Wykorzystanie równań do szacowania magazynów witaminy A w całym organizmie przy użyciu metod stabilnych izotopów

Podsumowanie

Protokół opisuje równania do szacowania całkowitych zapasów witaminy A (TBS) za pomocą metodologii rozcieńczania izotopów retinolu oraz przedstawia krótki przegląd wykorzystania analizy przedziałowej opartej na modelach w projekcie badania super-badanego do szacowania grupowego i indywidualnego TBS.

Streszczenie

Metody stabilnych izotopów do ilościowego oszacowania całkowitych zapasów witaminy A (TBS) opierają się na zasadzie rozcieńczenia izotopów. Krótko mówiąc, podawa się osobę pojedynczą ^doustnądawkę 2 H- lub ¹³C-oznakowanej witaminy A, a stężenia retinolu oznakowanego i nieoznakowanego w osoczu mierzone są spektrometrią mas w określonym czasie po podaniu, zwykle w ciągu 14-21 dni. TBS oblicza się za pomocą równania rozcieńczenia izotopów retinolu (RID) lub równania bilansu masy. Równania RID i bilansu mas wymagają informacji o specyficznej aktywności retinolu w plazmie (SA_p; tj. stosunek śladu do śladu), które są uzyskiwane na podstawie pomiarów spektrometrii mas. Oba równania wymagają wartości współczynników, aby uwzględnić absorpcję i magazynowanie doustnej dawki stabilnego izotopowo znakowanego retinolu w momencie szacowania TBS. Opublikowane wartości współczynników mogą być wykorzystane w równaniach. Alternatywnie, TBS można określić poprzez modelową analizę przedziałową danych kinetycznych retinolu plazmy za pomocą oprogramowania WinSAAM Simulation, Analysis, and Modeling. Krótko mówiąc, projekt badania superbadanego z modelową analizą przedziałową danych kinetycznych retinolu plazmy może być użyty do określenia grupowego TBS oraz wartości populacyjnie specyficznych dla współczynnika złożonego (FaS), który następnie jest wykorzystywany w równaniu RID do określenia indywidualnego TBS. Projekt superbohatera wymaga oszacowania średniego spożycia witaminy A w diecie dla grupy uczestników oraz pobierania próbek krwi w ~11-16 punktach czasowych w ~28-91 dni, przy 5-7 uczestnikach na punkt czasowy, jednak każdy uczestnik dostarcza tylko 2-3 próbki krwi. Stężenie witaminy A w wątrobie można oszacować na podstawie TBS, zakładając udział TBS w wątrobie oraz oszacowanie masy ciała. Status witaminy A ocenia się poprzez porównanie szacowanego stężenia witaminy A w wątrobie z proponowanymi wartościami progowymi, aby kategoryzować status na całym kontinuum, od niedoboru do nadmiaru zapasów witaminy A.

Wprowadzenie

Metody stabilnych izotopów dostarczają ilościowego oszacowania całkowitych zapasów witaminy A (TBS) i mogą być wykorzystywane do oceny stanu witaminy A u dzieci i dorosłych w środowiskach społecznych¹. Ponieważ dostarczają ilościowego oszacowania TBS na całym kontinuum stanu, od niedoboru po nadmiar zapasów, uważane są za najlepsze pośrednie metody oceny poziomu witaminy A u ludzi¹. Natomiast stężenia retinolu lub białka wiążącego retinol w surowicy są powszechnie stosowane do oceny statusu; jednak nie odzwierciedlają zapasów witaminy A w organizmie, chyba że zapasy są bardzo niskie, ponieważ retinol w surowicy jest pod kontrolą homeostatyczną; Ponadto zmniejszają się one przejściowo podczas stanu zapalnego, co komplikuje interpretację wyników w populacjach o wysokim wskaźniku zakażeń². Test zmodyfikowanej dawki względnej (MRDR) dostarcza szacunku adekwatności zapasów witaminy A w wątrobie, ale nie dostarcza ilościowej oceny stężenia witaminy A² w wątrobie. Zazwyczaj metody stabilnych izotopów są stosowane do badania metabolizmu witaminy A oraz do szacowania wpływu interwencji witaminy A w populacjach zagrożonych niedoborem 3,4,5,6,7,8,9,10. Są również przydatne do oceny ryzyka nadmiernych zapasów witaminy A u osób narażonych na różne źródła witaminy A, takie jak produkty wzbogacone, suplementy witaminy A w wysokich dawkach i/lub proszki mikroodżywcze ^1,11. Te zastosowania są istotne dla lepszego zrozumienia metabolizmu witaminy A przez cały cykl życia, doprecyzowania wymagań dotyczących witaminy A oraz oceny skuteczności i bezpieczeństwa interwencji witaminy A, które mają na celu poprawę odżywiania i wyników zdrowotnych dzieci i kobiet w wieku rozrodczym w społecznościach o ograniczonych zasobach. TBS szacuje się metodologią rozcieńczania izotopów retinolu (RID) oraz równania RID lub równania bilansu masy. Alternatywnie, TBS można oszacować poprzez analizę przedziałową danych kinetycznych plazmy retinolu opartą na modelach, korzystając z oprogramowania WinSAAM Simulation, Analysis, and Modeling (www.winsaam.org) z projektem super-subject¹². Krótko mówiąc, metody te wymagają 1) podania pojedynczej doustnej dawki stabilnej izotopowej oznaczonej witaminy A uczestnikom, 2) pobrania 1-2 próbek krwi ~14-21 dni po podaniu izotopu metodą RID (lub pobrania 2-3 próbek krwi na uczestnika w ciągu 28-91 dni oraz oszacowania średniego spożycia witaminy A w diecie grupy do analizy przedziałowej opartej na modelu), oraz 3) dostęp do odpowiedniego spektrometru mas (GC-C-IRMS, GC/MS, LC/MS/MS) do pomiaru stężeń retinolu oznakowanego i nieoznakowanego w osoczu.

Protokół ten ma na celu dostarczenie wskazówek nowym użytkownikom metodologii RID w zakresie obliczania TBS za pomocą równania RID lub równania bilansu masy. Ponadto przedstawiono krótki przegląd wykorzystania analizy przedziałowej opartej na modelach w ramach projektu badania super-badanego do szacowania TBS dla grupy uczestników i dla poszczególnych uczestników; jednak szczegóły dotyczące przeprowadzania modelowania przedziałowego danych kinetycznych plazmowego retinolu wykraczają poza zakres tego manuskryptu (więcej informacji na temat tego podejścia można znaleźć w Green i ^in.12). Przegląd metod stabilnych izotopów witaminy A można znaleźć w Lietz i ^in.1.

Równanie RID do szacowania TBS
Równanie RID stosuje się, gdy doustna dawka stabilnej izotopowej witaminy A jest podana osobie, a LC/MS/MS lub GC/MS służy do pomiaru znakowanego i nieoznakowanego retinolu w osoczu, aby uzyskać specyficzną aktywność retinolu w osoczu (SA_p) (czyli stosunek śladownika do śladu w osoczu)^13,14. Do oszacowania TBS za pomocą równania RID wymagana jest pojedyncza próbka krwi w ciągu ~14-21 dni po podaniu izotopu. Równanie RID pokazane poniżej służy do oszacowania TBS u dorosłych i dzieci ¹⁵:

TBS = Fa × S × (1/SA_p)

gdzie TBS to μmol witaminy A, Fa to ułamek doustnej dawki markera witaminy A, która jest wchłaniana i obecna w magazynach organizmu w czasie t, a S to stosunek specyficznej aktywności retinolu w osoczu (SA_p) do aktywności w zapasach (_{SA s}) w czasie t. SA_p to specyficzna aktywność retinolu w osoczu, wyrażona jako ułamek dawki w osoczu: (oznakowany retinol / nieoznakowany + oznakowany retinol) w osoczu / doustna dawka znakowanego retinolu (μmol)⁾¹². Należy zauważyć, że wkład nieoznakowanego retinolu do całkowitego retinolu w mianowniku jest znikomy 14-21 dni po dawkowaniu izotopu, gdy zwykle szacuje się TBS. Szczegółową analizę równania RID można znaleźć w artykule Green i ^in.12.

Ponieważ współczynniki Fa i S są mnożone w równaniu RID, powszechnie nazywa się je współczynnikiem złożonym FaS. Opublikowane wartości współczynnika złożonego FaS, oparte na teoretycznych dorosłych i dzieciach z szerokim zakresem TBS, są dostępne wielokrotnie po dawkowaniu izotopów (Tabela 1; zaadaptowane z Green i Green¹⁵). Wartości te można wykorzystać w równaniu RID do obliczenia TBS osobników z podobnych populacji¹⁵. Alternatywnie, analiza przedziałowa danych kinetycznych plazmowego retinolu może być wykorzystana na podstawie modelowej analizy przedziałowej do określenia wartości specyficznych dla populacji dla współczynnika złożonego FaS ^12,16.

Równanie bilansu masy do szacowania TBS:
Równanie bilansu masy służy do obliczania TBS, gdy doustna dawka ^witaminyA z oznakowaniem C-C podana jest osobie, a GC-C-IRMS służy do pomiaru wzbogacenia ^{o 13}C (¹³C/całkowita stopień) w surowicy^10,17. Równanie bilansu masy wymaga dwóch próbek krwi: próbki bazowej do pomiaru naturalnej ilości ¹³C w surowicy oraz drugiej próbki 14 dni po podaniu, aby zmierzyć wzbogacenie ^{surowicy o 13}C. Jednak jeśli badacz jest zainteresowany oszacowaniem średniej TBS dla grupy osób, pobieranie bazowej próbki krwi można wykonać u 5-6 uczestników, a średnia obfitość ¹³C dla tych osób może posłużyć jako oszacowanie bazowej obfitości surowicy ¹³C dla osób z grupy. Naturalna obfitość ^13°C wynosi ~1,1%, ale ponieważ może się ona różnić w zależności od diety, powinna być dokładnie mierzona w surowicy na początku, aby skorygować obfitość ^13°C po dawce, jak pokazano w przykładzie poniżej¹⁰. Równanie bilansu masy wymaga pomiarów obfitości izotopów (¹³°C/całkowity C) dla: 1) dawki ¹³witaminy A (F_a) oznaczanej przez C, 2) bazowego retinolu w surowicy (F_b) oraz 3) retinolu po dawce (F_C). Pomiary obfitości izotopów są wykorzystywane do obliczania stosunku śladownika do śladu, a następnie TBS. W równaniu uwzględniono dodatkowe czynniki uwzględniające wchłanianie i magazynowanie dawki ¹³witaminy A oznaczonej C-znakiem w momencie oceny TBS. Szczegółową analizę równania bilansu masy można znaleźć w Gannon i Tanumihardjo¹⁰.

Równanie bilansu masy pokazane poniżej służy do oszacowania TBS u dorosłych lub dzieci:

TBS = a x (1/TTR) x (czynnik absorpcji x czynnik dla przechowywania)

gdzie TTR to stosunek znacznika surowicy do śladu. Czynnik a odpowiada za utratę 13-C-znakowanego znacznika witaminy A między dawkowaniem a pobraniem próbek krwi i oblicza się jako ^e-kt, gdzie k = ln(2)/okres półtrwania retinolu, a t = dni od podania¹⁰ dni. Czynnik wchłaniania dawki tracera zakłada się na 0,8-1,0 (80%-100%) dla dorosłych lub 0,75-0,9 (75%-90%) dla dzieci^{10 lat}. Czynnik magazynowania (stosunek TTR w surowicy do zapasów) zakłada się jako 0,8, gdy spożycie witaminy A w diecie nie jest kontrolowane w 14-dniowym okresie między dawkowaniem a pobieraniem próbek krwi, lub 1,0, gdy spożycie witaminy A w diecie jest niskie i kontrolowane¹⁰.

Szacowanie stężenia witaminy A w wątrobie
Całkowity zapas witaminy A w wątrobie można oszacować na podstawie udziału TBS w wątrobie. Zakłada się, że ~50% TBS znajduje się w wątrobie, gdy poziom witaminy A jest niski, a ~80%, gdy poziom witaminy A jest odpowiedni; te założenia opierają się na ograniczonych danych, które pokazują, że witamina A w wątrobie jako procent całkowitej witaminy A zależy od jej statusu i może wahać się od ~40%-90%^18,19. Potrzebne są dodatkowe dane, aby lepiej oszacować witaminę A z wątroby jako procent całkowitej witaminy A w organizmie. Do tego czasu informacje z Tabeli 2 mogą być przydatne do szacowania statusu witaminy A w badanej populacji, aby ustalić, czy przyjmować wartość 50% czy 80%. Ponadto, jeśli częstość występowania stężenia retinolu w surowicy <0,7 μmol/L wynosi ≤10% u dzieci w wieku 6-59 miesięcy, przyjmuje się, że poziom witaminy A w populacji jest odpowiedni; należy zauważyć, że ten próg pokrywa się z kategorią niedoboru witaminy A według WHO jako łagodnego problemu zdrowia publicznego (Tabela 2)^20,21. Stężenie witaminy A w wątrobie oblicza się na podstawie całkowitych rezerw wątroby na podstawie masy wątroby, którą można oszacować na 3% masy ciała u dzieci i 2,4% masy ciała u dorosłych^{w wieku 22 lat}. Alternatywnie, masę wątroby można oszacować za pomocą powierzchni ciała (BSA) i równania predykcyjnego²³.

Przegląd analizy przedziałowej opartej na modelu z projektem superobiektowym do oszacowania grupowego i indywidualnego TBS
Analiza przedziałowa oparta na modelach może być wykorzystywana do badania kinetyki retinolu pojedynczych z częstym pobieraniem próbek, ale okazała się szczególnie przydatna w populacjach, gdzie częste próbkowanie nie jest możliwe, takich jak małe dzieci i dzieci w wieku przedszkolnym, a potencjalnie także kobiety w ciąży i karmiące piersią, w środowiskach ubogich zasobów 11,24,25,26,27. Analiza przedziałowa oparta na modelu jest stosowana w projektowaniu badania super-badanego do przewidywania TBS dla grupy uczestników oraz do oszacowania wartości specyficznych dla populacji współczynnika złożonego FaS, który następnie może być użyty do określenia TBS poszczególnych uczestników badania za pomocą równania RID^12,24. Projekt super-obiektu jest stosowany w środowiskach społecznościowych, aby zminimalizować liczbę pobranych próbek krwi od każdego pojedynczego: 12,24,26. Przykład tego projektu pokazano w Tabeli 3 dla 91-dniowego badania z 105 uczestnikami i 16 czasami pobierania próbek krwi. W tym przykładzie każdy uczestnik przyjmuje jedną doustną dawkę stabilnej izotopowej oznaczonej witaminy A i dostarcza próbkę krwi 14 dni po podaniu dawki do oszacowania TBS każdego osobnika, korzystając z równania RID z wartością FaS uzyskaną przez model po 14 dniach; oraz drugą próbkę krwi w jednym z pozostałych 15 przypadków, aby uzyskać kinetyczne dane kinetyczne z osocza i retinolu, które są potrzebne do analizy przedziałowej opartej na modelu. W tym modelu do każdego z 15 dodatkowych terminów pobierania próbek krwi przydzielonych jest 7 osób. Zazwyczaj 5 uczestników na czas jest uznawane za wystarczające, ale ponieważ niektórzy mogą pominąć wyznaczony czas pobierania próbek krwi, zaleca się stosowanie ~7 osób na czas. Osocze jest analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu uzyskania pomiarów retinolu oznakowanego i nieoznakowanego, a także oblicza się udział dawki izotopu witaminy A w osoczu (FD_p). Krótko mówiąc, średnia geometryczna FD_p względem czasu jest wykreślona i dopasowuje do modelu przedziałowego za pomocą oprogramowania WinSAAM 12,24,26. Przykład modelu 8-przedziałowego metabolizmu witaminy A w całym ciele przedstawiono na rysunku 1¹⁵. Model obejmuje przedziały reprezentujące osocze witaminę A (przedział 5) oraz dwie wymienne pule magazynujące witaminę A (przedziały 6 (duża) i 7 (mała)). Suma masy witaminy A w dwóch wymiennych komorach magazynowych służy jako oszacowanie TBS:

TBS (μmol) = M(6) + M(7)

gdzie M(I) to μmol witaminy A w przedziale I

Wartości specyficzne dla populacji współczynników Fa i S można obliczyć w dowolnym momencie (t) na przestrzeni trwania badania super-badanego, stosując następujące równania^12,24:

Fa_t = F(6)_t + F(7)_t

S_t = SA_pt / SA_{s t} = [F(5)_t / M(5)] / {[F(6)_t + F(7)_t] / [M(6) + M(7)]}

gdzie Fa_t to ułamek spożycia dawki znacznika wchłoniętej i znajdującej się w zapasach w czasie t; F(I)_t to ułamek dawki traceru obecnej w przedziale I w czasie t; S_t to specyficzna aktywność w osocze w porównaniu do magazynów w czasie t; SA to specyficzna aktywność retinolu w osocze (p) lub magazynach w czasie t; a M(I) to μmol witaminy A w przedziale I. Zobacz Green i ^in.12, aby szczegółowo omówić analizę przedziałową opartą na modelach.

Protokół

Dane są hipotetyczne; W badaniu nie brał udziału żaden z ludzi.

1. Estymacja TBS za pomocą równania RID

1. Aby oszacować TBS za pomocą równania RID, użyj następujących hipotetycznych danych uczestników:
   Wiek: 25 lat
   Oznakowane stężenie retinolu w osoczu: 0,0163 μmol/L
   Nieoznakowane stężenie retinolu w osoczu: 1,154 μmol/L
   Doustna dawka witaminy A: 6,838 μmol RE
   Opublikowany łączny współczynnik FaS w 14 dniach¹⁵: 0,727
   UWAGA: Ilość dawki izotopu witaminy A zależy od aktywności witaminy A w oznaczonym związku witaminy A (zwykle ²H lub ¹³C-znakowanego octana retinylu) i wyraża się jako μmol równoważny retinolowi (RE). Na przykład, jeśli do doustnego podawania ^{stosuje się 2}_H 6-retinylowooctanu i pożądana jest dawka 2000 μg RE, dawka ²_H 6-retinylowooctanu oblicza się na podstawie mas cząsteczkowych ²_H 6-retinylowooctanu (328,49 μg/μmol) i ²H_6-retinolu (292,49 μg/μmol): 2000 x (328,49/292,49) = 2246 μg ²_H 6-retinylowooctan. Dawkę 2000 μg RE wyrażonej w μmol oblicza się przez podzielenie dawki (μg RE) przez masę cząsteczkową ²H 6-retinol: 2000/292,49 = 6,838 μmol.
2. Oblicz SA_p za pomocą poniższego równania:
   SA_p = [oznakowany retinol / (oznakowany retinol + nieoznakowany retinol) w osoczu] / dawka (μmol)
   Użyj powyższych danych uczestników, aby rozwiązać równanie:
   SA_p = [0,0163 / (0,0163 + 1,154)] / 6,838 = 0,0020 μmol
3. Oblicz TBS za pomocą równania RID pokazanego poniżej:
   TBS = FaS x (1/SA_p)
   Użyj powyższych danych uczestników, aby uzyskać wartość FaS oraz obliczoną wartość_{SA p} z kroku 2:
   TBS = 0,727 x (1/ 0,0020) = 364 μmol

2. Estymacja TBS za pomocą równania bilansu masy

1. Aby oszacować TBS za pomocą równania bilansu masy, użyj następujących hipotetycznych danych uczestników:
   Wiek: 4 lata
   F_a (2 oznaczone węgla plus naturalna obfitość): 0,11
   F_b: 0.010745
   F_c: 0.0110476
   Zastosowana dawka tracera: 1,0 μmol RE
   Czynniki wchłaniania i magazynowania:
   Absorpcja: 0,8
   Przechowywanie: stosunek TTR w surowicy do wątroby (dieta niekontrolowana): 0,8
   UWAGA: Do dawkowania ^{stosuje się 13}_C 2-znakowanej witaminy A, a ilość izotopów w dawce (F_a) oblicza się jako: (^[13C₂] oznaczane w syntezie + naturalna ilość (¹³C/20C łącznie)¹⁰. Przyjęta wartość absorpcji w tym przykładzie wynosi 0,8; wartość między 0,8 a 1,0 może być dobrana na podstawie czynników wpływających na wchłanianie witaminy A w badanej populacji (tj. wskaźniki zapalenia/infekcji mogą zmniejszać wchłanianie¹). Należy zauważyć, że F_a tutaj nie jest tym samym co współczynnik Fa w równaniu RID.
2. Oblicz stosunek śladu do śladu (TTR) za pomocą równania pokazanego poniżej:
   TTR = (F_{c-F b})/(F_{a-F c})
   gdzie F_a = ¹³C obfitości izotopów w dawce ¹³C oznaczanej przez witaminę A; F_b = ^13Cobfitość izotopów retinolu w surowicy na poziomie wyjściowym; F_c = ¹³C obfitość izotopów retinolu w surowicy po dawkowaniu
   Użyj wartości F_a, F_b i F_c z powyższych danych uczestników do obliczenia TTR:
   TTR = (0,0110476 - 0,010745) / (0,11 - 0,0110476) = 0,003058035
3. Następnie oblicz 1/TTR
   1/TTR = 1 / 0,003058035 = 327,01
4. Następnie oblicz czynnik a za pomocą poniższego równania:
   czynnik a = ¹³dawka witaminy A (μmol) znakowana przez C x ^e-kt
   1. Najpierw oblicz k , używając równania pokazanego poniżej:
      k=ln(2)/okres półtrwania retinolu
      Naturalny log 2 (ln(2)) jest równy 0,693147181; okres półtrwania retinolu szacowany jest na 32 dni* u dzieci; Korzystając z tych informacji, obliczamy k
      k = 0,693147181 / 32 = 0,021660849
      *szacowane wartości stosuje się dla okresu półtrwania retinolu (32 do 136 d dla dzieci; 140 d dla dorosłych); lub wartości można oszacować na podstawie szybkości zaniku dawki tracera u osób z grupy kontrolnej podczas badania ^3,10.
   2. Następnie oblicz ^e-kt, gdzie t to czas (dni od dawkowania izotopu; t = 14 dni dla równania bilansu masy). Użyj tych informacji z obliczoną wartością k z kroku 4.1:
      ^e-kt = ^{e-0,02166 x 14} = 0,738413073
   3. Na koniec oblicz czynnik a, używając poniższego równania, ilość dawki izotopowej z powyższych danych uczestników (1,0 μmol) oraz obliczoną wartość ^e-kt
      czynnik a = ¹³dawka witaminy A (μmol) znakowana przez C x ^e-kt
      Czynnik A = 1,0 x 0,738413073 = 0,738413073
5. Oblicz TBS za pomocą równania bilansu masy pokazanego poniżej:
   TBS = czynnik x (1/TTR) x dla absorpcji x czynnik dla przechowywania
   Użyj obliczonego czynnika a (0,738413073) oraz obliczonej wartości 1/TTR (327) z powyższych kroków, a także stałych wartości absorpcji (0,8) i magazynowania (0,8):
   TBS = 0,738413073 x 327 x 0,8 x 0,8 = 155 μmol

3. Szacowanie witaminy A w wątrobie

1. Aby obliczyć całkowite rezerwy witaminy A w wątrobie oraz stężenie witaminy A, użyj następujących danych uczestników:
   Wiek: 25 lat
   Masa: 61,0 kg
   Wysokość: 156,8 cm
   TBS: 364 μmol (szacowane przez RID)
   Częstość występowania stężeń retinolu w osoczu <0,7 μmol/L w populacji badanej wynosi <2%.
2. Najpierw oblicz masę wątroby na podstawie powierzchni ciała (BSA) za pomocą równania pokazanego poniżej:
   BSA (^{m 2}) = sqrt [masa ciała (kg) x wysokość (cm)/3600]
   Użyj powyższych danych uczestników do obliczenia BSA:
   BSA (m²) = sqrt [61,0 x 156,8/3600] = 1,63 m²
3. Następnie oblicz masę wątroby według odpowiedniego równania pokazanego poniżej oraz obliczoną wartość BSA z powyższego:
   Jeśli powierzchnia ciała (BSA) wynosi <1:
   Masa wątroby (g) = 772 (g/m²) x powierzchnia ciała (BSA) - 38
   Jeśli powierzchnia ciała (BSA) wynosi ≥1:
   Masa wątroby (g) = 772 (g/m²) x powierzchnia ciała (BSA)
   Oblicz BSA za pomocą równania pokazanego poniżej; (zwróć uwagę, że BSA to ≥1 od kroku 2 powyżej):
   Masa wątroby (g) = 772 (g/m²) x powierzchnia ciała (BSA)
   Masa wątroby (g) = 772 (g/m²) x 1,63 m² = 1258 g
4. Na koniec oblicz stężenie witaminy A w wątrobie, stosując poniżej równanie:
   Stężenie witaminy A w wątrobie = TBS (μmol) * proporcja TBS występuje w wątrobie/masie wątroby (g)
   Użyj wartości TBS z powyższych danych uczestników (364 μmol) oraz przypuszczalnej wartości 0,8 dla udziału TBS w wątrobie (status witaminy A w populacji badanej jest uznawany za wystarczający na podstawie częstości występowania niskiego stężenia retinolu w surowicy <2%) oraz obliczonej wartości masy wątroby (1258 g) z powyższych parametrów:
   Stężenie witaminy A w wątrobie = 364 μmol * 0,8 / 1258 = 0,232 μmol/g wątroby

4. Modelowo przewidywana TBS dla grupy

1. Aby obliczyć TBS przewidywanego przez model dla grupy (populacji badawczej) z wykorzystaniem projektu badania super-badanego, użyj następujących hipotetycznych wyników modelowania z badania super-badanego przeprowadzonego wśród kobiet w wieku rozrodczym (szczegóły na temat tego podejścia zobacz Green i ^in.15):
   Hipotetyczny wynik modelu:
   M(6) = 973,281 μmol
   M(7) = 55,7646 μmol
2. Oblicz TBS dla grupy, korzystając z dostarczonego modelu super-podmiotowego oraz poniższego równania:
   TBS = M(6) + M(7)
   Użyj masy witaminy A w przedziałach 6 i 7 (na podstawie wyników modelu):
   TBS = 973,281 + 55,7646 = 1029 μmol
   UWAGA: Przykład obliczania wartości dla współczynnika złożonego FaS na podstawie wyników modelu wykracza poza zakres tego przeglądu. Więcej informacji można znaleźć w artykule Green i ^in.12,15.

Wyniki

Protokół ten przedstawia przykłady ilościowego oszacowania TBS u dorosłych lub dzieci za pomocą metodologii rozcieńczania izotopów retinolu, a także równania RID lub równania bilansu masy. Równanie RID stosuje ^{się, gdy}do dawkowania stosuje się 2 H lub ¹³witaminy C znakowanej C, a LC/MS/MS lub GC/MS do pomiaru stężeń retinolu oznakowanego i nieoznakowanego w osoczu. Równanie RID wymaga informacji o specyficznej aktywności retinolu w osocze (stosunek znacznika do śladowca) z wykorzystaniem pomiarów spektrometrii mas, doustnej dawki oznakowanej witaminy A (μmol RE) oraz wartości współczynnika złożonego FaS. Dostępne są opublikowane wartości współczynnika złożonego FaS ; alternatywnie, wartości specyficzne dla populacji można oszacować poprzez modelowe modelowanie przedziałowe danych kinetycznych plazmy retinolu. Równanie RID jest zwykle stosowane w ciągu ~14 do 21 dni po podaniu, ale można je zastosować później, jeśli dostępna jest odpowiadająca wartość współczynnika złożonego FaS . Wartość TBS dla pokazanego tutaj przykładu wynosiła 364 μmol.

Równanie bilansu masy stosuje się, gdy do dawkowania używa się witaminy A znakowanej ^{przez 13}C, a GC-C-IRMS do pomiaru obfitości izotopów ^13Cw osoczu. Równanie bilansu masy wymaga stosowania stosunku śladownika do śladu (mierzonej obfitości izotopów ¹³°C w osoczu) oraz wartości czynników (współczynników), które uwzględniają wchłanianie i magazynowanie dawki ¹³witaminy A znakowanej przez C w momencie oceny TBS. Opublikowane wartości współczynników są dostępne do wykorzystania w równaniu. Równanie bilansu masy stosuje się 14 dni po podaniu. Wartość TBS dla pokazanego tutaj przykładu wynosiła 155 μmol.

Analiza przedziałowa danych kinetycznych plazmy retinolu z projektem super-badanym służy do szacowania TBS dla grupy uczestników badania oraz do określenia wartości współczynnika FaS do późniejszego określenia TBS dla poszczególnych uczestników. TBS dla grupy oblicza się jako masę witaminy A w wymiennych zbiornikach magazynujących witaminę A organizmu; a TBS dla poszczególnych uczestników badania oblicza się 14 dni po podaniu i/lub później, korzystając z wartości specyficznej aktywności retinolu osocza (_{SA p}) każdego uczestnika oraz odpowiadającej modelu wartości współczynnika FaS w wybranym czasie (lub czasach) z równaniem RID. Wartość TBS dla pokazanego tutaj przykładu wynosiła 1029 μmol.

Wyniki TBS można interpretować, przeliczając TBS na stężenie witaminy A w wątrobie oraz porównując stężenia witaminy A z wartościami granicznymi, aby kategoryzować status witaminy A w całym kontinuum; Należy zauważyć, że wartości progowe od niedoborowych do toksycznych magazynów proponowanych w 2015 roku prawdopodobnie będą uprzezniane wraz z dostępnością większej liczby danych². Stężenie witaminy A w wątrobie w pokazanym przykładzie wynosiło 0,232 μmol/g wątroby

Rysunek 1: Model przedziałowy metabolizmu witaminy A w całym ciele u ludzi. Okręgi symbolizują przedziały; prostokąty są elementami opóźniającymi; strzałki między składnikami to współczynniki transferu ułamkowe [L(I,J), czyli ułamek retinolu z przedziału J przenoszony do przedziału I każdego dnia] oraz czasy opóźnienia [DT(I), czyli dni spędzone w elemencie opóźnienia I]. Przedział 1 to miejsce wprowadzenia spożywanego znacznika (*) oraz witaminy A [U(1)]. Składniki 1-4 reprezentują trawienie, wchłanianie i przetwarzanie chylomikronów aż do przejęcia przez hepatocyty (przedział 4), a następnie wydzielanie retinolu z białkiem wiążącym retinol do przedziału osocza 5, który jest miejscem pobierania próbek (trójkąt). Składnik 8 umożliwia nieodwracalne pobieranie retinolu w osocze przez tkanki, z których retinol nie jest recyklingowany. Retinol w osocze może również wymieniać się z witaminą A w dwóch basenach pozanaczyniowych (większa komora 6 i mniejsza komora 7), przy czym przedziały 6 i 8 są miejscami nieodwracalnej utraty z organizmu. VA = witamina A. Ta liczba została zmieniona z¹⁵. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1: Szacowane wartości współczynnika złożonego FaS dla teoretycznych dorosłych i dzieci w wybranych okresach. Zaleca się stosowanie równania RID do szacowania TBS u dorosłych do 14 dni lub później. Skróty: GM = średnia geometryczna; NA = nie ma zastosowania. Ta tabela została zmodyfikowana z¹⁵. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Progi rozpowszechnienia populacji dla niedoboru witaminy A. Skróty: VAD = niedobór witaminy A; MRDR = zmodyfikowany test odpowiedzi dawcy względnej; WHO = Światowa Organizacja Zdrowia. Ta tabela została zmodyfikowana z²¹. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Liczba uczestników w czasie 91-dniowego badania super-badanego. Pobieranie próbek krwi odbywa się u wszystkich uczestników (n=105) w dniu 14, a każdy uczestnik jest losowo przypisywany do drugiego punktu czasowego w trakcie 91-dniowego badania, tak aby w każdym czasie było co najmniej 7 uczestników, a każdy uczestnik dostarczał łącznie 2 próbki krwi. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Podsumowując, metody stabilnych izotopów dostarczają ilościowych szacunków TBS u dorosłych i dzieci i mogą być stosowane w środowiskach społecznych¹. TBS dorosłych i dzieci można oszacować metodologią rozcieńczania izotopów retinolu, stosując równanie RID lub równanie bilansu masy. Chociaż oba równania opierają się na zasadzie rozcieńczenia izotopów, istnieje kilka różnic. Krótko mówiąc, równanie RID wymaga pojedynczej próbki krwi i stosuje się ją w ciągu ~14-21 dni, ale można je stosować także później, jeśli dostępna jest odpowiednia wartość współczynnika złożonego FaS . Opublikowane wartości współczynnika złożonego FaS są dostępne w różnych momentach po dawkowaniu do zastosowań w równaniu RID¹⁵; alternatywnie, wartości specyficzne dla populacji można określić za pomocą analizy przedziałowej opartej na modelu. Równanie bilansu masy wymaga pobrania 2 próbek krwi, jednej na początku dawki, a drugiej 14 dni po podaniu. Jednak, jak wspomniano wcześniej, jeśli oszacowana jest średnia ilość TBS dla grupy, można pobrać pobieranie krwi na poziomie bazowym u 5-6 uczestników, a średnia obfitość ¹³°C dla tych osób może posłużyć jako oszacowanie bazowej obfitości ¹³°C w surowicy.

Przy stosowaniu równania RID ważne są uwzględnienie dawki jako aktywności witaminy A (μmol RE) zamiast μmol oznakowanego esteru retynylowego, a jeśli stosuje się opublikowane wartości współczynnika FaS , ważne jest, aby wybrać wartości FaS pochodzące z podobnej populacji (dzieci lub dorosłych) i odpowiadające czasowi (dniu badania), w którym SA_p zmierzono w celu oszacowania TBS. Stosując równanie bilansu masy, kluczowe jest uwzględnienie naturalnej obfitości ¹³°C w dawce ¹³°C oznaczanej witaminy A oraz skorygowanie obfitości ^{surowicy po dawce 13}°C na naturalną ilość ¹³°C w surowicy na poziomie wyjściowym, aby uzyskać dokładne oszacowania TBS¹⁰.

Modelowanie przedziałowe oparte na modelu jest stosowane w projektowaniu badania super-badanego w środowiskach społecznościowych do oszacowania grupowego TBS oraz wartości specyficznych dla populacji współczynnika złożonego FaS w trakcie trwania badania^12,24. Zaletą tego podejścia jest to, że wartości wyprowadzone przez model dla współczynnika złożonego FaS prawdopodobnie dostarczają dokładniejszego oszacowania TBS dla osób z grupy niż opublikowana wartość pochodząca z innej populacji. To podejście zapewnia również większą elastyczność w zakresie czasu pobierania próbek krwi w badaniach terenowych. Na przykład, jeśli uczestnik nie jest dostępny w wyznaczonym czasie na pobranie krwi RID, próbkę krwi można pobrać później, a odpowiadająca mu wartość modelu dla współczynnika złożonego FaS może zostać wykorzystana w równaniu RID do oszacowania jego TBS ^12,24.

Wyniki TBS można interpretować, przeliczając TBS na stężenie witaminy A w wątrobie oraz porównując wartości z proponowanymi progami stężenia witaminy A w układzie dla kategoryzacji witaminy A w całym kontinuum, od niedoboru do toksycznych zapasów². Chociaż proponowane progi sugerowały, że >1 μmol/g wątroby wskazuje na hiperwitaminozę A, najnowsze badania nie wykazały działań niepożądanych w zakresie 1-3 μmol/g, a zmiany histopatologiczne pojawiają się przy >3 μmol/g^11,28. Potrzebne są dodatkowe dane dotyczące stężeń witaminy A w wątrobie i ich fizjologicznych efektów u ludzi, aby doprecyzować wartości graniczne dla kategorii statusów subtoksycznych i toksycznych.

Chociaż podejścia stabilne izotopowe do oceny statusu witaminy A dostarczają ilościowych szacunków TBS i są uważane za najlepsze metody oceny stanu, nie są jeszcze szeroko stosowane ze względu na stosunkowo wysokie koszty w porównaniu z innymi metodami oceny oraz ograniczony dostęp do: stabilnej izotopowej oznakowanej witaminy A oraz wiedzy w zakresie przygotowywania i podawania dawek; spektrometrię mas oraz ekspertyzę w zakresie analiz plazmy; ekspertyza w projektowaniu badań i stosowaniu równań do szacowania TBS; oraz ekspertyzę w modelowej analizie przedziałowej danych kinetycznych retinolu plazmy. Dla nowych użytkowników konsultacje i współpraca ekspertów są kluczowe podczas planowania, wdrażania i analizy badania, aby zapewnić sukces.

Pomimo wyzwań, w ostatnich latach nastąpiły postępy w metodologii stabilnych izotopów, które ułatwiły jego zastosowanie w środowiskach społecznościowych^12,29. Przyszłe badania z wykorzystaniem tej metody prawdopodobnie przyniosą istotne nowe informacje o metabolizmie i zapotrzebowaniu witaminy A w całym cyklu życia, bioskuteczności karotenoidów prowitaminy A w diecie oraz skuteczności i bezpieczeństwie interwencji poprawiających status witaminy A w populacjach zagrożonych niedoborem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Excel	Microsoft	Microsoft Excel
Kalkulator naukowy Texas Instruments TI-30XIIS	Texas Instruments	TI-30XIIS