Ten protokół kliniczny został zatwierdzony przez Komisję Etyki Szpitala Ludowego Hengshui (Zatwierdzenie nr 2019-2-013). Wszyscy uczestnicy lub ich prawni opiekunowie wyrazili pisemną świadomą zgodę przed włączeniem do programu. Badanie było zgodne z Deklaracją Helsińską oraz wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi etyki badań na ludziach.
Przygotowanie nanokompozytu srebra-węgla (Ag-C)
Aby zsyntetyzować nanokompozyt Ag-C, precyzyjnie zważono 3,0 g winianu sodu potasu i umieściono w tyglu kwarcowym o pojemności 50 mL w piecu rurowym. Próbkę podgrzewano do 400 °C w tempie 15 °C/min i utrzymuję przez 6 godzin, po czym pozostawiono ją do temperatury pokojowej (~25 °C). Produkt został przeniesiony do szklanej zlewki o pojemności 250 mL i rozproszony w 80 mL wody dejonizowanej (rezystancyjność ≥18 MΩ·cm) za pomocą mieszadła magnetycznego przy 400 obr./min przez 10 minut. Zawiesina była wirowana w 10 000 x g przez 10 minut w 4 °C, a następnie zebrano brązowy supernatant zawierający kwantowe kropki węglowe (CQD). Supernatant został skoncentrowany do 20 mL przy 80 °C podczas mieszania, a następnie dodano 60 mL acetonu i mieszania wirów przez 1 minutę. Po wirowaniu w 9 500 x g przez 20 minut w 4 °C, jasnożółty supernatant był pobierany jako roztwór zapasowy CQD. Aby przygotować odczynnik Tollensa, 1 mL 0,5 M AgNO3 wymieszano z 1,04 mL wody amoniakalnej i 0,65 mL 3 M NaOH, a następnie dodano 17,3 mL wody dejonizowanej przy ciągłym mieszaniu. W trzyszyjkowej kolbie owiniętej folią aluminiową połączono 25 mL roztworu CQD i 75 mL wody dejonizowanej i mieszano z częstotliwością 500 obr./min przez 5 minut. pH zostało dostosowane do około 7,0 przy użyciu skoncentrowanej wody z amoniakiem, po czym dodano 1 ml odczynnika Tollensa. Mieszanka była podgrzewana do 120 °C przez 20 minut w ciemnych warunkach. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej uzyskiwano żółty roztwór Ag-C i przechowywano go w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
UWAGA: Woda NaOH i amoniak są i uwalniają drażniące opary. Radzić sobie ze wszystkimi reakcjami w okapu oparowym chemicznym, nosząc rękawiczki, gogle ochronne i fartuch laboratoryjny. Nie zamykaj szczelnie podgrzewanych pojemników, aby zapobiec gromadzeniu się ciśnienia.
Przygotowanie nanosrebrnych opatrunków antybakteryjnych (NSAD)
Aby przygotować mieszankę rozpuszczalników, 15 mL wody zjonizowanej wymieszano z 200 μL kwasu octowego lodowcowego w szklanej zlewce o pojemności 100 mL. Do tego dodano 0,1 mL przygotowanego roztworu Ag-C (22 mg/L), 0,2 mL glicerol i 60 mg poloksameru, które całkowicie rozpuszczono w temperaturze 50 °C przy magnetycznym mieszaniu. Następnie stopniowo dodawano 0,6 g proszku chitosanu, aby zapobiec zgrudkowaniu, i mieszano przez 30 minut, aż uzyska jednorodność. Następnie dodano 2 mL 1 M NaHCO3 kroplami podczas mieszania, aby wywołać łagodne pianie, a następnie kolejne 10 minut mieszania. Całkowita objętość została dostosowana do 20 mL z wodą dejonizowaną, a roztwór był odgazowywany ultradźwiękowo przez 5 minut. Jednorodny roztwór wlewano do prostokątnej formy (14 cm x 8 cm x 0,5 cm), uszczelniano folią spożywczą i pozostawiano do żelu przez 48-72 godziny w temperaturze pokojowej (20-25 °C). Po żelacji film był usuwany i suszony w piecu z wymuszonym powietrzem w temperaturze 40 °C przez 12-18 godzin, co dało filmy NSAD o grubości około 1 mm. Rejestruj temperaturę otoczenia i wilgotność podczas żelacji, ponieważ wpływają one na jednolitość warstwy i wytrzymałość na rozciąganie. Wyrzuć wszelkie folie zawierające widoczne pęknięcia lub pęcherzyki.
Charakterystyka nanokompozytu Ag-C
Kropla rozcieńczonego roztworu Ag-C została umieszczona na siatce mikroskopii transmisyjnej (TEM) pokrytej węglem i suszona pod światłem podczerwieni przez 10 minut. Próbki zostały sfotografowane z napięciem 100 kV pod kątem TEM. Wielkość cząstek analizowano za pomocą oprogramowania ImageJ, mierząc co najmniej 200 losowo wybranych cząstek, a dane wyrażono jako średnią ± SD.
Ocena aktywności antybakteryjnej
Staphylococcus aureus (ATCC 29213) i Escherichia coli (ATCC 25922) zostały hodowane przez noc w bulionie sojowym tryptonowym (TSB) w temperaturze 37 °C. Zawiesina bakteryjna została dostosowana do gęstości optycznej OD600 = 0,1 (~1 x 107 CFU/mL). Próbki podzielono na trzy grupy: grupy kontrolne poddawane dejonizowanej wodzie, pozytywne grupy kontrolne poddawane amoksycylinie (10 μg/mL) oraz grupy testowe z nanokompozytem Ag-C (równoważna zawartość Ag o 10 μg/mL). Kultury inkubowano w temperaturze 37 °C i wstrząsano z częstotliwością 150 obr./min przez 7 dni. Każdego dnia pobierano 100 μL próbek, które były seryjne rozcieńczane, nakładane na agar TSB i inkubowane przez 24 godziny. Policzono jednostki tworzące kolonie (CFU), a wskaźniki hamowania (%) obliczono jako [(N0− Nt)/N0] x 100. Każdy eksperyment przeprowadzono w trzech egzemplarzach, a wyniki podawano jako średnią ± SD.
UWAGA: Wszystkie hodowle bakteryjne należy obsługiwać w szafce o poziomie bezpieczeństwa biologicznego II. Wszystkie odpady w autoklawie na 20 minut przed utylizacją w 121 °C.
Zachowanie obrzęku NSAD
Kwadratowe próbki NSAD (1 cm x 1 cm) zostały zważone, aby uzyskać masę suchą (W0). Każda próbka była zanurzana w 10 mL soli fizjologicznej w temperaturze 37 °C. Po 1, 6, 12 i 24 godzinach próbki były pobierane, osuszane papierem filtracyjnym i ważone (wt). Współczynnik obrzęku (%) obliczono jako [(Wt − W0)/W0] x 100. Wszystkie pomiary zostały wykonane w trzech egzemplarzach, a wyniki podane jako średnia ± SD.
Montaż i zastosowanie VAC połączone z NSAD
Przygotowany film NSAD został przycięty do rozmiaru rany za pomocą sterylnych nożyczek i nałożony bezpośrednio na dno rany. Pod NSAD włożono dwie sterylne silikonowe rurki drenażowe (grubość ścianki 1 mm, mikropory 0,4-0,5 mm). Cała rana oraz 2-3 cm otaczającej nienaruszonej skóry zostały uszczelnione przezroczystą folią poliuretanową, aby zapewnić szczelność powietrzną. Rury drenażowe były podłączone do ciągłego źródła ujemnego ciśnienia, utrzymywanego między -60 kPa a -80 kPa przez 72 godziny. Pieczęć była codziennie sprawdzana, a zebrany wysięk rejestrowano pod kątem koloru i objętości. Opatrunki wymieniano co 3-5 dni lub wcześniej, jeśli pojawił się przeciek. Terapia VAC została przerwana, gdy tkanka ziarninowa całkowicie pokryła ranę. Potwierdz pełną hemostazę przed zasklepieniem rany. Jeśli wystąpi aktywne krwawienie, tymczasowo obniż ciśnienie ujemne do -40 kPa. Monitoruj dyskomfort pacjenta, nadmierny ból lub awarię urządzenia.
Gospodarka odpadami
Wszystkie pozostałości zawierające srebro i alkaliczne zostały zebrane w oznaczonych pojemnikach na odpady do utylizacji odpadów niebezpiecznych. Roztwory zasadowe były neutralizowane do pH 7 przed wyładowaniem. Odpady biologiczne były sterylizowane przez autoklawowanie i utylizowane zgodnie z przepisami szpitalnej dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.
Pacjenci i projekt badania
Łącznie 300 pacjentów z rozpoznanymi otwartymi złamaniami piszczeli typu I lub II (OTF) zostało zrekrutowanych w Dziale Ortopedii Urazowej Szpitala Ludowego Hengshui w okresie od listopada 2019 do listopada 2022 roku. Pacjenci byli przesiewani według wcześniej określonych kryteriów włączenia i wykluczenia. Kryteria włączenia to: (1) wiek od 18 do 70 lat; (2) potwierdzone złamanie Gustilo typu I lub II na podstawie oceny klinicznej i radiologicznej; (3) brak poważnych uszkodzeń naczyń lub nerwów; oraz (4) możliwość wyrażenia świadomej zgody i przestrzegania obserwacji pooperacyjnej. Kryteria wykluczenia obejmowały: (1) złamania Gustilo typu III; (2) ciężkie choroby współwystępujące, takie jak niekontrolowana cukrzyca, obwodowe choroby naczyń obwodowych, przewlekłe infekcje lub niedobory odporności; (3) patologiczne złamania; oraz (4) zaburzenia ciąży lub krzepnięcia. Losowanie przeprowadzono za pomocą komputerowej sekwencji z losowaniem bloków (rozmiar bloku = 6). Ukrycie alokacji zapewniano za pomocą zapieczętowanych, nieprzezroczystych kopert przygotowanych przez niezależnego statystyka. Pacjenci byli równomiernie podzieleni na trzy grupy (n = 100 każda): Grupa 1 otrzymała zamkniętą redukcję i utrwalenie paznokcia śródrdzeniowego (CRINF) przy konwencjonalnej opiece nad raną; Grupa 2 otrzymała CRINF połączony z zamknięciem wspomaganym próżnią (VAC); a Grupa 3 otrzymała CRINF z nanosrebrnym opatrunkiem antybakteryjnym (NSAD) oraz VAC. Wszystkie zabiegi były wykonywane przez ten sam zespół chirurgiczny, aby zminimalizować stronniczość operatora. Oceniający wyniki byli nieświadomi przydziału leczenia podczas oceny gojenia się ran, infekcji i bólu. Wszyscy pacjenci byli obserwowani przez 9 miesięcy po operacji w celu oceny gojenia złamań i funkcjonalnej rekonwalescencji.
Plan leczenia Gustilo typu I i II OTF
Pacjenci poddawani byli znieczuleniu (ogólnemu, kręgosłupowemu lub miejscowemu) w zależności od stopnia ciężkości urazu i stanu medycznego. Po wstępnym oczyszczaniu rany zostały dokładnie przepłukane sterylną solą fizjologiczną i nadtlenkiem wodoru; odwijana tkanka była przycięta, a brzegi tkanek miękkich tymczasowo zszywane w razie potrzeby. Stabilizację złamania osiągano poprzez zamkniętą redukcję i utrwalenie paznokcia śródrdzeniowego po standardowych procedurach ortopedycznych17. Dla Grupy 3 wycięto sterylną folię NSAD dopasowaną do wymiarów rany i nałożono na dno rany; Pod opatrunkiem umieszczono dwa silikonowe drenały. Półprzepuszczalna folia poliuretanowa uszczelniała ranę oraz 2-3 cm otaczającej nienaruszonej skóry. Szczelność i hemostaza zostały potwierdzone przed ssaniem; Przewody szpilkowe (jeśli istniały) były przykryte sterylną gazą. Ciągłe podciśnienie było stosowane w temperaturze od -60 do -80 kPa i dostosowywane do rozmiaru i głębokości rany, a opatrunki wymieniano co 3-5 dni lub wcześniej, jeśli wystąpił wyciek lub nasycenie. W grupach 1 i 2 rany były przykrywane sterylną gazą z petrolatu i zmieniano co 48-72 godziny. Opieka pooperacyjna obejmowała profilaktyczne antybiotyki o szerokim spektrum przez 3-5 dni (cefalosporyny lub fluorochinolony), beztlenowe stosowanie metronidazoluw razie potrzeby, terapię przeciwzapalną i przeciwbólową, kontrolę obrzęków, środki wspomagające krążenie oraz wsparcie żywieniowe (w tym suplementację białkiem). Pacjenci z zajęciem neuronaczyniowym otrzymywali środki neurotroficzne oraz przeciwobrzękniowe/przeciwskurczowe, gdy było to stosowne. Podczas zaplanowanych wizyt pooperacyjnych w celu monitorowania infekcji przeprowadzono monitorowanie laboratoryjne (pełna morfologiza, tempo sedymentacji erytrocytów, białko C-reaktywne). Rehabilitacja rozpoczęła się od skurczów izometrycznych i delikatnego ruchu stawów od trzeciego dnia, a po ~1 tygodniu przeszła do aktywnego zakresu ruchu, jeśli było tolerowane. Śledztwo radiograficzne uzyskano po około 1 miesiącu, 3 miesiącach, 6 i 9 miesiącach; Stopniowe obciążanie rozpoczęło się, gdy na zdjęciu rentgenowskim pojawiły się widoczne mosty odciski i ciągłość z korą piszczelową i dopuszczeniem bólu klinicznego.
Indeksy obserwacji
Główne miary wyników obejmowały czas gojenia ran, czas gojenja złamań, tempo gojenia oraz tempo gojenia złamań. Wyniki wtórne obejmowały częstość występowania powikłań pooperacyjnych (infekcja powierzchni, głęboka infekcja, opóźnione zrowienie, zatorowość tłuszczowa, infekcja przewodu igłowego oraz zakażone niezniesienie), długość pobytu w szpitalu, całkowite koszty leczenia oraz intensywność bólu pooperacyjnego. Intensywność bólu oceniano za pomocą Skali Oceny Numerycznej (NRS) od 0 (brak bólu) do 10 (najgorszy możliwy ból). Gojenje ran definiowano jako całkowitą epitelizację bez wysięku, natomiast gojenie złamań potwierdzono radiologicznie poprzez pomostowanie mozowala przez co najmniej trzy kory. Oceny kontrolne przeprowadzano po 1 miesiącu, 3 miesiącach, 6 i 9 miesiącach po operacji, w tym ocenę kliniczną i radiografię.
Analiza statystyczna
Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu wersji SPSS 20.0. Ciągłe zmienne zostały przebadane pod kątem normalności i wyrażone jako średnia ± odchylenia standardowego (SD). Różnice między trzema grupami analizowano za pomocą jednokierunkowej metody ANOVA, a następnie testu post-hoc Tukeya dla wielu porównań. Dane o nienormalnym rozkładzie analizowano za pomocą testu Kruskala-Wallisa. Zmienne kategoryczne wyrażano jako liczby i procenty i analizowano za pomocą testu chi-kwadrat (χ²) lub testu dokładnego Fishera, gdy było to stosowne. 95% przedziały ufności (CI) zostały obliczone dla kluczowych parametrów. Istotność statystyczna została ustalona na p < 0,05. Wszystkie analizy przeprowadził niezależny biostatystyk nieświadomy przydziału grup.