Artykuł metodologiczny

Efektywna i szybka generacja komórek zabójczych indukowanych przez CAR-T i cytokiny w urządzeniach skalowalnych GMP

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69369

⸱

5 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Immunology and Molecular Oncology Unit, Veneto Institute of Oncology IOV - IRCCS, 2Department of Surgery, Oncology and Gastroenterology, University of Padua, 3Department of Cardiac, Thoracic, Vascular Sciences and Public Health, University of Padua

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje skalowalną metodę rozszerzania produktów Adoptive Cell Therapies (ACT), mianowicie komórek Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T oraz komórek zabójczych indukowanych cytokinami (CIK), wykorzystujących urządzenia Gas-permeable Rapid Expansion (G-Rex), wykazując efektywny i solidny wzrost w klinicznie istotnych warunkach.

Streszczenie

Terapie komórkami adopcyjnymi (ACT) szybko się rozwijały w ostatnich latach, odgrywając kluczową rolę w immunoterapii nowotworowej i znacząco wpływając na wyniki leczenia. Kluczowym etapem w rozwoju terapii komórkowej, zarówno na etapie przedklinicznym, jak i klinicznym, jest proces produkcji. Konwencjonalne metody hodowli statycznej wymagają częstej manipulacji komórkową i często są ograniczone przez zmniejszoną wymianę gazów oraz dostarczanie składników odżywczych, co może obniżać wydajność i fenotyp komórek. Przedstawiamy tutaj krok po kroku, powtarzalny i skalowalny protokół ekspansji ex vivo dwóch produktów ACT, mianowicie komórek Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T oraz Cytokine-Induced Killer (CIK), wykorzystujących urządzenia Gas-permeable Rapid Expansion (G-Rex). Urządzenia G-Rex zostały specjalnie zaprojektowane, aby zwiększyć wymianę składników odżywczych i wspierać hodowle o wysokiej gęstości przy minimalnej ingerencji użytkownika. Wśród różnych podejść ACT, komórki CAR-T wykazały niezwykłe sukcesy w leczeniu nowotworów hematologicznych, umożliwiając szybki rozwój od badań eksperymentalnych do zastosowań klinicznych. Oprócz komórek CAR-T, komórki CIK były również szeroko stosowane w badaniach klinicznych ze względu na charakterystyczny fenotyp oraz brak działań niepożądanych związanych z leczeniem oraz choroby przeszczepu przeciwko gospodarzowi (GvHD). Protokół ten określa kluczowe kroki techniczne dla obu typów komórek, zaczynając od izolacji i zasiewania komórek jednojądrowych krwi obwodowej (PBMC). W skrócie, PBMC są stymulowane przeciwciałami anty-CD3/CD28, po czym następuje transdukcja lentiwirusowa w celu rozszerzenia komórek CAR-T, lub interferon-γ (IFN-γ), przeciwciało przeciwCD3 oraz interleukina 2 (IL-2) w celu uzyskania komórek CIK. Cytometria przepływowa jest stosowana do monitorowania żywotności i fenotypu komórek, a w celu potwierdzenia potencjału terapeutycznego produktu komórkowego i potwierdzenia skalowalności podejścia wykonywane są testy funkcjonalne. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten stanowi praktyczne rozwiązanie do produkcji dużej liczby komórek efektorowych w warunkach przedklinicznych, ułatwiając zastosowanie kliniczne w kilku populacjach komórek odpornościowych. Wreszcie, oferuje skalowalne rozwiązanie do produkcji ogniw efektorowych o wysokiej wydajności.

Wprowadzenie

Terapia komórkami adopcyjnymi (ACT) stała się ważnym filarem zaawansowanych terapii w leczeniu nowotworów. Podejście to opiera się na podawaniu ex vivo rozszerzonych produktów komórkowych w celu osiągnięcia skuteczności przeciwnowotworowej1. Do tej pory w ACT wykorzystano wiele typów komórek, od podejść antygenowo-specyficznych, np. naturalnego zabójcy (NK)2, zabójcy indukowanego cytokinami (CIK)3,4, naturalnego zabójcy T (NKT)5 lub γδ T6, po wysoce specyficzne i spersonalizowane komórki, takie jak limfocyty infiltrujące guzy (TILs)7 oraz inżynieryjne terapie komórkowe, np. chimeryczne receptory antygenowe (CAR)1, Komórki receptorów 8 i T (TCR) 9,10.

Komórki CAR-T to genetycznie zmodyfikowane komórki T powstające w wyniku transdukcji wirusowej ex vivo , aby wyrazić syntetyczny receptor odpornościowy, zaprojektowany do rozpoznawania konkretnego celu molekularnego. Struktura CAR składa się z antygenowo-specyficznego przeciwciała fragmentu zmiennego o zmiennej zmienności (scFv) w połączeniu z wewnątrzkomórkowymi domenami sygnalizacyjnymi, w tym łańcuchem TCRζ oraz cząsteczkami kostymulującymi. Po zaangażowaniu antygenów domena wewnątrzkomórkowa dostarcza sygnały aktywacyjne sprzyjające proliferacji limfocytów T i aktywności przeciwnowotworowej11.

Komórki CIK to heterogeniczna populacja aktywowanych limfocytów T, które nabywają ekspresję CD56 podczas ekspansji ex vivo z jednojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC) lub krwi pępowinowej (UCB)12. To rozszerzenie obejmuje stymulację interferonem γ (IFN-γ), przeciwciałem monoklonalnym przeciw CD3 oraz interleukiną-2 (IL-2), po czym następuje hodowla w IL-2 przez 14 dni. Komórki CIK funkcjonalnie przypominają zarówno komórki NK, jak i T, wykazując aktywność przeciwnowotworową zarówno poprzez mechanizmy niezależne od kompleksu tkankowego (MHC) i zależneod tego typu 13,14,15,16. Te właściwości pozwalają komórkom CIK być wykorzystywane zarówno w środowiskach terapeutycznych allogenicznych, jak i autologicznych, przy minimalnym ryzyku choroby przeszczepu kontra-gospodarza (GvHD)17.

W praktyce klinicznej zarówno terapie komórkowe CAR-T, jak i CIK wymagają podawania dużej liczby komórek. Komórki CAR-T są podawane w dawce 50-200 milionów dawek na pacjenta18 lat. Podobnie komórki CIK są zazwyczaj podawane w dawkach do 10 miliardów komórek na infuzję, przy czym pacjenci często otrzymują wiele wlewów w zależności od protokołu leczenia19. Tradycyjne metody hodowli komórkowej z użyciem kolb lub płyt są nieefektywne, czasochłonne i wymagają częstego przepuszczania, co uniemożliwia dużą ekspansję i zwiększa ryzyko skażenia. Zautomatyzowane lub półautomatyczne systemy wykorzystujące hodowle workowe lub bioreaktory pozwalają na dużą skalę ekspansji, ale mają ograniczenia, np. naprężenia ścinające, konieczność regulacji gęstości i częstej perfuzji medium20,21, a także obsługa jednej partii naraz, co prowadzi do wysokich kosztów zarówno w kontekście akademickim, jak i przemysłowym. W tej trudnej sytuacji alternatywą jest urządzenie o szybkim rozszerzaniu przepuszczalnym dla gazów (G-Rex), statyczna metoda hodowli wyposażona w membranę krzemową na dnie odwiertu, która zapewnia efektywną wymianę tlenu i zwiększanie wysokości zbiorników, umożliwiając dużą pojemność średniej objętości. System wspiera wzrost komórek bez wymiany medium lub regulacji gęstości22,23. Systemy G-Rex-M wykazały skalowalność do 5000 mL i są kompatybilne z automatycznymi systemami pobierania, zapewniając platformę wolną od zanieczyszczeń i zamkniętą hodowlę, którą łatwo przekładać z środowiska akademickiego na kliniczną do opracowywania zaawansowanych produktów leczniczych (ATMPs)24.

W opisanej procedurze wykorzystaliśmy zalety i cechy urządzeń G-Rex, aby zoptymalizować protokół rozbudowy zarówno komórek CAR-T, jak i CIK. Wykazaliśmy, że oba typy komórek można efektywnie rozszerzać i skalować, utrzymując spójny fenotyp i profil funkcjonalny w różnych systemach hodowli. Schematyczny przegląd protokołu rozbudowy zarówno dla komórek CIK, jak i CAR-T przedstawiono na Rysunku 1.

Rysunek 1
Rysunek 1: Przegląd protokołów rozbudowy komórek CAR-T i CIK z wykorzystaniem urządzeń hodowli G-24 lub G-6M. Komórki CAR-T i CIK są rozszerzane z izolowanych PBMC od dnia 0. W celu rozbudowy komórek CAR-T PBMC są stymulowane w pierwszym dniu przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, genetycznie modyfikowane w dniu 2, a następnie hodowane suplementacją hIL-7 i hIL-15 co 3-4 dni, z końcowym pobraniem do testów funkcjonalnych w dniu 9. W formacie G-6M suplementacja cytokin jest ograniczona do 2. dnia, bez konieczności dalszego karmienia cytokiny przez cały okres hodowli. W celu rozszerzenia komórek CIK PBMC są stymulowane pierwszego dnia rhIFN-γ a drugiego dnia przeciwciałem anty-CD3 i rhIL-2, które następnie podaje się co 3-4 dni. W przypadku G-24 wymagana jest zmiana medium równocześnie z suplementacją cytokiną. Komórki CIK są pobierane 14 dnia do dalszych testów funkcjonalnych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Protokół

Zanonimizowane płaszcze buffy od zdrowych dawców wcześniej przebadanych pod kątem braku zakażenia patogenami (np. HIV, HCV, HBV, kiła) zostały pobrane z Banku Krwi Szpitala w Padwie przed uzyskaniem pisemnej świadomej zgody. Próbki krwi były manipulowane w certyfikowanych szafkach na zabezpieczenia biologicznego, a personel nosił odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE).

UWAGA: Wszystkie procedury z użyciem wektorów lentiwirusowych przeprowadzono w warunkach poziomu BioSafety 2 (BSL-2), zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Obsługa wektorów lentiwirusowych wymaga dodatkowych środków ostrożności, w tym podwójnego zakładania rękawiczek. Odpady biologicznie niebezpieczne (w tym materiały wirusowe, komórki przetworzone i próbki pochodzące od człowieka) były autoklawowane przed utylizacją, natomiast odpady chemiczne (w tym fluorescencyjne barwniki i odczynniki) wymagały segregacji zgodnie z instytucjonalnymi protokołami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych. Należy pamiętać, że specyficzne wymagania dotyczące bezpieczeństwa biologicznego mogą się różnić w zależności od instytucji i należy je zweryfikować przed wdrożeniem protokołu.

1. Izolacja PBMC

  1. Izoluj PBMC z zdrowych sierści buffy coat lub próbek krwi obwodowej za pomocą wirowania gradientu gęstości. Rozcieńcz warstwę buffy równą ilością sterylnej soli fosforanowej 1x Phosphate Buffer Injection (PBS) i ostrożnie ułóż rozcieńczoną krew na tej samej objętości Lymphoprepu w stożkowej probówce o pojemności 50 mL. Rozcieńczenie 1x PBS nie jest konieczne dla krwi obwodowej. Wiruj w 400 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej bez hamulca.
  2. Po wirowaniu zbieraj warstwę PBMC na styku plazma-limfoprep i myj ją sterylnym 1x PBS. Wirówka i ponowna zawiesina PBMC w pożywce hematopoetycznej (CM) uzupełnionej o 1% penicyliny/streptomycyny (dalej cCM). Oceń liczbę komórek i żywotność za pomocą testu wykluczenia Trypan Blue.

2. Ekspansja komórek CAR-T z PBMC w naczyniach hodowlanych G-24

  1. Aktywacja PBMC (Dzień 0)
    1. Ponownie zawieszę 2 x 106 świeżo wyizolowanych PBMC w 2 mL cCM uzupełnionych 5% surowicą płodową bydła (FBS) (dalej cCM-F), co daje końcową gęstość nasiania 1 x 106 PBMC /cm2/mL, i przeniesiono do studni naczynia hodowlanego G-Rex (G-24) z 24 dołkami. Zasiać tyle studni, ile zależy od różnych warunków transdukcji do wykonania w dniu 1 (Krok 2.2 – Dzień 1).
    2. Do każdego dołku należy bezpośrednio do każdego dołku dodać 4 μl przeciwciał anty-CD3 (czystofunkcjonalny stopień, końcowe stężenie: 0,2 μg/mL) oraz 20 μl anty-CD28 (czysta funkcjonalność, końcowe stężenie: 1 μg/mL) bezpośrednio do każdego dołku, aby aktywować limfocyty T. Komórki hodowlane w nawilżonym inkubatorze utrzymywane w temperaturze 37 °C, 5%CO2.
  2. Transdukcja limfocytów T wektorami lentiwirusowymi (dzień 1)
    1. Po nocnej stymulacji pobierz i policz aktywowane limfocyty T za pomocą testu wykluczenia Trypan Blue w celu oceny żywotności. Oblicz 1 x 10 6 żywotnych aktywowanych komórek dla każdego dołku G-24 (powierzchnia studni 2 cm2), co odpowiada gęstości zasiewnej 0,5 x 106 komórek/cm². Przełóż ogniwa do probówki i wiruj w 300 x g przez 5 minut.
    2. Przygotuj posiłek transdukcyjny dla każdego dołku, łącząc odpowiednią objętość wektora lentiwirusowego, opartą na stężeniu (TU/mL) przygotowania wektora lentiwirusowego (tutaj lentiwirus CD19-CAR-BBζ uzyskany w St. Jude Children's ResearchHospital 25; multiplicity of infection (MOI) 20), z 5 μl siarczanu protaminy wzmacniającej transdukcję (roztwór stockowy 8 mg/mL uzyskuje się przez rozpuszczenie siarczanu protaminy w 1x PBS i sterylnie filtrowany 0,2 μm filtr; końcowe stężenie 50 μg/mL). Użyj pożywki CM z dodatkiem 5% FBS bez dodatku penicyliny/streptomycyny, aby osiągnąć końcową objętość 0,8 mL/dołek (0,4 mL/cm²). Do kontroli nietransdukowanej (UTD) przygotuj opisane medium transdukcyjne, unikając dodawania wektora lentiwirusowego.
    3. Ponownie zawiesijcie komórki z pelletami (krok 2.2.1) w 0,8 mL/dołek medium transdukcyjnego i załóżcie je w nowym dołku G-24. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5%CO2.
      UWAGA: Jeśli planowana jest transdukcja wielu dołków tym samym wektorem lentiwirusowym, przygotuj mieszankę główną pożywki transdukcyjnej zawierającej wirusa i siarczan protaminy w pożądanym stężeniu. Dokładnie wymieszaj, aby zapewnić jednolitość. Następnie aliquot 0,8 mL tego wymieszania głównego do każdej probówki z osadami komórek w peletach, aby zagwarantować spójne warunki transdukcji we wszystkich próbkach.
  3. Hodowla i ekspansja komórek CAR-T (dzień 2 do 9)
    1. W dniu 2 zwiększyć objętość hodowli do ostatecznej objętości 8 mL/dołek, dodając 7,2 mL świeżego cCM-F, uzupełnionego ludzką interleukiną-7 (hIL-7) i ludzką interleukiną-15 (hIL-15) w końcowym stężeniu 10 ng/mL każda (objętość cytokin obliczana jako całkowita objętość 8 mL na dołek).
    2. W dniu 5 odśwież podłoże hodowlane, ostrożnie usuwając 6 mL podłoża kondycjonowanego z każdego dołku, nie naruszając komórek na dnie i zastępując go 6 mL świeżego cCM-F wzbogaconego o hIL-7 i hIL-15 (końcowe stężenie: 10 ng/mL obliczane z uwzględnieniem całkowitej objętości 8 mL na dołek). Jeśli pracujesz z wieloma otworami, przygotuj mieszankę główną z nośników cCM-F wzbogaconą o cytokiny hIL-7 i hIL-15, aby zapewnić równomierne rozłożenie cytokin.
    3. W 9. dniu ogniwa CAR-T są efektywnie rozbudowywane i gotowe do dalszych zastosowań. Aby pobrać komórki CAR-T, delikatnie usuń i wyrzuć 5 ml podłoża kondycjonowanego. Używając pipety 1000 μL, ponownie zawiesij ogniwa CAR-T w pozostałych 3 mL nośnika i przenieś je do rurki 15 mL. Policz komórki CAR-T i sprawdź ich żywotność za pomocą testu wykluczenia Trypan Blue. Zazwyczaj z każdego otworu G-24 uzyskuje się około 3 x 10 7 komórek CAR-T (3,24 ± 1,67 x 107 komórek) (Tabela Uzupełniająca 1).

3. Rozszerzenie CIK na jednostkach kultury G-24

  1. Aktywacja PBMC (Dzień 0)
    1. Nasiać 1 x 106 świeżo izolowanych PBMC dla każdego odwiertu w zbiorniku hodowlanym G-24, co odpowiada gęstości 0,5 x 106/cm2, w 8 mL cCM uzupełnionym rekombinowanym ludzkim interferonem-γ (rhIFN-γ, końcowe stężenie: 1000 IU/mL). Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C, 5%CO2.
  2. Stymulacja i ekspansja komórek CIK (Dzień 1 do Dzień 14)
    1. W dniu 1, 22-24 godziny po stymulacji rhIFNγ, należy bezpośrednio do każdego dołku dodać 4 μL przeciwciał przeciwCD3 (końcowe stężenie: 50 ng/mL) oraz 4 μL rekombinowanej ludzkiej interleukiny-2 (rhIL-2, końcowe stężenie: 500 IU/mL). Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C, 5%CO2.
    2. Co 3 do 4 dni (w dniu 5, 9 i 12 hodowli komórek) zastąpić 6 mL kondycjonowanego podłoża świeżym cCM i rhIL-2 (końcowe stężenie: 500 IU/mL), obliczając końcowe stężenie rhIL-2 względem pełnej objętości 8 mL.
    3. Czternastego dnia pobierz komórki CIK, wyrzucając 5 mL podłoża kondycjonowanego i ponownie zawieszając je w pozostałych 3 mL podłoża kondycjonowanego. Przełóż komórki do probówki o pojemności 15 ml i oceniaj całkowitą liczbę komórek oraz żywotność komórek za pomocą testu wykluczenia Trypan Blue. Zazwyczaj z każdego dołku uzyskuje się około 8 x 10 komórek CIK7 (8,6 ± 4,58 x 107 komórek) (Tabela Uzupełniająca 2).
      UWAGA: Podczas zmian ośrodka ostrożnie zasysaj supernatant, uważając, aby nie zakłócić populacji warstwy komórkowej ani nie dotknąć błony przepuszczalnej dla gazów. Uszkodzenie błony może utrudniać wymianę gazową i negatywnie wpływać na żywotność komórek.

4. Produkcja na dużą skalę ogniw CAR-T i CIK

UWAGA: Protokoły rozbudowy komórek CAR-T i CIK opisane w Sekcjach 2 i 3 można łatwo skalować do większych urządzeń hodowli G-Rex, mianowicie formatu G-6M. Podczas przejścia z formatu G-24 (powierzchnia: 2 cm2) na urządzenie G-6M (powierzchnia: 10 cm2) wszystkie stężenia i gęstości pozostają stałe, podczas gdy wszystkie objętości i bezwzględne są proporcjonalnie zwiększane pięciokrotnie, aby dopasować się do zwiększonej powierzchni. Oznacza to, że gęstość zasiewów komórkowych, stężenia uzupełniające podłoże i stężenia cytokin pozostają niezmienione, ale całkowite objętości podłoża, liczba komórek zasiewanych oraz bezwzględne ilości dodanych cytokin będą proporcjonalnie zwiększane. Ta funkcja skalowalności umożliwia płynne przejście od protokołów badań na małą skalę do produkcji przedklinicznej lub wczesnej klinicznej bez konieczności znaczących modyfikacji protokołu, co pozwala zachować spójne cechy komórek efektorowych.

  1. Rozszerzenie komórek CAR-T w urządzeniach formatu G-6M
    1. Aktywacja PBMC w dniu 0 oraz transdukcja lentiwirusowa w dniu 1, zgodnie z opisem w sekcji 1, utrzymując wszystkie stężenia i gęstości przy zwiększaniu objętości i ilości bezwzględnych o czynnik pięciokrotny.
    2. Drugiego dnia podnieś objętość hodowli do łącznie 100 mL przy użyciu podłoża cCM-F. Oblicz i dodaj hIL-7 oraz hIL-15, aby uzyskać końcowe stężenie 10 ng/mL.
      UWAGA: W przeciwieństwie do formatu G-24, wyższa konstrukcja urządzenia G-6M pozwala na większą średnią objętość, umożliwiając stałe dostarczanie składników odżywczych i cytokin przez cały okres hodowli bez konieczności wymiany podłoża (podejście "Fill and Forget "). Dlatego w piątym dniu nie są wymagane dodatkowe cytokiny.
    3. Aby pobrać komórki CAR-T w 9. dniu, należy wyrzucić około 90 ml pożywki z każdego dołku za pomocą pipety serologicznej i ponownie zawiesijować komórki w pozostałych 10 mL. Przełóż komórki do probówki 15 mL i użyj ich do kolejnych badań.
  2. Rozszerzenie komórek CIK w urządzeniach formatu G-6M
    1. Wykonaj zasiewanie PBMC w dniu 0, zgodnie z protokołem opisanym w Sekcji 3 i zwiększ wszystkie objętości oraz odczynniki pięciokrotnie, aby dopasować się do większego formatu urządzenia (G-6M).
    2. Pierwszego dnia dostosuj objętość hodowli do łącznie 100 mL z podłożem cCM. Do każdego otworu należy dodać końcowe stężenie 500 IU/mL rhIL-2 oraz 50 ng/mL anty-CD3.
    3. Suplementuj 500 IU/mL rhIL-2 co 3-4 dni (dzień 5, 9 i 13) do każdego dołka bez zmiany medium.
    4. Komórki CIK pobieraj 14. dnia, usuwając około 90 ml podłoża z każdego dołku pipetą serologiczną. Ponownie zawiesić komórki w pozostałych 10 mL, przenieść je do probówki 15 mL i użyć do kolejnych testów.

5. Charakterystyka fenotypu komórek efektorowych za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Na końcu protokołu rozszerzania przeprowadza się analizę markerów powierzchniowych za pomocą cytometrii przepływowej na komórkach CAR-T i CIK w celu oceny ich fenotypu, w tym różnych stanów różnicowania, tj. Naiwne (CD45RA+CD62L+), pamięci centralnej (CM, CD45RA-CD62L+), pamięci efektorowej (EM, CD45RA-CD62L-) oraz pamięci efektorowej CD45RA (EMRA, CD45RA+CD62L-; Rysunek uzupełniający 1A-B).

  1. Zbierz 3 x 10 komórekpo 5 komórek do każdej tubki barwiącej. Płucz komórki w 1x PBS z 1% FBS (PBS-F), wiruj w 300 x g przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesij pellet komórkowy w 50 μL roztworu mieszanki przeciwciał przygotowanej w buforze barwniczym (1 część buforu Brilliant i 1 część PBS-F) zgodnie z pożądanym panelem barwienia (Tabela 1 i Tabela 2).
  2. Inkubuj komórki przez 20 minut w temperaturze 4 °C chronione przed światłem, następnie umyj zabarwione komórki i przeprowadź w wirówce. Jeśli wymagany jest drugi etap barwienia, przeprowadź barwienie konkretną mieszanką przeciwciał, jak opisano wcześniej (krok 5.1).
  3. Na koniec umyj komórki i połóż barwnik żywotny, tutaj Fixable Viability Stain 780 (FVS780), w 50 μL 1x PBS, inkubując przez 15 minut w temperaturze 4 °C chronionej przed światłem. Po barwieniu żywotności nie jest wymagany proces mycia. Po inkubacji należy do każdej próbki dodać 200 μL 1x PBS i przejść do akwizycji cytometrycznej przepływu. Szczegółowa strategia bramkowania została przedstawiona na Rysunku Uzupełniającym 1A-B.
CelKlonFluorochromStężenie/rozcieńczenieCel
Pierwszy etap barwieniarhCD19-His//2 μg/mLWykrywanie cząsteczek CAR
Inkubacja w 4 °C przez 20 minut
Etap mycia
Drugi etap barwieniaJegoGG11-8F3.5.1WF1/50Wykrywanie cząsteczek CAR
CD3UCHT1BV5101/40Rodowód
CD4SK3BV6501/40Rodowód
CD8RPA-T8BV4211/20Rodowód
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83Dojrzewanie
CD62LDREG-56FITC1/10Naprowadzanie, aktywacja
Inkubacja w 4 °C przez 20 minut
Etap mycia
Trzeci etap barwieniaFVS780//1/5000Rozróżnianie żywych/martwych komórek
Inkubacja w 4 °C przez 15 minut

Tabela 1: Panel przeciwciał stosowany do barwienia komórek CAR-T. Panel barwienia używany do oceny ekspresji CAR, fenotypu limfocytów T oraz statusu różnicowania. Przedstawiono klon przeciwciał, stężenie oraz sprzężony fluorochrom dla każdego interesującego celu.

CelKlonFluorochromRozcieńczenieCel
Pierwszy etap barwieniaCD56HCD56WF1/40Rodowód
NKG2D1D11APC1/83Aktywacja
CD3UCHT1BV5101/40Rodowód
CD4SK3BV6501/40Rodowód
CD8RPA-T8BV4211/20Rodowód
CD45RAHI100PerCP-Cy5.51/83Dojrzewanie
CD62LDREG-56FITC1/10Naprowadzanie, aktywacja
Inkubacja w 4 °C przez 20 minut
Etap mycia
Drugi etap barwieniaFVS780//1/5000Rozróżnianie żywych/martwych komórek
Inkubacja w 4 °C przez 15 minut

Tabela 2: Panel przeciwciał stosowany do barwienia komórek CIK. Panel barwienia używany do oceny subpopulacji CIK, fenotypu i statusu różnicowania. Przedstawiono klon przeciwciał, stężenie oraz sprzężony fluorochrom dla każdego interesującego celu.

6. Ocena specyficznej aktywności cytotoksycznej komórek CAR-T i CIK

UWAGA: Aktywność cytotoksyczna komórek CAR-T i CIK mierzona jest poprzez współhodowlę z komórkami docelowymi w pożądanym stosunku efektorów do komórek docelowych (E:T). Rodzaj testu zależy od rodzaju komórek docelowych, czy pochodzą one z guzów litych lub nowotworów hematologicznych. W tym protokole opisujemy fluorescencyjną cytometrię przepływową opartą na barwnikach komórkowych dla komórek zawiesnych oraz test analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) oparty na impedancji dla komórek adherentnych.

  1. Cytometria przepływowa oparta na barwnikach fluorescencjowych
    UWAGA: Cytotoksyczność antygenowo-specyficzna wobec nowotworów hematologicznych można ocenić za pomocą testu cytometrii przepływowej opartej na barwnikach fluorescencyjnych. Przed współhodowlą komórki docelowe są oznaczane barwnikami fluorescencyjnymi, aby umożliwić ich identyfikację. Po współhodowli z komórkami efektorowymi śmierć komórek docelowych ocenia się przez barwienie barwikiem o żywotności. Analiza cytometryczna przepływu pozwala na ilościowe określenie zabijania specyficznego dla antygenu, na podstawie udziału nieżywotnych komórek fluorescencyjnych barwnikowych.
    1. Dla każdego warunku współhodowli należy zebrać 2 x 10 komórek po5 celów i ponownie zawiesić je w 400 μL kompletnego nośnika hodowlanego, aby uzyskać końcowe stężenie 5 x10 5 komórek /mL. Dodaj barwnik fluorescencyjny w końcowym stężeniu 5 μM (tutaj barwnik Cell Trace Violet, CTV). Inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C, chroniony przed światłem. Po inkubacji przemyj komórki raz pełnym medium i ponownie zawiesuj pellet w końcowym stężeniu 4 x 105 komórek /mL.
    2. Podawaj 500 μL barwionej zawiesiny komórek docelowych (tutaj 2 x 10 5 komórek Raji jako model komórki zawieszeniowej CD19+) do czystych probarek 5 mL zgodnie z konfiguracją eksperymentalną. Potwierdzenie skutecznego barwienia za pomocą cytometrii przepływowej, identyfikując komórki docelowe jako komórki pozytywne na fluorescencyjną substancję (SSC-A kontra CTV). Zaleca się około 98% komórek fluorescencyjnych barwnikowych.
    3. Równolegle policz i przygotowuj komórki efektorowe (tutaj 5 x 10 6 komórek CD19 CAR-T) dla każdego warunku współhodowlania. Przemyj komórki i ponownie zawiesij je w kompletnej pożywce hodowlowej w odpowiednim stężeniu, aby dopasować pożądany stosunek efektora do celu (E:T). Do każdej odpowiadającej rurki zawierającej komórki docelowe dodaj 500 μL zawiesiny ogniwa efektorowego.
      1. Aby uzyskać stosunek E:T 25:1, dodaj 5 x 10 efektorowych ogniw CD19 CAR-T do 2 x 10 ogniw Raji po5 w każdej probówce i przygotuj tyle rurek, ile wymaga eksperymentalny projekt.
    4. Inkubuj współkultury przez 6 godzin w temperaturze 37°C w nawilżonym inkubatorze z 5%CO2. Włącz warunek kontrolny zawierający wyłącznie komórki docelowe do pomiaru samoistnej śmierci komórki. Ta kontrola jest ważna dla rozróżnienia śmierci tła od cytotoksyczności specyficznej dla komórek efektorowych.
    5. Przemyj współhodowlane komórki i barw je barwikiem FVS780 rozcieńczonym w 1x PBS (ostateczne rozcieńczenie 1:5000). Inkubuj przez 15 minut w temperaturze 4 °C, chroniony przed światłem. Przemyj komórki i ponownie zawiesij ostatni granulat komórkowy w 600 μL buforu PBS-F. Należy podstąpić do pobierania cytometrii przepływowej w celu oceny cytotoksyczności specyficznej dla komórek efektorowych.
      1. Wykonaj strategię bramkowania cytometrem przepływowym w następujący sposób: zidentyfikuj komórki docelowe jako dodatkowe na fluorescencyjne barwniki (SSC-A kontra CTV), a następnie w obrębie tej populacji oblicz procent martwych komórek docelowych (SSC-A kontra FVS780, Rysunek Uzupełniający 1C). Oblicz lizę specyficzną, odejmując spontaniczną śmierć komórek docelowych (%FVS780+ w CTV+ w warunkach tylko docelowych) od cytotoksyczności specyficznej dla komórek efektorowych (%FVS780+ w CTV+ w warunkach efektor-target ko-kultura).
  2. Analiza komórek w czasie rzeczywistym (RTCA)
    UWAGA: Test RTCA to metoda oceny aktywności cytotoksycznej komórek efektorowych wobec przylegających komórek docelowych26. Śmierć komórek docelowych wykrywa się jako różnicę w sygnale impedancji spowodowanej odłączeniem komórek od studni E zaangażowanej w urządzenie xCELLigence. Wykonaj test RTCA zgodnie z zalecanym przez producenta protokołem, aby zapewnić optymalną wydajność i powtarzalność.
    1. Podhodowla celuje komórki dzień przed testem (dzień -1), aby zapewnić osiągnięcie 60%-80% zgodności do dnia 0. Ten krok jest kluczowy, aby utrzymać komórki w aktywnej proliferacji na początku eksperymentu. Zaleca się stosowanie komórek docelowych między przejściami 5-20, z minimum tygodniem (3-4 przejścia) po rozmrożu, aby zapewnić optymalną wydajność komórek.
    2. W dniu 0 ostrożnie dodaj 50 μL medium hodowlanego do każdej studni płytki E, włącz płytę wewnątrz urządzenia i odbierz sygnał tła. Następnie przenieś płytę z powrotem na okap na etap siewu komórek.
    3. Policz komórki docelowe i przelej wymaganą łączną liczbę do czystej rurki. Ponownie zawiesz komórki w odpowiedniej objętości pożywki hodowlowej, aby osiągnąć pożądane stężenie do zasiewania na płytce E, i przenieś 100 μL komórek docelowych do każdej jamki (tutaj 4 x 10 4 komórek MCF-7 jako model linii komórek nowotworowych). Trzymaj płytkę wewnątrz okapu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, aby zapewnić równomierne przymocowanie ogniw docelowych. Włącz płytę wewnątrz urządzenia w temperaturze 37 °C w inkubatorzeCO2 i rozpocznij akwizycję w czasie rzeczywistym (interwał akwizycji 15 minut przez 22 godziny).
      UWAGA: Przed użyciem nowej linii komórek docelowych wykonaj miareczkowanie komórek, zgodnie z zaleceniami producenta.
    4. W dniu 1 (około 20-22 godzin po zasiewaniu komórek docelowych) policz komórki efektorowe i ponownie je zawiesij w świeżym pożywce hodowlanym, dostosowując stężenie komórek, aby osiągnąć pożądany stosunek efektora do celu (E:T). Na przykład, aby uzyskać stosunek E:T 10:1, dodaj 4 x 10 efektorowych komórek CIK do 4 x 10 4komórek MCF-7 docelowych dla każdego dołka.
    5. Każdy stan zabiegu przygotuj w technicznych duplikatach, używając sterylnej płytki z 96 dołkami w kształcie dna U i wyrównuj go przez 15 minut w temperaturze 37°C. Dla każdego stanu podawaj 50 μl zawiesiny ogniwa efektorowego za pomocą pipety wielokanałowej. Umieść płytkę E z powrotem w przyrządzie i kontynuuj akwizycję w czasie rzeczywistym (interwał akwizycji 15 minut przez 24 godziny). Oblicz lizę specyficzną za pomocą następującego równania:
      Równanie 1

Wyniki

Opisany tutaj protokół zapewnia efektywny i solidny przepływ pracy dla ex vivo rozszerzania i inżynierii ogniw efektorowych z izolowanych PBMC, mianowicie komórek CAR-T i CIK. Metoda ta wymaga minimalnej manipulacji komórkami i wykorzystuje zdolność wymiany gazów urządzeń G-Rex, zapewniając lepszą dostępność składników odżywczych i natlenienie w porównaniu z konwencjonalnymi systemami hodowli statycznej23,24. Kluczową zaletą tego protokołu jest jego inherentna skalowalność od małych urządzeń 24-dołkowych (G-24), odpowiednich do badań przedklinicznych, po większe urządzenia 6M (G-6M), kompatybilne z potrzebami translacyjnymi lub klinicznymi produkcyjnymi, bez konieczności stosowania jakichkolwiek zmian w protokole poza skalowaniem proporcjonalnym.

Korzystając z tego protokołu, zarówno komórki CAR-T, jak i CIK zostały pomyślnie rozbudowane równolegle z zdrowych dawców PBMC w formatach G-24 i G-6M, jak opisano w sekcjach 2-4. Pod koniec okresu hodowli oba typy komórek wykazywały dużą ekspansję fałdową i żywotność, z porównywalną proliferacją między dwoma formatami urządzeń (Rysunek 2, Tabela Uzupełniająca 1, Tabela Uzupełniająca 2), co podkreśla powtarzalność protokołu w różnych skalach hodowlanych.

Aby zweryfikować skalowalność urządzeń hodowlanych, komórki efektorowe zostały dodatkowo scharakteryzowane fenotypowo i funkcjonalnie. Dla komórek CD19 CAR-T zidentyfikowaliśmy ekspresję CAR i oceniliśmy podzbiory CD4+ i CD8+, zauważając przewagę komórek CD19 CAR+ CD8+ T (Rysunek 3A-B, Tabela Uzupełniająca 1). Dla komórek CIK oceniliśmy częstość populacji T (CD3+CD56-), NK (CD3-CD56+) i CIK (CD3+CD56+) (Rysunek 3D), a także ekspresję receptora aktywującego NKG2D (Rysunek 3E, Tabela Uzupełniająca 2). Ponadto zaobserwowaliśmy ogólnie porównywalne fenotypy i ekspresję specyficznych markerów populacyjnych pomiędzy formatami hodowli G-24 i G-6M zarówno dla komórek CAR-T, jak i CIK. Status różnicowania zarówno produktów komórkowych CD19 CAR-T, jak i CIK został przeanalizowany za pomocą barwienia CD62L i CD45RA (Rysunek 3C-F, Tabela Uzupełniająca 1, Tabela Uzupełniająca 2), co wykazało podobne fenotypy pamięci i efektorów między komórkami hodowanymi w formatach G-24 i G-6M. Wyniki te pokazują, że skalowanie procesu nie narusza integralności fenotypowej ani statusu różnicowania populacji rozszerzonych komórek efektorowych.

Na koniec, aby ocenić moc funkcjonalną, zastosowaliśmy testy cytotoksyczności specyficzne dla celu. Zarówno komórki CD19 CAR-T, jak i CIK rozszerzające się w obu urządzeniach wykazywały silną aktywność cytolityczną, potwierdzając zachowanie właściwości funkcjonalnych w różnych skalach (Rysunek 4). Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wspierają przydatność rozszerzonych produktów do dalszych zastosowań w modelach przedklinicznych oraz potencjalnie testach klinicznych.

Rysunek 2
Rysunek 2: Proliferacja i żywotność komórek CD19 CAR-T i CK. Komórki CAR-T (n = 5) i komórki CIK (n = 6) rozwinięte z PBMC na płytkach G-24 i G-6M zostały zebrane odpowiednio w dniu 9 i 14 ekspansji, aby przeprowadzić liczenie komórek oraz ocenę wzrostu fałdów (A-C) oraz procentu (B-D) komórek żywotnych. Histogramy reprezentują średnią ekspresję ± odchyleniu standardowym (SD), a kropki wskazują pojedynczych dawców (patrz Tabela Uzupełniająca 1 i Tabela Uzupełniająca 2 dla wartości indywidualnych). Dane analizowano za pomocą dwustronnego testu t-t z wieloma parami (A-C) lub testu rangi Wilcoxona z dopasowanymi parami (B-D), z korekcją Holm-Sidak dla wielu porównań (*p < 0,05). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3
Rysunek 3: Ocena fenotypu komórek CD19 CAR-T i CIK rozszerzonych w urządzeniach G-24 i G-6M. Ekspresja cząsteczek CAR w komórkach CD19 CAR-T (n = 5) została przeanalizowana za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny (A) efektywności transdukcji w protokołach ekspansji G-24 i G-6M, a także ekspresji (B) CD4+/CD8+ oraz (C) podpopulacji naiwnych/pamięci w podzbiorze CD3+CAR+. Fenotyp komórek CIK objętości (n = 6) został przeanalizowany za pomocą cytometrii przepływowej w celu zbadania (D) procentu CIK (CD3+CD56+), NK (CD3-CD56+) i T (CD3+CD56-), a także ekspresji (E) NKG2D oraz (F) naiwnej/pamięciowej podpopulacji w podzbiorze CD3+CD56+ (G-24 n=5, G-6M n=6). Naiwna (CD45RA+CD62L+), pamięć centralna (CM, CD45RA-CD62L+), pamięć efektorowa (EM, CD45RA-CD62L-) oraz pamięć efektorowa CD45RA (EMRA, CD45RA+CD62L-). Histogramy reprezentują średnią ekspresję ± SD, a kropki wskazują pojedynczych dawców (patrz Tabela Uzupełniająca 1 i Tabela Uzupełniająca 2 dla wartości indywidualnych). Dane analizowano za pomocą dwustronnego testu t-test wieloparowy (B-C-D-F) lub dwustronnego testu rangi dopasowanego Wilcoxona (A-E), z korekcją Holm-Sidak dla wielu porównań (*p < 0,05). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4
Rysunek 4: Ocena cytotoksyczności komórek CD19 CAR-T i komórek CIK. (A) Specyficzną lizę komórek CD19 CAR-T (pomarańczowych, n = 5) lub nietransdukowanych (UTD) (szarych, n = 5) przeciwko chłoniakowi Burkitta Raji (jako model linii komórkowej zawiesiny) wykonano za pomocą 6-godzinnego testu zabijania opartego na cytometrii przepływowej. Wyniki przedstawiono jako średnią specyficzną lizę ± SD. (B) Cytotoksyczność komórek CIK hodowanych w G-24 (jasnoniebieski, n = 7) lub G-6M (ciemnoniebieski, n=6) w porównaniu z linią komórkową raka piersi MCF-7 (jako model linii adherentnej) była monitorowana co 15 minut przez 24 godziny za pomocą analizatora komórek w czasie rzeczywistym. Wyniki przedstawiono jako średnio-specyficzną lizę ± SEM. Dane zostały przeanalizowane testem Mann-Whitney, korekcją Holm-Sidak pod kątem wielu porównań (*p < 0,05). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek uzupełniający 1: Strategia bramowania używana do analiz cytometrii przepływowej. Reprezentatywne wykresy ilustrujące strategie bramkowe dla (A) charakteryzacji fenotypowej komórek CAR-T i (B) komórek CIK oraz (C) testu cytotoksyczności opartego na barwnikach fluorescencjowych. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Wzrost, żywotność i fenotyp hodowli komórek CD19 CAR-T od poszczególnych dawców. Dla każdego dawcy pokazano całkowitą liczbę komórek, wzrost fałdów, żywotność oraz charakterystykę fenotypową komórek T CD19-CAR pobranych 9 dnia hodowli w urządzeniach G-24 i G-6M. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Wzrost, żywotność i fenotyp hodowli komórek CIK od poszczególnych dawców. Dla każdego dawcy pokazano całkowitą liczbę komórek, wzrost fałdów, żywotność oraz charakterystykę fenotypową komórek CIK pobranych w 14. dniu hodowli w urządzeniach G-24 i G-6M. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół ten określa wdrożenie wydajnej i skalowalnej platformy do generowania dwóch różnych produktów ACT, mianowicie komórek CAR-T i CIK, pochodzących z PBMC wykorzystujących systemy hodowli G-Rex. Wdrożyliśmy funkcjonalne i fenotypowe testy dowodu koncepcji, aby zweryfikować skalowalność podejścia. Wykazaliśmy, że zarówno fenotyp, jak i aktywność rozszerzonych komórek są utrzymywane podczas skalowania, co zapewnia odpowiedniość systemu do zastosowań badawczych i bezpośredniego przekładu klinicznego. Rzeczywiście, udało nam się wykazać, że zarówno komórki CAR-T, jak i CIK mogą być efektywnie rozszerzane z wysoką wydajnością komórek, przy jednoczesnym zachowaniu funkcjonalnego fenotypu efektora oraz silnej cytotoksyczności specyficznej dla antygenów w różnych hodowlanych urządzeniach.

W połączeniu z technologią membran przepuszczalnych przez gaz urządzeń hodowlanych, protokół ten prowadzi do szybszej kinetyki rozszerzalności, ogranicza ręczną obsługę i umożliwia stałe wysokie plony między dawcami. Te cechy sprawiają, że protokół jest wysoce powtarzalny i mniej pracochłonny w porównaniu ze standardowymi systemami hodowli20,21, które często wymagają wymiany wielu mediów oraz zwiększonego ryzyka utraty i zanieczyszczenia komórek.

Ponadto protokół ten umożliwia płynne przejścia między skalami produkcyjnymi: od małych otwartych systemów (G-24, odpowiedni do badań przedklinicznych i przesiewowy, na przykład konstrukcji CAR, kombinacji cytokinowych lub zmienności dawcy) do większych systemów otwartych (G-6M, do walidacji przed-GMP), a ostatecznie do większych systemów zamkniętych (do produkcji GMP). Jak opisano w niniejszym badaniu, przejście od małych do większych systemów otwartych wymaga jedynie proporcjonalnych korekt objętości i wejścia komórek względem rozmiaru urządzenia, co stanowi istotną przewagę praktyczną. Podobnie, jedyną implementacją potrzebną do przejścia z systemów otwartych na zamknięte dla produkcji GMP, a tym samym do adaptacji protokołu G-6M do produkcji GMP na dużą skalę, jest wykorzystanie odpowiednich odczynników klasy GMP oraz urządzeń zamkniętych (G-10M-CS o powierzchni 10 cm2, odpowiadającej pojedynczemu odwiertu G-6M, lub G-100M-CS o powierzchni 100 cm², odpowiadający otwartemu odpowiednikowi G-100M) bez dalszych modyfikacji samego protokołu. Te zamknięte urządzenia różnią się od swoich otwartych odpowiedników integracją sterylnych połączeń rur do automatycznego zarządzania mediami, które współpracują z pompą do obsługi cieczy (GatheRex), tworząc całkowicie zamknięte środowisko. To podejście zamkniętego systemu eliminuje ręczną wymianę nośników i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia, co czyni je idealnym dla środowisk produkcyjnych zgodnych z GMP, gdzie sterylność i powtarzalność są kluczowe. Warto zauważyć, że skalowalność stanowi kluczową cechę łączącą wczesne etapy odkrywania z translacją kliniczną, szczególnie w środowiskach akademickich lub wczesnych biotechnologicznych z ograniczonymi zasobami.

Dalsze wdrożenie tego protokołu w kierunku pełnej zgodności z GMP powinno uwzględnić przejście z mediów zawierających FBS na formuły bezseryjne/ksenogeno, zgodnie z aktualnymi trendami regulacyjnymi FDA i EMA, aby wyeliminować zmienność między partiami, wyeliminować potencjalne ryzyko zanieczyszczenia ksenogenicznego oraz zwiększyć zgodność z przepisami27.

Co więcej, minimalna interwencja wymagana przez proponowany system rozbudowy stanowi idealną platformę do wdrożenia wielowymiarowego profilowania fenotypowego28 poprzez redukcję artefaktów wywołanych procedurą, które mogłyby zakłócić analizę fenotypową podczas procesów produkcyjnych. Dodatkowo, poza komórkami CAR-T i CIK, system może być wysoce adaptowalny do innych populacji limfocytów oraz zmodyfikowanych komórek odpornościowych, co zwiększa jego zastosowanie w rozwoju immunoterapii29,30.

Chociaż protokół jest solidny i nie wymaga modyfikacji, kilka kroków jest szczególnie istotnych dla sukcesu. Dla ekspansji komórek CIK kluczowe jest odpowiednie wyznaczenie czasu dodawania cytokin, aby zapewnić optymalną różnicację i ekspansję. W przypadku komórek CAR-T transdukcja powinna nastąpić 24 godziny po aktywacji, aby zmaksymalizować wydajność, a lentiwirusowe alikwoty powinny być rozmrażane tylko raz, ponieważ powtarzające się cykle zamarzania i rozmrażania znacząco obniżają efektywność transdukcji31.

Zmienność biologiczna między pierwotnymi przygotowaniami komórkowymi naturalnie przyczynia się do różnic w tempie rozrostu i aktywności funkcjonalnej, odzwierciedlając różnorodność dawców. Ta nieunikniona i wewnętrzna zmienność może być skutecznie zarządzana poprzez równoległe rozszerzenia od wielu dawców, zapewniając solidne i powtarzalne wyniki w różnych eksperymentach.

Podsumowując, protokół ten umożliwia szybkie, skalowalne i niezawodne rozszerzanie funkcjonalnych limfocytów efektorowych bezpośrednio z PBMC, oferując elastyczność zarówno w badaniach na wczesnej etapie, jak i w translacji klinicznej na dużą skalę. System ten można łatwo dostosować do różnych typów komórek i modyfikacji genetycznych, zapewniając wszechstronną platformę do rozwoju immunoterapii.

Podziękowania

Konstrukcja CAR została dostarczona w ramach MTA przez St. Jude Children's Research Hospital. Prace te zostały wsparte przez grant ScaleReady G-Rex 2025; Uniwersytet w Padowie - SOMMAGGIO_BIRD24_01; Fundacja AIRC pod programem 5x1000 2019 - ID. 22759; Alleanza Contro il Cancro, Progetto CAR-T_2 RCR-2023-23684268. Badania te otrzymały fundusze "Ricerca Corrente" od włoskiego Ministerstwa Zdrowia na pokrycie kosztów publikacji. Figury zostały stworzone za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 9 i BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Błyskotliwy bufor barwnyBD Biosciences566349
Przeciwciała CD28, antyludzkieMiltenyi Biotech130-093-375Klon 15E8
Przeciwciała CD3, antyludzkieMiltenyi Biotech130-093-387Klon OKT3
CD3 BV510BD Biosciences740147Klon UCHT1
CD314 APC (NKG2D)Biolegenda320808Klon 1D11
CD4 BV650BD Biosciences563875Klon SK3
CD45RA PerCP-Cy5.5BD Biosciences563429Klon HI100
CD56 PEBiolegenda318306Klon HCD56
CD62L FITCBD Biosciences555543Klon FREG-56
CD8 BV450BD Biosciences562428Klon RPA-T8
Zestaw do Proliferacji CellTrace Violet CellThermoFisher naukowyC34557
Dimetylsulfotlenek (DMSO)ThermoFisher naukowyD2650
Dulbecco′ s Fosforanowa Buforowana sól fizjologiczna (D-PBS)Sigma AldrichD5652
Tablica E 16Agilent5469813001
Serum bydlęce płodu (FBS), wartośćThermoFisher ScientificA5256701
Naprawialna plama żywotności 780 (FVS780)BD Biosciences565388
G-Rex 24 studni, płyta i płyta 24;Wilson Wolf80192M
G-Rex 6M Well Plate Wilson Wolf80660M
Roztwór buforowy HEPESLonzaECM0180D
Jego przeciwciałoMiltenyi Biotech130-120-718
Album ludzki 20%CSL Behring
Ludzkie białko rekombinowane IL-15PeproTech200-15
Ludzkie białko rekombinowane IL-7PeproTech200-07
LSRFortessa X-20BD Biosciences
LymphoprepSTEMCELL Technologies18060
MCF-7ATCCHTB-22Linia komórkowa raka piersi  
Penicylina i StreptomycynaLonzaECB3001D
Roztwór fizjologiczny (0,9% chlorku sodu)Monico
Siarczan protaminySigma AldrichP3369
RajiATCCCCL-86Linia komórkowa chłoniaka Burkitta;
Rekombinowana ludzka IFN-gammaR& D Systems285-IF-100/CF
Rekombinowany IL-2 (Proleukina)Novartis
rhCD19-HisInvitrogenA42607
Instytut Pamięci Roswell Park 1640 (RPMI-1640)EuroklonECB9006L
Stabilna L-glutaminaLonzaECB3004D
Rozwiązanie Trypan-BlueSigma AldrichT8154
xCELLigence analiza komórek w czasie rzeczywistymAgilent
X-VIVO 15 Bezsurowiczne pośrednik komórkowy hematopoetycznejLonza02-053Q

Bibliografia

  1. Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science. 348 (6230), 62-68 (2015).
  2. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 19 (3), 200-218 (2020).
  3. Cappuzzello, E., et al. How can cytokine-induced killer cells overcome CAR-T cell limits. Front Immunol. 14, 1229540(2023).
  4. Sharma, A., Schmidt-Wolf, I. G. H. 30 years of CIK cell therapy: Recapitulating the key breakthroughs and future perspective. J Exp Clin Cancer Res. 40, 388(2021).
  5. Bayatipoor, H., et al. Role of NKT cells in cancer immunotherapy-from bench to bed. Med Oncol. 40, 29(2022).
  6. Hayday, A., Dechanet-Merville, J., Rossjohn, J., Silva-Santos, B. Cancer immunotherapy by γδ T cells. Science. 386, 6717(2024).
  7. Rohaan, M. W., van den Berg, J. H., Kvistborg, P., Haanen, J. B. A. G. Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma: A viable treatment option. J Immunother Cancer. 6, 102(2018).
  8. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  9. Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. Engineered T cells: The promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 16, 566-581 (2016).
  10. Zhang, J., Wang, L. The emerging world of TCR-T cell trials against cancer: A systematic review. Technol Cancer Res Treat. 18, 1533033819831068(2019).
  11. Sadelain, M., Brentjens, R., Rivière, I. The basic principles of chimeric antigen receptor design. Cancer Discov. 3 (4), 388-398 (2013).
  12. Cappuzzello, E., Sommaggio, R., Zanovello, P., Rosato, A. Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of cytokine-induced killer (CIK) cells. Cytokine Growth Factor Rev. 36, 99-105 (2017).
  13. Palmerini, P., et al. A serum-free protocol for the ex vivo expansion of cytokine-induced killer cells using gas-permeable static culture flasks. Cytotherapy. 22 (9), 511-518 (2020).
  14. Pietà, A. D., et al. Innovative therapeutic strategy for B-cell malignancies that combines obinutuzumab and cytokine-induced killer cells. J Immunother Cancer. 9, e002475(2021).
  15. Pievani, A., et al. Dual-functional capability of CD3+CD56+ CIK cells, a T-cell subset that acquires NK function and retains TCR-mediated specific cytotoxicity. Blood. 118 (12), 3301-3310 (2011).
  16. Cappuzzello, E., Tosi, A., Zanovello, P., Sommaggio, R., Rosato, A. Retargeting cytokine-induced killer cell activity by CD16 engagement with clinical-grade antibodies. OncoImmunology. 5, e1199311(2016).
  17. Rambaldi, B., Rizzuto, G., Rambaldi, A., Introna, M. Genetically modified and unmodified cellular approaches to enhance graft versus leukemia effect, without increasing graft versus host disease: The use of allogeneic cytokine-induced killer cells. Front Immunol. 15, 1459175(2024).
  18. Rotte, A., et al. Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies. J Immunother Cancer. 10, e005678(2022).
  19. Zhang, Y., Schmidt-Wolf, I. G. H. Ten-year update of the international registry on cytokine-induced killer cells in cancer immunotherapy. J Cell Physiol. 235 (12), 9291-9303 (2020).
  20. Garcia-Aponte, O. F., Herwig, C., Kozma, B. Lymphocyte expansion in bioreactors: Upgrading adoptive cell therapy. J Biol Eng. 15, 13(2021).
  21. Smith, T. A. CAR-T cell expansion in a Xuri Cell Expansion System W25. Methods Mol Biol. 2086, 151-163 (2020).
  22. Ludwig, J., Hirschel, M. Methods and process optimization for large-scale CAR T expansion using the G-Rex cell culture platform. Methods Mol Biol. 2086, 165-177 (2020).
  23. Vera, J. F., et al. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J Immunother. 33, 305-315 (2010).
  24. Bajgain, P., et al. Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex "M" series. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14015(2014).
  25. Talleur, A. C., et al. Allogeneic CD27-depleted cells in adoptive cell therapy. Adv Cell Gene Ther. 2, e45(2019).
  26. Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. Determining optimal cytotoxic activity of human HER2/neu-specific CD8 T cells by comparing the Cr-51 release assay to the xCELLigence system. J Vis Exp. (66), e3683(2012).
  27. Eberhardt, F., et al. Impact of serum-free media on the expansion and functionality of CD19.CAR T-cells. Int J Mol Med. 52, 58(2023).
  28. Cadiñanos-Garai, A., et al. High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing. Mol Ther. 33, 2291-2309 (2025).
  29. Wang, X., Byrne, M. E., Liu, C., Ma, M. T., Liu, D. Scalable process development of NK and CAR-NK expansion in a closed bioreactor. Front Immunol. 15, 1412378(2024).
  30. Noldner, P. K., et al. Improving lung cancer tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) manufacturing. Cytotherapy. 27, 1240-1250 (2025).
  31. Bandeira, V., et al. Downstream processing of lentiviral vectors: Releasing bottlenecks. Hum Gene Ther Methods. 23, 255-263 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kom rki CAR Tadoptywna terapia kom rkowaurz dzenia G Rexmononuklearne kom rki krwi obwodowejtransdukcja lentiwirusowacytometria przep ywowaprotok ekspansji kom rekstymulacja interleukin 2test z b kitem trypanu
Efektywna i szybka generacja komórek zabójczych indukowanych przez CAR-T i cytokiny w urządzeniach skalowalnych GMP
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.