Artykuł metodologiczny

Ilościowe obrazowanie fluorescencyjne infekcjiy alfavirusów w badaniach przesiewowych leków przeciwwirusowych

44 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69384

⸱

14 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG), 2Department of Pest and Vector Insect Control, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources, 3Institute for Insect Biotechnology, Justus-Liebig University, 4BMFTR Junior Research Group in Infection Research "ASCRIBE", Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym opracowaniu przedstawiono solidny i elastyczny protokół ciągłej wizualizacji infekcji alfawirusami. Protokół ten umożliwia badanie replikacji alfawirusów oraz ocenę skuteczności związków przeciwwirusowych na poziomie komórkowym w oparciu o obrazowanie fluorescencyjne.

Streszczenie

Mikroskopia fluorescencyjna oferuje wysoce czułe i wszechstronne podejście do badania infekcjiy alfavirusami na poziomie komórkowym. Dzięki połączeniu wirusów znakowanych fluorescencyjnie z ilościową analizą obrazu metoda ta umożliwia szczególną charakterystykę przestrzenną i czasową dynamiki infekcji, w tym wykrywanie subtelnych różnic w kinetyce replikacji i rozprzestrzenianiu się wirusa z komórki na komórkę. Głównym celem niniejszego protokołu jest jego zastosowanie w testach przesiewowych przeciwirusowych. Ilościowe określanie intensywności fluorescencji na podstawie obrazów stanowi solidny i powtarzalny sposób oceny skuteczności związków przeciwirusowych, umożliwiając wczesne i czułe wykrywanie efektów hamujących w zainfekowanych komórkach. Ułatwia to identyfikację obiecujących hitów przeciwirusowych i wspiera ocenę odpowiedzi zależnej od dawki. Podejście to jest również odpowiednie do badań porównawczych różnych szczepów lub mutantów alfavirusów, ponieważ różnice w zachowaniu replikacyjnym i wzorcach rozprzestrzeniania stają się łatwo zauważalne. Elastyczność metody, kompatybilność z wieloma liniami komórkowymi oraz prosta integracja z zautomatyzowanymi platformami obrazowymi sprawiają, że jest ona skalowalna i odpowiednia dla kampanii wysokoprzepustowego przesiewu. W ogólnym ujęciu protokół ten usprawnia odkrywanie i ocenę strategii przeciwirusowych. Biorąc pod uwagę, że kilka alfavirusów wywołuje istotne choroby ludzkie i weterynaryjne, brakuje zatwierdzonych terapii przeciwirusowych, a wirusy te nadal rozszerzają swój zasięg geograficzny wraz z pojawianiem się nowych ognisk zakażeń, identyfikacja nowych leków przeciwirusowych pozostaje pilnym priorytetem. W związku z tym ten oparty na fluorescencji schemat postępowania stanowi cenny i aktualny wkład w nowoczesne badania nad alfavirusami.

Wprowadzenie

Alfavirusy to otoczkowe wirusy o jednoniciowym, dodatnim sensie kwasu rybonukleinowego (RNA), należące do rodziny Togaviridae1,2,3. Są one przenoszone głównie przez komary i odpowiadają za szereg chorób u ludzi i zwierząt. Rodzaj alfavirusów obejmuje kilka istotnych medycznie wirusów, takich jak wirus chikungunya (CHIKV), wirus Sindbis, wirus wschodniego zapalenia mózgu koni oraz wirus wenezuelskiego zapalenia mózgu koni4,5. Patogeny te wywołują objawy od gorączki i wysypki po ciężkie powikłania neurologiczne6. Niepokojące jest to, że CHIKV ponownie stał się poważnym problemem zdrowia publicznego. Od początku 2025 roku odnotowano ponad 220 000 przypadków w 14 krajach, co skutkowało co najmniej 80 zgonami7. Choć wskaźnik śmiertelności jest niski, znaczna część zainfekowanych osób zapada na chroniczne bóle stawów, co może prowadzić do długotrwałej niepełnosprawności i ograniczenia mobilności8. Aby opracować ukierunkowane strategie przeciwwirusowe, niezbędne jest pełniejsze zrozumienie replikacji alfavirusów oraz interakcji między gospodarzem a patogenem. Jednocześnie niektóre alfavirusy, takie jak wirus Semliki Forest (SFV), wykazują niską patogenność u ludzi, mimo wysokiego podobieństwa genetycznego i strukturalnego do bardziej zjadliwych alfavirusów. Sprawia to, że SFV jest idealnym modelem do badania alfavirusów, nie stanowiąc wysokiego ryzyka dla zdrowia ludzi9,10,11.

Tradycyjne testy, takie jak metoda plackowa, oznaczenie 50% zakaźnej dawki w hodowli tkankowej (TCID50) oraz analiza ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), są cenne dla kwantyfikacji mian wirusowych i ekspresji genów, jednak ograniczają się do pomiarów końcowych i wymagają lizy lub fiksacji komórek. W konsekwencji nie pozwalają one na bezpośrednie uchwycenie dynamiki infekcji w tych samych komórkach w czasie12,13. Aby wyeliminować te ograniczenia, obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym stanowi potężne, nieniszczące podejście do monitorowania kinetyki infekcji w wielu punktach czasowych. Wykorzystanie wirusów znakowanych fluorescencyjnie, takich jak SFV znakowany mCherry, umożliwia bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację sygnału wirusa reporterowego oraz jego rozprzestrzeniania się w żywych komórkach14,15. W opisanych tutaj eksperymentach zastosowano linie komórkowe powszechnie używane w badaniach nad arbowirusami. Komórki U4.4, pochodne z larw Aedes albopictus, są komórkami komara, które wspierają wydajną replikację wielu arbowirusów i ułatwiają badania nad oddziaływaniami wektor-wirus16,17. Równolegle zastosowano komórki BHK-21, fibroblastopodobną linię ssaczą pochodzącą z tkanki nerek młodych chomików, która stanowi podatny system gospodarza kręgowca, często wykorzystywany do propagacji wirusów i testów w wirologii molekularnej18.

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje monitorowanie ekspresji wirusowego reporteru oraz charakteryzację związków przeciwwirusowych, posługując się inhibitorami furyny jako przykładem. Furyna jest konwertazą proprotein obecną u wielu eukariontów i odgrywa kluczową rolę w aktywacji prekursorów czynników wzrostu, hormonów, metaloproteinaz macierzy, białek osocza oraz receptorów19,20. Wiele alfawirusów wykorzystuje furynę do rozszczepiania i aktywacji swoich białek powierzchniowych, co jest kluczowym etapem dla skutecznej replikacji20. Inhibitory furyny to syntetycznie zaprojektowane związki, które blokują aktywność furyny, ograniczając tym samym replikację wirusa 21,22,23. Ze względu na ograniczoną dostępność znormalizowanych protokołów dla zautomatyzowanej analizy infekcji alfawirusami w oparciu o mikroskopię fluorescencyjną z wykorzystaniem wielofunkcyjnego czytnika do obrazowania komórek, przedstawiono szczegółowy schemat postępowania w celu charakteryzacji związków przeciwwirusowych w komórkach aedine. Protokół określa etapy hodowli komórkowej, produkcji wirusa, infekcji, traktowania związkami przeciwwirusowymi (inhibitorami furyny), obrazowania fluorescencyjnego oraz analizy obrazów. Opisane tutaj metody można jednak łatwo zaadaptować do innych wirusów i alternatywnych znaczników fluorescencyjnych.

Protokół

1. Bezpieczeństwo biologiczne

UWAGA: Rekombinowany wirus Semliki Forest z tagiem mCherry (SFV-mCherry) użyty w tym protokole jest zmodyfikowany genetycznie24,25,26. Wprowadzenie genu reporterowego fluorescencyjnego klasyfikuje go jako organizm zmodyfikowany genetycznie, co sprawia, że podlega on dodatkowym wymaganiom dotyczącym zabezpieczeń i regulacji. Prace z innymi alfawirusami, w szczególności z wirusami bardziej patogennymi, takimi jak CHIKV, mogą wymagać dodatkowych zezwoleń i środków bezpieczeństwa.

  1. Oczyścić komorę bezpieczeństwa biologicznego odpowiednim środkiem dezynfekcyjnym i naświetlać promieniowaniem UV przez co najmniej 30 min przed i po przeprowadzaniu analiz wirusowych.
  2. Utylizować wszystkie zanieczyszczone materiały zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego. Odpady stałe i ciekłe gromadzić osobno w pojemnikach przeznaczonych do autoklawowania i poddać autoklawowaniu przed utylizacją.

2. Przygotowanie związków przeciwwirusowych

UWAGA: Inhibitory furyny MI-113027 (trans-4-(aminomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide), MI-113127 (trans-4-(guanidinomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide) oraz MI-114822,23 (4-(guanidinomethyl) phenylacetyl-arginine-tert.-leucine-arginine-4-amidinobenzylamide) zastosowane w niniejszym badaniu, są przykładami związków przeciwwirusowych wybranych do testów. Inhibitor furyny MI-1148 został wykorzystany jako kontrola negatywna w teście cytotoksyczności oraz jako kontrola pozytywna w teście przeciwwirusowym.

  1. Rozpuścić związki przeciwwirusowe w odpowiednim rozpuszczalniku. Jeśli to możliwe, należy użyć wody sterylnej, aby uniknąć efektów cytotoksycznych. Dimetylosulfotlenek lub metanol mogą być stosowane w stężeniu maksymalnie 2% (v/v). Zaleca się stosowanie roztworów zapasowych o stężeniu 10 mM w wodzie sterylnej.
  2. Roztwory zapasowe przechowywać w temperaturze -20 °C, zależnie od ich stabilności i rozpuszczalności, chyba że producent określił inaczej.

3. Hodowla komórkowa

  1. Hodować komórki U4.4 w pożywce Leibovitz's L-15 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% niezasadniczych aminokwasów MEM, 1% bulionu tryptonowo-fosforanowego, 1% glutaminy oraz 1% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep) (gęstość wysiewu: ok. 1 × 106 komórek/kolbę T25, objętość hodowli: 5 mL). Utrzymywać komórki w temperaturze 28 °C. Prowadzić pasażowanie komórek U4.4 w stosunku 1:6 raz w tygodniu, dostosowując gęstość wysiewu do potrzeb eksperymentalnych.
    UWAGA: Z niniejszym protokołem kompatybilne są również inne linie komórkowe, np. komórki C6/36. W zależności od potrzeb można stosować alternatywne pożywki i suplementy. Dodatek antybiotyków jest opcjonalny i może zostać pominięty.
  2. Hodować komórki nerki chomika syryjskiego (BHK-21) w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium uzupełnionej o 10% FBS, 1% glutaminy lub Równowaga statyczna, ΣFx=0, wykres, analiza równowagi sił, schemat stabilności mechanicznej.‑alanyl‑Równowaga statyczna, ΣFx=0, wykres, analiza równowagi sił, schemat stabilności mechanicznej.‑glutaminy oraz 1% Pen/Strep (gęstość wysiewu: ok. 1 × 106 komórek/kolbę T75, objętość hodowli: 10 mL). Utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i zawartością 5% CO2. Prowadzić pasażowanie komórek w stosunku 1:12 co 4-5 dni, z możliwością modyfikacji gęstości wysiewu zgodnie z wymaganiami.
  3. Upewnić się, że komórki pozostają zdrowe i aktywnie proliferują.

4. Produkcja wirusa

  1. Przygotowanie zapasów SFV-mCherry (SFV6-2SG-mCherry) w komórkach BHK-21.
    1. Hodowla komórek BHK-21 (gęstość wysiewu: ok. 1 × 105 komórek/dołek, objętość hodowli: 500 µL) w przezroczystej 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej w warunkach opisanych powyżej.
    2. Przy konfluencji wynoszącej około 90% (docelowa konfluencja: ok. 2 × 105 komórek), przeprowadzić transfekcję komórek BHK-21 plazmidem SFV6-2SG-mCherry przy użyciu odczynnika do transfekcji w medium do infekcji (DMEM uzupełniony o 1% Pen/Strep i 0,2% albuminy surowicy bydlęcej). W tym celu rozcieńczyć 1 µL odczynnika do transfekcji w 25 µL medium z obniżoną zawartością surowicy.
    3. W oddzielnej probówce rozcieńczyć 0,5 µg DNA plazmidowego i 1 µL zastrzeżonego dodatku w 25 µL medium z obniżoną zawartością surowicy. Dodać rozcieńczony roztwór DNA do roztworu zawierającego rozcieńczony odczynnik do transfekcji i inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej. Następnie dodać 50 µL otrzymanego kompleksu do komórek.
      UWAGA: Można stosować inne odczynniki do transfekcji, pod warunkiem że są one kompatybilne z konkretną linią komórkową; instrukcje mogą się różnić w zależności od zastosowanego odczynnika.
    4. Po 48 h od transfekcji zebrać za pomocą pipety supernatant zawierający wirusa, rozdzielić do probówek wolnych od DNA/RNA w ilości 250 µL na probówkę i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Miareczkowanie metodą TCID50.
    1. Hodowla komórek BHK-21 (gęstość wysiewu: ok. 2 × 104 komórek/dołek, objętość hodowli: 100 µL) w czarnej 96-dołkowej płytce klasy obrazowej w warunkach opisanych powyżej.
    2. Rozmrozić alikwot wirusa, przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne próbki wirusa w mediach do infekcji (15 µL próbki wirusa + 135 µL mediów do infekcji), usunąć stare medium i dodać 100 µL rozcieńczeń do komórek.
    3. Inkubować komórki przez 1 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i zawartością 5% CO₂, a następnie zastąpić inokulum 100 µL świeżego medium do infekcji.
    4. Po 48 h od infekcji (hpi) ocenić replikację wirusa poprzez pomiar fluorescencji przy użyciu wielofunkcyjnego czytnika płytek obrazowych (szczegółowy opis w sekcji 7) i określić efekt cytopatyczny wywołany infekcją wirusową. Obliczyć wartość TCID50 metodą Reeda-Muencha28 i przeliczyć na szacowane miana wirusa (PFU/mL), stosując standardowe przybliżenie oparte na rozkładzie Poissona, zgodnie z którym 1 TCID50 odpowiada 0,7 PFU.

5. Oznaczanie cytotoksyczności

  1. Hodowlę komórek U4.4 (gęstość wysiewu: ok. 3 × 104 komórek/dołek, objętość hodowli: 100 µL) prowadzić w przezroczystej 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowych w warunkach opisanych powyżej.
    UWAGA: Zewnętrzne dołki (rzędy A i H; kolumny 1 i 12) zostały obsiane komórkami, lecz wykluczono je z analizy eksperymentalnej, aby uniknąć efektów brzegowych, w tym zwiększonego parowania.
  2. Przy 90% konfluencji (docelowa konfluencja: ok. 6 × 104 komórek) traktować komórki inhibitorami furyny MI-1130 i MI-1131 w stężeniach 100, 50, 25 i 12,5 µM w całkowitej objętości 100 µL. Jako kontrole negatywne zastosować MI-1148 (w tych samych stężeniach co MI-1130 i MI-1131), komórki nietraktowane oraz komórki traktowane wodą, a jako kontrolę pozytywną cytotoksyczności – jonomycynę (100 µM w teście).
  3. Po 48 h od traktowania (hpt) ocenić żywotność komórek za pomocą luminescencyjnego testu opartego na ilościowym oznaczeniu ATP. Do każdego dołka dodać równą objętość odczynnika do testu luminescencyjnego (1:1 w stosunku do pożywki hodowlanej), wstrząsać płytką przez 2 min w celu zapewnienia lizy komórek, a następnie inkubować przez 10 min w ciemności przed pomiarem luminescencji.
    UWAGA: Można stosować również inne testy żywotności komórek oparte na innych zasadach detekcji.
  4. Pomiar luminescencji przeprowadzić w czarnej lub białej płytce 96-dołkowej przy użyciu czytnika wielomodalnego.

6. Infekcja wirusowa i leczenie związkiem przeciwwirusowym

  1. Hodować komórki U4.4 (gęstość wysiewu: ok. 3 × 104 komórek/dołek, objętość hodowli: 100 µL) w czarnej płytce 96-dołkowej klasy obrazowej w warunkach opisanych powyżej.
    UWAGA: Zewnętrzne dołki (rzędy A i H; kolumny 1 i 12) zostały obsiane komórkami, ale wyłączone z analizy eksperymentalnej, aby uniknąć efektów brzegowych, w tym zwiększonego odparowania.
  2. Zainfekować komórki (docelowa konfluencja: ok. 6 × 104 komórek) wirusem SFV-mCherry przy wielokrotności zakażenia (MOI) 0,01 w nieuzupełnionym medium L-15, używając objętości inokulum 100 µL, i inkubować przez 1 h w 28 °C.
    UWAGA: Należy używać wyłącznie stoków wirusa reporterowego o niskim numerze pasażu, szczególnie podczas pracy z bardzo niskimi wartościami MOI i infekcjami wielodniowymi.
  3. Rozcieńczyć inhibitory furyny MI-1130, MI-1131 i MI-1148 do końcowych stężeń 100, 50, 25 i 12,5 µM w oddzielnej płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V, używając uzupełnionego medium L-15. Przygotować 110 µL na dołek, aby zapewnić 10% nadmiaru, a następnie przenieść 100 µL (objętość końcowa) na komórki. W przypadku kontroli należy zastosować zainfekowane komórki traktowane rozpuszczalnikiem związków przeciwwirusowych oraz zainfekowane komórki zawierające tylko wirusa jako kontrolę negatywną. Należy również dodać niezinfekowane, nietraktowane komórki w celu zmierzenia fluorescencji tła.
  4. Po 1-godzinnym okresie infekcji usunąć inokulum i przenieść 100 µL rozcieńczonych inhibitorów furyny z płytek z dnem w kształcie litery V do czarnych płytek klasy obrazowej.
  5. Inkubować komórki w 28 °C.

7. Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek, ilościowa analiza obrazu i prezentacja danych

  1. Pomiar ekspresji wirusowego reportera za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (konfigurację programu patrz: Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2, Supplementary Figure 3, Supplementary Figure 4, Supplementary Figure 5, Supplementary Figure 6 oraz Supplementary Figure 7).
    1. W 24. i 48. godzinie po infekcji (hpi) zabarwić jądra komórkowe, dodając 8 µL roztworu przenikającego przez błony komórkowe barwnika przeciwjądrowego do każdej studni. Inkubować przez 30 min w temperaturze 28 °C.
      UWAGA: Infekcję można monitorować w wielu punktach czasowych. Jednak pomiary w 48 h po infekcji dają najsilniejszy sygnał (patrz: Supplementary Figure 8) i pozwalają najdokładniej ocenić efekty przeciwwirusowe. Odczyty w 24 h lub w punktach pośrednich są możliwe, ale przedłużenie inkubacji powyżej 48 h zwiększa ryzyko przerośnięcia komórek. Należy dobrać odpowiednią konfluencję komórek na początku eksperymentu, aby upewnić się, że komórki nie przerosną do wybranego punktu czasowego odczytu. Pozwoli to uniknąć przeszkód w dokładnym zliczeniu komórek.
    2. Po inkubacji (dodatkowo do przezroczystej pokrywki) nałożyć na górę płytki przezroczystą folię uszczelniającą w celu zapewnienia bezpieczeństwa.
      UWAGA: Podczas korzystania z urządzenia do obrazowania niezbędny jest wybór odpowiedniego typu płytki. Ustawienia oświetlenia, czasu integracji i wzmocnienia będą się różnić w zależności od genu reporterowego. Wysoce zaleca się przeprowadzenie wstępnych pomiarów w celu wyznaczenia optymalnych parametrów. Początkowe ustawienia oświetlenia, integracji i wzmocnienia użyte do opracowania protokołu w danych warunkach podano na Supplementary Figure 2, gdzie szczegółowo opisano konfigurację programu.
    3. Nabyć obrazy całych studni z wykorzystaniem funkcji łączenia obrazów (image stitching; cztery pola na studnię przy powiększeniu 4x) za pomocą czytnika wielomodalnego.
    4. Zmierzyć intensywność czerwonej fluorescencji, używając kostki filtra Texas Red (Wzbudzenie: 586/15 nm; Emisja: 647/57 nm).
    5. Wyznaczyć całkowitą liczbę komórek w kanale DAPI przy następujących ustawieniach (Wzbudzenie: 377/50 nm; Emisja: 447/60 nm).
  2. Ilościowa analiza obrazu (surowe dane patrz: Supplementary Table 1).
    UWAGA: Do pomiarów fluorescencji użyto czytnika obrazującego mikro płytek. Szczegółowe parametry użyte w tym badaniu znajdują się na Supplementary Figure 2.
    1. Przetworzyć obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do obrazowania.
    2. W panelu redukcji danych wybrać Image Stitching do kanałów DAPI i Texas Red, aby utworzyć pojedynczy obraz ze studni.
    3. Dodać Image Statistics i wybrać Total intensity dla połączonego kanału Texas Red. Zastosować Image Preprocessing, aby usunąć szum tła z połączonego kanału DAPI.
    4. Uruchomić Cellular Analysis na wstępnie przetworzonym połączonym kanale DAPI.
    5. Obliczyć średnią intensywność czerwonej fluorescencji na komórkę poprzez odjęcie średniej fluorescencji niezinfekowanych, nieleczonych studni kontrolnych od każdej studni traktowanej, a następnie podzielenie wyniku przez całkowitą liczbę komórek w odpowiadającej jej studni.
  3. Rozwiązywanie problemów
    1. Monitorować stabilność ostrości podczas pomiaru, szczególnie w przypadku długich pomiarów obrazowania lub przy użyciu płytek wrażliwych na temperaturę.
    2. Włączyć autofokus i zwiększyć częstotliwość autofokusu, jeśli zaobserwowano dryft ostrości. Jeśli dryft nadal występuje, zmniejszyć prędkość akwizycji lub pozwolić płytkom wyrównać się do temperatury instrumentu przed obrazowaniem.
    3. Używać płytek klasy obrazowej, aby zapewnić spójną jakość sygnału podczas akwizycji. Zapobiegać przenikaniu sygnału (bleed-through) i prześwietleniu, unikając nadmiernego oświetlenia i długich czasów integracji.
    4. Obniżyć intensywność wzbudzenia, skrócić czas integracji lub zmniejszyć wzmocnienie, aż do uniknięcia saturacji sygnału. Zweryfikować, czy kanały fluoroforów są dobrze odseparowane i w razie potrzeby dostosować ustawienia filtra.
      UWAGA: Przenikanie sygnału między DAPI a mCherry jest zazwyczaj niskie, ale zależy od użytej konstrukcji reporterowej (np. GFP).
    5. Unikać nadmiernej konfluencji komórek, aby zachować właściwą kinetykę infekcji i czułość testu. W przypadku wystąpienia nadmiernej konfluencji skrócić czas inkubacji przed pomiarem.
    6. Monitorować wpływ barwnika na żywotność komórek i jakość sygnału, szczególnie przy wysokich stężeniach. Zmniejszyć stężenie barwnika lub skrócić czas inkubacji w przypadku zaobserwowania toksyczności związanej z barwnikiem lub przesyconego tła.
    7. Przygotowywać i przechowywać barwniki zgodnie z zaleceniami producenta, aby zachować stabilność sygnału.

Wyniki

W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowy protokół monitorowania rozprzestrzeniania się alfawirusów oraz oceny związków przeciwwirusowych (np. inhibitorów furyny) z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej w formacie wielodołkowym. Aby zademonstrować wizualizację efektów hamujących ekspresję reportera wirusowego, do testów w linii komórkowej aedine U4.4 wybrano trzy wcześniej zsyntetyzowane inhibitory furyny: MI-1148, MI-1130 oraz MI-1131. Przegląd schematu doświadczalnego zilustrowano na Rysunku 1.

Przed oceną skuteczności przeciwwirusowej niezbędne jest przeprowadzenie oceny cytotoksyczności, aby upewnić się, że wszelkie zmniejszenie replikacji wirusa nie wynika z indukowanej przez związek śmierci komórek. W związku z tym komórki U4.4 przy 90% konfluencji poddano działaniu inhibitorów w stężeniach 100, 50, 25 lub 12,5 µM. Jako kontrole negatywne posłużyły komórki nieleczone oraz komórki traktowane wodą (kontrola rozpuszczalnika), natomiast jako kontrolę pozytywną zastosowano jonomycynę. Żywotność komórek oceniono 48 h po zabiegu za pomocą testu luminescencyjnego opartego na ilościowym oznaczaniu ATP. W przypadku testowanych inhibitorów furyny nie zaobserwowano istotnego zmniejszenia żywotności komórek (Rycina 2).

Ze względu na brak cytotoksyczności, związki poddano następnie ocenie pod kątem aktywności przeciwwirusowej. W tym celu komórki U4.4 zainfekowano wirusem SFV-mCherry przez 1 h, a następnie potraktowano tymi samymi inhibitorami furyny w tych samych stężeniach. Zainfekowane komórki nieleczone oraz zainfekowane komórki potraktowane wodą służyły jako kontrole negatywne dla aktywności przeciwwirusowej, natomiast niezinfekowane komórki nieleczone wykorzystano do oceny fluorescencji tła. Po 48 h od rozpoczęcia leczenia zmierzono ekspresję reportera wirusowego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przed obrazowaniem do każdej studzienki dodano 8 µL przepuszczalnego przez błony komórkowe roztworu barwnika jądrowego i inkubowano przez 30 min w celu zabarwienia jąder komórkowych. Z przetworzonych obrazów fluorescencyjnych zmierzono sygnał czerwonej fluorescencji odpowiadający ekspresji reportera wirusowego oraz całkowitą liczbę jąder. spośród przetestowanych inhibitorów MI-1148 wykazał silną aktywność przeciwwirusową, znacząco redukując ekspresję reportera wirusowego w sposób zależny od dawki (Rycina 3). W przeciwieństwie do niego, MI-1130 i MI-1131 nie wykazały zauważalnego hamowania ekspresji reportera wirusowego przy żadnym z badanych stężeń. Surowe dane oraz analiza testu przeciwwirusowego znajdują się w Tabeli uzupełniającej 1.

Reprezentatywne wyniki pokazują, że protokół niezawodnie identyfikuje związki o aktywności przeciwwirusowej, co obrazuje silna redukcja sygnału reporterowego zaobserwowana dla MI-1148. Z kolei inhibitory MI-1130 i MI-1131 nie zmniejszyły ekspresji reportera, co wskazuje, że ich silne hamowanie furyny, odzwierciedlone przez pikomolowe stałe inhibicji, nie przełożyło się na aktywność przeciwwirusową w tych warunkach (Rysunek 4). Wyniki te podkreślają zdolność testu do odróżniania związków aktywnych od nieaktywnych oraz wspieranie identyfikacji silnych i istotnych struktur wiodących.

Proces przesiewania przeciwwirusowego; hodowla komórkowa, infekcja wirusowa, traktowanie związkami; wykres analizy danych.
Rysunek 1: Schemat eksperymentalny. Schematyczny przegląd procedury eksperymentalnej wykorzystanej do oceny aktywności przeciwwirusowej inhibitorów furyny w linii komórkowej U4.4 pochodzącej od komarów z rodzaju Aedes. Schemat obejmuje przygotowanie związków, wysiew komórek, infekcję wirusem Semliki Forest z tagiem mCherry, traktowanie związkami, mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji w czasie rzeczywistym oraz kwantyfikację ekspresji reportera wirusowego. Ilustracja została stworzona w programie BioRender. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy przeżywalności komórek, porównanie stężeń leków; traktowanie MI-1148, MI-1130, MI-1131.
Rycina 2: Efekty cytotoksyczne inhibitorów furyny w komórkach U4.4. Przy konfluencji około 90%, komórki U4.4 poddano działaniu MI-1148, MI-1130 oraz MI-1131 w stężeniach 100, 50, 25 i 12,5 µM. Komórki nieleczone oraz komórki traktowane wodą posłużyły jako kontrole negatywne, natomiast jonomycyna (100 µM) została użyta jako kontrola pozytywna. Po 48 h od traktowania oceniono przeżywalność komórek poprzez kwantyfikację ATP. Dane znormalizowano względem kontroli nieleczonej i wyrażono w procentach (%). Przedstawiono średnią przeżywalność komórek (n=3), a słupki błędów reprezentują współczynnik zmienności. Linia przerywana oznacza próg cytotoksyczności ustalony na 80%. n.d. = nie wykryto. Prezentacja danych została wykonana za pomocą programu GraphPad Prism v9.5.1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy intensywności czerwieni komórek w funkcji stężenia leku; analiza statystyczna związków z serii MI.
Rycina 3: Aktywność przeciwwirusowa inhibitorów furyny przeciwko wirusowi lasu Semliki (SFV) z tagiem mCherry w linii komórkowej aedine U4.4. Przy konfluencji wynoszącej około 90% komórki zainfekowano SFV-mCherry przez 1 h, a następnie poddano działaniu MI-1148, MI-1130 oraz MI-1131 w stężeniach 100, 50, 25 i 12,5 µM. Po 48 h od zastosowania leczenia zmierzono ekspresję reportera wirusowego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przed obrazowaniem do każdej studni dodano 8 µL przepuszczalnego przez błony komórkowe roztworu barwnika jądrowego i inkubowano przez 30 min w celu zabarwienia jąder komórkowych. Obrazy fluorescencyjne pozyskano przy użyciu filtra Texas Red dla sygnału wirusowego oraz filtra DAPI dla jąder. Przeprowadzono analizę obrazu w celu ilościowego oznaczenia całkowitej intensywności fluorescencji czerwonej (wskazującej na replikację wirusa) oraz całkowitej liczby komórek w studni. Dane (n = 4) przedstawiono jako całkowitą intensywność czerwieni na komórkę (całkowity sygnał wirusa / całkowita liczba komórek). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Istotność statystyczną w porównaniu z kontrolą zainfekowaną SFV określono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (one-way ANOVA) i testu wielokrotnych porównań Dunnetta: **** = P<0.0001; ns = P>0.05. Reprezentacja danych i analiza statystyczna zostały wykonane programem GraphPad Prism v9.5.1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy kultur komórkowych zainfekowanych SFV przy różnych stężeniach, pokazujący poziomy infekcji.
Rycina 4: Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne wykazujące aktywność przeciwwirusową inhibitorów furyny przeciwko wirusowi Semliki Forest (SFV) z tagiem mCherry w linii komórkowej aedine U4.4. Komórki przy konfluencji wynoszącej około 90% zainfekowano SFV-mCherry przez 1 h, a następnie poddano działaniu MI-1148, MI-1130 oraz MI-1131 w stężeniach 100, 50, 25 i 12,5 µM. Zainfekowane komórki nieleczone oraz zainfekowane komórki traktowane wodą służyły jako kontrole negatywne, natomiast niezakzakażone komórki nieleczone włączono jako kontrole tła. Sygnał reporterowy oceniano 48 h po zastosowaniu leczenia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem filtra Texas Red w celu uchwycenia sygnału mCherry. Pasek skali = 2000 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela uzupełniająca 1: Surowe dane dotyczące całkowitej intensywności sygnału wirusa oraz liczby komórek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 1: Kroki procedury zastosowane w czytniku obrazującym dla reprezentatywnych wyników. Najpierw ustawienie temperatury (kolor czerwony) zgodne z warunkami hodowli komórek U4.4. Następnie trzy niezależne kroki akcji obrazowania (kolor pomarańczowy) dla pomiarów DAPI, Texas Red i pola jasnego (Brightfield). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Ustawienia obrazowania w krokach procedury zastosowane w czytniku obrazującym dla reprezentatywnych wyników. W pierwszej kolejności należy zmodyfikować następujące ustawienia: powiększenie (4x) oraz rozmiar obrazu (Full WFOV). Należy wybrać fluorofor podlegający pomiarowi, a następnie odpowiednio dostosować parametry oświetlenia (Illumination), czasu integracji (Integration time) oraz wzmocnienia (Gain). Na koniec należy wybrać montaż obrazu (2x2) oraz zakładkę (30 µm x 30 µm). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 3: Kroki redukcji danych zastosowane w czytniku obrazów dla reprezentatywnych wyników. Pierwszym krokiem jest składanie obrazów (stitching, kolor niebieski) dla kanałów DAPI i Texas Red. Po drugie, statystyki obrazu (kolor fioletowy) dostarczają pomiaru całkowitej intensywności. Następnie wymagany jest krok wstępnego przetwarzania obrazu (kolor zielony) w celu usunięcia szumu tła z kanału DAPI. Na koniec przeprowadzana jest analiza komórkowa (kolor żółty) na wstępnie przetworzonym, złożonym obrazie DAPI. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 4: Szycie obrazów w etapach redukcji danych zastosowanych w czytniku obrazowym dla reprezentatywnych wyników. Najistotniejszym ustawieniem jest zmniejszenie rozmiaru końcowego obrazu (80%), ponieważ niższa wartość wpływa na rozdzielczość obrazu, a tym samym na końcowy pomiar parametrów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 5: Statystyki obrazów w krokach redukcji danych zastosowanych w czytniku obrazów dla reprezentatywnych wyników. Ważne jest, aby wybrać odpowiedni kanał (Stitched: Fluorophore), określić minimalny próg (2500), a na koniec parametr do pomiaru (Total Intensity). Aby uzyskać dokładniejszy pomiar, można stworzyć wtyczkę do obrazów (Image Plug). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 6: Wstępne przetwarzanie obrazów w krokach redukcji danych zastosowanych w czytniku obrazów dla reprezentatywnych wyników.Najistotniejszym ustawieniem jest parametr toczącej się kuli (30 µm), co pozwala na uzyskanie bardziej szczegółowych wyników. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 7: Analiza komórkowa w krokach redukcji danych zastosowanych w czytniku obrazów dla wyników reprezentatywnych. Ważne jest wybranie kanału, który przeszedł wstępne przetwarzanie obrazu (Image Preprocessed). Należy wybrać opcję podziału stykających się obiektów oraz wypełniania dziur za pomocą masek. Kluczowe jest wybranie odpowiedniego zakresu selekcji obiektów (5-50 µm). Na koniec, w celu uzyskania bardziej precyzyjnych wyników, można zastosować wtyczkę do obrazu (Image Plug). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 8: Działanie przeciwwirusowe inhibitorów furyny przeciwko wirusowi lasu Semliki (SFV) z tagiem mCherry w linii komórkowej aedine U4.4. Przy około 90% konfluencji komórki zainfekowano SFV-mCherry przez 1 h, a następnie poddano działaniu MI-1148, MI-1130 oraz MI-1131 w stężeniach 100, 50, 25 i 12,5 µM. Po 24 h (słupki czerwone) i 48 h (słupki zielone) od rozpoczęcia terapii zmierzono ekspresję reportera wirusowego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (n = 4). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Zdolność do obserwacji replikacji alfawirusów w czasie rzeczywistym oferuje sekwencyjną i kumulatywną perspektywę w porównaniu do konwencjonalnych testów punktowych. Ten protokół wielokrotnego obrazowania żywych komórek jest użytecznym modelem do badania alfawirusów, ponieważ zapewnia dynamiczną platformę do obserwacji rozprzestrzeniania się wirusa.

Sukces niniejszego protokołu zależy od kilku parametrów. Po pierwsze, przed wykonaniem testu przeciwwirusowego ważne jest ocenie cytotoksyczności związków, aby wykluczyć wyniki fałszywie dodatnie wynikające z śmierci komórek. Po przeprowadzeniu oceny efektów cytotoksycznych można następnie ocenić aktywność przeciwwirusową związków. W przypadku testowanych związków nie zaobserwowano cytotoksyczności. Związki MI-1130 i MI-1131 nie wykazały istotnego wpływu na ekspresję reportera wirusowego, podczas gdy MI-1148, użyty jako kontrola pozytywna, skutecznie ją zahamował. Ponadto kluczowy jest moment infekcji w stosunku do wysiewania komórek. Komórki muszą osiągnąć odpowiednią konfluencję, aby zapewnić powtarzalną infekcję bez nadmiernego rozrostu. Ważne jest również zoptymalizowanie wielokrotności infekcji (MOI) w zależności od linii komórkowej, aby zaobserwować stopniową infekcję bez upośledzenia żywotności komórek. Na koniec należy starannie określić częstotliwość akwizycji obrazów, aby umożliwić wizualizację stopniowej ekspresji reportera wirusowego bez dużych skoków. W większości zastosowań pozyskiwanie obrazów na przykład co osiem godzin zapewnia efektywną równowagę między szczegółowością czasową a integralnością próbki.

Główną zaletą tego protokołu jest jego elastyczność. W niniejszym doświadczeniu wykorzystano SFV-mCherry oraz komórki U4.4, aby zademonstrować monitorowanie ekspresji wirusowego reportera oraz jego inhibicję po zastosowaniu inhibitorów furyny. Protokół ten można jednak zoptymalizować pod kątem analizy fluorescencyjnej innych wirusów z odmiennymi markerami reporterowymi, takimi jak GFP, a także w odniesieniu do innych typów komórek gospodarza, w tym komórek pierwotnych i zróżnicowanych linii komórkowych. Chociaż protokół koncentruje się na podawaniu związków po infekcji, schemat postępowania można łatwo dostosować do eksperymentów z różnym czasem dodania substancji, w tym do wstępnego traktowania, traktowania równoczesnego, traktowania bezpośrednio po infekcji lub traktowania z opóźnieniem, aby dokładniej zbadać mechanizm działania przeciwwirusniczego. Protokół ten został pierwotnie zastosowany do porównania funkcjonalności mechanizmu RNAi w komórkach C6/36 oraz U4.414. Następnie rozszerzono go o badania nad tym, w jaki sposób dsRNA bezpośrednio celujące w wirusa hamuje ekspresję wirusowego reportera15.

Podczas stosowania tego protokołu mogą wystąpić pewne trudności. Wirusy reporterowe, mimo że są bardzo użyteczne w wielu zastosowaniach in vivo29 i in vitro30, mogą wykazywać niższą wirulencję31 oraz niestabilność genetyczną genów reporterowych32. Odrywanie się komórek spowodowane nadmiernym stopniem konfluencji może utrudniać wyraźną wizualizację i obrazowanie, wpływając tym samym na liczbę komórek. Przedłużona ekspozycja na barwniki do żywych komórek (np. Hoechst 33342 do jąder komórkowych) może zmienić zachowanie lub żywotność komórek15. Ponadto eksperymenty z udziałem wysoce patogennych alfawirusów, takich jak CHIKV, mogą wymagać bardziej rygorystycznych środków bezpieczeństwa biologicznego i odpowiednich modyfikacji protokołu. Dodatkowo w niektórych przypadkach może wystąpić dryft ostrości wynikający z różnic między płytkami oraz stosowania różnych rodzajów płytek. Na przykład sygnały fluorescencyjne w przezroczystych płytkach do hodowli komórkowej mogą przenikać z dołków do sąsiednich, natomiast płytki białe mogą powodować prześwietlenie. W obu przypadkach wpłynie to na dokładność pomiaru sygnału fluorescencyjnego.

Niniejszy protokół oferuje kilka zalet w porównaniu do konwencjonalnych testów wirusologicznych. Na przykład testy plackowe oraz testy TCID50 dostarczają danych końcowych na temat mian wirusa12. Co więcej, qPCR oferuje czułą detekcję viralnego RNA, ale nie pozwala on na rozróżnienie między wirusami zdolnymi do replikacji a niezdolnymi do zakażenia cząstkami wirusowymi lub resztkowymi kwasami nukleinowymi. W przeciwieństwie do tych metod, tego rodzaju obrazowanie żywych komórek z wykorzystaniem fluorescencji umożliwia ciągłą, nieinwazyjną ocenę progresji wirusa, jego rozprzestrzeniania się oraz efektów leczenia w tej samej populacji komórek w czasie.

Poza badaniem inhibitorów furyny jako związków przeciwwirusowych, nasz protokół może zostać dostosowany do innych zastosowań. Jest on szczególnie odpowiedni do przesiewowego badania leków przeciwwirusowych, umożliwiając kwantyfikację odpowiedzi zależnych od dawki w odniesieniu do różnych związków. Stanowi on platformę do badania interakcji gospodarz-patogen, w tym czasu i lokalizacji wnikania, replikacji i rozprzestrzeniania się wirusa. Może być wykorzystany do porównywania wirusów reporterowych, różnych szczepów lub różnych alfavirusów. Ponadto można go połączyć z takimi podejściami jak wyciszanie genów za pomocą siRNA lub dsRNA. W ten sposób system ten może pomóc w identyfikacji i walidacji krytycznych celów oraz związków przeciwwirusowych dla replikacji wirusowej. Należy jednak pamiętać, że ten test oparty na fluorescencji stanowi wstępne podejście przesiewowe, a nie samodzielną metodę potwierdzającą; niezbędne będą dalsze badania, w tym testy z wirusami typu dzikiego, aby potwierdzić wyniki przesiewowe.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy prof. dr. Andresowi Meritsowi z Uniwersytetu w Tartu (Estonia) oraz prof. dr. Andreasowi Pichlmairowi z Uniwersytetu Technicznego w Monachium (Niemcy) za udostępnienie pCMV-SFV6-2SG-mCherry. Dziękujemy prof. dr Stefanie Becker z Uniwersytetu Medycyny Weterynaryjnej w Hanowerze (Niemcy) za komórki C6/36. Dziękujemy prof. dr. Torstenowi Steinmetzerowi z Uniwersytetu w Marburgu (Marburg, Niemcy) za udostępnienie inhibitorów furyny. Niniejsza praca została sfinansowana przez program Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz Ministerstwa Szkolnictwa Wyższego, Badań i Sztuk stanu Hesja za pośrednictwem Centrum Genomiki Bioróżnorodności Translacyjnej LOEWE (LOEWE-TBG) z kodem finansowania: LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52, a także przez BMFTR (Projekt ASCRIBE, numer grantu 01KI2024).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumin wołowy frakcja V, pH 7.0SERVA Electrophoresis11930.03
BenchStable DMEMThermo Fisher ScientificA4192101
komórki BHK-21CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Niemcy603126
KOLBA DO KULTUR KOMÓRKOWYCH, 50 ML, 25 cm2, PS, czerwony filtr zakrętki, przezroczysta, CELLSTAR, TC, sterylnaGreiner Bio-One690175
Mikropłytka do kultur komórkowych, 24 dołki, PS, dno płaskie (dołek z kominkiem), przezroczysta, CELLSTAR, TC, pokrywka z pierścieniami kondensacyjnymi, sterylnaGreiner Bio-One662160
Mikropłytka do kultur komórkowych, 96 dołków, PS, dno płaskie (dołek z kominkiem), µCLEAR, czarna, CELLSTAR, TC, pokrywka z pierścieniami kondensacyjnymi, sterylnaGreiner Bio-One655090
Mikropłytka do kultur komórkowych, 96 dołków, PS, dno płaskie (dołek z kominkiem), przezroczysta, CELLSTAR, TC, pokrywka z pierścieniami kondensacyjnymi, sterylnaGreiner Bio-One655180
Mikropłytka do kultur komórkowych, 96 dołków, PS, dno V-kształtne, przezroczystaGreiner Bio-One651101
Skrobacz do komórekVWR734-2602
Test luminescencyjny żywotności komórek CellTiter-GloPromegaG7573
Wielofunkcyjny czytnik obrazowania komórkowego Cytation 5Biotek
Kostka filtru DAPI 1225100Biotekex: 377/50 nm; em 447/60 nm
Podłoże Eagle'a modyfikowane przez Dulbecco (DMEM GlutaMAX)Thermo Fisher ScientificA4192102
Płodowa surowica wołowaFisher Scientific11550356
Inhibitor furyny MI-1130Niniejsza praca
Inhibitor furyny MI-1131Niniejsza praca
Inhibitor furyny MI-1148Hardes et al. 2015.  https://doi.org/10.1002/cmdc.201500103 
Oprogramowanie Gen5 PrimeBiotek
Sól wapniowa jonomycyny, 99%Thermo Fisher ScientificJ60628
Podłoże L-15 Leibovitz'a, z dodatkiem GlutaMAX Thermo Fisher Scientific31415029
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000001
Niezbędne aminokwasy MEM (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
Mikropłytka, PS, 96 dołków, dno płaskie (dołek z kominkiem), czarna, Fluotrac, średnie wiązanieGreiner Bio-One655076
Odczynnik NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)Thermo Fisher ScientificR37605
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985062
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
SFV6–2SG-mCherryProf. Dr. Andres Merits (Uniwersytet w Tartu, Estonia) i Prof. Dr. Andreas Pichlmair (Uniwersytet Techniczny w Monachium, Niemcy)
Kostka filtru Texas Red 1225102 Biotekex: 586/15 nm; em: 647/57 nm
Bulion tryptone-fosforanowy Thermo Fisher Scientific18050039
komórki U4.4Instytut Friedricha Loefflera, Federalny Instytut Badawczy nad Zdrowiem Zwierząt, Greifswald, Niemcy
Uszczelniacz Viewseal, przezroczystyGreiner Bio-One676070

Bibliografia

  1. Powers, A. M. Togaviruses: Alphaviruses. eLS. , (2014).
  2. Shaw, A. R., Feinberg, M. B. Vaccines. Clinical Immunology. , Elsevier. (2008).
  3. Gould, E. A., et al. Understanding the alphaviruses: recent research on important emerging pathogens and progress towards their control. Antiviral Research. 87 (2), 111-124 (2010).
  4. Lim, E. X. Y., Lee, W. S., Madzokere, E. T., Herrero, L. J. Mosquitoes as suitable vectors for alphaviruses. Viruses. 10 (2), (2018).
  5. de Caluwé, L., Ariën, K. K., Bartholomeeusen, K. Host factors and pathways involved in the entry of mosquito-borne alphaviruses. Trends in Microbiology. 29 (7), 634-647 (2021).
  6. Adizie, T., Adebajo, A. O. Travel- and immigration-related problems in rheumatology. Best practice & research. Clinical Rheumatology. 28 (6), 973-985 (2014).
  7. ECDC Chikungunya virus disease worldwide overview: Situation update. , (2025).
  8. Paixão, E. S., et al. Chikungunya chronic disease: a systematic review and meta-analysis. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 112 (7), 301-316 (2018).
  9. Atkins, G. J., Sheahan, B. J., Liljeström, P. The molecular pathogenesis of Semliki Forest virus: a model virus made useful. The Journal of General Virology. 80 (Pt 9), 2287-2297 (1999).
  10. Contu, L., Balistreri, G., Domanski, M., Uldry, A. -C., Mühlemann, O. Characterisation of the Semliki Forest Virus-host cell interactome reveals the viral capsid protein as an inhibitor of nonsense-mediated mRNA decay. PLoS Pathogens. 17 (5), (2021).
  11. Teppor, M., et al. Semliki Forest virus chimeras with functional replicase modules from related alphaviruses survive by adaptive mutations in functionally Important Hot Spots. Journal of Virology. 95 (20), (2021).
  12. Smither, S. J., et al. Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 565-571 (2013).
  13. Shan, L., Yang, D., Wang, D., Tian, P. Comparison of cell-based and PCR-based assays as methods for measuring infectivity of Tulane virus. Journal of Virological Methods. 231, 1-7 (2016).
  14. Omokungbe, B., et al. Gene silencing in the aedine cell lines C6/36 and U4.4 using long double-stranded RNA. Parasites & Vectors. 17 (1), 255(2024).
  15. Centurión, A., Omokungbe, B., Stiehler, S., Vilcinskas, A., Hardes, K. Inhibition of Semliki Forest virus replication with long double-stranded RNA in Aedes albopictus cells. Virus Research. 357, 199584(1995).
  16. Weger-Lucarelli, J., et al. Adventitious viruses persistently infect three commonly used mosquito cell lines. Virology. 521, 175-180 (2018).
  17. Attarzadeh-Yazdi, G., et al. Cell-to-cell spread of the RNA interference response suppresses Semliki Forest virus (SFV) infection of mosquito cell cultures and cannot be antagonized by SFV. Journal of Virology. 83 (11), 5735-5748 (2009).
  18. Gahmberg, C. G., Simons, K. Isolation of plasma membrane fragments from BHK21 cells. Acta pathologica et microbiologica Scandinavica. Section B: Microbiology and immunology. 78 (2), 176-182 (1970).
  19. Thomas, G. Furin at the cutting edge: from protein traffic to embryogenesis and disease. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 3 (10), 753-766 (2002).
  20. Garten, W. Characterization of proprotein convertases and their involvement in virus propagation. Activation of Viruses by Host Proteases. , Springer. Cham. 205-248 (2018).
  21. Becker, G. L., Hardes, K., Steinmetzer, T. New substrate analogue furin inhibitors derived from 4-amidinobenzylamide. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (16), 4695-4697 (2011).
  22. Hardes, K., et al. Novel furin inhibitors with potent anti-infectious activity. ChemMedChem. 10 (7), 1218-1231 (2015).
  23. Hardes, K., et al. Elongated and shortened peptidomimetic inhibitors of the proprotein convertase furin. ChemMedChem. 12 (8), 613-620 (2017).
  24. Pennemann, F. L., et al. Cross-species analysis of viral nucleic acid interacting proteins identifies TAOKs as innate immune regulators. Nature Communications. 12 (1), 7009(2021).
  25. Andersen, L. L., et al. Systematic P2Y receptor survey identifies P2Y11 as modulator of immune responses and virus replication in macrophages. The EMBO Journal. 42 (23), (2023).
  26. Huang, Y., Urban, C., Hubel, P., Stukalov, A., Pichlmair, A. Protein turnover regulation is critical for influenza A virus infection. Cell Systems. 15 (10), 911-929 (2024).
  27. Hardes, K. Synthese, Charakterisierung und Anwendung neuer Inhibitoren der Proproteinkonvertase Furin [Doctoral Dissertation]. , Philipps-Universität Marburg. (2014).
  28. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
  29. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  30. Yang, P., et al. Imaging of viral replication in live cells by using split fluorescent protein-tagged reporter flaviviruses. Virology. 603, 110374(2025).
  31. Jose, J., Taylor, A. B., Kuhn, R. J. Spatial and temporal analysis of alphavirus replication and assembly in mammalian and mosquito cells. mBio. 8 (1), (2017).
  32. Eckert, N., et al. Influenza A virus encoding secreted Gaussia luciferase as useful tool to analyze viral replication and its inhibition by antiviral compounds and cellular proteins. PloS One. 9 (5), (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przesiewy przeciwwirusowemikroskopia fluorescencyjnaanaliza obrazudynamika infekcjikinetyka replikacjirozprzestrzenianie si mi dzykom rkoweprzesiewy wysokoprzepustowezwi zki przeciwwirusowe
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.