A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Badanie wykorzystuje modele zwierzęce i komórkowe do badania, czy inhibitor NRF2 ML385 hamuje postęp złośliwego gruczolakoraka płuc wywołany krzemionką poprzez szlak osi autofagii ROS/NRF2.
Ekspozycja na krzemionkę wiąże się ze zwiększonym ryzykiem gruczolakoraka płuc, jednak mechanizm molekularny pozostaje niejasny. Celem niniejszego badania jest ustanowienie powtarzalnego protokołu eksperymentalnego, który pozwoli zbadać, w jaki sposób inhibitor czynnika jądrowego erytroidnego 2-powiązanego z czynnikiem 2 (NRF2) ML385 hamuje postęp złośliwego gruczolakoraka płuc wywołany krzemionką poprzez regulację szlaku osi autofagii ROS/NRF2. Po pierwsze, model krzemionki został opracowany przez donosową perfuzję zawiesiny krzemionkowej u myszy C57BL/6. Stopień włóknienia płuc oceniono za pomocą barwienia Masson, infiltrację komórek odpornościowych analizowano immunofluorescencją, a ekspresję NRF2, kinazy cyklin-zależnej 1 (CDK1) oraz kanału anionowego zależnego od napięcia 1 (VDAC1) w tkance płucnej wykryto za pomocą immunohistochemii. Następnie, w eksperymentach in vitro , linia komórek makrofagów RAW264.7 została poddana użyciu krzemionki. Strumień autofagiczny i poziomy stresu oksydacyjnego oceniono za pomocą współlokalizacji lizosomów LC3 oraz sond ROS, a interwencję przeprowadzono inhibitorem NRF2 ML385. Na koniec analizowano wpływ ML38 na migrację, inwazję i apoptozę komórek gruczolakoraka płuc za pomocą testu scratch, komórek przechodzących przez pory o określonej wielkości oraz cytometrii przepływowej. Wyniki wykazały, że krzemionka może indukować włóknienie płuc, infiltrację komórek odpornościowych oraz wzrost poziomu NRF2, CDK1 i VDAC1 u myszy (p < 0,001), hamować przepływ autofagiczny makrofagów i obniżać poziom ROS. ML385 może odwrócić te efekty (p < 0,05). Protokół ten zapewnia kompleksowy proces eksperymentalny od budowy modelu in vivo po badania mechanizmów in vitro , oferując operacyjną ścieżkę techniczną do badania molekularnego mechanizmu gruczolakoraka płuc związanego z krzemionką oraz strategii terapeutycznych ukierunkowanych na NRF2.
Gruczolacz płuc jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem na całym świecie, z szacunkowo 2 milionami nowych przypadków i 1,76 miliona zgonówrocznie. W ostatnich latach wzrosła częstość gruczolakoraka płuc wśród osób, które nigdy nie paliły, co może być związane z czynnikami środowiskowymi, takimi jak zanieczyszczenie powietrza2. Krzemionka jest powszechnym zanieczyszczeniem środowiskowym i została zidentyfikowana jako potencjalny czynnik patogenny dla gruczolakoraka płuc u człowieka3. Krzemionka może powodować utrzymujący się przewlekły stan zapalny, prowadząc do infiltracji makrofagów, limfocytów i neutrofilów oraz uwalniania reaktywnych form tlenu i czynników zapalnych4. To długotrwałe mikrośrodowisko zapalne sprzyja powstawaniu gruczolakoraka płuc 5,6. Chociaż związek między ekspozycją na krzemionkę a gruczolakorakiem płuc został potwierdzony, jego specyficzny mechanizm molekularny nie został w pełni wyjaśniony.
Czynnik transkrypcjonalny NRF2, zakodowany przez gen NFE2L2, odgrywa kluczową rolę jako główny regulator w utrzymaniu homeostazy redoks komórkowej w odpowiedzi na stres oksydacyjny 7,8. W normalnych warunkach NRF2 jest znakowany i degradowany przez kompleks ligazy ubikwityny KEAP1-CUL3. Pod wpływem stymulacji stresu oksydacyjnego lub substancji elektrofilowych aktywność KEAP1 jest hamowana, co pozwala NRF2 na stabilne gromadzenie się i wejście do jądra, pełniąc tym samym funkcję obronną i regulacyjną rdzenia9. Niemniej jednak nadmierna aktywacja NRF2 w mikrośrodowisku nowotworowym może zwiększać glikolizę i przeżywalność komórek nowotworowych, zatrzymując nagromadzenie się ROS i zwiększając odporność na apoptotę10,11. Badania wykazały, że ekspozycja na krzemionkę może prowadzić do nieprawidłowej aktywacji szlaku sygnalizacyjnego NRF2 12,13. Dlatego celowanie w NRF2 może być skuteczną strategią interwencji w złośliwym postępie gruczolakoraka płuc wywołanego krzemionką14.
Celem tego badania jest wyjaśnienie, czy inhibitor NRF2 ML385 hamuje złośliwy postęp gruczolakoraka płuc wywołany krzemionką poprzez regulację szlaku autofagii ROS/NRF2. Stworzyliśmy myszy model indukowany krzemionką, aby odtworzyć kluczowe cechy choroby i wykorzystaliśmy eksperymentalne metody in vitro do badania interakcji między makrofagami a komórkami nowotworowymi. Stwierdziliśmy, że krzemionka indukuje ekspresję cząsteczek zapalnych i immunologicznych oraz dodatkowo wspiera powstawanie guzów poprzez szlak osi autofagii ROS/NRF2. Gdy stosowano inhibitor NRF2 (ML385), działanie krzemionki promujące na tworzenie guzów spowolniło, co sugeruje, że inhibitor NRF2 może odgrywać rolę w leczeniu guzów płuc indukowanych krzemionką.
Wszystkie bloki dawców zostały pobrane z archiwalnych okazów patologicznych zebranych w latach 2016–2018 w Afiliowanym Szpitalu Ludowym nr 1 Huai'an Uniwersytetu Medycznego w Nankinie. Próbki zostały zdeidentyfikowane przed użyciem i przetworzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami. Komisja etyczna Afiliowanego Szpitala Ludowego nr 1 Huai'an Uniwersytetu Medycznego w Nankinie, KY-2024-250-01. Hodowla, utylizacja i stosowanie myszy eksperymentalnych ściśle przestrzegają Przepisów dotyczących Zarządzania Zwierzętami Laboratoryjnymi oraz międzynarodowych wytycznych.
Konstrukcja modelu myszy indukowanego krzemionką
Przygotowanie myszy i zawiesiny krzemionkowej: Chowaj samce myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni w pokoju dla zwierząt o temperaturze pokojowej 20-25 °C i 12-godzinnym cyklu światła / 12 godzin ciemności. Aby przygotować zawiesinę z pyłu krzemowego, precyzyjnie zważono 300 mg proszku krzemowego i zawieszono w 10 mL sterylnej soli fizjologicznej 1x buforowanej fosforanami. Następnie mieszanina była intensywnie wirowana i oscylowana przez 5 minut, a następnie ultradźwiękowo obrobiona w ultradźwiękowej maszynie w kąpieli wodnej przez 30 minut, aby zapewnić równomierne rozproszenie cząstek i zapobiec agregacji. Ostateczne stężenie tego zawieszenia rezerwowego wynosi 30 mg/mL. Sterylizuj ją przez autoklawowanie w 121 °C przez 30 minut. Przed każdym użyciem należy ponownie zawirować i potrząsnąć przez 2-3 minuty, aby ponownie zawiesić osadzone cząstki.
Myszy wdychały zawiesinę krzemionkową przez nos. Mikropipeta była używana do powolnego i kropelowego wprowadzania roztworu do jamy nosowej myszy. Myszy podzielono na 6 grup, po 20 w każdej grupie. Objętość wdechowa każdej grupy wynosiła 10 μL, 30 μL, 50 μL, 70 μL, 90 μL i 200 μL, przy stężeniu 30 mg/mL, raz dziennie przez 40 kolejnych dni. Podczas infuzji chwyć skórę za uchem myszy kciukiem i palcem wskazującym lewej ręki, a pozostałymi palcami przytrzymaj ciało i ogon myszy. Upewnij się, że mysz leży na plecach z lekko odchyloną głową do tyłu, aby zawieszenie mogło być naturalnie wciągnięte do dróg oddechowych. Stwierdziliśmy, że po drugim dniu wdychania zawiesiny krzemionkowej 10 μL, 30 μL, 50 μL i 70 μL krzemionki u myszy nie doszło do zgonu, podczas gdy po drugim dniu wdychu zawiesina krzemionkowa 90 μL i 200 μL u myszy nastąpiła do zgonu. W związku z tym maksymalna objętość wdychania krzemionki u myszy wynosiła 70 μL dziennie.
Podczas obsługi krystalicznej krzemionki musi być wykonywana w szafie bioasekuracyjnej lub okapie oparowym, a przez cały proces należy nosić maski N95, przeciwkurzalne gogle, rękawice nitrylowe oraz odzież ochronną. Podczas przygotowania zawieszenia ruchy powinny być delikatne, a komora ważenia powinna być używana, aby zapobiec powstawaniu aerozoli. Wszystkie odpady kontaktowe krzemionkowe powinny być zbierane w szczelnie zamkniętych pojemnikach odpornych na przebicie i utylizowane zgodnie z przepisami dotyczącymi niebezpiecznych odpadów chemicznych. Surowo zabronione jest mieszanie go z ogólnymi śmieciami lub wlewanie do kanałów. Odpady biologiczne, takie jak podłoże hodowlane komórek, powinny być zbierane do specjalnych koszy na śmieci zawierające środki dezynfekuujące i sterylizowane pod wysokim ciśnieniem. Zwłoki i tkanki zwierząt powinny być umieszczane w workach na odpady biologiczne i sterylizowane pod wysokim ciśnieniem w celu nieszkodliwego leczenia.
Oceń skuteczność modelu myszy indukowanego krzemionką. Oceniaj zwierzęta w różnych momentach po wdychaniu krzemionki, mianowicie w 3., 14. i 40. dniu. Myszy umieszczono w profesjonalnych urządzeniach do eutanazji zwierząt, a dwutlenek węgla wprowadzono z tempem napełniania 30%-50% objętości/min. Były ciągle wystawione na działanie aż do momentu, gdy przestały oddychać. Po potwierdzeniu śmierci przeprowadzono kolejne operacje. Usunięto tkankę płucną. Tkanka płucna była utrwalona w roztworze 4% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Po utrwaleniu tkanka była odwodniona alkoholem gradientowym, przejrzczona ksylenem, a następnie osadzona w parafinie. Ciągłe przekroje wykonywano przy użyciu maszyny do sekcowania parafiny o grubości 4-5 μm do późniejszego barwienia histologicznego i analizy immunohistochemicznej. Tkanka płucna nie wymaga leczenia odwapnienia. Przeprowadzono badanie patologiczne tkanki płucnej w celu oceny skutecznego generowania modeli. Kryteria sukcesu konstrukcji modelu krzemki były następujące: istotne zapalenie płuc, zwłóknienie oraz występowanie guzków krzemowej.
Analiza infiltracji komórek odpornościowych w modelu myszy indukowanym krzemionką
Tkanki płucne myszy w 14. dniu po wdychaniu krzemionki były barwione markerami fluorescencyjnymi zawierającymi CD3e (współczynnik rozcieńczenia 1:200), CD8a (współczynnik rozcieńczenia 1:200), CD86 (współczynnik rozcieńczenia 1:200), F4/80 (współczynnik rozcieńczenia 1:200) oraz Nk1.1 (współczynnik rozcieńczenia 1:200), aby zobrazować komórki odpornościowe. Zabezpiecz przekroje komórek lub tkanek i blokuj je 5% błoniną surowicy bydłej (BSA) przez 1 godzinę, aby zmniejszyć wiążenie niespecyficzne. Użyj zwykłej surowicy pochodzenia tego samego gatunku co przeciwciało blokujące, rozcieńcz surowicę PBS w proporcji 1:10 i dodaj 100 μL rozcieńczonej surowicy do próbki. Następnie blokuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby surowica mogła zablokować endogenne przeciwciała. Po zabezpieczeniu delikatnie spłukaj 2 razy PBS. Pierwotne przeciwciała zawierające CD3e (współczynnik rozcieńczenia 1:200), CD8a (współczynnik rozcieńczenia 1:200), CD86 (współczynnik rozcieńczenia 1:200), F4/80 (współczynnik rozcieńczenia 1:200) oraz Nk1.1 (współczynnik rozcieńczenia 1:200) były inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C lub w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny. Po myciu PBS dodano fluorescencyjne przeciwciało wtórne, które inkubowano w ciemności przez 1 godzinę.
Barwienie Massona i analiza immunohistochemiczna
Sekcje parafinowe zostały odwoskowane ksylenem i nawodnione alkoholem gradientowym, a następnie pobranie antygenów przeprowadzono w buforze cytrynianu sodu o pH 6,0 poprzez remediację termiczną pod wysokim ciśnieniem. Do remediacji termicznej pod wysokim ciśnieniem umieść plasterki tkanki nasączone w buforze naprawczym w mikrofalówce na średnim ogniu na 8-12 minut. Endogenna aktywność nadtlenku była blokowana roztworem nadtlenku wodoru 3% na 20 minut, a następnie miejsce wiązania niespecyficzne było blokowane 5% BSA w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodaj przeciwciała pierwotne: NRF2 (1:200), CDK1 (1:400) i VDAC1 (1:500) i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C. Po 3-krotnym umyciu PBS dodaj przeciwciało przeciwkróliczne dla kóz oznaczone HRP (1:500) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Preparaty parafinowe poddawano barwieniu DAB, barwieniu hematoksylinowym, przezroczystości odwodnienia oraz neutralnemu uszczelnianiu żelowemu, aby uzyskać odpowiadające wyniki immunohistochemii molekularnej. Gdy do wywoływania kolorów używa się DAB, umiarkowany wzrost powinien być brunatnożółty do brązowobrązowego, a tło powinno być przezroczyste. Zarówno nadmierne (ciemnobrązowe), jak i niewystarczające (jasnożółte) wywoływanie kolorów wymagają optymalizacji czasu wywoływania koloru.
Stopień włóknienia płuc został częściowo przeanalizowany metodą oceny Ashcrofta15: Fragmenty barwione Massonem obserwowano pod mikroskopem powiększenia 100x, a tkankę płuc losowo podzielono na 8 obszarów. Każdy region był oceniany według stopnia zwłóknienia (0-8 punktów), a końcowy wynik to średnia ze wszystkich regionów: 0 punktów (prawidłowa tkanka płuca), 1-2 punkty (łagodne włóknienie), 3-4 punkty (umiarkowane włóknienie), 5-8 punktów (ciężka fibroza).
Wyniki immunohistochemiczne zostały ilościowo przeanalizowane za pomocą oprogramowania Image. Losowo wybrano pięć pól o dużym powiększeniu, a średnia wartość gęstości optycznej (MOD) każdego pola została zmierzona jako wskaźnik poziomu ekspresji białek.
Badanie wpływu krzemionki i ML385 na autofagię i ROS w komórkach RAW264.7
Zarówno komórki RAW264.7, jak i A549 (dostarczone przez Uniwersytet Nauki i Technologii Anhui) zostały wyhodowane przy użyciu podłoża DMEM o wysokiej glukozie, uzupełnionego 10% surowicy bydła płodu (FBS) oraz 1% dwuosobowego roztworu przeciwciał penicylinowo-streptomycyny. Komórki 1 x 107 były równomiernie hodowane w inkubatorze o stałej temperaturze przy 37 °C i 5%CO2. Do 1 x 105 komórek /mL ogniw RAW264,7 dodano 5 μL zawiesiny krzemionkowej o stężeniu 30 mg/mL. Po inkubacji trwającej 24 godziny komórki zostały przepłukane PBS 3x, a autofagia i stres oksydacyjny zostały wykryte przez sondy ROS, LC3 i lizosomów. Jednocześnie ML38516, inhibitor NRF2, został użyty do hamowania ekspresji NRF2 (końcowe stężenie ML385: 5 mM/L). Autofagia i stres oksydacyjny zostały wykryte zgodnie z powyższymi krokami eksperymentalnymi. Statystycznie przeanalizowano stres oksydacyjny i przepływ autofagii obu grup.
Analiza immunohistochemiczna ekspresji VDAC1, CDK1, s62 i NRF2 w tkance gruczolakoraka płuc
Ekspresje VDAC1, CDK1, s62 i NRF2 sprawdzono u 30 pacjentów. Tkanki z gruczolastadkiem płuc oraz przyległymi zdrowymi tkankami pozyskano z Afiliowanego Szpitala Ludowego nr 1 Huai'an Uniwersytetu Medycznego w Nankinie i przeanalizowano za pomocą immunohistochemii (IHC). Wyniki IHC i włóknienia płuc zostały przeanalizowane statystycznie. Zbieraj dane pacjentów zgodnie z informacjami o pacjencie w systemie szpitalnym. Szczegółowe kroki eksperymentalne przedstawiają się następująco: sekcje parafiny zostały odwoszczone ksylenem i nawodnione alkoholem gradientowym, a następnie przeprowadzono remediację antygenową w buforze cytrynianowym sodu o pH 6,0 poprzez remediację termiczną pod wysokim ciśnieniem. Endogenna aktywność nadtlenku była blokowana roztworem nadtlenku wodoru 3% na 20 minut, a następnie miejsce wiązania niespecyficzne było blokowane 5% BSA w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodaj przeciwciała pierwotne: NRF2 (1:200), CDK1 (1:400), p62 (1:500) i VDAC1 (1:500), a następnie inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C. Po 3 myciu PBS dodaj przeciwciało przeciw kozom antykróliczym z oznakowaniem HRP (1:500) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Rozwój koloru DAB, barwienie z hematoksyliną, odwodnienie przezroczyste, neutralne uszczelnienie dziąsł. Gdy do wywoływania kolorów używa się DAB, umiarkowany wzrost powinien być brunatnożółty do brązowobrązowego, a tło powinno być przezroczyste. Zarówno nadmierne (ciemnobrązowe), jak i niewystarczające (jasnożółte) wywoływanie kolorów wymagają optymalizacji czasu wywoływania koloru.
Analiza migracji i inwazji komórek
Badana była analiza wpływu ML385 i supernatantu z współinkubacji krzemionki z komórkami RAW264.7 na migrację i inwazję komórek po inkubacji z linią komórkową gruczolakoraka płuc A549. Supernatant komórek RAW264.7 współhodowanych z krzemionką przez 24 godziny został dodany do komórek A549. Komórki zostały podzielone na grupę krzemionkową, krzemionkową+ML385 oraz grupę PBS. Grupa krzemionkowa: 5 μL zawiesina krzemionki 30 mg/mL została dodana do 1 x 105 ogniw/mL ogniw RAW264.7. Po inkubacji trwającej 24 godziny usuń supernatant komórkowy do późniejszego użycia. Grupa krzemionka+ML385: 5 μL zawiesiny krzemionkowej 30 mg/mL oraz końcowe stężenie 5 mM/L ML385 zostało dodane do 1 x 105 ogniw/mL ogniw RAW264,7. Po inkubacji trwającej 24 godziny usuń supernatant komórkowy do późniejszego użycia. Grupa PBS: 5 μL PBS dodano do 1 x 105 komórek /mL komórek RAW264,7. Po inkubacji trwającej 24 godziny usuń supernatant komórkowy do późniejszego użycia. Podczas testu scratch komórki A549 zostały najpierw zasiane na płytkach z 12 dołkami o gęstości 5 x 105 na odwór. Po osiągnięciu 95%-100% fuzji komórek, na komórkach monowarstwowych wykonano rysy za pomocą końcówki sterylnej pipety 200 μL. Usunięte komórki delikatnie zmywano PBS. Następnie warunki hodowli zostały zmienione tak, aby obejmować 1% podstawowego medium FBS oraz supernatanty każdej grupy leczonej, aby utrzymać żywotność komórek w 7-dniowym okresie eksperymentalnym. Obrazy tej samej pozycji zostały zebrane pod mikroskopem odwróconym odpowiednio o 0 godzinie (dzień 0) i 7. dniu (dzień 7) po zadrapaniu. Na koniec obszar zadrapania został przeanalizowany ilościowo, a szybkość zamykania rys obliczono za pomocą oprogramowania ImageJ, aby ocenić wpływ supernatantu z różnych grup leczonych na zdolność migracji komórek A549.
W badaniu inwazyjnym komórek przechodzących przez pory o określonych rozmiarach zastosowano komorę membrany poliwęglanowej o pojemności 8 μm, przy czym membrana górnej komory była wcześniej pokryta żelem, co symulowało rozcieńczenie środowiska zewnątrzkomórkowego w stosunku 1:8, tworząc barierę błony podstawnej. Komórki A549 zostały ponownie zawieszone w zawiesinie powstałej przez zmieszanie medium wolnego od surowicy z supernatantami każdej grupy leczeń w proporcji 1:1, a następnie inokulowane w górnej komorze (2 x 104 komórek na komorę). W dolnej komorze dodano roztwór powstały przez zmieszanie medium zawierającego 20% FBS z supernatantami odpowiadających grup oczyszczających (krzemionka+ML385, grupa krzemionkowa i grupa PBS) w tej samej proporcji jako chemiczny atraktant. Supernatanty odpowiadających grup leczenia zostały pobrane przez ssanie przez pipetę w RAW264.7 Cell phagocytosis krzemionki. Po ciągłej inkubacji komórek w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 7 dni, nieinwazyjne komórki w komorze górnej usuwano wacikami, a komórki, które przeniknęły przez błonę i dotarły do dolnej komory, były utrwalane 4% paradehydem i barwione 0,1% kryształowym fioletem. Na koniec liczba inwazyjnych komórek została losowo wybrana z 5 pól widzenia za pomocą mikroskopu optycznego.
Analiza wpływu krzemionki i ML385 na apoptozę komórek A549 z wykorzystaniem cytometrii przepływowej
Przygotowanie i grupowanie komórek: Pobrano komórki A549 traktowane supernatantami każdej grupy leczeń (grupa PBS, grupa krzemionkowa, krzemionka + grupa ML385). Komórki były delikatnie myte 2 razy wstępnie schłodzonym PBS, następnie ponownie zawieszane w buforze wiązającym 1x, a gęstość komórek została dostosowana do 1 x 106 komórek w probówce/100 μL. Następnie do zawiesiny komórkowej dodano 5 μL Annexin V-FITC i 5 μL roztworu barwiącego PI, delikatnie wymieszano i inkubowano w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 minut. Po inkubacji do każdej probówki dodawano 400 μL buforu wiążącego 1x, który natychmiast testowano na maszynie. Detekcja przeprowadzono za pomocą cytometru przepływowego. Wzbudzony przez laser o długości 488 nm, sygnał fluorescencji Annexin V-FITC był zbierany przez kanał FITC, a sygnał fluorescencyjny PI przez kanał PE. Przed eksperymentem używano próbek pojedynczych barwników do korekty kompensacji fluorescencji, aby wyeliminować nakładanie się spektralne. Podczas analizy danych najpierw wyznacz populację komórek docelowych na wykresie rozrzutowym FSC-A/SSC-A i usuń fragmenty. Następnie adhezje komórek zostały wykluczone za pomocą wykresu rozpraszającego FSC-H/FSC-A; Na koniec utworzono bramkę rozróżniającą komórki żywe, wczesne komórki apoptotyczne, komórki późnej apoptoty/martwicze oraz komórki mechanicznie uszkodzone. Dane zostały uzyskane i przeanalizowane za pomocą oprogramowania FlowJo V10.
Model myszy krzemionkowej
Na Rysunku 1 myszy były podawane downętrznie krzemionkowo w dawce 30 mg/mL i 70 μL przez 40 kolejnych dni, co zapewniło, że u myszy nie doszło do żadnych zgonów i umożliwiło pomyślne opracowanie modelu myszy krzemionkowego. Tymczasem myszy stosowano jako negatywną kontrolę z PBS. Celem było wyeliminowanie wpływu operacji i samego rozpuszczalnika oraz zapewnienie, że fenotyp jest specyficznie indukowany krzemionką. Pomyślna replikacja tego modelu urazu płuc wywołanego krzemionką stanowi niezbędną podstawę in vivo do dalszych badań nad mechanizmem postępu złośliwego i interwencją lekową.
Analiza infiltracji komórek odpornościowych w guzkach myszy indukowanych krzemionką
Na Rysunku 2, wykrywając infiltrację komórek odpornościowych w guzkach myszy krzemionkowych, stwierdzono, że w tych guzkach występuje duża liczba infiltracji komórek odpornościowych (CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ i Nk1.1+), które uczestniczą w powstawaniu i rozwoju choroby krzemionkowej płuc. Wskazuje to, że krzemionka indukuje utrzymujące się zapalne mikrośrodowisko nowotworowe, które jest kluczowym czynnikiem sprzyjającym występowaniu i rozwojowi nowotworów, a także patofizjologiczną podstawą udziału szlaku ROS/NRF2.
Związek między włóknieniem płuc wywołanym krzemionką a NRF2, CDK1 i VDAC1 u myszy
Wykrywając ekspresję cząsteczek immunologicznych w guzkach, stwierdzono, że NRF2 (cel hamujący ML385), CDK1 (związany z cyklem komórkowym) oraz VDAC1 (zaangażowany w mitochondrialny stres oksydacyjny) były wysoko ekspresowane wokół i wewnątrz guzków i były związane z włóknieniem płuc (Rysunek 3).
Wpływ krzemionki i ML385 na autofagię i ROS w komórkach RAW264.7
Dzięki współhodowli krzemionki i komórek RAW264.7 odkryto, że krzemionka może indukować produkcję autofagosomów. Po 24 godzinach hodowli ograniczono współlokalizację autofagosomów i lizosomów, zahamowano przepływ autofagii, a produkcję ROS również ograniczono. Po dodaniu ML385 (inhibitor NRF2 ) wzmocniono współlokalizację autofagosomów i lizosomów, wzmocniono przepływ autofagii, a ROS również zwiększono odpowiednio (Rysunek 4).
Analiza ekspresji VDAC1, CDK1, s62 i NRF2 w tkance gruczolakoraka płuc przeprowadzona przez IHC
Jak pokazano na Rysunku 5, NRF2 (cel hamujący dla ML385), CDK1 (związany z cyklem komórkowym), VDAC1 (zaangażowany w mitochondrialny stres oksydacyjny) oraz p62 (zaangażowany w autofagię) są wysoko eksprimowane w tkankach gruczolakoraka płuc i wykazują istotne różnice w porównaniu z sąsiednimi tkankami.
Wpływ ML385 i supernatantu z współinkubacji krzemionki z komórkami RAW264.7 na migrację i inwazję komórek A549
Supernatant z hodowli krzemionkowej i RAW264.7 może wspierać migrację i proliferację komórek A549, podczas gdy ML385 może znacząco hamować te procesy (jak pokazano na Rysunku 6). Wynik ten wskazuje, że działanie makrofagów indukowane przez krzemionkę sprzyjającą nowotworom zależy od szlaku NRF2 . Hamowanie NRF2 może skutecznie blokować ten efekt promujący nowotwory, zmniejszając tym samym postęp złośliwych komórek nowotworowych.
Wpływ krzemionki i ML385 na apoptozę komórek A549
Rysunek 7 pokazuje, że krzemionka i supernatant hodowli komórek RAW264.7 mają pewien efekt hamujący na apoptozę komórek A549, a ML385 może promować apoptozę komórek A549.
Badanie to ujawniło szlak mechanistyczny, dzięki któremu ekspozycja na krzemionkę sprzyja postępowi złośliwego gruczolakoraka płuc poprzez oś ROS/NRF2/autofagia, stosując zarówno metody in vivo , jak i in vitro . Eksperymenty na zwierzętach potwierdziły, że kluczowe cząsteczki szlaku sygnalizacyjnego NRF2 są istotnie aktywowane w mikrośrodowisku włóknienia płuc wywołanego krzemionką. Eksperymenty komórkowe wykazały, że krzemionka bezpośrednio hamuje strumień autofagiczny w makrofagach i obniża poziom ROS, a efekt ten można specyficznie odwrócić przez inhibitor NRF2 ML385. Badania mechanizmów wykazały, że makrofagi poddawane krzemionce sprzyjają migracji, inwazji i hamowaniu apoptozy komórek gruczolakoraka płuc za pomocą czynników wydzielających, a ten efekt promujący guz jest całkowicie zależny od aktywacji szlaku NRF2.
Dostępność danych:
Zbiory danych wspierające zakończenie tego artykułu zostały zawarte w artykule.
Rysunek 1: Konstrukcja modelu krzemionkowego u myszy. (A) Leczyć myszy inhalacją krzemionki (30 mg/mL) w różnych objętościach (10 μL, 30 μL, 50 μL, 70 μL, 90 μL i 200 μL). 20 myszy na dawkę wdechową. (B) Krzywa przetrwania myszy. Maksymalna ilość wdychania to 70 μL/dzień. (C) Wyniki obserwacji histologicznego barwienia HE w płucach u myszy z grupy krzemionkowej i grupy PBS w dniu 3, 14 i 40. dniu. (D) Wyniki statystyczne dotyczące liczby guzków płucnych obserwowanych u myszy przy niskim powiększeniu, test t, ***p <0,001, p= 0,004, t = 10,61 (dzień 14), p =0,0006, t = 10,02 (dzień 40). N =9. Paski błędów pokazują błąd standardowy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 2: Obserwacja infiltracji komórek odpornościowych w tkance guzkowej myszy poprzez barwienie fluorescencyjne. Wysokie przeniknięcie komórek odpornościowych (CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ i NK1.1+) w guzkach płucnych indukowanych krzemionką u myszy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 3: Analiza zależności między ekspresjami NRF2, CDK1, VDAC1 a włóknieniem wywołanym krzemionką za pomocą immunohistochemii (IHC) i barwienia Masson . (A) Ekspresje NRF2, CDK1 i VDAC1 oraz wyniki barwienia Massonem. (B) Wyniki IHC. (C) Przeprowadzono statystyczną analizę włóknienia płuc pomiędzy grupą krzemionkową a grupą myszy z PBS. test t, ***p <0,001, p =0,0002, t =13,42 (NRF2), p=0,0008, t =9,247 (CDK1), p =0,0009, t =8,944 (VDAC1), p =0,0003, t =11,76 (zwłóknienie płuc). N =9. Paski błędów pokazują błąd standardowy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 4: Wpływ krzemionki na autofagię w komórkach RAW264.7 oraz działanie regulujące autofagię inhibitora NRF2 ML385. (A) Po współinkubacji krzemionki z komórkami RAW264,7 przez 24 godziny, współlokalizacja autofagosomów (LC3) i lizosomów zmalała (Green). Jednak po dodaniu ML385 wzrosła współlokalizacja autofagosomów i lizosomów (żółty). (B) Po współinkubacji krzemionki z komórkami RAW264,7 przez 24 godziny, ROS generowany przez grupę krzemionkową zmniejszył się, ale wzrósł po dodaniu ML385. (C) Analiza statystyczna ROS i strumienia autofagii obu grup, test t, ***p <0,001, p = 0,0005, t = 10,59 (ROS), p <0,0001, t = 17,08 (autofagolizom). N =6. Paski błędów pokazują błąd standardowy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 5: Analiza immunohistochemiczna ekspresji VDAC1, CDK1, s62 i NRF2 w tkance gruczolakoraka płuc u człowieka. (A) Różnice ekspresji (VDAC1, CDK1, s.62 i NRF2) między tkanką gruczolakoraka płuc a sąsiednią tkanką nienowotworową. (B) Analiza statystyczna różnicowej ekspresji między 30 przypadkami nowotworów a sąsiednimi tkankami nienowotworowymi z Afiliowanego Szpitala Ludowego nr 1 Huai'an Uniwersytetu Medycznego w Nankinie, test t, ***p <0.001, s. <0.0001, t =8.322 (CDK1), p <0.0001, t =16.4 (NRF2), s. <0.0001, t =15.47 (s.62), s. <0.0001, t =17,75 (VDAC1). N =30. Paski błędów pokazują błąd standardowy. (C) Analiza statystyczna włóknienia tkanki gruczolakoraka płuc oraz sąsiedniej tkanki nienowotworowej, test t, ***p <0,001, p =0,0009, t =8,854 (zwłóknienie). N =30. Paski błędów pokazują błąd standardowy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 6: Wpływ ML385 i supernatantu z koinkubacji krzemionki z komórkami RAW264.7 na migrację i inwazję komórek po inkubacji z linią komórkową gruczolakoraka płuc A549. (A) Wyniki scratch komórek są w dniu 0 i 7 po współinkubacji supernatantu i ML385 z komórkami A549. (B) Wyniki inwazyjne na komórki 7 dnia po współinkubacji supernatantu i ML385 z komórkami A549. (C) Przeprowadzenie analizy statystycznej wyników testu zarysowania komórek. *p <0.05, **p <0.01. test t, p =0,0020, t =22,43 (krzemionka+ML385 kontra krzemionka), p =0,0135, t =8,510 (krzemionka+ML385 vs PBS), p =0,0143, t =8,281 (krzemionka kontra PBS). N =6. Paski błędów pokazują błąd standardowy. (D) Przeprowadzenie analizy statystycznej wyników testu inwazyjnego na komórki. *p <0,05, **p <0,01, test t, p =0,0097, t =10,06 (krzemionka+ML385 kontra krzemionka), p =0,0472, t =4,437 (krzemionka+ML385 kontra PBS), p =0,0125, t =8,857 (krzemionka kontra PBS). N =6. Paski błędów pokazują błąd standardowy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 7: Analiza wpływu krzemionki i ML385 na apoptozę komórek A549 za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Wykrywanie wyników apoptozy komórek A549 za pomocą cytometrii przepływowej. (B) Przeprowadzenie analizy statystycznej procentu komórek apoptotycznych. *p <0,05, **p <0,01, t-test, p =0,0013, t =27,29 (krzemionka+ML385 kontra krzemionka), p =0,0022, t =6,973 (krzemionka+ML385 kontra PBS), p =0,0048, t =5,649 (krzemionka kontra PBS). N =6. Paski błędów pokazują błąd standardowy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Badanie wykorzystuje modele zwierzęce i komórkowe do badania, czy inhibitor NRF2 ML385 hamuje postęp złośliwego gruczolakoraka płuc wywołany krzemionką poprzez szlak osi autofagii ROS/NRF2.
Dziękujemy członkom zespołu za wsparcie i wkład w to badanie. Badanie to zostało wsparte przez Kluczowe Laboratorium Głębokiej Redukcji Przemysłowego Kurzu oraz Higienę Pracy w Instytutach Szkolnictwa Wyższego Anhui (nr AYZJSGXLK202202006), Fundusz Start-up Nowych Obszarów Ludowych Szpitali Ludowych w Szanghaju (nr PRYYH202501).
| BeyoGold Transwell | Beyotime Biotechnology | FTW067-48lns | Transwell |
| CD3e | BD Bioscience | 561827 | FITC Hamster Anti-Mouse CD3e (145-2C11) |
| CD86 | BD Bioscience | 105013 | CD86 |
| CD8a | BD Bioscience | 100713 | CD8a |
| CDK1 | Abcam | ab133327 | Anty-CDK1 |
| Zestaw do wykrywania apoptozy komórek | Beyotime Biotechnology | C1062L | Wykrywanie apoptozy |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131-25ml | DAPI |
| Maszyna do osadzania | P.S.J MEDICAL | BM450A | Maszyna do osadzania |
| F4/80 | BD Bioscience | 123109 | F4/80 |
| W pełni automatyczny suszarka tkanek | Leica Biosystems | ASP3005 | W pełni automatyczny suszarka tkanek |
| Szkiełka mikroskopowe szkiełka | Citotest | 250124A1 | Szkiełka mikroskopowe szkiełka |
| H& E dye | Beyotime Biotechnology | C0105M | H& E dye |
| Strój IHC | Absin Biotechnology | ABS996-5ml | Strój IHC |
| Sonda LC3 | Beyotime Biotechnology | C3018M | Sonda LC3 |
| Niskoprofilowe łopatki mikrotomowe | Thermo Fisher | 3052835 | Niskoprofilowe łopatki mikrotomowe |
| Sonda lizosomowa | Beyotime Biotechnology | C1046 | Sonda lizosomowa |
| Marker | Deli | SK109 | Marker |
| Barwnik Masson | Beyotime Biotechnology | C0189M | Barwnik Masson |
| Matrix-Gel | Beyotime Biotechnology | C0371-5ml | Klej matrycowy |
| Mikrotom | Leica Biosystems | HistoCore BIOCUT | Mikrotom |
| ML385 | Abcam | ab287109 | Inhibitor NRF2 |
| NK1.1 | BD Bioscience | 561117 | NK1.1 |
| NRF2 | Abcam | ab1809Y | Anty-NRF2 |
| s. 62 | Abcam | ab20735 | Anti-p62 |
| Wosk parafinowy | Solarbio | YA0012 | Wosk parafinowy |
| Zestaw do analizy reaktywnych form tlenu | Beyotime Biotechnology | S0033M | Sonda ROS |
| Krzemionka | Sigma Aldrich | S5631 | Krzemionka krystaliczna |
| VDAC1 | Abcam | AB34726 | Anty-VDAC1 |
