Opracowanie modelu opartego na organoidzie prostaty myszy do badania interakcji gospodarz-patogen

Summary

Protokół ten opisuje generowanie modelu mięśni prostaty wyhodowanego w 2D. Obejmuje dysocjację organoidów, zasiewanie komórek, różnicowanie, ocenę integralności nabłonka oraz zakażenie in vitro uropatogenicznym Escherichia coli. Model zapewnia dostępność wierzchołkową i nadaje się do badania interakcji gospodarz-patogen, przezwyciężając ograniczenia tradycyjnych trójwymiarowych systemów organoidalnych.

Abstract

Starszych mężczyzn silnie dotknęły choroby prostaty, takie jak łagodna przerostliwość prostaty, zapalenie prostaty czy rak prostaty. Razem te schorzenia znacząco przyczyniają się do globalnego obciążenia zdrowotnego i są główną przyczyną chorób u mężczyzn. Modele organoidalne zrewolucjonizowały modelowanie chorób, umożliwiając replikację kluczowych cech struktury i funkcji nabłonka in vitro. Jednak zamknięta struktura lumenów organoidów ogranicza eksperymentalny dostęp do powierzchni wierzchołkowej, utrudniając badania interakcji gospodarz-patogen. Aby pokonać te wyzwania, stworzyliśmy fizjologicznie istotny system hodowli, w którym komórki pochodzące z organoidów prostaty myszy są zasiewane jako dwuwymiarowy (2D) model. To podejście zachowuje kluczowe cechy nabłonka, zapewniając jednocześnie bezpośredni dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Ten krok po kroku protokół opisuje dysocjację dojrzałych organoidów prostaty myszy oraz optymalne warunki zasiewania, aby wspierać przyczepanie, proliferację i różnicowanie komórek. Mikroskopia immunofluorescencyjna potwierdziła ekspresję markerów specyficznych dla prostaty w modelu organoidalnym oraz wykazała dokładne odzwierciedlenie organizacji komórkowej tkanki prostaty. Pomiary TEER, wraz z barwieniem F-aktyny i styków ciasnych, dodatkowo potwierdziły różnicowanie komórek i tworzenie barier. Zakażenie modelu uropatogeniczną Escherichia coli (UPEC) wykazało jego przydatność w badaniu interakcji gospodarz-patogen. Model ten stanowi cenną platformę do badania biologii nabłonka prostaty oraz mechanizmów chorób, a także jest szczególnie dobrze przystosowany do badania interakcji gospodarz-patogen oraz oceny potencjalnych strategii terapeutycznych.

Introduction

Gruczoł krokowy to mały narząd położony poniżej pęcherza, otaczający cewkę moczową. Jest to niezbędny organ męskiego układu rozrodczego, a jego główną funkcją jest produkcja płynu prostaty. Ten płyn stanowi do 30% osocza nasiennego i jest kluczowy dla odżywiania oraz ochrony plemników podczas ich podróży przez kobiecy układ rozrodczy¹. Choroby prostaty, takie jak zapalenie prostaty, łagodna przerostliwość prostaty czy rak prostaty, są bardzo powszechne i stanowią poważne obciążenie dla opieki zdrowotnej na całym świecie 2,3,4,5. Chociaż łagodna przerostliwość prostaty i rak prostaty są szeroko badane, zapalenie prostaty, a szczególnie bakteryjne, pozostają stosunkowo niedostatecznie zbadane. Zapalenie prostaty dotyka do 16% mężczyzn na świecie, ^6,7 %, przy czym infekcje bakteryjne stanowią około 10% przypadków. Pomimo swojej częstości, bakteryjne zapalenie prostaty wciąż jest słabo poznane. Szczepy Escherichia coli (E. coli), w szczególności uropatogeniczne E. coli (UPEC), są główną przyczyną bakteryjnego zapalenia prostaty ^8,9.

Badania nad molekularnymi mechanizmami infekcji prostaty pozostają ograniczone przez brak fizjologicznie istotnych modeli in vitro. Większość badań nad chorobą prostaty tradycyjnie opierała się na liniach komórkowych lub modelach zwierzęcych. W szczególności linie nowotworowe lub przekształcone, takie jak LNCaP czy RWPE-1, były szeroko wykorzystywane do modelowania choroby prostaty i odpowiedzi na leczenie 10,11,12,13. Jednak modele te nie cechują się składem komórek ani złożonością zdrowego lub nowotworowego nabłonka prostaty. Ponadto wiele innych badań wykorzystało modele zwierzęce (głównie mysie) do analizy różnych hipotez dotyczących infekcji prostaty, odpowiedzi immunologicznej, wzrostu guza prostaty oraz przerzutów 14,15,16,17. Chociaż modele te były jak dotąd najbardziej zaawansowane i informacyjne, zazwyczaj budzą wątpliwości etyczne, wymagają znacznego czasu i zasobów oraz mogą być kosztowne. Alternatywnie, eksplanty tkanek ex vivo oraz hodowle pierwotne były również wykorzystywane do krótkoterminowych badań odpowiedzi tkanek na leki lub rozwoju nowotworów 18,19,20. Jednak modele te mają ograniczoną żywotność, a dostępność świeżej ludzkiej tkanki jest często ograniczona.

Trójwymiarowe (3D) kultury organoidów pochodzące z dorosłych komórek macierzystych okazały się obiecującą alternatywą do modelowania tkanek nabłonkowych in vitro. W przeciwieństwie do konwencjonalnych linii komórkowych, organoidy zachowują kluczowe cechy oryginalnego nabłonka, takie jak heterogeniczność komórkowa, architektura specyficzna dla tkanek oraz cechy funkcjonalne 21,22,23. W przeciwieństwie do pierwotnych hodowli komórkowych, czyli explantów ex vivo, kultury organoidów mogą być rozszerzane i przechodziane przez długi czas bez starzenia się. Te właściwości sprawiają, że układy organoidalne są szczególnie dobre do badania chorób i interakcji patogen-gospodarz w kontekście fizjologicznie istotnym. Organoidy prostaty zostały wygenerowane ze zdrowej i nowotworowej tkanki ludzkiej, a także z modeli myszy, i wykorzystywane głównie w badaniach nad rakiem prostaty 24,25,26. Niemniej jednak dla badań nad infekcjami struktura trójwymiarowa organoidów stanowi poważne wyzwanie, głównie ze względu na ograniczony dostęp do powierzchni komórek luminalnych. Tradycyjnie nienaruszone organoidy 3D były infekowane przez mikrowstrzyknięcie patogena lub najpierw przez rozłożenie organoidu na fragmenty lub pojedyncze komórki przed inkubacją z patogenem²³. Tutaj zmienność rozmiaru i struktury 3D może wpływać na powtarzalność i przepustowość. Alternatywnie, organoidy apical-out umożliwiają przezwyciężenie ograniczeń niedostępności światła. Kultywowanie organoidów w zawiesienie, zarówno w płytkach tkankowych o ultra-niskim przyczepie, jak i na powierzchniach pokrytych nieklejącymi substancjami powierzchniowo czynnymi, powoduje odwrócenie polaryzacji organoidów. W rezultacie powierzchnia wierzchołkowa jest skierowana na zewnątrz, co umożliwia bezpośredni dostęp do badań infekcji patogenem^27,28. Jednak tych hodowli nie można utrzymać długoterminowo, a zmienność wielkości organoidów i liczby komórek komplikuje określenie wielokrotności zakażeń (MOI). Dodatkowo, mechanizmy leżące u podstaw odwrócenia polaryzacji i jego wpływu na komórki organoidalne nie są jeszcze w pełni poznane. Aby przezwyciężyć ograniczenia organoidów, takich jak modele zakażenia in vitro, opracowano modele oparte na organoidach dostępnych na wierzchołku, wykorzystując organoidy z narządów takich jak żołądek, jelito lub płuco 29,30,31. Takie systemy zachowują główne cechy nabłonka i umożliwiają łatwiejszą manipulację, obrazowanie oraz kontrolowaną ekspozycję na patogeny i/lub leki. Jednak warunki hodowli umożliwiające różnicowanie komórek nie zawsze przekładają się z hodowli organoidów do modeli hodowli 2D^31,32.

Tutaj opisujemy protokół służący do wygenerowania apale dostępnego modelu nabłonka prostaty z wykorzystaniem organoidów prostaty myszy. Model ten został wcześniej opracowany i zweryfikowany w naszym laboratorium, gdzie wykazaliśmy jego silne podobieństwo do rodzimej tkanki prostaty oraz jego znaczenie dla badań biologii infekcji z udziałem UPEC³². System wiernie naśladuje skład komórkowy i polaryzację nabłonka prostaty, oferując jednocześnie zwiększoną dostępność do eksperymentalnej manipulacji. Ponadto wykazujemy jego przydatność w badaniu interakcji gospodarz-patogen w prostatie, oferując bardziej przystępną alternatywę dla modeli in vivo oraz bardziej fizjologicznie istotny system niż konwencjonalne linie komórkowe czy modele 3D organoidów.

Protocol

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury dotyczące zwierząt były zgodne z wytycznymi Uniwersytetu w Würzburgu i otrzymywane przez odpowiednie przepisy instytucjonalne i rządowe. W tym badaniu użyto wyłącznie myszy WT, które zostały uśpione w naszym instytucie przez inne grupy badawcze do niezależnych celów. Nie poświęcono zwierząt specjalnie na tę pracę, zgodnie z zasadami 3R (zastępstwo, redukcja i udoskonalenie).

UWAGA: Protokół przedstawiony tutaj opiera się na wcześniejszym badaniu opublikowanym przez^{autorów 32}. Wszystkie opisane tutaj kroki muszą być wykonywane w sterylnej szafce bezpieczeństwa biologicznego, stosując odpowiednie techniki aseptyczne i z użyciem odpowiedniego sprzętu ochronnego. Mięśnie prostaty zostały wygenerowane z myszy C57BL/6 i utrzymane w hodowli 3D, jak opisano wcześniej^25,26. Aby podążać za zasadami 3R, prostaty myszy zostały przekazane przez ośrodek zwierzęcy z nieleczonych, naiwnych myszy WT (co najmniej 6-miesięcznych), które zostały poświęcone z innych powodów. Krótko mówiąc, prostaty myszy były mielone i trawione w dwóch etapach przy użyciu kolagenazy i enzymu TrypLE Express. Następnie komórki były zasiewane w kroplach macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), aby wygenerować organoidy 3D. Do kultury dodawano medium kulturowe, które uzupełniano co 3 dni. Kultury organoidów 3D były przepuszczane raz w tygodniu i wykorzystywane do zasiewania 2D od przejścia 3 wzwyż. Tygodniowe organoidy prostaty myszy zostały użyte do zasiewania modelu organoidowego na powierzchni 2D, zgodnie z obecnym protokołem. Nie jest wymagane powlekanie płytek tkankowych białkami ECM w ramach tego protokołu.

1. Generowanie modelu narządów prostaty

1. Izolacja organoidów 3D
   1. Aspiruj medium z pożądanej liczby dołków organoidów 3D z płyty 24-dołkowej. Zamień go na 500 μL adDMEM/F12+/+ na odwór (patrz Tabela materiałów).
   2. Użyj pipety P1000, aby mechanicznie zakłócić zrzut ECM. Zbierz zawieszenie w stożkowej rurce o pojemności 15 mL. Zbieraj maksymalnie dwie studnie na rurkę.
   3. Uzupełnij adDMEM/F12+/+ do 10 mL. Delikatnie odwróć tubkę 3-4 razy, żeby wymieszać. Wirować w 450 x g przez 5 minut w 4 °C.
2. Trójwymiarowe rozbicie organoidów w pojedynczych komórkach
   1. Aspiruj nadwysoka. Ponownie zawiesij pellet w 2 mL podgrzanego (37 °C) enzymu TrypLE Express z dodatkiem 10 μM RHOKi.
   2. Inkubuj w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Użyj pipety P1000, aby mieszać zawiesinę ogniwową co 5 minut.
      UWAGA: Sprawdź zawiesinę komórkową pod mikroskopem odwróconym za pomocą obiektywu 4x, aby upewnić się, że komórki są w większości pojedyncze. Akceptowalne są małe skupiska 2-3 komórek. Zazwyczaj wystarczy 15 minut inkubacji, ale można ją wydłużyć, jeśli zajdzie taka potrzeba.
   3. Uzupełnij 10 ml adDMEM/F12+/+. Delikatnie odwróć tubkę 3-4 razy, żeby wymieszać. Wirować w 450 x g przez 5 minut w 4 °C.
3. Powłoka zawiesina jednokomórkowa
   1. Aspiruj supernatant bez zakłócania granulki. Ponownie zawiesić pellet komórkowy w pożywce hodowlowej uzupełnionej 10 μM RHOKi (300 μL pożywki hodowlanej na dołek organoidów 3D stosowanych w kroku 1.1.1).
      UWAGA: Pożywka hodowla składa się z: Advanced Dulbecco Modified Eagle Medium/F12, 10 mmol L⁻¹ HEPES, 1x GlutaMAX, 1x B27, 1 mM N-acetylocyteryny, 10% podłoża kondycjonowanego Nogginem, 10% R-spondin 1 podłoża kondycjonowanego, 50 ng·^mL-1 EGF, 1 nM 5α-dihydrotestosteronu (DHT), 0,2 μM TGFβi oraz 100 ng·^mL-1 Primocyny (patrz Tabela materiałów). Do eksperymentów z infekcjami używaj pożywki hodowlowej bez Primocinu.
   2. Policz liczbę komórek w zawiesie za pomocą komory liczącej Neubauera.
   3. Rozcieńcz zawiesinę komórkową w pożywce hodowlowej uzupełnionej 10 μM RHOKi do stężenia 62 500 komórek·^mL-1. Użyj 200 μL zawiesiny komórkowej na odwiert do zasiewów na płytach 48-dołkowych (hodowla tkankowa od producenta, patrz Tabela materiałów) lub 300 μL na dołek na komorowych szkiełkach μ (patrz Tabela materiałów). Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5%_CO2.
      UWAGA: Każda studnia organoidów 3D, użyta w kroku 1.1.1. zazwyczaj daje około 200 000 ogniw.
   4. Po jednym dniu większość pojedynczych komórek zostaje przymocowana do powierzchni 2D. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni. Zbiór osiąga się w ciągu 7 dni.
      UWAGA: Upewnij się, że RHOKi jest dodawane tylko przy początkowym siewaniu, a nie przy kolejnych zmianach podłoża.
4. Różnicowanie modelu opartego na organoidach.
   UWAGA: Postępuj zgodnie z kolejnymi krokami, aby uzyskać zróżnicowany model oparty na organoidach wzbogacony o komórki luminalne.
   1. Dodaj 10 nM DHT do zawiesiny ogniwa (krok 1.3.3). Stosuj podłoże wznawiane o 10 nM DHT przy kolejnych zmianach podłoża (co 2-3 dni).
      UWAGA: Jeśli do zawiesiny komórkowej nie zostanie dodany DHT (a następnie zmiany podłoża), model oparty na organoidach zostanie wzbogacony o komórki bazalne.

2. Pomiary oporu elektrycznego transepitelowego (TEER)

1. Zasiać zawiesinę komórek organoidalnych w stężeniu 62 500 komórek·^mL-1, używając 300 μL (uzyskanych w kroku 1.3.3.) na 8-dołkowym μ-suwaku PET z 40 elektrodami na dołek (patrz Tabela materiałów). Dodaj 300 μL pożywki hodowlanej, opisanej w 1.3.1, do jednej z jamek bez komórek.
   UWAGA: Studnia wolna od komórek służy jako pusta pozycja do pomiarów.
2. Podłącz μ-suwak do systemu analizy komórek opartego na impedancji (patrz Tabela materiałów) za pomocą stacji 16-dołkowej umieszczonej w inkubatorze do hodowli tkankowej. Mierz TEER na 400 Hz przez 7 dni. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.

3. Barwienie immunofluorescencyjne

UWAGA: W przypadku tej metody należy upewnić się, że komórki są zasiewane w komorowych μ-szkiełkach (patrz Tabela materiałów), które są kompatybilne z aplikacjami mikroskopii wysokiej rozdzielczości.

1. W wybranym momencie usuń podłoże i przemyj komórki 3 razy 1x PBS. Utrwalaj komórki 4% paradehydem (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej (unikaj ekspozycji na światło).
   UWAGA: 4% paraformaldehydu może wywołać reakcję alergiczną, poważne uszkodzenie oczu i podejrzewa się wywołanie raka. Zawsze używaj odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE). Unikaj wdychania kurzu, oparów, gazów, mgieł, oparów lub sprayów. Noszę rękawice ochronne i upewnij się, że skażona odzież pozostaje w laboratorium do czasu odpowiedniej dekontaminacji. Utylizuj zawartość i pojemniki w zatwierdzonym zakładzie utylizacji odpadów.
2. Po utrwaleniu umyj komórki 3 razy 1x PBS (po 5 minut każda). Przepuszczaj komórki 0,5% Tritonem X-100 (patrz Tabela materiałów) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Triton X-100 powoduje podrażnienia skóry i poważne uszkodzenia oczu. Jest bardzo toksyczny dla organizmów wodnych, ma długotrwałe skutki i może powodować zaburzenia hormonalne w środowisku. Podczas obsługi zakładaj rękawice ochronne, ochronę oczu i twarzy. Utylizuj zawartość i pojemniki w zatwierdzonym zakładzie utylizacji odpadów. Unikaj wypuszczania do środowiska.
3. Umyj komórki dwa razy 1x PBS (5 minut każda). Blokuj ogniwa buforem blokującym (1% BSA w PBS, patrz Tabela materiałów) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
4. Rozcieńcz przeciwciała główne w buforze blokującym (1% BSA w 1x PBS) i inkubuj z komórkami przez noc w temperaturze 4 °C na platformie bujającej. Następnego dnia inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. (patrz Tabela materiałów dotyczących rozcieńczeń przeciwciał).
   UWAGA: W przypadku barwienia F-aktyny falloidyną lub błony plazmatycznej CellMask (patrz Tabela materiałów) pomiń krok 3.4.
5. Umyj komórki 3 razy 1x PBS (5 minut każda). Rozcieńcz przeciwciała wtórne, falloidynę lub CellMask (patrz Tabela materiałów) w buforze blokującym (1% BSA w 1x PBS) i inkubuj z komórkami przez godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Umyj komórki 3 razy 1x PBS (5 minut każda). Inkubuj komórki 15 minut w temperaturze pokojowej przy użyciu Hoechst (patrz Tabela materiałów) rozcieńczonego w 1x PBS, aby zabarwić jądra.
7. Przemyj komórki 3 razy 1x PBS (5 minut każda) i zostaw je z 1x PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
8. Zobrazuj szkiełka μ komory (patrz Tabela materiałów) w mikroskopii konfokalnej laserowej lub mikroskopie fluorescencyjnym.
   UWAGA: Obrazy przeglądowe można było wykonać za pomocą obiektywu 20x na mikroskopie fluorescencyjnym, aby ocenić ogólną skuteczność i rozmieszczenie infekcji. Obrazy o wyższej rozdzielczości uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w cel 40x do zanurzenia w wodzie, aby zobaczyć poszczególne bakterie przyczepione do komórek nabłonka lub internalizowane w jego wnętrzu. Fluorofory były wzbudzane za pomocą linii laserowych o średnicy 405, 499, 590 i 653 nm, w zależności od użytych fluoroforów. Emisję wykrywano przy oknach emisji ustawionych na 415 do 516 nm dla Hoechst, 509 do 573 nm dla GFP lub Alexa 488, 600 do 651 nm dla mcherry lub Alexa 594 oraz 663 do 720 nm dla Alexa 647. Stosy Z były pozyskiwane z krokiem o rozmiarze 0,5 μm, pokrywając pełną grubość warstwy nabłonkowej. Obrazy były rejestrowane w rozdzielczości 1024 na 1024 piksele, z częstotliwością skanowania 400 Hz i średnią klatek ustawioną na 4, co zapewnia dobrą jakość obrazu. Moc lasera i wzmocnienie detektora były utrzymywane na stałym poziomie we wszystkich warunkach tego samego eksperymentu. Wszystkie parametry obrazowania, w tym moc lasera, wzmocnienie detektora, prędkość skanowania i uśrednianie, powinny być optymalizowane i dostosowane w zależności od używanego mikroskopu konfokalnego.

4. Zakażenie bakteryjne uropatogeniczną E. coli (UPEC)

UWAGA: Upewnij się, że utrzymany jest model oparty na organoidach przez 7 dni bez Primocinu (patrz Tabela materiałów) w kolejnych krokach.

W badaniu zastosowano uropatogeniczny szczep E. coli UTI89, konstytutywnie ekspresujący białko mCherry z plazmidu pFPV-mCherry (opornego na ampicylinę).

UWAGA: Podczas obchodzenia się z patogenami zakaźnymi (poziom bezpieczeństwa biologicznego 2) należy nosić rękawice oraz odpowiednio zabezpieczać oczy i twarz. Zawsze noś w pełni zapięty fartuch laboratoryjny. Wszystkie procedury wykonuj w certyfikowanej szafie bezpieczeństwa biologicznego. Zdekontaminuj powierzchnie robocze i dokładnie umyj ręce po obsłudze materiałów biologicznych. Zbieranie odpadów BSL-2 w wyznaczonych pojemnikach dla zagrożeń biologicznych odpowiednich do autoklawowania. Przed utylizacją odczyszcz materiały odpadowe za pomocą autoklawowania lub innej odpowiedniej metody dekontaminacji.

1. Trzy dni przed eksperymentem z infekcją należy wyprowadzić szczep UPEC na płytki agarowej LB uzupełnionej odpowiednim antybiotykiem (w tym protokole zastosowano ampicylinę 100 μg·^mL-1 ) i inkubować przez 16-24 godziny w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Niektóre antybiotyki mogą powodować reakcje alergiczne lub podrażnienia przy kontakcie i przyczyniać się do oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, jeśli zostaną nieprawidłowo odrzucone. Zawsze przygotowuj i dodawaj antybiotyki do szafki zabezpieczeń biologicznych, nosząc odpowiedni sprzęt ochronny (rękawice i ochronę oczu). Utylizuj roztwory zawierające antybiotyki jako odpady chemiczne w zatwierdzonym zakładzie utylizacji odpadów.
2. Dwa dni przed eksperymentem z infekcją zaszczepić 3 mL bulionu LB uzupełnionego odpowiednim antybiotykiem (ampicylina 100 μg·^mL-1) przy użyciu pojedynczej kolonii UPEC z płyty agarowej (krok 4.1). Inkubuj statycznie w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin.
3. Dzień przed eksperymentem z infekcją przeanalizuj posiew bakteryjny od kroku 4.2 i zmierz jej przedawkowanie₆₀₀. Oblicz objętość tej hodowli potrzebną do inokulacji 3 mL bulionu LB wzbogaconego ampicyliną (100 μg·^mL-1) do początkowego OD₆₀₀ 0,05, stosując następujący wzór: objętość (μL) = (0,05 * 3 000 μL) / zmierzony OD₆₀₀. Dodaj obliczoną objętość hodowli z kroku 4.2. do świeżego bulionu LB i inkubuj statycznie w 37 °C przez 24 godziny.
   UWAGA: OD₆₀₀ w nocnej kulturze od kroku 4.2 powinien być między 1.7 a 2.2.
4. W dniu infekcji wykonaj wychowanie od kroku 4.3 i zmierz przedawkowanie₆₀₀. Pobierz OD₆₀₀ 1 z hodowli, następnie wiruj w 12 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Usuń supernatant.
5. Ponownie zawiesić w 1 ml pożywki organoidowej wolnej od Primociny bez DHT. Rozcieńcz do MOI 100.
   UWAGA: Każdy dołek w płycie 48-dołkowej uważa się za posiadający około 150 000 komórek w dniu 7. To oszacowanie uzyskano poprzez liczenie komórek w długim okresie przed infekcją w wielu eksperymentach. Aby dokładnie dostosować MOI, zaleca się wysiewanie dodatkowej studni do liczenia komórek przed infekcją. Aby określić wymaganą objętość zawiesiny bakteryjnej (krok 4.4), pomnoź liczbę komórek na dołek przez MOI, aby uzyskać łączną liczbę bakterii potrzebnych w dołku, a następnie podziel tę liczbę przez stężenie bakterii (8 × 10⁵ bakterii/μL), aby uzyskać objętość w μL.
6. Zamień medium hodowlane modelu organoidalnego na medium zawierające bakterie. Dostosuj objętość zgodnie z powierzchnią hodowli: użyj 200 μL na odwór dla płyt 48-dołkowych i 300 μL na odwór dla μ szkiełek. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5%_CO2.
7. Po okresie inkubacji aspiruj podłoże zawierające bakterie z modelu organoidowego. Przemyj studnię 3 razy adDMEM/F12+/+, aby usunąć bakterie zewnątrzkomórkowe.
8. Dodaj pożywkę posiewową zawierającą 50 μg·^mL-1 gentamicyny, aby zabić bakterie zewnątrzkomórkowe. Inkubuj przez 30 minut.
   UWAGA: Stężenie gentamicyny może wymagać korekty w zależności od zastosowanego szczepu bakterii. Jeśli stosujemy stężenie powyżej 50 μg·^mL-1, zaleca się sprawdzenie cytotoksyczności komórkowej.
9. Usuń pośrednik i zamień go świeżym podłożem uzupełnionym 10 μg·^mL-1 gentamicyną na pozostały czas infekcji.
   Przetworzyć zainfekowane komórki pod kątem barwienia fluorescencyjnego po sekcji 3 lub do ilościowej identyfikacji za pomocą cytometrii przepływowej po sekcji 5.

5. Ilościowa analiza zakażeń za pomocą cytometrii przepływowej

1. Aspiruj pożywkę hodowlową i przemyj komórki 3 razy 1x PBS. Użyj 100 μL enzymu TrypLE Express do odłączenia komórek. Inkubuj przez 5-10 minut, aż wszystkie komórki zostaną odłączone.
   UWAGA: Wystarczy odwiert z płyty 48-dołowej na każde warunki.
2. Zbierz zawiesinę komórkową i przenieś ją do studni z płytą 96-dołkową (stożkowe dno). Dodaj 100 μL buforu cytometru przepływowego (1x PBS, 10% FBS, 5 mM EDTA), aby dezaktywować enzym TrypLE Express.
3. Wiruj płytę z 96 dołkami w 450 x g przez 5 minut w 4 °C. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulat w 150 μL buforu cytometru przepływowego.
4. Pozyskiwanie i ilościowe określenie zakażonych komórek za pomocą cytometru przepływowego (patrz Tabela materiałów).
   UWAGA: Cytometria przepływowa została wykonana przy użyciu lasera wzbudzającego 488 nm oraz filtra emisyjnego 615/20 nm do wykrywania komórek mCherry-dodatnich. Dane były pozyskiwane przy wysokim przepływie (66 μL·min⁻¹), zbierając co najmniej 10 000 zdarzeń na próbkę i obejmując tylko zdarzenia o wysokości rozpraszania w przód większej niż 80 000. Zakażone komórki zidentyfikowano na podstawie fluorescencji mCherry w porównaniu z kontrolą niezakażoną (naiwną), po wykluczeniu zanieczyszczeń i dubletów. Do strategii gateingowej można uwzględnić wskaźnik żywotności (np. jodek propidiu lub inne barwienia żywe/martwe) w celu oceny żywotności komórek. Może to być szczególnie przydatne przy pierwszej pracy z modelem, aby upewnić się, że dysocjacja komórek nie wpływa negatywnie na komórki.

Results

Protokół ten opisuje generowanie modelu nabłonka prostaty myszy opartego na organoidach, który odtwarza typ komórek i ekspresję transkrypcyjną przedziału nabłonkowego tkanki natywnej. Model ten został wygenerowany przy użyciu trójwymiarowych organoidów komórek macierzystych dorosłych pochodzących z tkanki prostaty u dorosłych myszy. Te kultury organoidalne są następnie przechowywane w hodowli i przekazywane co tydzień. W modelu opartym na organoidach pierwszy krok w procesie pracy (Rysunek 1A) zaczyna się od użycia 7-dniowych organoidów 3D. Ten okres jest niezbędny, aby osiągnęły odpowiedni rozmiar i gęstość komórek do późniejszego zasiewania na powierzchnię 2D. Po przepuszczeniu małe fragmenty organoidów (Rysunek 1B, dzień 0) zostały zasiane w ECM i pozostawione do wzrostu. Z czasem rosną do dużych, kulistych struktur z wyraźnym wewnętrznym światłem już 7 dnia (rysunek 1B). Po rozbiciu 7-dniowych organoidów na pojedyncze komórki, komórki zostały zasiane na płytce poddanej posiewce tkankowej (Rysunek 1C, dzień 0) przy użyciu tego samego medium co w hodowli 3D (1nM DHT), aby utworzyć monowarstwę. Już pierwszego dnia przyklejone komórki zaczęły się mnożyć. W kolejnych dniach monowarstwa rozszerzała się i osiągała zbieg między 3. a 5. dniem, co zaobserwowano mikroskopią w świetle (Rysunek 1C). Aby scharakteryzować zmiany morfologiczne w czasie i monitorować moment, w którym model oparty na organoidach osiąga zbieg, zabarwiliśmy błonę plazmatyczną metodą CellMask i przeprowadziliśmy obrazowanie fluorescencyjne w wielu punktach czasowych (rysunek 1D).

Ponieważ sygnalizacja receptorów androgenowych (AR) jest kluczowym regulatorem różnicowania komórek w prostatie, a modulacja stężenia testosteronu (DHT) w pożywce hodowli organoidów wykazała ukierunkowaną różnicację komórek macierzystych na komórki bazalne lub luminalne³², dostosowaliśmy poziom DHT w pożywce hodowlowej, aby wspierać wzbogacenie komórek luminalnych (DHT 10 nM) lub komórek bazalnych (bez DHT, Control; Metoda1, Rysunek 2A). Jak pokazano na Rysunku 2 (B-F), nie zaobserwowano istotnych różnic w wzroście lub konfluencji komórek. Jak można się było spodziewać, w warunkach kontrolnych (pożywka hodowla organoidalna bez DHT) większość komórek ekspresowała cytokeratynę 5 (KRT5), marker komórek macierzystych podstawy prostaty (rysunek 2B,E). Dla porównania, tylko kilka komórek wykazywało niskie poziomy CD24a, markera zróżnicowanych komórek prostaty luminalnej (rysunek 2B,F).

Suplementacja 1 nM DHT, jak wcześniej opisaliśmy³², spowodowała mieszaną populację zawierającą zarówno komórki bazalne, jak i luminalne. Jednak ekspresja CD24a pozostała niska, co wskazuje na niepełne zróżnicowanie do komórek luminalnych (rysunek 2C, F³²). Zwiększenie DHT do 10 nM sprzyjało pełnej różnicacji komórek luminalnych, przy jednoczesnym zachowaniu części komórek podstawnych po 7 dniach hodowli (rysunek 2D-F). Różnicowanie modeli opartych na organoidach można również ocenić za pomocą mikroskopii jasnego pola. Chociaż różnice między warunkami nie są zbyt wyraźne, gdy komórki są rzadkie (Dzień 0–5, Rysunek 1C, Ilustracja Uzupełniająca 1A), morfologia i wygląd komórek stają się wyraźne i zauważalne między trzema warunkami hodowli dzięki mikroskopii jasnej w Dniu 7 (Rysunek 1C, Rysunek Uzupełniający 1A,B). W braku DHT komórki wydawały się płaskie i bardziej nieregularne, podczas gdy w DHT 10 nM komórki były ściśle upakowane w wielokątny układ, przypominający morfologię brukową (Ilustracja uzupełniająca 1B).

Warto zauważyć, że kultury organoidów 3D również ulegały zmianom morfologicznym podczas hodowli w różnych stężeniach DHT. Konkretnie zaobserwowano wyraźny wzrost wielkości organoidów zależny od dawki, przy czym największe organoidy powstają w obecności 10 nM DHT (Rysunek 1B, Ilustracja uzupełniająca 2A,B). Wyniki te wskazują, że szlak AR jest kluczowy nie tylko dla różnicowania komórek, ale także dla modulacji dynamiki wzrostu organoidów prostaty myszy.

Aby ocenić integralność nabłonka i polaryzację modeli, przeprowadziliśmy pomiary oporu elektrycznego transepitelu (TEER) w modelu organoidalnym uprawianym z dawką lub 10 nM DHT. Wartości TEER rosły z czasem w obu warunkach, ale były znacznie wyższe w obecności 10 nM DHT (rysunek 3A), co wskazuje na zwiększoną funkcję bariery nabłonkowej. Wyniki te potwierdziło barwienie falloidynową filamentów aktyny, które zazwyczaj organizowane są w pierścień wierzchołkowy na stykach komórek komórkowych w komórkach nabłonka prostaty luminalnej. W warunkach 10 nM DHT pierścień aktynowy wydawał się bardziej wyraźny w porównaniu do warunków kontrolnych, co odpowiadało zwiększonej polaryzacji komórek i organizacji nabłonka (Rysunek 3B). Dodatkowo, immunobarwienie dla zonula occludens 1 (ZO-1) wykazało wzrost liczby styków ścisłych w warunkach DHT 10 nM (rysunek 3C), co dodatkowo wspiera wzmocnioną integralność bariery nabłonkowej i różnicowanie w kierunku fenotypu świetlnego. Projekcje ortogonalne pokazują, że organoidy hodowane z DHT 10 nM wykazują wyraźnie zdefiniowaną polaryzację nabłonka (Ilustracja uzupełniająca 3A). Komórki bazalne KRT5⁺ znajdują się na dole, a luminalne komórki CD24a⁺ rozmieszczone są wzdłuż warstwy nabłonkowej, wykazując silniejszą intensywność barwienia po stronie wierzchołkowej. Ta architektura jest podobna do tej obserwowanej w tkance prostaty myszy (Rysunek uzupełniający 3B). Warto zauważyć, że dane z Human Protein Atlas pokazują, że te markery mają porównywalną lokalizację w ludzkiej tkance prostaty, gdzie komórki bazalne KRT5⁺ znajdują się pod warstwą świetlną CD24a⁺ (Ilustracja uzupełniająca 3C)³³. Dla porównania, komórki hodowane pod kontrolą lub w warunkach 1 nM DHT nie wykazują wyraźnego rozdzielenia przestrzennego między markerami bazalnymi a luminalnymi, a wysokość komórek była znacznie niższa niż w warunkach 10 nM (Ilustracja uzupełniająca 3A). Wskazuje to, że suplementacja 10 nM DHT sprzyja różnicowaniu i polaryzacji nabłonka w modelu 2D w sposób porównywalny z nabłonkiem narodziny prostaty. Ponieważ model oparty na organoidach hodowany przy użyciu 10 nM DHT bardzo przypomina rodzimy nabłonek prostaty myszy (Rysunek 2D, Ilustracja uzupełniająca 3A,B), stanowi on istotną platformę do badania interakcji gospodarz-patogen. Aby wykazać zastosowanie modelu, użyliśmy zakażeń UPEC, a konkretnie szczepu UTI89, jednego z najczęściej stosowanych szczepów UPEC w dziedzinie układu przyrządowo-płciowego. Jak pokazano na rysunku 4A, bakterie hodowano w bulionie LB przez 24 godziny (jak opisano w metodzie 4) i inkubowano z komórkami przez godzinę. Bakterie zewnątrzkomórkowe były następnie zabijane gentamicyną, aby ilościowo określić inwazję i replikację wewnątrzkomórkową. Po zakażeniu modelem organoidalnym UPEC przyklejał się do komórek nabłonkowych w dużej liczbie (0 hpi; Rysunek 4B, lewy panel; Rysunek 4C). Następnie, po leczeniu gentamyną (1 hpi), liczba komórek UPEC-dodatnich znacząco się zmniejszyła z powodu śmierci bakterii zewnątrzkomórkowych (Rysunek 4B, panel środkowy; Rysunek 4C). Przy 24 hpi liczba zakażonych komórek pozostała niezmieniona (rysunek 4C), jednak mikroskopia konfokalna wykazała, że bakterie wewnątrzkomórkowe nadal się replikują, tworząc struktury przypominające wspólnoty, podobne do tych wcześniej opisanych w nabłonku pęcherza moczowego (Rysunek 4B, prawy panel). Zakażone komórki zostały zidentyfikowane za pomocą fluorescencji mCherry przy użyciu niezakażonych (naiwnych) osób kontrolnych jako odniesienia, po wykluczeniu zanieczyszczeń i dubletów (Rysunek uzupełniający 4).

Rysunek 1: Przegląd przepływu pracy i ewolucji morfologicznej organoidów prostaty oraz modeli opartych na organoidach w czasie. (A) Schematyczne przedstawienie eksperymentalnego przepływu pracy (Metoda 1). (B) Obrazy Brightfield pokazujące morfologiczny rozwój organoidów prostaty uzupełnione o 1 nM DHT, wykonane w dniach 0, 1, 3, 5 i 7 (od lewej do prawej). Skala: 200 μm. (n = 3). (C) Obrazy jasnego pola modelu organoidowego uzupełnione o 1 nM DHT, wykonane w dniach 0, 1, 3, 5 i 7 (od lewej do prawej). Skala: 200 μm. (n = 3). (D) Reprezentatywne obrazy mikroskopii immunofluorescencyjnej modelu organoidalnego uzupełnione 1 nM DHT i barwione CellMask (czerwony), w dniach 1, 3, 5 i 7 (od lewej do prawej). Jądra zostały pokolorowane kolorem Hoechst 33342 (niebieski). Skala: 50 μm. (n = 3) Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Rysunek 2: DHT moduluje różnicowanie linii w modelu opartym na organoidach. (A) Schematyczne przedstawienie różnych warunków stosowanych do różniczkowania. (B-D) Reprezentatywne obrazy z mikroskopii immunofluorescencyjnej modelu organoidalnego uprawiane przez 7 dni w przypadku (B) braku (Ctrl) lub obecności (C) 1 nM lub (D) 10 nM DHT. Zdjęcia zostały wykonane w dniach 1, 3, 5 i 7 (od lewej do prawej). Modele oparte na organoidach zostały barwione na CD24a (marker komórek świetlnych, zielony) oraz KRT5 (marker komórek podstawnych, magenta). Jądra zostały pokolorowane kolorem Hoechst 33342 (niebieski). Skala: 50 μm. (n = 4). (E,F) Ilościowa identyfikacja obrazowa komórek (E) KRT5⁺ i (F) CD24a⁺ w modelu organoidalnym uprawianym bez DHT (Ctrl), 1nM lub 10nM. Dane są wyświetlane jako procent dodatkowych komórek na pole widzenia. Test statystyczny: jednokierunkowy ANOVA z testem post hoc Tukeya. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Model oparty na organoidach różnicowany za pomocą 10 nM DHT wykazuje wyższą polaryzację komórek w porównaniu do grupy kontrolnej. (A) analiza TEER modelu organoidowego uprawianego przez 7 dni w nieobecności (Ctrl; różowy) i obecności DHT (10 nM; zielony). Paski błędu reprezentują SD (n = 3). Test statystyczny: jednokierunkowy ANOVA z testem post hoc Tukeya. (B,C) Reprezentatywne obrazy z mikroskopii immunofluorescencyjnej modelu organoidalnego uprawiane przez 7 dni bez (Ctrl; góra) lub z użyciem 10 nM DHT (dolny) i barwiony na (B) F-aktynę (czerwoną) oraz (C) ZO-1 (czerwoną). Jądra zostały pokolorowane kolorem Hoechst 33342 (niebieski). Skala: 50 μm. (n = 3) Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Rysunek 4: Analiza dynamiki infekcji w modelu organoidowym. (A) Schematyczne przedstawienie protokołu infekcji (sekcja 4). (B) Reprezentatywne obrazy z mikroskopii immunofluorescencyjnej pokazujące model zakażony na podstawie organoidów 0, 1 i 24 godzin po zakażeniu (hpi; od lewej do prawej). UPEC są wyświetlane na czerwono. Jądra zostały pokolorowane kolorem Hoechst 33342 (niebieski). Skala: 50 μm. (n = 3). (C) Analiza cytometrii przepływowej komórek UPEC-dodatnich (mCherry dodatnie, zakażone) przy 0, 1 i 24 hpi. Strategia bramkowania została przedstawiona na Dodatkowym Rysunku 4. Paski błędu reprezentują SEM (n = 3). Test statystyczny: jednokierunkowy ANOVA z testem post hoc Tukeya. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek uzupełniający 1: Ewolucja morfologiczna modelu opartego na organoidach w czasie. (A,B) Obrazy jasnego pola modelu organoidowego w (A) braku (Ctrl) i (B) obecności 10 nM DHT, wykonane w dniach 0, 1, 3, 5 i 7 (od lewej do prawej). Skala: 200 μm. (n = 3) Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Ilustracja uzupełniająca 2: Stężenie DHT wpływa na wzrost trójwymiarowego narządu prostaty. (A) Obrazy jasnego pola modelu organoidowego w braku (Ctrl; góra) oraz obecności 10 nM DHT (na dole), wykonane w dniach 0, 1, 3, 5 i 7 (od lewej do prawej). Skala: 200 μm. (n = 3). (B) Ilościowe określenie rozmiaru 3D organoidów w dniu 7 uprawianych w trzech różnych warunkach: brak DHT (Ctrl; różowy), 1 nM DHT (fioletowy) i 10 nM DHT (zielony). Test statystyczny: jednokierunkowa ANOVA z testem post hoc Tukeya (n = 3). Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Charakterystyka morfologii organoidów prostaty i polaryzacji nabłonka. (A) Ortogonalne rzuty konfokalnych stosów z ilustrującymi organizację nabłonka i polaryzację apicalno-bazalną przy różnych stężeniach DHT (Ctrl, 1 nM i 10 nM DHT). Komórki bazalne zostały zabarwione na KRT5 (magenta), a luminalne na CD24a (zielone). Pasek skali: 50 μm.(B) Barwienie immunofluorescencyjne tkanki prostaty myszy osadzonej w OCT, wykazujące markery nabłonkowe bazalne (KRT5, magenta) i luminalne (CD24a, zielone). Jądra są barwione barwieniem DAPI (niebieskim). Pasek skali: 50 μm. Krótko fragmenty tkanek myszy były utrwalane 4% PFA, odwodnione przez noc 30% sacharozy oraz^{32 μ} osadzone w OCT. Następnie preparaty były nawadniane w PBS przez 10 minut i immunobarwiane po sekcji 3. (C) Analiza immunohistochemiczna ekspresji białek CD24a i KRT5 w ludzkiej tkance prostaty (Panel C został wydobyty z bazy danych Human Protein Atlas Database, wersja 25.0; Human Protein Atlas proteinatlas.org), Uhlén, M. i in. (2015)³³, https://www.proteinatlas.org/ENSG00000186081-KRT5/tissue/prostate). Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Strategia blokowania cytometrii przepływowej w identyfikacji zakażonych komórek. Komórki były najpierw gated na podstawie wysokości bocznego rozpraszania (SSC-H) względem wysokości rozpraszania przedniego (FSC-H), aby wykluczyć zanieczyszczenia, a następnie nastąpiło bramkowanie na SSC-H względem obszaru rozpraszania bocznego (SSC-A) w celu wybrania pojedynczych komórek. następnie zidentyfikowano komórki mCherry-dodatnie (zakażone) za pomocą Counts w porównaniu z fluorescencją PE-Texas Red-H (Histogram). Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Na prostatę może wpływać wiele chorób, w tym łagodna przerostliwość prostaty, zapalenie prostaty oraz rak prostaty. Choroby te są bardzo powszechne i znacząco wpływają na jakość życia pacjentów². Pomimo ich znaczącego wpływu na opiekę zdrowotną, nasza wiedza na temat tych chorób, zwłaszcza mechanizmów podstawowych i odpowiedzi gospodarza w chorobach nienowotworowych, pozostaje ograniczona. Wynika to głównie z braku fizjologicznie istotnych modeli eksperymentalnych. Z jednej strony uwiecznione linie komórkowe nie oddają złożoności ani różnicowania normalnego nabłonka prostaty. Z drugiej strony, modele zwierzęce, głównie gryzonie, budzą wątpliwości etyczne i nie są opłacalne. Alternatywnym podejściem jest wykorzystanie ludzkich komórek pierwotnych lub ekplantów tkanek pochodzących od pacjentów. Jednak ograniczona dostępność świeżej tkanki prostaty ogranicza ich szerokie zastosowanie. Te ograniczenia podkreślają potrzebę stosowania innych systemów in vitro, które są fizjologicznie istotne, łatwe w użyciu i możliwe do eksperymentalnego zarządzania. W tym kontekście technologia dorosłych komórek macierzystych zrewolucjonizowała modelowanie chorób. Te kultury 3D mają zdolność samoorganizacji, zachowując tożsamość nabłonka oraz różnorodność komórkową nabłonka 23,34,35,36,37,38. Choć ich architektura 3D umożliwiła zastosowania w badaniach nad rakiem, testowaniu leków i medycynie regeneracyjnej 23,34,35,36,37,38,39,40,41, ich zamknięta struktura, z wierzchołkiem skierowanym do wewnątrz, stanowi praktyczne wyzwania dla dostępu eksperymentalnego, szczególnie w in vitro Modele infekcji. Organoidy apikalnie rozwiązują to ograniczenie, odwracając polaryzację nabłonka, odsłaniając powierzchnię wierzchołkową do badań bezpośrednich infekcji^27,28. Jednak ich skuteczność jako modelu infekcji może być ograniczona przez zmienność rozmiaru, nierówną ekspozycję na patogeny oraz kruchość podczas długotrwałej infekcji.

Przedstawiamy tutaj protokół generowania modelu prostaty myszy opartego na organoidach, który odtwarza skład komórek nabłonkowych i profil transkrypcjonalny nabłonka natywnego mysiego, zapewniając jednocześnie łatwy dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Zoptymalizowany w naszej poprzedniej pracy³², model ten umożliwia precyzyjną kontrolę kluczowych zmiennych eksperymentalnych, w tym gęstości zasiew, jednolitej ekspozycji na bodźce, określonych stosunków bakterii do komórek (MOI) oraz wysokoprzepustowych parametrów obrazowania, które często trudno jest ustandaryzować w konwencjonalnych systemach organoidów 3D.

Zgodnie z zasadą 3R (Zasteniaj, Redukuj, Udoskonalaj) dla eksperymentów na zwierzętach⁴², organoidy używane jako źródło komórek pierwotnych w tym modelu pochodzą od dzikich naiwnych myszy, które zostały poświęcone do niezwiązanych ze sobą celów, takich jak hodowla. Prostata jest pozyskiwana dzięki darowiźnie z pobliskich ośrodków dla zwierząt, co zmniejsza potrzebę składania ofiar w składaniu dodatkowych zwierząt specjalnie na potrzeby tego protokołu.

Solidne i wiarygodne zróżnicowanie organoidów oraz modeli opartych na organoidach jest kluczowe dla wiernego oddania składu komórkowego i cech funkcjonalnych tkanek rodzimych, zapewniając ich istotność w modelach in vitro. Różnicowanie komórek w obrębie organoidów jest silnie zależne od specyficznego składu pożywki hodowlanej, w tym od precyzyjnych stężeń czynników wzrostu i czynników farmakologicznych (czyli inhibitorów leków). Manipulowanie tymi czynnikami umożliwia bezpośrednią różnicowanie w kierunku konkretnych linii komórkowych, co wykazują różne układy organoidalne. Na przykład w organoidach jelitowych usunięcie WNT sprzyja różnicowaniu enterocytów, co może być dodatkowo wzmocnione przez interferon gamma (przegląd w³⁸). Różnicowanie w komórki pucharowe można osiągnąć poprzez usunięcie inhibitora p38 i nikotynamidu lub przez hamowanie Notcha za pomocą DAPT/DBZ (przegląd w³⁸). IGF-1 i FGF-2 również wykazano jako wspierające długoterminowe rozszerzanie hodowli wzbogaconych o komórki wydzielnicze⁴³. Ponadto IL-22 zwiększa różnicowanie komórek Panetha, a komórki enteroendokrynne powstają poprzez hamowanie szlaków takich jak Notch i BMP³⁸. Podobnie organoidy żołądkowe i monowarstwy oparte na organoidach wykazują różnicowanie w kierunku komórek pit po wyodrębnianiu WNT z pożywki hodowlanej, podczas gdy dodanie nikotynamidu do pożywki kieruje komórki do fenotypu gruczołu (komórki szyjne i główne)^31,44,45.

W prostatze receptor androgenowy (AR) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy tkanek 46,47,48,49. Testosteron, produkowany przez komórki Leydiga w jądrach, jest przekształcany w DHT w komórkach nabłonka prostaty przez reduktazę 5α. DHT aktywuje AR, który dimerizuje, translokuje się do jądra i wiąże z elementami odpowiedzi androgenowej, regulując geny zaangażowane w różnicowanie komórek i homeostazę⁵⁰. Wcześniejsze badania wykazały, że suplementacja 1 nM w trójwymiarowych organoidach prostaty myszy wystarcza, aby osiągnąć różnicowanie komórek do komórek luminalnych⁵¹. Inni wykazali również, że suplementacja witaminą D (konkretnie 1,25-dihydroksywitaminą D) sprzyjała wzrostowi ludzkiego narządu prostaty i przyspieszała różnicowanie poprzez hamowanie kanonicznej aktywności WNT oraz tłumienie członka rodziny WNT DKK3⁵². Jednak w tych badaniach użyto jedynie organoidów trójwymiarowych. Nasze wcześniejsze badania³² i inne⁵³ wykazały, że suplementacja 10 nM DHT w organoidach 3D nie wystarcza do pełnej różnicowania. Natomiast zastosowanie opisanego tutaj modelu 2D, czyli zasiewania komórek w 2D 10 nM DHT, wystarcza, by różnicować model do stanu podobnego do natywnej tkanki³². Aby zrozumieć tę różnicę między modelami 3D a 2D, potrzebne będą dalsze prace, ale można ją wyjaśnić różnymi mechano-fizycznymi sygnałami między systemami lub obecnością ECM zawierających czynniki wzrostu w modelu 3D.

W tkance prostaty dorosłych można znaleźć trzy główne typy komórek nabłonkowych: komórki luminalne, podstawne i neuroendokrynne. Spośród nich we wszystkich dotychczas opublikowanych modelach organoidów obecne są tylko komórki świetlne i bazalne. Brak rzadkich komórek neuroendokrynnych sugeruje, że obecne protokoły organoidalne mogą nie być w pełni zoptymalizowane. Pomiędzy komórkami luminalnymi a bazalnymi populacja komórek pośrednich prostaty została również opisana jako stan przejściowy wyrażający zarówno markery świetlne (np. CD24a), jak i bazalne (np. SCA-1)^18,51. Ta subpopulacja często występuje w okolicy prostaty cewki moczowej, dlatego często nazywa się je komórkami luminalnymi okołowomoczowej⁵⁴. Chociaż odnotowano to w niektórych układach organoidalnych 3D przy określonych warunkach różnicowania lub sygnalizacji^53,55, nie obserwujemy wyraźnego rozdzielenia między komórkami luminalnymi a pośrednimi w naszym systemie³². Jednym z możliwych wyjaśnień jest to, że podczas generowania 3D organoidów nie rozróżniamy różnych obszarów prostaty, a aby uniknąć skażenia komórkami cewki moczowej, usuwamy tkankę bezpośrednio przylegającą do połączenia prostaty cewki moczowej. Dlatego kultury organoidalne pochodzące z okolic bliższych lub cewki moczowej prawdopodobnie są bardziej zdolne do generowania komórek pośrednich.

Integralność bariery jest uważana za cechę charakterystyczną dojrzałego i zróżnicowanego nabłonka, zapewniając ochronną barierę przed toksynami i drobnoustrojami docierającymi do tkanek pod spodem. Styki ciasne (bogate w białka ZO-1⁵⁶) odgrywają kluczową rolę w regulacji przepuszczalności parakomórkowej i utrzymaniu integralności bariery nabłonkowej⁵⁷. W miarę różnicowania się komórek nabłonkowych, dojrzewanie tych międzykomórkowych złączeń wzmacnia barierę⁵⁸. Dlatego ocena integralności bariery jest ważnym odczytem dla modelu nabłonka in vitro . W tym protokole przedstawiamy trzy uzupełniające się metody oceny integralności bariery: pomiar TEER, immunodawizowanie ZO-1 oraz barwienie F-aktiną. Chociaż wszystkie trzy metody skutecznie oceniają integralność barier, różnią się znacząco pod względem sprzętu i wymaganych zasobów. Pomiary TEER dostarczają wartości ilościowej, którą można śledzić w czasie, oferując dynamiczny wgląd w funkcję bariery; Jednak ta technika wymaga specjalistycznego sprzętu i oprogramowania, które mogą nie być dostępne w każdym laboratorium. Dla porównania, barwienie przeciwciałami przeciwciałami przeciw ZO-1 lub falloidyną jest znacznie łatwiejsze do opanowania pod względem czasu i kosztów (np. barwienie falloidyną można wykonać w około 3 godzinach – sekcja 3).

Protokół ten opisuje, jak wykorzystać trójwymiarowe organoidy prostaty myszy do wygenerowania wierzchołkowo dostępnego modelu 2D. Kilka przeglądów przedstawiło zalety i wady organoidów oraz systemów opartych na organoidach w badaniu interakcji gospodarz-patogen 23,36,59. W badaniach nad infekcjami kluczowe jest uwzględnienie naturalnego miejsca interakcji między patogenami a nabłonkiem gospodarza. W prostatie komórki luminalne są zazwyczaj pierwszym punktem kontaktu, dlatego dostęp do powierzchni wierzchołkowej jest niezbędny do dokładnego modelowania dynamiki infekcji. W konwencjonalnych trójwymiarowych organoidach prostaty powierzchnia wierzchołkowa jest zwrócona do lumen organoidu i nie jest bezpośrednio dostępna. W tych przypadkach narażenie na patogeny może być osiągnięte poprzez mikroiniekcje, które są niskoprzepustowe i technicznie wymagające, lub poprzez zakłócenie organoidów, co obniża polaryzację nabłonka i prowadzi do powstania miejsc interakcji niefizjologicznych²³. Dla porównania, apically dostępny model 2D przedstawiony w tym protokole oferuje bezpośredni dostęp do powierzchni luminalnej. Umożliwia to kontrolowaną i fizjologicznie istotną ekspozycję na patogeny, precyzyjną regulację MOI oraz kompatybilność z platformami obrazowania o wysokiej wydajności, wysokiej rozdzielczości lub z żywymi komórkami. Tutaj prezentujemy zastosowanie tego modelu jako systemu zakażenia in vitro, wykorzystując referencyjny szczep UPEC, UPEC, UPEC, szeroko stosowany jako źródło reprezentujące główny gatunek bakterii odpowiedzialny za bakteryjne zapalenie prostaty⁹. Jednak model ten można łatwo dostosować do badania innych patogenów prostaty, takich jak Enterococcus feecalis czy Pseudomonas aeruginosa, co czyni go wszechstronną platformą do biologii infekcji prostaty.

Dysocjacja organoidów 3D jest kluczowym krokiem do pomyślnego ustanowienia modelu opartego na organoidach. Brak pełnej dysocjacji organoidów 3D, skutkujący powstaniem dużych fragmentów, może utrudnić przyczepność komórek do powierzchni hodowli, podczas gdy długotrwała ekspozycja na odczynnik dysocjacyjny przez ponad 30 minut obniża żywotność komórek. Ponadto utrzymanie stałego odstępu przejścia około siedmiu dni przed dysocjacją i zasiewem jest niezbędne, ponieważ stan fizjologiczny organoidów silnie wpływa na ich zdolność do przyczepania i różnicowania. Kolejną kluczową zmienną wpływającą na pomyślny rozwój modelu opartego na organoidach prostaty jest gęstość zasiew. Stężenie nasiewne użyte tutaj zostało zoptymalizowane pod kątem różnicowania przez 7 dni. Zwiększenie lub zmniejszenie tego stężenia prawdopodobnie skutkowałoby różnymi czasami różnicowania. Ponadto niewystarczająca rezawisja komórek przed powłoką może prowadzić do nierównomiernego rozmieszczenia komórek w dołkach, co skutkuje zmienną gęstością komórek, która z kolei wpływa zarówno na proliferację, jak i różnicowanie. Ponadto, podobnie jak w innych modelach organoidów, różne partie ECM lub czynników wzrostu mogą wpływać na zdolność wzrostu i różnicowania. Dlatego ważne jest, aby zweryfikować, czy model oparty na organoidach zachowuje spójny fenotyp po każdej zmianie partii lub numeru partii czynnika wzrostu.

Gdy model oparty na organoidach zostanie już ustalony, parametry infekcji również muszą być starannie zoptymalizowane. Często wymagane są różne MOI, aby osiągnąć solidne i powtarzalne poziomy infekcji, w zależności od szczepu bakterii i wybranego odczytu. Dla szczepu UPEC UPEC, UPEC, UCI89 (używanego tutaj i w³²) oraz dla kilku izolatów zapalenia prostaty³², MOI 100 wystarczyło do uzyskania wiarygodnej liczby zakażonych komórek w punktach czasowych adhezji, inwazji i replikacji. Jednak jeśli inkubacja komórek z bakteriami musi być przedłużona powyżej 1 godziny, należy stosować niższy MOI, aby zapobiec przerostowi UPEC poza komórkami w ośrodku i późniejszej toksyczności dla komórek. W tym protokole zakażenie oceniano za pomocą dwóch metod: I) cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia udziału zakażonych komórek oraz II) mikroskopii konfokalnej do oceny lokalizacji bakterii. Jednak można stosować także inne podejścia, takie jak testy jednostkowe formujące kolonie do pomiaru^{bakterii 32}, immunodbarwienie do wykrywania markerów gospodarza lub bakteryjnego³² czy analizy transkryptomiczne do profilowania odpowiedzi gospodarza.

Chociaż model oparty na organoidach prostaty zapewnia system istotny fizjologicznie, należy wziąć pod uwagę kilka ograniczeń przy jego stosowaniu do badań nad infekcjami. Jednym z głównych ograniczeń tego modelu jest brak rezydujących lub obwodowych komórek odpornościowych, co ogranicza jego zdolność do pełnego wychwycenia odpowiedzi gospodarza na infekcję (np. rekrutację komórek odpornościowych lub immunologiczne oczyszczanie). Inne istotne elementy nieobecne w modelu to naczynia, stroma i nerwy, które mogą wpływać na interakcje gospodarz z patogenem. Wprowadzenie dodatkowych typów komórek, takich jak fibroblasty stromalne, komórki odpornościowe i śródbłonki, pomogłoby odtworzyć bardziej kompletne mikrośrodowisko tkankowe. Zaawansowane systemy kohodowli lub mikrofluidyczne platformy organ-na-chipie mogłyby dodatkowo wspierać złożone interakcje komórkowe i umożliwiać dynamiczne badania infekcji. Dodatkowo, przy użyciu organoidów pochodzących z modeli zwierzęcych należy uwzględnić różnice specyficzne dla gatunku, szczególnie przy badaniu patogenów specyficznych dla człowieka. Chociaż nasze wcześniejsze badania³² wykazały, że wyniki modelu opartego na mięśniach mięśni środkowej mogą być odtwarzane w tkankach ludzkich, zmienność między gatunkami w regulacji genów, ekspresji receptorów czy odpowiedziach hormonalnych może nadal ograniczać bezpośrednie znaczenie modelu dla fizjologii człowieka. Włączenie organoidów pochodzenia ludzkiego, gdy to możliwe, zwiększyłoby wartość translacyjną, umożliwiając badanie interakcji i reakcji patogenów specyficznych dla człowieka. Choć te dodatki mogą wzmocnić modele oparte na organoidach jako potężne narzędzia do badania biologii prostaty, patogenezy infekcji i rozwoju terapeutycznego, model czysto nabłonkowy, który przedstawiamy, oferuje uproszczony i podzielony system. Pozwala to na ukierunkowane badania interakcji gospodarza z patogenem specyficznymi dla nabłonka bez zakłóceń ze strony innych składników tkanek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
48 płyt studni	Sarstedt	83.3923	Kształt spodu: płaski
5&alfa;-Androstan-17β-ol-3-jeden dihydrotestosteron	Sigma-Aldrich	A8380	Oznaczono ją jako DHT. Roztwór zapasowy 10μ M w 100% etanolu
8-dołkowy PET z 40 elektrodami na włążek	Biofizyka stosowana	8W10E+	Slajdy używane do pomiarów TEER
96 płyt studni	Sarstedt	82.1583	Kształt dna: stożkowy
Advance Dulbecco' zmodyfikowany średni Eagle/F12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Został oznaczony jako adDMEM/F12+/+ po uzupełnieniu o 10 mmol L− 1 HEPES i 1x GlutaMAX
Ampicylina	Roth	K029.2	Stężenie 100 mg/mL
Przeciwciało przeciw CD24a	Proteintech	10600-1-AP	Przeciwciało pierwotne; rozcieńczenie 1:100 w 1x PBS 1% BSA
Przeciwciało anty-cytokeratyna 5 Alexa Fluor 647	Abcam	ab193895	Przeciwciało pierwotne; rozcieńczenie 1:100 w 1x PBS 1% BSA
anty-Rabbit IgG Alexa Fluor 488  Przeciwciało	Invitrogen	A21441	Przeciwciało wtórne; rozcieńczenie 1:500 w 1x PBS 1% BSA
Przeciwciało poliklonalne przeciw przeciw ZO-1	Proteintech	21773-1-AP	Przeciwciało pierwotne; rozcieńczenie 1:750 w 1x PBS 1% BSA
B27, 50x	Thermo Fisher Scientific	12587010
Serumaalbumina bydła (BSA) Fraktion V, NZ - pochodzenie	Roth	8076.3	Komponent bufora blokującego używany przy 1% w 1x PBS
komorowe i mikro-Suwa 8 Studnie	Ibidi	80806	Modyfikacja powierzchni: ibiTreat
Stożkowa rurka (15 mL)	Sigma Aldrich	T1943	Płaskie dno jest lepsze dla małych granulek.
Disodowy etylendiaminetetra-acetan 2H2O (EDTA)	Roth	8043.2	Domowa produkcja: 93,0 g w 400 mL H2O, dostosuj pH do 8,0, równo objętość z H2O do 500 mL; 0,5 mln EDTA; Składnik bufora cytometru przepływowego
Zrównoważony roztwór soli Dulbecco (DPBS)	Gibco	14190-144	PBS
ECHO Revolve Microscope	ECHO
ECIS  Z-Theta -  System analizy komórek oparty na impedancji	Biofizyka stosowana	ECIS  Z-Theta	System obejmuje: stację 16 i/lub 96 studni; zewnętrzny moduł sterujący; Laptop PC; oprogramowanie ECIS do kontroli, pozyskiwania i wyświetlania; moduł podniesionego pola do automatycznej migracji komórek i elektroporacji
Serum płodowe bydła (FBS) Superior	Sigma Aldrich	S0615	Składnik buforu cytometru przepływowego; Składnik pożywki hodowli linii komórkowej 293T; Składnik pożywki hodowlanej HEK293T linii komórkowej
Flash Phalloidin Red 594	Biolegenda	424203	Rozcieńczenie 1:250 w 1x PBS 1% BSA
Bufor cytometru przepływowego			1x PBS, 10% FBS, 5 mM EDTA
Gentamicyn	Sigma Aldrich	G1272
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-038	Dlifeptyd L-alanylu-glutaminy, składnik adDMEM/F12+/+
Harvard Biochrom Ultrospec 10 Cell Density Meter	Fisher Scientific	10704417
Głęboka czerwona barwa HCS CellMask	Technologie życia	H32721	Rozcieńczenie 1:1 000 w 1x PBS 1% BSA
HEK293T linia komórkowa transfektowana wektorem ekspresyjnym Noggin-Fc myszy	Linia komórkowa od prof. dr Clevers		Używana do produkcji Noggin; podłoże hodowlane: 500 ml DMEM, wysoka zawartość glukozy, GlutaMAX, pirozian (Gibco Life Technologies, 31966)+ 50 ml FBS; Farin i in. Gastroenterology 143.6 (2012): 1518-1529
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630056	Komponent adDMEM/F12+/+
Hoechst 33342	Technologie życia	H3570	Rozcieńczenie 1:5 000 w 1x PBS
Ludzki czynnik wzrostu naskórka (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Koncentracja 500 & micro; g/mL
Pętle inokulacyjne	Sarstedt	86.1567.010
Rurki inokulacyjne	Sarstedt	62.515.006
Mikroskop konfokalny Leica Stellaris 5	Leica
Bulion Luria Bertani (bulion LB)	Roth	X968.1
Matrigel	Corning	356231	Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM)
N-acetylocytesteina	Sigma-Aldrich	A9165-25G	Koncentracja 500 mM
Noggin CM
NovoCyte Quanteon	Agilent		Cytometr przepływowy
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	Stosowano 4% w 1x PBS, 4% sacharozy
Primocin	Invivogen	Ant-PM-1
Q-VETTES półmikro	Ratiolab	2712120
RHOKi (Y-27632)	AbMole	M1817	inhibitor RhoA/ROCK; Magazyn koncentracyjny 10 mM
R-spodin1 CM
R-Spondin1 wyrażający linię komórkową 293T	Sigma Aldrich	SCC111	Używany do produkcji R-spo1 CM; medium hodowlane: 500 ml DMEM, wysoka glukoza, GlutaMAX, pirosurowian (Gibco Life Technologies, 31966)+ 60 ml FBS
TGFβ i (A-83-01)	Tocris	2939	Inhibitor ALK4/5/7; Koncentracja 5 mM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284	użyto 0,5% rozcieńczonego w PBS 1x
Enzym TrypLE Express & nbsp;	Gibco	12605028	Enzymatyczny środek do dysocjacji komórek do trawienia trójwymiarowych organoidów prostaty myszy
Uropatogeniczny Escherichia coli szczep UTI89	Szczep WT od prof. dr Dobrindta		przekształcony za pomocą pFPV-mCherry (addgene #20956)