Artykuł metodologiczny

Lokalizacja błony plazmatycznej i wewnątrzkomórkowych receptorów nikotynowej acetylocholiny za pomocą obrazowania ilościowego w komórkach ssaków

DOI:

10.3791/69371

⸱

19 grudnia 2025

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje ekspresję i ilościową liczbę podjednostek receptorów acetylocholinowych neuronów za pomocą linii komórkowej Neuro-2a ssaków. Znaczniki fluorescencyjne wrażliwe na pH oraz mikroskopia konfokalna umożliwiają precyzyjną ocenę lokalizacji receptorów w błonie plazmatycznej w porównaniu do tych wyrażanych w neutralnych pH-przedziałach wewnątrzkomórkowych, ułatwiając badania transportu nAChR i modulacji farmakologicznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowa identyfikacja neuronalnych receptorów nikotynowych acetylocholinowych (nAChR) wyrażanych na błonie plazmatycznej komórek ssaków jest istotna dla rozwoju nowych terapii selektywnych na cele oraz do badania białek chaperonów modulujących transport receptorów. Badanie to przedstawia solidny zestaw metodologii ekspresji zarówno homomerycznych, jak i heteromerycznych nAChR w komórkach neuro2a (N2a) ssaków oraz ilościowego określenia ich lokalizacji powierzchniowej i wewnątrzkomórkowej za pomocą fluorescencyjnych znaczników na pH wrażliwych. pHuji i superekliptyczna pHluorin (SEP) to białka wrażliwe na pH, które można zmodyfikować do oznaczania białek rekombinowanych, umożliwiając wizualizację przestrzennego rozkładu podjednostek nAChR. Te znaczniki fluorescencyjne emitują przy neutralnym pH, ale są hartowane w środowisku kwaśnym. Aby śledzić względną lokalizację wewnętrznych i plazmowych podjednostek α7, α4 i β2 nAChR, do końca C każdej konstrukcji DNA przyłącza się albo pHuji, albo SEP. Aby wyrazić α7-pHuji wraz z chaperonem NACHO, czyli (α4-SEP; β2-pHuji) w komórkach N2a, stosuje się lipidowy reagent transfekcyjny DNA. Odczynnik transfekcyjny i DNA plazmidu są inkubowane oddzielnie w medium o obniżonej surowicy w temperaturze pokojowej, a następnie łączą się, tworząc kompleksy lipidowo-DNA ułatwiające dostarczanie plazmidów do komórek. Po inkubacji komórki są obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej żywych komórek zarówno w warunkach wysokiego, jak i niskiego pH lub w obecności podtypowego selektywnego ligandu fluorescencyjnego. Obrazy są analizowane za pomocą skorygowanej całkowitej fluorescencji komórkowej w odpowiednich kanałach fluoroforowych, dostarczając ilościowych informacji o rozmieszczeniu fluorescencyjnie oznakowanych podjednostek nAChR między błoną plazmatyczną a przedziałami wewnątrzkomórkowymi. Konfokalne obrazowanie komórek żywych umożliwia śledzenie w czasie rzeczywistym lokalizacji podjednostek nAChR, aby rozróżnić różnice między populacjami receptorów wewnętrznych i powierzchniowych. Odporna ekspresja błony plazmatycznej α7-pHuji lub (α4-SEP; β2-pHuji) osiąga się w ciągu 24 godzin w temperaturze 37 °C. Metoda ta może być dostosowana do dodatkowych chaperonów, podjednostek pomocniczych lub ligandów fluorescencyjnej do badania transportu nAChR, modulacji farmakologicznej oraz zmian związanych z chorobą w ekspresji nAChR.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neuronalne receptory nikotynowe acetylocholinowe (nAChR) to ligandowe kanały transbłonowe wyrażane na błonie plazmatycznej wielu typów komórek, w tym neuronów, komórek glejowych i komórek odpornościowych. Receptory te składają się z α (α2-α10) lub β (β2-β4) podjednostek, które łączą się, tworząc podtypy homomeryczne lub heteromeryczne, przy czym α7 i α4β2 nAChR są najbardziej liczne w mózgu 1,2. Dysregulacja tych podtypów była powiązana z chorobą Alzheimera, zaburzeniami użycia nikotyny, nadnadpobudliwą padaczką hipermotoryczną związaną ze snem, chorobą Parkinsona oraz ciężką depresją, a także innymi schorzeniami neurologicznymi i psychiatrycznymi 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Szybkie i wiarygodne metody ekspresji i ilościowej oceny nAChR są niezbędne do zrozumienia mechanizmów chorób oraz opracowania terapii selektywnych do celowania. Jednak osiągnięcie silnej ekspresji tych receptorów przez błonę plazmatyczną jest często trudne i czasochłonne. Opisana tutaj metoda umożliwia silną ekspresję powierzchniową nAChR w ciągu około 24 godzin po transfekcji DNA i może być łączona z ligandami lub białkami chaperonowymi modulującymi transport receptorów.

Istnieje kilka metod ekspresji nAChR, w tym transientna transfekcja DNA lub generowanie stabilnych linii komórkowych wyrażających pożądany podtyp. Chociaż tworzenie stabilnych linii komórkowych jest przydatne w długoterminowych badaniach dotyczących tego samego podtypu receptora, proces ten jest pracochłonny i może zająć kilka miesięcy. Po ustaleniu takie linie komórkowe mogą wykazywać zmienną ekspresję receptorów w przejściach, utratę ekspresji w czasie lub błędy selekcyjne dla klonów o suboptymalnej funkcji receptora lub gęstości13. Obniżenie temperatury inkubacji z 37 °C do 30 °C, dodanie molekularnych chaperonów takich jak nikotyna lub wydłużenie czasu inkubacji mogą sprzyjać ekspresji powierzchniowej 13,14,15. Ograniczenia te są szczególnie widoczne w przypadku heteromerycznych nAChR, które wymagają prawidłowego składania i transportu podjednostek, oraz badań skupiających się na regulacji receptorów wspomaganych przez chaperony. Dlatego rutynowa walidacja ekspresji podtypów receptorów w przejściach jest konieczna przy pracy ze stabilnymi liniami komórkowymi ekspresyjnymi nAChR.

Często naukowcy interesują się wariantami podjednostek nAChR oraz podjednostkami chaperonów lub pomocniczych białek, dlatego muszą ekspresjonować różnorodne DNA w szybkim tempie, aby umożliwić szybką elastyczność w testach. Ekspresja przejściowa nAChR jest w tym względzie korzystna, ponieważ proces może być szybko zakończony, pozwalając badaczowi badać wiele podtypów receptorów lub warunków eksperymentalnych bez konieczności czekania miesięcy na wygenerowanie stabilnych linii komórkowych. Częstym zjawiskiem, nawet przy ekspresji przejściowej, jest to, że wiele nAChR pozostaje w komórce 24 godziny po indukcji w temperaturze 37 °C, co wymaga dodatkowych okresów inkubacji > 48 godzin16,17. Na przykład, bez białka chaperonu odpornego na inhibitory cholinesterazy (RIC)-3, tylko ~1% α7 nAChR jest wyrażanych na błonie plazmatycznej komórek SHE-P ssaków18. Przy współekspresji RIC-3 wykrywa się na powierzchni około 20% α7 nAChR. Chociaż jest to poprawa, całkowita liczebność receptorów pozostaje niska. Współekspresja α7 nAChR z NACHO może dodatkowo zwiększyć ekspresję powierzchniową, choć nadal mniej niż 40% całej populacji receptorów trafia do błony plazmatycznej19. Innym podejściem jest inkubacja komórek transfekowanych w temperaturze 30 °C, aby poprawić ekspresję błony plazmatycznej20,21. Dla α4β2 nAChR ta redukcja temperatury powoduje pięciokrotne zwiększenie gęstości receptorów powierzchniowych bez odpowiadającego wzrostu całkowitej podjednostkibiałka 21. Jednak ta poprawa wymaga co najmniej jednego dodatkowego dnia oraz większego użycia materiałów zużywalnych, odczynników i instrumentów.

Przedstawione prace oferują zestaw zoptymalizowanych metod ekspresji i ilościowej ekspresji i ilościowej ekspresji konkretnych podtypów nAChR w ciągu 24 godzin po transfekcji w komórkach N2a ssaków, osiągając około 83% dla α7, 77% dla α4 oraz 56% dla podjednostek β2 zlokalizowanych w błonie plazmatycznej. W przypadku α7 nAChR ekspresję błony plazmatycznej można ilościowo określić za pomocą α7-selektywnej, fluorescencyjnie oznakowanej α-bungarotoksyny (αBTX) lub poprzez rekombinowane znakowanie fluorescencyjne. Aby oznaczyć każdą podjednostkę, na końcu C poszczególnych podjednostek nAChR 25,26 są projektowane fluorescencyjne białka pHuji i superekliptyczne pHluorin (SEP)22,23,24. pHuji i SEP to warianty czerwonych i zielonych białek fluorescencyjne wrażliwe na pH, które fluorescencją przy pH 7,4, ale są chłodzone w bardziej kwaśnych warunkach27,28. Ponieważ fluorescencja SEP i pHuji jest tłumiona przy pH < 6, każdy obserwowany sygnał wewnątrzkomórkowy odzwierciedla fluorofory znajdujące się w przedziałach obojętnych, a nie na błonie plazmatycznej. Należy zauważyć, że niektóre organelle, takie jak aparat Golgiego, mają kwaśne światło światła; w związku z tym fluorofory przyłączone do obszaru C-końcowego podjednostek nAChR nie są wykrywane, gdy podjednostki przechodzą przez szlak sekretorowy29. Różnica między całkowitą fluorescencją przy pH 7,5 a pH < 6 stanowi sygnał generowany przez nAChR zlokalizowane na błonie plazmatycznej. Rejestrowanie obrazów za pomocą mikroskopii konfokalnej z żywymi komórkami zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną, umożliwiającą precyzyjną ilościową lokalizację podjednostek. Dodatkowo, przeprowadzanie wszystkich eksperymentów na żywych komórkach pozwala każdej komórce pełnić rolę własnej kontroli, uwzględniając zmienność ekspresji białek między komórkami w każdej grupie leczenia30. Metoda ta może być dodatkowo dostosowana do dodatkowych białek chaperonowych, takich jak NACHO lub inne, do badania transportu nAChR. Dodatkowe zastosowania obejmują modulację farmakologiczną, włączenie podjednostek pomocniczych oraz analizę zmian związanych z chorobą w ekspresji nAChR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Poniższa procedura opisuje metody, które zostały skutecznie zastosowane do przejściowego transfektu linii komórkowej N2a za pomocą podjednostek nAChR (Rysunek 1). Solidna ekspresja błony plazmatycznej osiąga się w ciągu 24 godzin, co jest uchwycone mikroskopią konfokalną z aktywnymi komórkami.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie poszczególnych metod przedstawionych w protokole. Komórki są hodowane do momentu, gdy osiągają 70%-80% zbiegu w naczyniach obrazujących. Komórki są następnie traktowane odczynnikiem transfekcyjnym i kompleksem DNA. (Góra) Po 24 godzinach komórki można objąć fluorescencyjnym ligandem do oznaczania podjednostek wyrażonych na błonie plazmatycznej, a następnie obrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego. (Na dole) Alternatywnie, dla genów podjednostek nAChR, które zostały zmodyfikowane do oznaczania białkiem wrażliwym na pH 24 godziny po transfekcji, komórki można obrazować żywe za pomocą mikroskopu konfokalnego, aby uchwycić całkowitą fluorescencję komórek. Bufor obrazowania o pH 7,4 jest następnie zamieniany na bufor chłodzący pH 5,5. To zatrzyma fluorescencję białek wrażliwych na pH przypisanych do podjednostek nAChR zlokalizowanych na błonie plazmatycznej komórki, pozwalając jedynie podjednostkom wewnętrznym pozostać fluorescencyjnym. Te same komórki są ponownie obrazowane. Analiza obrazów przeprowadza się za pomocą ImageJ w celu ilościowego określenia wyrazu wewnętrznych i zewnętrznych podjednostek. Procedury te można zmodyfikować, aby uwzględnić chaperon i białka pomocnicze. Stworzone w BioRender. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

1. Transfekcja przejściowa N2a nAChR

UWAGA: Linia komórkowa N2a została wybrana, ponieważ wykazuje fenotyp neuronalny i niską endogenną ekspresję nAChR. Geny podjednostek α7-pHuji, α4-SEP i β2-pHuji są indywidualnie umieszczone w wektorze ekspresyjnym pcDNA3.1(+) ssaków. Białko chaperonu NACHO jest eksprimowane z pREP9 (hojnie podarowanego przez dr. R. Loringa z Northeastern University). We wszystkich etapach stosuj techniki sterylne i pracuj wewnątrz szafki bioasekuracyjnej. Noś czysty fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawiczki. Czyść wszystkie materiały wchodzące lub wychodzące z szafki biosafety za pomocą 70% etanolu. Następujące kroki opisują transfekcję w szklanym dnie o średnicy 35 mm pokrytej poli-D-lizyną, odpowiedniej do obrazowania. Objętości można dostosowywać w zależności od potrzeb dla różnych zbiorników hodowlanych.

  1. Hodować komórki N2a w kolbie T25 (lub podobnej) zawierającej minimalne niezbędne medium Eagle's Minimum Essential (EMEM), uzupełnione o 10% surowicę płodową bydła (FBS) oraz w razie potrzeby 100 U/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny. Inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO₂, aż komórki osiągną ~90% konfluencji. Wizualizuj to za pomocą obiektywu do mikroskopu świetlnego 4x.
  2. Codziennie monitoruj konfluencję za pomocą mikroskopu świetlnego i wymieniaj podłoże co 1-2 dni, aby utrzymać optymalne warunki. Gdy komórki osiągną ~90% konfluentności, są gotowe do przepuszczenia do talerzy obrazujących.
  3. Podgrzej wszystkie odczynniki do 37 °C w kąpieli wodnej. Przed rozpoczęciem zabiegu wyczyść szafkę z zabezpieczeniem biologicznym oraz wszystkie materiały w 70% etanolu.
    UWAGA: 70% etanolu to wysoce łatwopalna ciecz i para, które mogą powodować poważne podrażnienia oczu. Trzymaj się z dala od ciepła, iskier, otwartych płomieni i innych źródeł zapłonu. Przechowuj je w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, z pojemnikami szczelnie zamkniętymi. Zakładaj rękawiczki ochronne oraz ochronę oczu/twarzy podczas obchodzenia. W przypadku kontaktu ze skórą lub oczami natychmiast przepłucz wodą i skonsultuj się z lekarzem, jeśli podrażnienie się utrzymuje. Zamiast tego można stosować alternatywny środek dezynfekujący, taki jak roztwór wybielacza 5%-10%.
  4. Aspiruj stare medium z kolby i myj komórki 5 mL PBS. Dodaj 1 ml trypsyny do kolby i delikatnie mieszaj. Inkubuj do podniesienia się komórek (<5 min). Aby zapobiec nadmiernemu trawieniu, natychmiast dodaj 4 mL podłoża wzrostu EMEM i delikatnie pipetuj w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
  5. Za pomocą hemocytometru określ stężenie komórek i oblicz wymaganą objętość ośrodka wzrostu EMEM, aby dostosować zawiesinę tak, aby 1 mL zawierało 0,5-2 komórki o wymiarach 10⁵.
  6. Na talerz nałóż 1 mL zawiesiny ogniwowej na misku 35 mm i dodaj wystarczającą ilość podłoża wzrostu EMEM, aby całkowita objętość wyniosła 2 mL. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂. Komórki są gotowe do transfekcji przy 70%-80% konfluencji.
  7. W dniu transfekcji podgrzewanie odczynników do 37 °C, całkowite rozmrażenie DNA podjednostki nAChR i doprowadzenie odczynnika transfekcyjnego do temperatury pokojowej. Wszystkie odczynniki przed umieszczeniem w szafce biosafety wyczyść 70% etanolem.
  8. Aby wyrazić α7 nAChRs: W rurce mikrowirówki rozcieńcz 4 μg α7 (1 μg/μL) i 1 μg DNA plazmidów NACHO (1 μg/μL) kroplami do zredukowanego medium surowicy (bez antybiotyku) do końcowej objętości 250 μL. Po dodaniu DNA delikatnie wymieszaj przez pipetowanie.
    1. Aby wyrazić α4β2 nAChRs: Rozcieńcz 4 μg każdej podjednostki DNA w łącznie 250 μL zredukowanego surowicowego nośnika. Delikatnie mieszaj przez pipetowanie. Dostosuj stosunek każdej podjednostki, aby zoptymalizować ekspresję konkretnych izoform receptorów.
    2. Aby wyrazić α4β2 nAChR dodatkowym plazmidem, należy dodać równe ilości każdego plazmidowego DNA. Niebieskie białko fluorescencyjne mTagBFP2³¹ w pcDNA3.1(+) pełni funkcję plazmidu kontrolnego i może być zastąpione dowolnym chaperonem α4β2.
  9. Delikatnie wymieszaj odczynnik do transfekcji DNA przed użyciem. W osobnej rurce mikrowirówki rozcieńcz 8 μL odczynnika transfekcyjnego kroplą w 250 μL zredukowanego medium surowicowego. Inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przejdź do kolejnego kroku w ciągu 25 minut.
  10. Po 5 minutach połącz rozcieńczone DNA z rozcieńczonym odczynnikiem transfekcyjnym (łącznie = 500 μL) krople. Delikatnie mieszaj przez pipetowanie i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Kompleksy DNA-lipidowe pozostają stabilne do 6 godzin.
  11. Podczas tworzenia się kompleksów należy wyjąć posiewki z inkubatora i zastąpić podłoże 1 mL EMEM bez surowicy (bez antybiotyków).
  12. Do każdej misy dodaj po kroplach 500 μL kompleksu odczynnikowego DNA-transfekcyjnego (końcowa objętość = 1,5 mL). Delikatnie mieszaj, kołysząc talerzem, aby zapewnić równomierne rozłożenie na talerzu, szczególnie na powierzchni szklanej powierzchni. Inkubuj w 37 °C przez 24 godziny, a następnie po 4-6 godzinach wymienia podłoże, aby wspierać zdrowie komórek.

2. Znakowanie komórek żywych α7 nAChR z ekspresją plazmatycznej przy użyciu αBTX Alexa Fluor 647

UWAGA: Następujący zabieg jest zazwyczaj wykonywany 24 godziny po transfekcji. Ochrona αBTX Alexa Fluor 647 (αBTX-AF647) przed światłem, aby zapobiec fotodestrukcji fluoroforu.

  1. Podgrzej wszystkie odczynniki do 37 °C i rozmroz roztwór zapasowy αBTX-AF647 (2,3 μM). Czyść 70% etanolem i włóż do szafki zabezpieczeń biologicznych.
  2. Wyjmij z inkubatora naczynie zawierające komórki przekryte DNA α7 i NACHO, oczyść zewnętrzną część 70% etanolem i umieść ją w szafce zabezpieczeń biologicznych.
  3. Usuń stare medium przez ssanie próżniowe. Aby przemyć komórki, dodaj 2 mL świeżego medium wzrostu EMEM.
  4. Usuń medium do mycia przez ssanie próżniowe. Dodaj 2 mL medium wzrostu EMEM do naczyń.
  5. Zastąpić odpowiednią ilość medium αBTX-AF647, aby osiągnąć końcowe stężenie 80 nM. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.
  6. Rano podgrzej PBS lub preferowane medium obrazowe i oczyść 70% etanolu. Przenieś do szafki do zabezpieczenia biologicznego.
  7. Wyjmij transfekowane komórki z inkubatora, wyczyść i umieść je w szafce zabezpieczeń biologicznych.
  8. Usuń stare medium zawierające αBTX-AF647 i umieść je w odpowiednim pojemniku na odpady.
  9. Przemyj komórki 2 mL PBS przez 3x, po 10 minut w temperaturze pokojowej. Płukania usuwają niezwiązane ligandy i zanieczyszczenia, a czas można dostosować do potrzeb badacza. Usuwaj PBS po każdym praniu.
  10. Dodaj 2 mL PBS lub preferowanego medium obrazującego i przejdź do obrazowania komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego.

3. Obrazowanie komórkami żywymi całkowitych i wewnętrznych α7-pHuji nAChR

UWAGA: Poniższa procedura wykorzystuje wewnętrznie wykonany plazmid α7-pHuji pcDNA3.1, współtransfekowany z chaperonem NACHO. Podobny protokół zastosowano do ekspresji α4-SEP i β2-pHuji w pcDNA3.1 za pomocą plazmidu kontrolnego mTagBFP2 pcDNA3.1, jak opisano w sekcji Wyników. Chroń próbki przed światłem przez cały proces, aby zapobiec fotodestrukcji fluoroforu.

  1. Przygotuj bufor obrazowania pH 7,4 (Tabela 1) oraz bufor chłodzący pH 5,5 (Tabela 2), zgodnie z opisem23.
  2. Podgrzewanie odczynników do 37 °C, czyszczenie z 70% etanolem i przelanie do szafki do zabezpieczenia biologicznego. Wyjmij transfekowane komórki z inkubatora, wyczyść je 70% etanolem i umieść je w szafce zabezpieczeń biologicznych.
  3. Usuń stare medium przez ssanie. Przepłucz naczynie 2 mL PBS 3 razy, po 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 2 mL buforu obrazowania pH 7,4.
  4. Przynieś talerz do mikroskopu konfokalnego. Włóż talerz obrazujący z buforem obrazowania o pH 7,4 do uchwytu szkiełka i umieść uchwyt w komorze podgrzewanej na mikroskopie konfokalnym.
  5. Podłącz rurkę pompy perystaltycznej do uchwytu na talerz obrazujący i zamknij komorę.
  6. Otwórz oprogramowanie obrazujące i wybierz lasery dla interesujących nas fluoroforów (pHuji 566/598 nm, α4-SEP 499/520 nm, β2-pHuji 568/603 nm oraz mTagBFP2 359/461 nm).
  7. Zeskanuj talerz, aby zlokalizować komórki do obrazowania za pomocą obiektywu 10x-60x. Zwiększ powiększenie, jeśli chcesz, i dostosuj głębokość ostrości w razie potrzeby.
  8. Dostosuj intensywność lasera i czułość detektora, aby zwizualizować fluorescencję bez sygnału tła. W razie potrzeby dostosuj przysłonę, aby zwiększyć sygnał fluorescencji.
  9. Wybierz preferowaną rozdzielczość i uchwyć pojedynczy obraz przy użyciu wybranego obiektywu (np. 60x).
  10. Zapisz lokalizację na mapie naczynia, aby przenieść te same komórki po zmianie buforu buforowego do pH 5,5 do kalenia.
  11. Powtórz proces obrazowania dla kilku obszarów anteny, rejestrując każdą nową lokalizację. Używaj tych samych ustawień przechwytywania dla wszystkich obrazów (eksperymentalnych i grup kontrolnych), aby umożliwić poprawne porównania.
  12. Utrzymując tylko linię wylotową podłączoną do pompy perystaltycznej, powoli wysysaj bufor pH 7,4 z naczynia do pojemnika na odpady.
  13. Gdy większość buforu zostanie usunięta (bez suszenia komórek), przenieś linię wlotową do bufora chłodzenia pH 5,5.
  14. Włącz pompę perystaltyczną, aby powoli dodawać bufor pH 5,5 (1,5 mL/min) do naczynia, dbając o to, by komórki pozostały przyczepione.
  15. Uruchom pompę przez 20 minut, obserwując, czy bufor prawidłowo przepływa do i z talerza.
  16. Wyłącz pompę i inkubuj komórki buforem do hartowania pH 5,5 przez dodatkowe 20 minut, aby zapewnić równowagę.
  17. Aby powtórzyć obrazowanie, załaduj zapisane lokalizacje z poprzedniej sesji, aby wrócić do tych samych regionów.
  18. Potwierdź, że głębokość ogniskowa i pozycja są prawidłowe, ponieważ mogą się przesunąć po wymianie bufora.
  19. Powtórz obrazowanie we wszystkich zapisanych miejscach z użyciem warunku schłodzenia pH.
OdczynnikKoncentracja (mM)
NaCl135
KCl5
MgCl21.8
HEPES20
d-glukoza1
Dostosuj roztwór do pH 7,4

Tabela 1: Przepis na bufor obrazowania. Dodano następujące odczynniki, a roztwór dostosowano do pH 7,4.

OdczynnikKoncentracja (mM)
NaCl135
KCl5
MgCl20.4
CaCl21.8
MES20
d-glukoza1
Dostosuj roztwór do pH 5,5

Tabela 2: Przepis na bufor hartowania. Następujące odczynniki zostały wymieszane, a powstały roztwór został dostosowany do pH 5,5.

4. Kwantyfikacja obrazów

UWAGA: Ta procedura wyjaśnia, jak analizować obrazy komórek za pomocą ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) oraz metody skorygowanej całkowitej fluorescencji komórkowej (CTCF)32.

  1. Otwórz ImageJ i otwórz obraz do analizy. Obraz pojawi się jako stos, z każdym przechwyconym kanałem oddzielonym w tej samej klatce.
  2. Przejdź do kanału Phase. Jeśli obraz jest zbyt jasny (co jest typowe dla pustych lub tłowych obszarów), wybierz Przetwarzaj > Wzmacniaj kontrast, a następnie kliknij OK.
  3. Za pomocą narzędzia lupy przybliż (+) jedną komórkę. Za pomocą narzędzia do wyboru odręcznego odrysuj kontur komórki w kanale fazowym.
  4. Przełącz się na kanał fluorescencjonalny odpowiadający interesującemu mnie fluoroforowi. Ustaw pożądane pomiary, wybierając Analizuj > Ustaw Pomiary. Upewnij się, że zaznaczono powierzchnię, średnią wartość szarości oraz zintegrowaną gęstość .
  5. Aby zmierzyć wybrany obszar, wybierz Analizuj > Mierzyć lub naciśnij Command + M (Mac) / Ctrl + M (Windows).
  6. Wykonaj trzy pomiary tła, śledząc puste obszary w pobliżu komórki. Powtarzaj kroki dla pożądanej liczby komórek.
  7. Dane pomiarowe pojawią się w osobnym oknie Wyniki w ImageJ. Skopiuj i wklej te dane do Excela do analizy.
  8. Oblicz średnią średnią tła na podstawie trzech pomiarów tła.
  9. Oblicz wartość CTCF dla każdej komórki według następującego wzoru:
    CTCF =Gęstość zintegrowana−(Powierzchnia komórki x Średnia fluorescencja tła)
  10. Powtórz ten proces dla wielu komórek i obrazów dla każdej grupy eksperymentalnej (oraz warunków pH, jeśli dotyczy). Wyeksportuj wszystkie wyniki do oprogramowania do analizy danych do przetwarzania statystycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po powyższych procedurach transfekcji, α7 nAChR oraz białko chaperonu NACHO były współekspresowane w komórkach N2a. Zarówno komórki nietransfekowane, jak i transfekowane zostały oznaczone αBTX-AF647 24 godziny po transfekcji DNA. Ponieważ αBTX nie jest przepuszczalny przez błonę, cała wykryta fluorescencja pochodzi z receptorów obecnych na błonie plazmatycznej. Na Rysunku 2A,A′ zaobserwowano słabe barwienie αBTX-AF647 w komórkach N2a bez transfekcji, zgodnie z oczekiwaniami....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione metodologie ekspresji i ilościowej identyfikacji podjednostek nAChR w komórkach N2a ssaków odpowiadają na długoletnie wyzwania w osiąganiu szybkiej (~24 godziny) i obfitej ekspresji nAChR (> 60%) w błonie plazmatycznej w badaniach odkrywania, lokalizacji i handlu lekami. Kluczową siłą tego zestawu protokołów jest jego zdolność adaptacji zarówno dla homomerycznych (α7), jak i heteromerycznych (α4β2) nAChR, a prawdopodobnie jest stosowany także do innych podtypów nAChR, wraz z współekspresją białek chaperonow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Jamesowi Janoso za jego doświadczenie w dziedzinie mikroskopii technicznej oraz Centrum Badań Transformacyjnych w Metabolizmie (National Institute of General Medical Sciences przy National Institutes of Health w ramach Nagrody numer P20GM130443) za wsparcie Rdzenia Mikroskopii na Uniwersytecie Alaski w Fairbanks. Działania LW były częściowo wspierane przez fundusze z Higher Education Investment Fund, zapewnionego przez stan Alaska za pośrednictwem Uniwersytetu Alaski. Działania SMS były wspierane przez Nagrodę Rozwoju Instytucjonalnego (IDeA) od National Institute of General Medical Sciences przy National Institutes of Health w ramach grantu numer P20GM103395. Badania opisane w tej publikacji zostały wspierane przez National Institute of Mental Health National Institutes of Health (MMW według numeru nagrody R03MH135358) oraz National Institute of General Medical Sciences (MMW według numeru nagrody R16GM150455) National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna-EDTA (1x)  Gibco25200-056Odczynnik odłączający komórkę
Alfa-bungarotoksyna Alexa Fluor 647InvitrogenB35450Sprzężony alfa-bungarotoksyna
Szafa BSL poziomu 1 Biosafety  NuaireNU-425-400Obszar roboczy hodowli komórek sterylnych
Chlorek wapniaAventor/VWRBDH9224Komponent bufora
D-(+)-glukozaMilliPore Sigma G8270Komponent bufora
EMEM z L-glutaminąATCC30-2003Ośrodek komórkowy
DNA wolne od endotoksynStworzone wewnętrznie z wykorzystaniem zestawów ZymoNie ma zastosowaniaDNA nAChR ma być wykorzystywane do transfekcji przejściowych komórek
Mikrowirówki wolne od endotoksyn, 0,5 mL Aventor/VWR89000-010DNA i przygotowanie do transfekcji
Mikrowirówki wolne od endotoksyn, 1,5 mL Aventor/VWR20170-038DNA i przygotowanie do transfekcji
Serum bydlęce płodoweAventor/VWR97068-085Suplement serum
Fluoview FV10iOlympusFV10iMikroskop konfokalny
Naczynia MatTek z szklanym dnemMatTekP35GC-0-10-CNaczynia obrazujące
GraphPad Prism v. 10GraphPad Prismhttps://www.graphpad.com/featuresOprogramowanie do analizy danych
HEPESMilliPore Sigma H3375Komponent bufora
Lipofektamina 2000Invitrogen11668019Odczynnik transfekcyjny
Heksahydrat chlorku magnezuTermonaukowe413410025Komponent bufora
Hydrat MESMilliPore Sigma M5287Komponent bufora
mTagBFP2-pBADAddGene 54572DNA kontrolne do wykorzystania do transfekcji przejściowej komórki 
Komórki Neuro 2a (N2a)Kolekcja Amerykańskiej Kultury TypowejCCL-131Komórki wykorzystywane do transfekcji DNA i ekspresji nAChR
Opti-MEMGibco31985-070Zmniejszona ilość surowicy
Penicylina/StreptomycynaAventor/VWRK952-100mLAntybiotyk
Pompa perystaltycznaGilsonMiniPuls3Bufor zmienia się podczas obrazowania 
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowymJakość biologiczna119-069-131Bufor soli fizjologicznej
Pipet AidDrummond 140084Precyzyjny transfer cieczy
Końcówki na pipet (sterylne i wolne od endotoksyn, 1000 uL)Rainin30389216Precyzyjny transfer cieczy
Końcówki pipet (sterylne i wolne od endotoksyn, 20 μL)Rainin30389229Precyzyjny transfer cieczy
Końcówki pipetyczne (sterylne i wolne od endotoksyn, 250 μL)Rainin30389246Precyzyjny transfer cieczy
Pipety, P10Rainin L-10XLSPrecyzyjny transfer cieczy
Pipety, P100Rainin L-100XLSPrecyzyjny transfer cieczy
Pipety, P1000Rainin L-1000XLSPrecyzyjny transfer cieczy
Chlorek potasuMilliPore Sigma P3911Komponent bufora
Serologiczne pipety (bezpłodne i beztlenowe, 10 ML)Aventor/VWR89130-898Precyzyjny transfer cieczy
Serologiczne pipety (bezpłodne i wolne od endotoksyn, 25 mL)Aventor/VWR89130-900Precyzyjny transfer cieczy
Serologiczne pipety (bezpłodne i wolne od endotoksyn, 5 mL)Aventor/VWR76201-710Precyzyjny transfer cieczy
Serologiczne pipety (sterylne i wolne od endotoksyn, 50 mL)Aventor/VWR75816-088Precyzyjny transfer cieczy
Chlorek soduAventor/VWRBDH9286Komponent bufora
Kolba do hodowli tkanekFalcon353109Naczynia do uprawy
Zestaw Maxiprep ZymoPure II PlasmidBADANIA ZYMOD4203-A + D4203-BProdukcja DNA wolnego od endotoksyny
α 4-WRZEŚNIA ThermoFisher Scientific GeneArt Usługi Syntezy Genów & nbsp;  https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.htmlUsługi syntezy genów na zamówienie
α 7-pHujiTwist Biosciencehttps://www.twistbioscience.com/Usługi syntezy genów na zamówienie
β 2-pHujiThermoFisher Scientific GeneArt Usługi Syntezy Genów & nbsp;  https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.htmlUsługi syntezy genów na zamówienie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whiting, P. J., et al. Expression of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in brain and retina. Mol Brain Res. 10 (1), 61-70 (1991).
  2. Albuquerque, E. X., et al. Nicotinic Receptor Function in the Mammalian Central Nervous System. Ann New York Acad Sci. 757 (1), 48-72 (1995).
  3. Picard, F., et al. Alteration of the in vivo nicotinic receptor density in ADNFLE patients: a PET study. Brain. 129 (8), 2047-2060 (2006).
  4. Breese, C. Abnormal Regulation of High Affinity Nicotinic Receptors in Subjects with Schizophrenia. Neuropsychopharmacology. 23 (4), 351-364 (2000).
  5. De Luca, V., Voineskos, S., Wong, G., Kennedy, J. L. Genetic interaction between α4 and β2 subunits of high affinity nicotinic receptor: analysis in schizophrenia. Exp Brain Res. 174 (2), 292-296 (2006).
  6. Maskos, U., et al. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436 (7047), 103-107 (2005).
  7. Picciotto, M. R., et al. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391 (6663), 173-177 (1998).
  8. Staley, J. K. Human Tobacco Smokers in Early Abstinence Have Higher Levels of β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors than Nonsmokers. J Neurosci. 26 (34), 8707-8714 (2006).
  9. Gotti, C., Zoli, M., Clementi, F. Brain nicotinic acetylcholine receptors: native subtypes and their relevance. Trends Pharmacol Sci. 27 (9), 482-491 (2006).
  10. Mineur, Y. S., Mose, T. N., Blakeman, S., Picciotto, M. R. Hippocampal α7 nicotinic ACh receptors contribute to modulation of depression-like behaviour in C57BL/6J mice. British J Pharmacol. 175 (11), 1903-1914 (2018).
  11. Fernandes, S. S., et al. Enhanced cholinergic-tone during the stress induce a depressive-like state in mice. Behav Brain Res. 347, 17-25 (2018).
  12. Ren, J. M., Zhang, S. L., Wang, X. L., Guan, Z. Z., Qi, X. L. Expression levels of the α7 nicotinic acetylcholine receptor in the brains of patients with Alzheimer's disease and their effect on synaptic proteins in SH-SY5Y cells. Mol Med Rep. 22 (3), 2063-2075 (2020).
  13. Letchworth, S. R., Whiteaker, P. Progress and Challenges in the Study of α6-Containing Nicotinic Acetylcholine Receptors. Biochem Pharmacol. 82 (8), 862-872 (2011).
  14. Nelson, M. E., et al. Functional Properties of Human Nicotinic Achrs Expressed by Imr-32 Neuroblastoma Cells Resemble Those of α3β4 Achrs Expressed in Permanently Transfected Hek Cells. J General Physiol. 118 (5), 563-582 (2001).
  15. Cooper, S. T., Harkness, P. C., Baker, E. R., Millar, N. S. Up-regulation of Cell-surface α4β2 Neuronal Nicotinic Receptors by Lower Temperature and Expression of Chimeric Subunits *. J Biol Chem. 274 (38), 27145-27152 (1999).
  16. Harkness, P. C., Millar, N. S. Inefficient cell-surface expression of hybrid complexes formed by the co-assembly of neuronal nicotinic acetylcholine receptor and serotonin receptor subunits. Neuropharmacology. 41 (1), 79-87 (2001).
  17. Dhara, M. Polyamine regulation of ion channel assembly and implications for nicotinic acetylcholine receptor pharmacology. Nat Commun. 11 (1), (2020).
  18. Vallés, A. S., Roccamo, A. M., Barrantes, F. J. Ric-3 chaperone-mediated stable cell-surface expression of the neuronal α7 nicotinic acetylcholine receptor in mammalian cells. Acta Pharmacol Sinica. 30 (6), 818-827 (2009).
  19. Dawe, G. B., et al. α7 nicotinic acetylcholine receptor upregulation by anti-apoptotic Bcl-2 proteins. Nat Comm. 10 (1), (2019).
  20. Peng, J. H., et al. Inducible, heterologous expression of human α7-nicotinic acetylcholine receptors in a native nicotinic receptor-null human clonal line. Brain Res. 825 (1-2), 172-179 (1999).
  21. Cooper, S. T., Harkness, P. C., Baker, E. R., Millar, N. S. Up-regulation of Cell-surface α4β2 Neuronal Nicotinic Receptors by Lower Temperature and Expression of Chimeric Subunits. J Biol Chem. 274 (38), 27145-27152 (1999).
  22. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  23. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  24. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  25. O'Brien, B. C. V., Weber, L., Hueffer, K., Weltzin, M. M. SARS-CoV-2 spike ectodomain targets α7 nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 299 (5), 104707(2023).
  26. O'Brien, B. C. V., et al. The human alpha7 nicotinic acetylcholine receptor is a host target for the rabies virus glycoprotein. Front Cell Infect Microbiol. 14, (2024).
  27. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  28. Sankaranarayanan, S., Angelis, D. D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophy J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  29. Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J General Physiol. 143 (1), 51-66 (2013).
  30. Nichols, W. A., et al. Lynx1 Shifts α4β2 Nicotinic Receptor Subunit Stoichiometry by Affecting Assembly in the Endoplasmic Reticulum. J Biol Chem. 289 (45), 31423-31432 (2014).
  31. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An Enhanced Monomeric Blue Fluorescent Protein with the High Chemical Stability of the Chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).
  32. Fitzpatrick, M. Measuring cell fluorescence using ImageJ. , http://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html#measuring-cell-fluorescence-using-imagej (2025).
  33. Srinivasan, R., et al. Nicotine up-regulates α4β2 nicotinic receptors and ER exit sites via stoichiometry-dependent chaperoning. J Gen Physiol. 137 (1), 59-79 (2011).
  34. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An Enhanced Monomeric Blue Fluorescent Protein with the High Chemical Stability of the Chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).
  35. Matta, J. A., et al. NACHO Mediates Nicotinic Acetylcholine Receptor Function throughout the Brain. Cell Rep. 19 (4), 688-696 (2017).
  36. Flores, C. M., Rogers, S. W., Pabreza, L. A., Wolfe, B. B., Kellar, K. J. A subtype of nicotinic cholinergic receptor in rat brain is composed of alpha 4 and beta 2 subunits and is up-regulated by chronic nicotine treatment. Mol Pharmacol. 41 (1), 31-37 (1992).
  37. Mazzaferro, S., Whiteman, S. T., Alcaino, C., Beyder, A., Sine, S. M. NACHO and 14-3-3 promote expression of distinct subunit stoichiometries of the α4β2 acetylcholine receptor. Cell Mol Life Sci. 78 (4), 1565-1575 (2021).
  38. Nichols, W. A., et al. Lynx1 Shifts α4β2 Nicotinic Receptor Subunit Stoichiometry by Affecting Assembly in the Endoplasmic Reticulum. J Biol Chem. 289 (45), 31423-31432 (2014).
  39. Fasoli, F., et al. In vivo chronic nicotine exposure differentially and reversibly affects upregulation and stoichiometry of α4β2 nicotinic receptors in cortex and thalamus. Neuropharmacology. 108, 324-331 (2016).
  40. Wada, E., et al. Distribution of alpha2, alpha3, alpha4, and beta2 neuronal nicotinic receptor subunit mRNAs in the central nervous system: A hybridization histochemical study in the rat. J Comparative Neurol. 284 (2), 314-335 (1989).
  41. Zoli, M., Léna, C., Picciotto, M. R., Changeux, J. P. Identification of Four Classes of Brain Nicotinic Receptors Using β2 Mutant Mice. J Neurosci. 18 (12), 4461-4472 (1998).
  42. Briggs, C. A., et al. and Low-Sensitivity Subforms of α4β2 and α3β2 nAChRs. J Mol Neurosci. 30 (1-2), 11-12 (2006).
  43. Weltzin, M. M., George, A. A., Lukas, R. J., Whiteaker, P. Distinctive single-channel properties of α4β2-nicotinic acetylcholine receptor isoforms. PLoS One. 14 (3), e0213143(2019).
  44. Moroni, M., Bermudez, I. Stoichiometry and Pharmacology of Two Human α4β2 Nicotinic Receptor Types. J Mol Neurosci. 30 (1-2), 95-96 (2006).
  45. Nelson, M. E., Kuryatov, A., Choi, C. H., Zhou, Y., Lindstrom, J. Alternate Stoichiometries of α4β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors. Mol Pharmacol. 63 (2), 332-341 (2003).
  46. Tapia, L., Kuryatov, A., Lindstrom, J. Ca2+ Permeability of the (α4)3(β2)2 Stoichiometry Greatly Exceeds That of (α4)2(β2)3 Human Acetylcholine Receptors. Mol Pharmacol. 71 (3), 769-776 (2007).
  47. Eaton, J. B., et al. The Unique α4(+)/(−)α4 Agonist Binding Site in (α4)3(β2)2 Subtype Nicotinic Acetylcholine Receptors Permits Differential Agonist Desensitization Pharmacology versus the (α4)2(β2)3 Subtype. J Pharmacol Exp Ther. 348 (1), 46-58 (2014).
  48. Mazzaferro, S., et al. Additional Acetylcholine (ACh) Binding Site at α4/α4 Interface of (α4β2)2α4 Nicotinic Receptor Influences Agonist Sensitivity. J Biol Chem. 286 (42), 31043-31054 (2011).
  49. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Bio Chem. 286 (36), 31241-33124 (2011).
  50. Asokan, A., Cho, M. J. Exploitation of Intracellular pH Gradients in the Cellular Delivery of Macromolecules. J Pharma Sci. 91 (4), 903-913 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Lokalizacja w b onie plazmatycznejlokalizacja wewn trzkom rkowakonfokalna mikroskopia ywych kom rekfluorescencja wra liwa na pHtransport receptor wbia ka opieku czekom rki Neuro2aanaliza w programie ImageJ

Powiązane artykuły