzymaniu stabilności białek błonowych lub ograniczoną kompatybilność z niektórymi systemami detergentów.

Interferometria Bio-Layer (BLI) to technika optyczna w czasie rzeczywistym, która umożliwia ilościowe pomiary interakcji biomolekularnych, w tym tych z udziałem zdezaktywowanych detergentem lub amfipolem białek błonowych. Wraz z wcześniej wspomnianymi technikami biofizycznymi, BLI oferuje wydajną platformę, która umożliwia bezpośrednie pomiary kinetyk wiązania, w tym skojarzenia (k_on), dysocjacji (k_off) i równoważnych stałych dysocjacji (K_D), przy niższych stężeniach próbek i prostej adaptacji do zdezaktywowanych detergentem lub Nanodisc białek błonowych. Warto również zauważyć, że jak wszystkie technologie biofizyczne, BLI ma swoje ograniczenia, które zostaną wspomniane w sekcji Dyskusji.

BLI wykrywa zmiany w wzorcu interferencji światła białego odbitego od końcówki bioczujnika, a zmiany grubości optycznej odpowiadają zjawiskom wiązania biomolekularnego. Te zmiany (Δλ, w nm) są rejestrowane jako senzorgramy i są proporcjonalne do masy związanej na powierzchni czujnika. BLI był szeroko stosowany do interakcji białko-białko i białko-ligand (w tym peptydów i małych cząsteczek) i jest odpowiedni dla zakresów powinności od nanomolarowych do mikromolarowych⁴. Jego elastyczność, niskie zużycie próbek i stosunkowo prosty zestaw sprawiają, że jest potencjalnie korzystnym narzędziem do badania zdezaktywowanych detergentem białek błonowych^5,6,7.

Niniejsze badanie przedstawia protokół BLI do charakteryzacji interakcji między TMEM120A M207A, białkiem błonowym, a Grammostola mechanotoxin 4 (GsMTx4), peptydem inhibitorem. TMEM120A zostało zaproponowane jako mechanoczuły kanał jonowy zaangażowany w wykrywanie bólu mechanicznego⁸; jednak jego aktywność kanałowa pozostaje kontrowersyjna. Wiele badań doniosło o braku mechanoczułych prądów, gdy TMEM120A jest ekspresowane w heterologowych systemach takich jak komórki HEK293 lub CHO^1,9,10,11. Do tej pory ponad cztery badania krio-EM rozwiązały strukturę TMEM120A w stanie zamkniętym i nie zaobserwowano otwartej konformacji^1,9,10,11.

Symulacje dynamiki molekularnej i analizy elektrofizjologiczne wskazują, że metionina 207 (M207) w dzikiego typu ludzkim TMEM120A może działać jako bariera bramkowa w ścieżce przewodzenia jonów¹¹. Mutacja tej rezydu do alaninowej (M207A) została wykazana jako zwiększająca przepuszczalność jonów, prawdopodobnie poprzez zmianę pakowania helis i przemieszczenie hydrofobowych bocznych łańcuchów takich jak Phe223. W konsekwencji, mutant M207A został wybrany do badań wiązania z GsMTx4.

GsMTx4 to peptyd modyfikujący bramki pochodzący z jadu pająka, który hamuje mechanoczułe kanałe kationowe. Składa się z 32 aminokwasowej sekwencji i ma masę cząsteczkową od 4 do 5 kDa, włączając kanały Piezo i TRP, głównie poprzez interakcję z warstwą lipidową, a nie bezpośrednie blokowanie poru^12,13. Poprzednie badania wykazały, że GsMTx4 zmniejsza aktywność TMEM120A w sztucznych systemach dwuwarstwy⁸. W badaniach BLI, mutant TMEM120A M207A został unieruchomiony na bioczujnikach przeciwko FLAG i narażony na rosnące stężenia GsMTx4, co pozwoliło na pomiar szybkości skojarzenia (k_on) i dys

Protokół

1. Oczyszczanie białka i optymalizacja próbki

1. Hodowla komórek i transfekcja
   1. Hodowla komórek zawiesinowych HEK293T/SF17 w pożywie bez surowicy uzupełnionym o 20 mM L-glutaminę w inkubatorze drążącym ustawionym na 120 RPM, 37 °C, 80% wilgotności i 8% CO₂. Utrzymuj komórki poprzez przesadzanie do przebiegu piątego; pozwól komórkom osiągnąć gęstość około 5 × 10⁶ komórek/mL.
   2. Transfekuj komórki plazmidem TMEM120A M207A (N-końcowe FLAG-Linker-3C-Linker-TMEM120A M207A) w wektorze pCDNA3.1, używając komercyjnego reagentu transfekcyjnego zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów).
   3. Osadź transfekowaną zawiesinę komórek przez wirowanie w odśrodkowym w tempie 5000 × g przez 15 min w 4 °C. Przechowuj osad komórkowy w temperaturze -80 °C do czasu oczyszczenia.
2. Lizys komórek i solubilizacja (Rysunek 1)
   1. Zawieś osad 30 mL komórek w buforze solubilizacyjnym zawierającym 100 mM 4-(2-hydroksietylowo)-1-piperazynoetanosulfonian (HEPES), pH 7,8; 300 mM NaCl; 0,5% (w/v) lub 4,98 mM laurylomaltozowo-neopentyloglikol (LMNG); 1x koktajl inhibitorów proteaz; 50 µg DNazy I; 10% (v/v) glicerolu.
   2. Rozbij komórki przez ultradźwięki z amplitudą 25% przy użyciu cyklu pulsującego 20 s włączone/20 s wyłączone przez 15 min, utrzymując próbkę na lodzie, aby zapobiec przegrzaniu.
   3. Wyjaśnij lizat przez wirowanie w odśrodkowym w tempie 25 800 × g przez 45 min w 4 °C.
3. Oczyszczanie wiązaniem powinowactwa za pomocą żywicy anty-FLAG
   1. Równoważ żywicę anty-FLAG M2 buforem równoważącym zawierającym 25 mM HEPES, pH 7,8; 200 mM NaCl; 0,05% (w/v) lub 0,4975 mM LMNG; 10% (v/v) glicerolu.
   2. Inkubaj wyjaśniony nadstan z równoważoną żywicą przez 2 h w 4 °C na rockerze.
   3. Przemyj żywicę 2x buforem płuczącym zawierającym 25 mM HEPES, pH 7,8; 150 mM NaCl; 0,05% (w/v) lub 0,4975 mM LMNG; 10% (v/v) glicerolu.
   4. Eluuj związane białko za pomocą buforu elucyjnego zawierającego 25 mM HEPES, pH 7,8; 400 mM NaCl; 0,001% (w/v) lub 0,00995 mM LMNG; 10% (v/v) glicerolu; 200 µg/mL peptydu FLAG.
4. Koncentracja i chromatografia wykluczająca (SEC)
   1. Skoncentruj eluowane białko do ~500 µL za pomocą jednostki do wirowania z filtrem o przepuszczalności 30 kDa.
   2. Przeprowadź SEC za pomocą wykluczającej kolumny referencyjnej równoważonej buforem 25 mM HEPES, pH 7,8; 200 mM NaCl; 0,00015% (w/v) lub 0,00149 mM LMNG.
   3. Zbieraj i łącz frakcje szczytowe odpowiadające docelowemu białku.
   4. Skoncentruj łączone frakcje do stężenia końcowego ~3 mg/mL. Po oczyszczeniu powinowactwowym potwierdź, że monomer białka TMEM120A M207A pojawia się na około 43 kDa na SDS-PAGE (Rysunek 2A). W przypadku SEC potwierdź, że oczyszczone białko w LMNG eluuje jako monodyspersyjny szczyt odpowiadający około 150 kDa, co reprezentuje dimer TMEM120A M207A wraz z micelą detergentu LMNG (Rysunek 2B).
      UWAGA: Czasami grupa monomerowego białka może pojawić się około 50 kDa, co jest powszechne dla białek membranowych rozpuszczonych w detergentach, ponieważ gotowanie próbek białek membranowych nie jest typowe.

2. Analiza stabilności termicznej za pomocą nano dyferencyjnej skaningowej fluorimetrii (NanoDSF)

1. Rozcieńcz oczyszczone białko TMEM120A M207A do 0,15 mg/mL w buforze SEC (25 mM HEPES, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG).
2. Wprowadź 10 µL każdej próbki do wysokoczułych kapilar.
3. Wykonaj pomiar przesunięcia termicznego w urządzeniu NanoDSF z rampą temperaturową od 25 °C do 90 °C.
4. Użyj kompatybilnego oprogramowania, aby skonfigurować pomiar i przeprowadzić zautomatyzowaną analizę.
5. Potwierdź, że widoczna jest pojedyncza krzywa przejścia termicznego (T_m), wskazująca na współpracujące zdarzenie rozwijania się (Rysunek 3).

3. Fotometria masowa do określenia stanu oligomerycznego

1. Przygotuj próbkę rozcieńczoną do 80 nM w buforze SEC (25 mM HEPES, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG).

Wyniki

Mutant TMEM120 M207A został wyrażony w komórkach zawiesinowych HEK293SF-17 za pomocą wektora pCDNA3.1 kodującego N-końcową etykietę FLAG Rycina 1. Przejściowa transfekcja umożliwiła ekspresję białka rekombinowanego. Po zebraniu komórek białka błonowe zostały solubilizowane w 0,5% laurylomaltozowym neopentyloglikole (LMNG), niejonowym detergentie nadającym się do utrzymania rozpuszczalności białek błonowych.

Solubilizowana frakcja została poddana oczyszczaniu powinowactwowemu za pomocą żywicy anty-FLAG M2. Żywica została przepłukana buforem zawierającym 0,01% LMNG w celu usunięcia białek związanych niespecyficznie, a TMEM120 M207A został eluowany w buforze zawierającym 0,001% LMNG. Eluat został skoncentrowany za pomocą filtrów wirowych z granicami cięć molekularnych 30 kDa lub 100 kDa, w zależności od wydajności próbki. Dalsze oczyszczanie przeprowadzono za pomocą chromatografii wykluczania rozmiarowego (SEC). Ostatni krok SEC przeprowadzono w buforze zawierającym 0,00015% LMNG, co dało monodyspersyjny profil eluacji zgodny z jednorodną i stabilną preparacją białkową nadającą się do dalszych analiz strukturalnych i funkcjonalnych (Rycina 2B).

Optymalizacja i charakterystyka biofizyczna TMEM120 M207A z etykietą FLAG są podsumowane na Rycinie 2. Ekspresja i oczyszczanie zostały potwierdzone przez SDS-PAGE, które wykazało pojedynczą pasmo na poziomie około 50 kDa. Obserwowana migracja była nieco powyżej oczekiwanej masy cząsteczkowej formy monomerycznej (Rycina 2A), prawdopodobnie z powodu próbki niepodgrzanej przed elektroforezą. Chromatogram SEC wyświetlał pojedynczy, symetryczny szczyt eluujący w objętości odpowiadającej pozornej masie cząsteczkowej około 150 kDa w 0,00015% (w/v) LMNG (Rycina 2B), zgodnie z dimerem TMEM120A M207A w micelach detergentu LMNG. To zachowanie eluacji wykazuje jednorodną i monodyspersyjną populację białka, czyniąc ją nadającą się do dalszej charakterystyki biofizycznej.

Właściwości miceli detergentowych LMNG w warunkach buforu eksperymentalnego zostały przeanalizowane za pomocą fotometrii masowej. Pomiary przeprowadzono w buforze SEC o różnych stężeniach LMNG w obecności białka w celu oceny wkładu miceli detergentowych do czystej masy cząsteczkowej. Przy 0,001% (w/v) LMNG, stężeniu powyżej krytycznej koncentracji micelarnej (CMC), główny szczyt został wykryty na poziomie około 69 kDa, odpowiadający samym micelom LMNG bez żadnego związanego białka (Rycina 4A). Kiedy stężenie LMNG zostało zmniejszone do 0,0001% (w/v), poniżej CMC, główny gatunek przesunął się do ~48 kDa, wskazując na obecność mniejszych resztkowych agregatów LMNG lub zespołów submicelarnych bez białka (Rycina 4B). Dalszy w (Rycinie 4C) TMEM120A M207A został rozcieńczony w buforze SEC zawierającym różne stężenia LMNG w celu oceny jego stanu oligomerycznego za pomocą fotometrii masowej. Przy 0,00001% LMNG (~20x poniżej CMC, magenta), dominujący szczyt został zaobserwowany na poziomie około 42 kDa, odpowiadający monomerowi TMEM120A M207A. Przy 0,00015% LMNG (~10x poniżej CMC, niebieski), główna populacja na poziomie ~86 kDa wskazywała na obecność dimerów. Zwiększenie stężenia LMNG do 0,001% (~2x powyżej CMC, pomarańczowy) wynikiem było główny gatunek ~150 kDa, zgodny z kompleksami białko-detergent. Przy 0,002% LMNG (~4x powyżej CMC, zielony), wykryto szerokie rozmieszczenie skupione wokół 180 kDa, reprezentujące większe zespoły związane z micelami lub oligomery wyższej rzędności. Wyniki te pokazują, że stężenie LMNG w buforze SEC mocno wpływa na czysty stan oligomeryczny TMEM120A M207A, przy czym równowaga monomer-dimer obserwowana jest poniżej CMC, a tworzenie kompleksów detergent-białko dominuje powyżej CMC.

Stabilność termodynamiczna TMEM120A M207A zebranego z głównego szczytu SEC i przechowywanego w buforze SEC (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% (w/v) LMNG, pH 7,8) została oceniona za pomocą analizy denaturacji termicznej. Białko wykazywało punkt przegięcia na poziomie około 46 °C, odpowiadający jego temperaturze topnienia (T_m) w tych warunkach solubilizowanego detergentem. Ta wartość T_m wskazuje na umiarkowane stabilność termiczną, sugerując, że TMEM120A M207A zachowuje prawidłowo sfałdowaną konformację w micelach LMNG, ale może zacząć się rozwijać lub skupiać w wyższych temperaturach.

Interferometria biowarstw (BLI) wykazuje powinowactwo wiązania w skali mikromolowej TMEM120A M207A do GsMTx4T. Ślady na Rycinie 5 przedstawiają pięć kroków eksperymentalnych: (1) linia

Dyskusja

Charakteryzowanie interakcji białek membranowych pozostaje wyzwaniem z powodu potrzeby szczegółowej czyszczenia białek, starannej optymalizacji stężenia detergentu i precyzyjnego projektowania testów. Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy proces przepływu pracy dla TMEM120A M207A, ilustrując zarówno oczyszczanie, jak i analizę kinetykę z wykorzystaniem GsMTx4 z interferometrią warstwową (BLI).

Krytyczne kroki i optymalizacja:
Jednym z ważnych krytycznych kroków było stężenie detergentu, które zostało zidentyfikowane jako główny determinant stabilności białka. Proces czyszczenia obejmował solubilizację komórek w buforze zawierającym 0,5% LMNG, następnie sekwencyjne mycie 0,005% LMNG, elucję z 0,001% LMNG i końcowe przesiewanie frakcyjne (SEC) w buforze zawierającym 0,00015% LMNG. Ta strategia stosowania detergentu, oparta na niskiej krytycznej koncentracji miceli (CMC) LMNG i powolnej szybkości odłączania, zapewniła lepszą stabilność białka w micelach podczas czyszczenia. Bufor SEC zawierał detergent w stężeniu 10-krotnie niższym od CMC LMNG (0,001%), co skutecznie zminimalizowało jego wpływ na dalsze badania biofizyczne. Jednorodność białka i brak agregacji zostały potwierdzone za pomocą spektrometrii masowej i analizy stabilności termicznej. Rysunek 2, Rysunek 3 i Rysunek 4 przedstawiają pomyślną optymalizację czyszczenia i stabilizacji białka w koncentracjach detergentu poniżej CMC.

Imobilizacja białka na bioczujniku była starannie kontrolowana, aby osiągnąć 50-80% nasycenia sondy. Poziom ładowania 50-80% może wprowadzić pewien stopień ograniczenia transportu masy; jednak ten zakres został wybrany, aby zapewnić odpowiednią siłę sygnału w systemie BLI, gdzie sondy poruszały się między dołkami podczas testu. Osiągnięcie tego poziomu imobilizacji ligandu pomogło w utrzymaniu jednolitej jakości sygnału, choć takie poziomy ładowania mają zarówno zalety, jak i potencjalne ograniczenia. Dołączenie sondy referencyjnej było kluczowe dla eksperymentów BLI.

Dodatkowe eksperymenty kontrolne, w których przetestowano cztery różne poziomy zimobilizowano TMEM120A z pojedynczą koncentracją peptydu (100 nM). Te dane są teraz zawarte w zmienionym rękopisie (Dodatkowy Rysunek S1). Zwiększenie ilości zimobilizowano białka skutkowało wyższymi sygnałami ładowania, ale we wszystkich przypadkach przesunięcie pozostało poniżej 1 nm od linii wyjściowej (Dodatkowy Rysunek S1A). Przedstawiliśmy dopasowane krzywe skojarzenia i dysocjacji za pomocą globalnego modelu wiązania 1:1, a także dołączyliśmy wykresy pozostałości, które pokazują małe, nieistotne różnice między dopasowanymi a eksperymentalnymi danymi.

W głównych testach kinetycznych (5-100 μM analit), dopasowane stałe kinetyczne wykazywały oczekiwane trendy zależne od stężenia. Wartości k_off wahały się od około 1,48 x 10^-5 do 1,43 x 10^-4 s^-1, podczas gdy wartości k_on wahały się od 1,12 x 10^-2 do 1,26 x 10^-5 M^-1s^-1. Te stopniowe zmiany w serii stężeń są zgodne z normalnym zachowaniem skojarzenia i dysocjacji zależnym od analitu.

W eksperymencie kontrolnym, gdzie różne poziomy ładowania sondy były testowane na pojedynczej koncentracji analitu (100 nM), wszystkie cztery ślady dały bardzo podobne stałe kinetyczne. Wartości k_off były zawsze 1,42 x 10^-5 s^-1, a wartości k_on były zawsze 2,76 x 10^-3 M^-1s^-1 dla wszystkich poziomów ładowania. Ta brak zmian sugeruje, że ani faza skojarzenia, ani faza dysocjacji nie zostały wpłynięte na gęstość sondy, ograniczenia transportu masy lub ponowne wiązanie analitu.

Oczekuje się również, że dysocjacja na 100 nM wydaje się szybsza w eksperymencie kontrolnym. Stężenie analitu 100 nM jest mniej więcej o rząd wielkości poniżej K_D, a na stężeniach znacznie poniżej K_D kompleks jest mniej stabilny, a efektywne obciążenie jest niskie. W takich warunkach dysocjacja przebiega szybciej, ponieważ siła wiązania jest słabsza przy niskich stężeniach analitu, a ponowne skojarzenie podczas fazy dysocjacji jest minimalne. To zachowanie jest zgodne z tym, co zazwyczaj obserwuje się, gdy stężenie analitu jest znacznie niższe od K_D.

Biorąc pod uwagę spójność parametrów kinetycznych między ładowaniami sond a oczekiwanym zachowaniem przy niskich stężeniach analitu, wspiera to hipotezę, że obserwowane stałe kinetyczne odzwierciedlają prawdziwe właściwości wiązania, a nie artefakty z

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
384-well black microplate	Greiner Bio-One	781906	BLI
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCO	Sigma-Aldrich	UFC903008	Purification
Anti-FLAG probe	Gator Bio	160036	BLI
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-10ML	Purification
BioRender	BioRender	https://biorender.com	Figure 1 creation
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Mass photometry
CD 293 Medium (1x)	Thermofisher	11913019	Cell culture
Centrifuge 5920 R: Large Capacity and High Performance	Eppendorf	NA	Purification
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Merck	11836170001	Purification
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	9003-98-9	Purification
ExpiFectamine 293 Transfection Kit	Thermofisher	A14524	Transfection
Gator Bio software	Gator Bio	NA	BLI
Gator Plus	Gator Bio	NA	BLI
GlutaMAX Supplement	Thermofisher	35050061	Cell culture
GsMTx4 trifluoroacetate	Sigma-Aldrich	SML3140-1MG	BLI
HEK293T/SF17 cells adapted to suspension growth	ATCC	ATCC CRL11268	Cell culture
LMNG (Lauryl maltose neopentyl glycol)	Thermofisher	A50940	Purification
Max Plate	Gator Bio	130062	BLI
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	11359061001	Purification
Prometheus High Sensitivity Capillaries	Nano Temper	PR-C006	Thermodynamic stability
Prometheus Panta	Nano Temper	NA	Thermodynamic stability
Q Buffer (0.3% Glycine pH 3.8)	Gator Bio	120010	BLI
Qsonica Q500 Sonicator Ultrasonic Cell Disrupter	Qsonica	NA	Purification
Superdex 200 Increase 10/300 GL	Cytiva	GE28-9909-44	Purification
Synthesized TMEM120A (M207A) gene cloned into pCDNA 3.1 plasmid with FLAG-3C-Linker	GenScript Biotech	NA	Plasmid
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379-25ML	BLI
Two MP	Refeyn	NA	Mass photometry