Standaryzowana izolacja i cytokinowe przygotowanie komórek mezenchymalnych pochodzących ze szpiku kostnego myszy w celu wzmocnionej immunomodulacji

Podsumowanie

Tutaj demonstrujemy protokół izolowania komórek mezenchymalnych pochodzących ze szpiku kostnego myszy wraz z metodą cytokinowego primingu, która wzmacnia immunosupresyjne działanie BMSC na komórki odpornościowe.

Streszczenie

Komórki mezenchymalne stromalne (MSC) posiadają silne funkcje regeneracyjne i immunomodulacyjne. Te właściwości sprawiają, że MSC są silnymi lekami komórkowymi do leczenia wielu zaburzeń odpornościowych. Szpik kostny jest głównym i najczęściej wykorzystywanym źródłem MSC. Przedkliniczne badania mechanistyczne z wykorzystaniem modeli mysich są kluczowe dla zdobycia wiedzy o optymalnych strategiach podawania leków dla BMSC w badaniach klinicznych na ludziach. Dlatego standaryzacja procesu produkcji myszych MSC jest również kluczowa dla uzyskania lepszych efektów terapeutycznych. Głównym celem tego protokołu jest pokazanie, jak kontrolowane przyjmowanie interferon-gamma (IFN-γ) wzmacnia wewnętrzne właściwości immunosupresyjne BMSC. Opisujemy generowanie podłoża warunkowanego (CM) z nieleczonych lub z IFN-γ-licencjonowanych BMSC oraz oceniamy ich aktywność biologiczną za pomocą podstawowych makrofagów otrzewnowych. Dzięki ELISA i profilowaniu cytometrycznemu przepływowemu protokół szczegółowo opisuje, jak sekretom pochodzący z BMSC — szczególnie gdy jest przygotowany IFN-γ — napędza polaryzację makrofagów przeciwzapalną, charakteryzującą się zwiększoną produkcją IL-10 i markerami powierzchniowymi powiązanymi z M2. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten ustanawia jednolite ramy do produkcji funkcjonalnie spójnych BMSC u myszy oraz oceny ich mocy immunomodulacyjnej. Poprzez zmniejszenie zmienności technicznej oraz zapewnienie przejrzystości wizualnej i proceduralnej, wspiera poprawę powtarzalności w przedklinicznych badaniach MSC oraz ułatwia optymalizację strategii wdrażania MSC w badaniach translacyjnych.

Wprowadzenie

Komórki mezenchymalne pochodzące ze szpiku kostnego (BMSC) mają szerokie zastosowanie zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych. Ich niska immunogenność, łatwa dostępność oraz zdolność do różnicowania wieloliniowych sprawiają, że BMSC są obiecującymi kandydatami do zastosowania w warunkach klinicznych jako farmaceutyki komórkowe ^1,2,3. Ich właściwości immunosupresyjne i regeneracyjne zostały szeroko wykorzystane w badaniach klinicznych w leczeniu zaburzeń zapalnych, takich jak choroba przeszczepu kontra-gospodarza (GVHD)⁴, sepsa⁵ oraz zapalna choroba jelit (IBD)⁶. Nisza stromalna szpiku kostnego składa się z heterogenicznej populacji komórek stromalnych. Niemniej jednak wszystkie MSC spełniają kryteria określone przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej (ISCT), które obejmują: przyleganie plastyczne, ekspresję receptorów powierzchniowych – CD73, CD90 i CD105 u ludzi oraz CD29, CD44 i CD90 u myszy – bez ekspresji markerów hematopoetycznych lub śródbłonkowych – CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, CD79a, HLA-DR oraz zdolność do adipogeniczności, chondrogen, czyli różnicowanie osteogenne⁷.

BMSC pozostają funkcjonalne dzięki uwalnianiu czynników parakrynologicznych, zwanych łącznie sekrobomem, który obejmuje cytokiny, chemokiny, czynniki wzrostu, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe oraz różne inne rozpuszczalne i kontaktowe cząsteczki ^8,9. Sekretom MSC moduluje niszę poprzez interakcję z elementami wrodzonego układu odpornościowego w sposób dwukierunkowy¹⁰. Czynniki uwalniane podczas interakcji MSC z makrofagami mogą przesunąć makrofagi w kierunku fenotypu prozapalnego lub przeciwzapalnego^11,12. Z kolei stan funkcjonalny MSC jest również regulowany przez lokalne komórki odpornościowe – szczególnie makrofagi – poprzez mechanizmy sprzężenia zwrotnego¹¹. Ten przenikliwy kontakt MSC i makrofagów jest niezbędny dla funkcji immunosupresyjnej MSC. Adoptowane MSC redukują stan zapalny tkanek tylko wtedy, gdy obecne są makrofagi, co zaobserwowano w modelach myszy z zapaleniem jelita grubego. Dla porównania, interakcja MSC z limfocytami B lub T bez makrofagów jest niewystarczająca, by wywrzeć swoje efekty terapeutyczne¹³.

Pierwsze badanie kliniczne fazy III z użyciem allogennych BMSC zostało ukończone przez Osiris Therapeutics w Stanach Zjednoczonych w leczeniu sterydooporycznego GVHD (NCT00366145)¹. Od tego czasu przeprowadzono liczne badania przedkliniczne i kliniczne, choć sukces badań klinicznych nie spełnił oczekiwań opartych na wynikach przedklinicznych. Aby poprawić skuteczność badań klinicznych opartych na MSC, niepokończona jest optymalizacja strategii wdrożenia leków. Zrozumienie optymalnej drogi podawania, dawki komórek terapeutycznych oraz stanu fizjologicznego komórek w miejscu opieki jest kluczowe. Na przykład w modelu in vivo z myszą jelita grubego badania wykazały, że kriokonserwowane MSC lub podawanie dożylne są suboptymalnymi metodami podawania¹⁴.

Różne podejścia, takie jak prelicencjonowanie cytokin, modyfikacja genetyczna czy niedotleniałe prekondycjonowanie, były szeroko badane w celu poprawy trwałości MSC in vivo oraz jej użyteczności terapeutycznej¹⁵. W modelu niedokrwienia kończyn tylnych myszy, prekondycjonowanie hipoksji (2%_O2) poprawiło zdolność proliferacji i migracji MSC poprzez zwiększoną ekspresję białka szoku cieplnego, 78-kD białka regulowanego glukozą (GRP78)¹⁶. Przedlicencjonowanie IL-1β (Interleukina-1 beta) zwiększa zdolność MSC do stosowania neutrofilów, monocytów, limfocytów i eozynofilów¹⁷. Po podaniu in vivo MSC są wystawione na aktywowane komórki T i NK pochodzące z IFNγ, które zwiększają produkcję indoleaminy 2,3-dioksydazy (IDO) przez MSCs¹⁸. IDO jest niezbędnym składnikiem sekretomu MSC, który zmniejsza tempo proliferacji limfocytów T. Co ciekawe, zdolność immunosupresyjną MSC jest zmniejszona podczas kohodowli z limfocytami T pochodzącymi z myszy IFNγ-/-¹⁹. Badania wykazały, że wcześniejsze licencjonowanie IFN-γ zmniejsza tempo apoptozy pośredniczonej przez limfocyty T w krioprezerwacji MSC^13,20. Primowanie IFNγ poprawia efekty terapeutyczne BMSC¹³. Wszystkie te dowody łącznie wskazują na niezbędną rolę IFNγ w produkcji silniejszych immunosupresyjnych MSC.

Aby określić najskuteczniejszą metodę dostarczania MSC, szeroko stosowano modele zwierzęce ze względu na ich etyczną dostępność. Aby zmniejszyć zmienność wyników przedklinicznych, kluczowe jest opracowanie zoptymalizowanej metody procesu produkcji MSC, która zapewni wysoką wydajność, żywotność komórek i spójność w czasie²¹. Przechodzenie MSC jest ważną zmienną, która może generować różne efekty terapeutyczne. Podczas hodowli in vitro passage może regulować charakterystykę i moc MSC, a po określonej liczbie przejść komórki stają się starzejące²². Dlatego w każdym badaniu klinicznym lub przedklinicznym kluczowe jest stosowanie numeru przejścia MSC. Podobnie spójność z konkretnym protokołem izolacji MSC jest również kluczowym czynnikiem w osiąganiu powtarzalności w wyniku użytkowania MSC. Wśród wielu podejść, popularne metody izolacji MSC są sortowanie komórek oparte na przeciwciałach²³, metoda selekcji ujemnej²⁴, trawienie^{enzymatyczne 25} . Jednak zastosowanie tych metod zależy od źródła, ponieważ niewłaściwe stosowanie zmniejsza plony, moc i zdolność różnicowania trójlinii.

Przedstawiamy tutaj ustandaryzowany protokół izolacji i charakteryzacji BMSC, kładąc nacisk na preferowany numer przejścia, technikę krioprezerwacji oraz zbieranie mediów warunkowych pochodzących z BMSC. Przedstawiamy również protokół do stymulacji MSC z IFN-γ oraz wreszcie pokazujemy porównawcze badanie różnicowego reagowania makrofagów otrzewnych na prawidłowe lub IFN-γ wcześniej licencjonowane BMSC.

Protokół

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone za zgodą i zgodnie z wytycznymi komisji etycznej ds. zwierząt ICMR-National Institute for Research in Reproductive and Child Health (IAEC Project No.09/23) oraz Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych Uniwersytetu Wisconsin-Madison. W niniejszym badaniu użyto samic myszy C57Bl/6J w wieku 6-8 tygodni, hodowanych i trzymanych w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF).

UWAGA: Stosowaliśmy się do protokołów bezpieczeństwa biologicznego określonych przez Komitet ds. Bezpieczeństwa Instytucjonalnego (IBSC) podczas pracy nad badaniami in vivo lub in vitro . Krótko mówiąc, podczas badań na zwierzętach zachowaliśmy delikatne traktowanie, aby zmniejszyć stres i ryzyko urazów. Używaliśmy odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, takiego jak okulary ochronne, rękawiczki, fartuch laboratoryjny, maska oraz jednorazowa czapka bouffant. W przypadku odczynników chemicznych dla zagrożeń biologicznych, takich jak DMSO, użyliśmy szafki zabezpieczeń biologicznych do obsługi tych substancji. Użyliśmy konkretnego pojemnika na odpady do wyrzucania bioniebezpiecznych odczynników lub ostrych przedmiotów.

1. Izolacja komórek stromalnych szpiku kostnego myszy mezenchymalnych

UWAGA: Po zebraniu kończyn tylnych pozostałe etapy należy wykonać w laminarnym przepływie do hodowli tkanek oraz sterylnych technikach aseptycznych²⁶.

1. Uśpienie myszy przez zwichnięcie szyjki, a następnie dokładne przepłukanie myszy 70% etanolem. Używając kleszczy okulistycznych, delikatnie nagniot skórę brzucha między dwoma stawami biodrowymi myszy i ostrożnie przetnij skórę nożyczkami.
2. Oddziel skórę, delikatnie ciągnąc w stronę stopy. Przyciąć stawy biodrowe i kostkę, aby uwolnić obie tylne kończyny.
3. Szybko przenieś tylne kończyny do lodowatego DMEM, uzupełnionego 1x penicyliną/streptomycyną oraz 2% FBS, aby uniknąć uszkodzenia tkanek do czasu dalszego procesu sekcji.
4. Weź każdą tylną kończynę do szalki Petriego zawierającej lodowate medium. Ostrożnie odklej mięśnie i tkankę łączną od kości udowej i piszczeli, delikatnie drapiąc diafisis kości. Przełóż oczyszczoną kość do nowej szalki Petriego zawierającej lodowato zimne medium.
5. Odłącz kość udową i piszczel, a następnie wykonaj cięcie na końcach kości piszczelowej i kości udowej tuż poniżej końca jamy szpikowej. Maksymalnie chroń jamę szpikową podczas zabiegu rozwarstwiania kości udowej i piszczeliowej.
6. Weź 1 mL sterylną strzykawkę z igłą 21 g i pobierz medium z płytki Petriego. Sterylnymi kleszczemi trzymaj wyciętą kość udową i delikatnie wprowadzaj igłę do jamy szpikowej. Przepłucz jamę szpiku, aby uzyskać szpik. Powtarzaj ten krok, aż kość stanie się biała. Przepłucz piszczelę w ten sam sposób.
7. Delikatnie pipetuj i wsuwaj, aby rozproszyć grudki komórek w szalce Petriego. Używając siatki filtracyjnej o średnicy 70 mm, przefiltruj zawiesinę komórkową, aby usunąć wszelkie cząstki kości. Zbierz filtrat i wiruj w 230 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
8. Usuń nadmiar i ponownie zawiesij granulek z kompletnym podłożem (DMEM, 10% FBS, 5% L-glutamina, penicylina i Streptomycyna). Zmierz wydajność i żywotność komórek za pomocą wykluczenia niebieskiego Trypana oraz liczenia na hemocytometrze.
9. Rozsiewaj komórki w kolbie o powierzchni 75 cm² poddany hodowli tkankowej o gęstości 5000 komórek/^{cm 2} w kompletnym medium DMEM¹³. Usuń nieprzylegające komórki hematopoetyczne po 48 godzinach hodowli poprzez zmianę podłoża. Wymień media na świeże co 3-4 dni.
   UWAGA: Używaj kolby do hodowli komórek zamiast miski, aby uniknąć zanieczyszczenia. Nie wyjmuj często kolby z inkubatora, aby sprawdzić komórki, ponieważ zaburza to wzrost komórek.
10. Aby odłączyć komórki przylegające, umyj je 1 razy PBS, dodaj 0,25% trypsyny-EDTA, trzymaj komórki w trypsinie przez 5 minut. Pomaga to odłączyć komórki od studni.
11. Dodaj kompletne medium, ponownie zawiesni i zachwyć, w dawce 230 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usuń nadmiar. Dodaj kompletne medium DMEM do pelletu, ponownie zawiesz i ponownie zasiewasz komórki z gęstością 5 000 komórek/^cm2.
12. Komórki przepuszczaj co tydzień, zmieniając podłoże co 3-4 dni. Po trzecim fragmencie wykonaj badanie hodowli MSC metodą cytometryczną przepływową, jak opisano w kroku 6. Używaj komórek przejścia 3-5 do każdego eksperymentu.
    UWAGA: Aby kriokonserwować komórki do przyszłego użytku eksperymentalnego, wiruj komórki w pożądanej objętości, ponownie zawiesij komórki w ośrodku zamrażającym, przechowuj 1 x 10^{6 komórek} w 1 mL mediów zamrażających w każdym krioviale w nocy w -80 °C, a następnie przelej komórki do azotu do długotrwałego użytku.
    Skład mediów zamrażających: 70% DMEM, 20% FBS, 10% DMSO.

2. Przygotowanie podłoża kondycjonowanego z hodowanych MSC

1. Rozsiewaj komórki z gęstością 5000 komórek/^{cm 2} na 6 dołków. Hodować MSC do 80% konfluentu.
2. Zbieraj podłoże kondycjonowane z płyty hodowli komórkowej i wirówki w ilości 230 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, filtruj i używaj do zabiegu.

3. Przygotowanie podłoża warunkowanego zagruntowanym IFNγ z hodowanych MSC

1. Rozsiewaj komórki na płytce 6-dołkowej o gęstości 5000 komórek/^cm2. Lecz komórki 25 ng/mL IFNγ przez 48 godzin. Przeprowadz badanie zależne od dawki, aby uzyskać optymalny efekt IFNγ na MSC. Do tego eksperymentu wybierz zakres stężeń IFNγ: 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL, aby uzyskać licencję na MSC. Stężenia 5 i 10 ng/mL były istotnie mniej skuteczne w polaryzacji makrofagów, a 25 ng/mL zostało zidentyfikowane jako optymalne stężenie (Rysunek Uzupełniający 1).
2. Po przelaniu nośnika zawierającego IFN-γ, przepłucz studnię 2 razy PBS, aby zapewnić całkowite usunięcie IFN-γ. Wszelkie pozostałości IFN-γ mogą zakłócać wyniki badania.
3. Inkubuj komórki przez kolejne 24 godziny w normalnym medium DMEM w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach pobierz przygotowane media zgodnie z krokiem 2.

4. Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących z jamy otrzewnej

1. Wstrzyknij 5 ml lodowatego PBS (z 3% FBS) do jamy otrzewnej myszy, a następnie delikatnie masuj jamkę brzuszną.
2. Odzyskaj roztwór PBS za pomocą sterylnej strzykawki. Zbieraj w probówce 10 mL. Wiruj roztwór w dawce 300 x g przez 5 minut.
3. Usuń supernatant. Rozpuszcz granulkę w pełnym nośniku RPMI (RPMI, 10% FBS, 1x penicylina i streptomycyna). Nakładaj komórki na 5000 komórek/^{cm 2}.
4. Usuń nieprzylegające komórki po 24 godzinach i hoduj do połączenia się. Używaj komórek do dalszych procedur eksperymentalnych, jeśli będzie to konieczne.

5. Test immunosorbentny związany z enzymami

1. Aby wykryć IL-10 pochodzący z makrofagów leczonych BMSC-CM, należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.
   1. Traktuj makrofagi BMSC-CM przez 24 godziny i pobieraj supernatant następnego dnia.
   2. Zmierz ilość IL-10 za pomocą zestawu ELISA IL-10 zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Aby wykrywać CCL2 pochodzący z BMSC lub IFNγ-treat, należy stosować zestaw CCL2 ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.

6. Analiza cytometrii przepływowej dla MSC i fenotypowanie makrofagów

1. Zasiać komórki na płytce 6-dołkowej i zdobyć zbieg skóry. Przemyj 1 raz z PBS (1 mL), a następnie trypsynizację. Dodaj trypsynę w stężeniu 0,25% i inkubuj przez 5 minut w trypsinie, aby całkowicie unieść komórki z płyty.
2. Dodaj podnośnik, aby dezaktywować działanie trypsyny. Zbierz komórki do rurki polistyrenowej o pojemności 10 mL. Wirować w dawce 300 x g przez 5 minut w 4 °C dla makrofagów oraz 230 x g przez 5 minut w 4 °C dla BMSC.
3. Usuń supernatant i ponownie zawiesij komórki w 2 mL buforu barwiącego (lodowato zimny PBS z 2% FBS i 0,05% azydu). Wiruj z 230 x g przez 7 minut. Przelewaj i rozbijaj granulki. Dodaj 1 mL barwnika Ghost Red 780 viability i 50 mL buforu FACS, ponownie zawiesij i umieść w tubie przepływowej. Bejcuj w ciemności przez 30 minut.
4. Po 30 minutach umyj komórki 1 ml buforu barwnego. Przelewaj i rozbijaj granulki. Dodaj pożądaną objętość przeciwciał lub kontrolę izotypu. Inkubuj przez kolejne 30 minut w ciemności. Umyj komórki buforem barwcowym, przelewaj i ponownie zawiesij w 400 mL buforu barwnika. Probówka jest gotowa do pozyskania.
5. Aby przygotować się do zwalczania barwienia żywych trupów, po trypsynizacji i wirowaniu rozpuszcz granulat w 2 mL buforu barwienia. Wyjmij 1 ml z innej rurki mikrowirówki i dodaj 10 ml DMSO, aby zniszczyć komórki. Wiruj i inkubuj przez 10 minut. Teraz wymieszaj to z pozostałym 1 ml roztworu zawierającego komórkę w rurce przepływowej.
6. Dodaj 1 ml bufora do bejcowania i wiruj w 230 x g przez 7 minut. Przelewaj i rozbijaj granulki. Dodaj 1 mL barwnika Ghost Red 780 viability i 50 mL buforu FACS, ponownie zawiesij i umieść w tubie przepływowej. Bejcuj w ciemności przez 30 minut. Po 30 minutach umyj komórki 1 ml buforu barwnego. Przelewaj i rozbijaj granulki. Ponownie zawiesz go w 400 mL bufora barwnego. Próbka z barwami żywych trupów jest gotowa do pozyskania.
   UWAGA: W przypadku barwienia makrofagów myszy przed standardowym protokołem barwienia należy dodać dodatkowy etap barwienia. Aby uniknąć nieścisłości w danych przepływu, blokowanie receptora FC jest kluczowym krokiem, który zapobiega wiązaniu niespecyficznych przeciwciał z receptorami Fc na komórkach. Aby zablokować receptor Fc, należy dodać 1 mL odczynnika blokującego Fc (oczyszczone przeciwciało przeciwmysie CD16/CD32) do zawiesiny komórkowej i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Wykonaj pozostałe etapy barwienia przeciwciał przepływowych bez zmywania odczynnika blokującego Fc.
7. Aby analizować dane przepływu, początkowo należy wybierać pojedyncze komórki na podstawie parametrów rozpraszania w kierunku przód i rozpraszania bocznego. Ten krok jest kluczowy, aby usunąć zanieczyszczenia i agregaty komórkowe. Następnie pojedyncze komórki zostaną zamknięte na podstawie barwienia żywych trupów. Przeprowadź dalszą analizę na podstawie populacji żywych komórek (Rysunek uzupełniający 2).

Wyniki

Ogólny schemat eksperymentalny opisano na Rysunku 1. Szpik kostny myszy został pobrany zarówno z kości udowej, jak i piszczelowej, nasiony, przejściowany i scharakteryzowany cytometrią przepływową (Rysunek 1A). Zebrano nośniki warunkowe BMSC (BMSC-CM) z lub bez licencjonowania IFNγ, a kilka fiolek BMSC-CM przechowywano w temperaturze -80 °C na potrzeby przyszłych eksperymentów (Rysunek 1B).

Komórki pochodzące ze szpiku kostnego zostały zliczone hemocytometrem (rysunek 2A) i zasiane z gęstością 5000 komórek/^cm2 w kompletnym ośrodku DMEM. Po 48 godzinach zmieniano pierwsze medium, a następnie co 3-4 dni, aż do pełnego połączenia się. Przepuszczaliśmy komórki, gdy osiągnęły 80% zbieżności (rysunek 2B). W fragmencie 4 scharakteryzowaliśmy komórki na podstawie ekspresji markerów specyficznych dla MSC. Komórki były pozytywne na CD44, CD29 i CD90 oraz negatywne na CD45, CD11b i CD34 (rysunek 2C). BMSC mogą różnic się na linie adipogeniczne, osteogeniczne i chondrogeniczne. 14,27,28,29. To utrzymuje wytyczne Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej.

Aby zrozumieć immunosupresyjne działanie MSCs-CM, leczyliśmy makrofagi pochodzące z jamy otrzewnej (PMφ) i stosowaliśmy je BMSC-CM (Rysunek 3A). Przeprowadziliśmy analizę cytometrii przepływowej makrofagów poddanych BMSC-CM (rysunek 3B,C). Makrofagi przystosowane do hodowli w jamie otrzewnej były barwione markerami powierzchniowymi specyficznymi dla M1 i M2. Zapobiegaliśmy wiązaniu przeciwciał niespecyficznych, inkubując makrofagi z oczyszczonym antymysim CD32/CD16 (blok Fc Myszy przed dodaniem przeciwciał barwiących), zanim faktycznie zabarwiliśmy markery komórkowe. Badana była ekspresja markerów specyficznych dla M1, CD86 i iNOS, oraz markerów specyficznych dla M2, CD206 i CD163. Komórki początkowo były glatowane na podstawie markera hematopoetycznego CD45.2 (dla C57BL6). IL-10 jest cytokiną charakterystyczną fenotypu M2. IL-10 uwalniany przez makrofagi MSCs-CM został zmierzony w badaniu ELISA (rysunek 3D). Ponieważ LPS/IFNg indukuje polaryzację M1³⁰, leczenie to służyło jako kontrola ujemna.

CCL2 jest jedną z cytokin charakterystycznych zidentyfikowanych w sekretomie MSC, które wywołują polaryzację makrofagów¹³. CCL2 wydany przez MSC został wykryty przez ELISA (Rysunek 3E). Aby potwierdzić rolę CCL2 w polaryzacji makrofagów, wcześniej objęliśmy makrofagi inhibitorem CCR2, a następnie zastosowaliśmy zabieg MSC-CM (rysunek 3F), a polaryzację makrofagów ponownie wykryto w badaniu IL-10 ELISA (rysunek 3F).

Nasze wyniki wyraźnie pokazują, że sekretom MSC może indukować polaryzację makrofagów przeciwzapalną, co potwierdza zwiększona produkcja IL-10 w makrofagach pochodzących z jelitowych po leczeniu podłożem warunkowanym (Rysunek 3).

Rysunek 1: Schemat przepływu badania. (A) Myszy C57BL/6 zostały uśpione. Szpik był usuwany zarówno z kości udowej, jak i piszczeli, odwirowany i hodowany przez tydzień, z wymianą mediów co 3 dni. MSC były przeszczepiane, a przy pasucie 4 charakteryzowane przez cytometrię przepływową i badanie adipogenezy. (B) MSC z przejścia 4 zostały zasiane w płytkach 6-dołkowe, w jednym zestawie z dodanym IFNγ w stężeniu 25 ng/mL, a w innym pozostawiono go bez obróbki. Po 48 godzinach wymień go na zwykłe, świeże, kompletne nośniki DMEM. Po 24 godzinach pobierz medium z płyty, wirówki i filtra. Przechowuj podłoże kondycyjne w temperaturze -80 °C na przyszłość. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Charakterystyka fenotypowa. (A) Komórki pochodzące ze szpiku kostnego były liczone hemocytometrem przed zasiewem. (B) Komórki mogły rosnąć do 80% zbieżności przed każdym przejściem. (C) Komórki przejścia 4 zostały scharakteryzowane analizą cytometrią przepływową z markerami specyficznymi dla myszy MSC. Pasek skali oznacza 100 mM. Rysunek 2C został zmodyfikowany z¹⁴. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Analiza sekretomu BM-MSC. (A) Schemat eksperymentów. (B) Reprezentatywny wykres cytometryczny dla analizy przepływowej PMφ leczonej MSC-CM. Komórki pochodzenia otrzewnego zostały ograniczone na podstawie markerów hematopoetycznych populacji CD45.2 dodatniej. Wybrana populacja została dodatkowo barwiona markerami specyficznymi dla M1: CD86 lub iNOS, markerami specyficznymi dla M2 (CD206) lub CD163, a także podwójnym barwieniem CD11b w każdym przypadku. (C) Zmierzono procent populacji komórek M1 lub M2. Populacja komórek leczona LPS/IFNγ była kontrolą ujemną. (D) ELISA została przeprowadzona w celu ilościowego określenia IL-10 uwalnianego przez PMφ leczone przez MSC-CM. ELISA została przeprowadzona w celu ilościowego określenia (E) CCL2 wydanego przez MSC-CM, (F) IL-10 wydanego przez PMφ. Jak wskazano na rysunku, jeden zestaw eksperymentów przeprowadzono w obecności antagonisty CCR2. Słupki błędu reprezentują średnią ± SEM. Dane reprezentują 3 niezależne eksperymenty z 3 próbkami MSC na grupę. Test t ucznia został wykorzystany do analizy statystycznej wszystkich eksperymentów. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001. Rysunek 3B-F został zmodyfikowany z¹³. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek uzupełniający 1: BMSC były wcześniej licencjonowane na 0, 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL IFNg. Makrofagi były leczone IFNγ z wcześniej licencjonowanymi MSC-CM. ELISA przeprowadzono w celu ilościowego określenia IL-10 uwalnianego przez PMφ leczone MSC-CM. Słupki błędu reprezentują średnią ± SEM. Dane reprezentują 3 niezależne eksperymenty z 3 próbkami MSC na grupę. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Ilustracja uzupełniająca 2: (A-C) Pojedyncze komórki zostały wybrane na podstawie parametrów rozproszenia w kierunku przodu i rozpraszania bocznego. (D) Pojedyncze komórki zostały zamknięte na podstawie barwienia żywych i martwych. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Izolacja komórek stromalnych pochodzących ze szpiku kostnego myszy jest kluczową techniką zrozumienia wewnętrznych właściwości immunosupresyjnych i regeneracyjnych MSC w modelach zwierzęcych in vivo . Chociaż metoda wydaje się prosta i łatwa do zastosowania, należy wykonać kilka kroków z precyzją, aby zapobiec zakażeniu bakteryjnym i zapewnić optymalną wydajność komórek. Każdy etap zabiegu powinien być przeprowadzany aseptycznie w ultraczystym środowisku.

Aby uniknąć niskiej wydajności komórek, wybieraj myszy w wieku 6-8 tygodni. Podczas cięcia końców kości udowej i piszczelowej jamka szpiku musi być jak najbardziej chroniona, a proces płukania powinien być twardy, ale delikatny, aby zapewnić całkowite usunięcie szpiku. Izolowane komórki powinny być inkubowane przy odpowiednim stężeniu CO₂ i w warunkach nawilżonych. Podczas zmian ośrodka niezbędne jest delikatne przemycie komórek solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) przed wymianą nośnika, aby wyeliminować zanieczyszczające komórki hematopoetyczne. Aby uniknąć zanieczyszczenia komórek hematopoetycznych, w momencie ponownego przepuszczania trypsynizacja nie powinna przekraczać 5 minut. We wczesnym okresie zmiana podłoża nie powinna być zbyt szybka, ponieważ częsta zmiana może powodować skażenie bakteryjne.

Przy każdym przejściu konieczne jest kriokonserwowanie komórek w kilku partiach, aby zachować spójność i dostępność. Dla primowania IFN-γ należy przeprowadzić eksperyment zależny od dawki, aby określić najskuteczniejsze warunki przed licencją dla podłoża warunkowanego przez MSC. W naszych eksperymentach testowaliśmy zakres stężeń IFNγ, tj. 5, 10, 25, 50, 100 ng/mL, aby uzyskać wcześniejszą licencję na MSC. Następnie zidentyfikowano 25 ng/mL jako optymalne stężenie.

Aby zachować integralność danych, komórki z określonej liczby przejścia powinny być konsekwentnie stosowane we wszystkich testach eksperymentalnych. Do charakterystyki przepływowej cytometrycznej MSC należy stosować komórki z przepustu 3 lub wyższego, aby zapewnić niezawodne wykrywanie ekspresji receptorów powierzchniowych. Rozróżnianie żywych i martwych komórek podczas barwienia cytometrią przepływową jest kluczowe, ponieważ zmniejsza prawdopodobieństwo fałszywie negatywnych wyników.

Wyniki stanowią kluczowy mechanizm, dzięki któremu egzogennie podawane BMSC łagodzą stan zapalny jelit podczas zapalenia jelita grubego. Primowanie IFN-γ wzmacnia wpływ mediów warunkowanych przez MSC na polaryzację makrofagów. CCL2 uwalniany z BMSC to krytyczna chemokina działająca na makrofagi, indukując polaryzację M2. Nasze wcześniejsze wyniki wykazały, że chemokiny CCL2 i CXCL12 współpracują z makrofagami, promując ich polaryzację. To zdarzenie jest niezbędne do propagowania sygnalizacji przeciwzapalnej poprzez kolejną modulację fenotypów limfocytów T i limfocytów B¹³.

W naszym badaniu zastosowaliśmy prosty protokół izolacji BMSC, oparty na właściwościach plastycznych adherentów MSC. Sortowanie cytometrią przepływową lub immunomagnetyczne może być stosowane do izolacji BMSC na podstawie markerów powierzchniowych specyficznych dla MSC. Jednak w obu tych metodach istnieje ryzyko utraty wielu komórek podczas przygotowywania próbki. Ponieważ szpik kostny myszy zawiera bardzo niewielką liczbę MSC (szacuje się, że stanowi około 0,001% do 0,08% komórek szpiku kostnego), preferowaliśmy standardową metodę izolacji opartej na właściwościach plastiku. Jednak ta metoda ma kilka wad. Głównym ryzykiem jest zanieczyszczenie komórek hematopoietycznych, które może zmniejszyć zdolność terapeutyczną MSC. Dlatego identyfikacja konkretnego numeru przejścia jest kluczowa, gdy znaczna populacja komórek wyraża receptory powierzchniowe specyficzne dla MSC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Okap hodowli komórkowej z pionowym przepływem laminarnym, wyposażony w światło UV i nbsp;
Sterylne nożyczki chirurgiczne
25/75 cm2 kolbka
Strzykawki 5/10 mL z igłami 27G
Naczynia z 6-dołkami kulturowymi
Accutase	Corning	#AT104
Anit-Mouse F4/80 APC	Biolegenda	#123116
Anti-Mouse CD 11b PE	BD PharMingen	#557397
Anti-Mouse CD 45.2 APC	BD PharMingen	#558702
Anti-Mouse CD163 Percp eFluor710	eBioscience	#46-1631-80
Anti-Mouse CD206 PE	Biolegenda	#141706
Anty-Myszy CD86 FITC	BD PharMingen	#553691
Anti-Mouse iNOS PE-Cy7	eBioscience	#25-5920-80
Zestaw CCL2 ELISA	Invitrogen	#554722
Antagonista CCR2 (RS 102895)	Sigma	#R1903
Wirówka
DPBS	Corning	#21-031-CV
Zmodyfikowany medium orła Dulbecco (DMEM)	Corning	# 10-013-CV
Surowica bydła płodowa	Sigma	#F8067
Siatka filtra (70 mm)
Barwnik Ghost Red 780 viability	Bioscience tonbo	#13-0865-T100
Zestaw IL-10 ELISA	Invitrogen	#88-7105-88
L-Glutamina	Corning	#25-005-CI
Mikroskop z aparatem do analizy kontrastu fazowego
Murine IFNγ	R& Układy D	#485-MI-100
Penicylina-streptomycyna	Corning	#30-002-CI
Rat anty-mouse CD16/CD32	BD PharMingen	#553142
RPMImedium	Corning	#10-040-CV
Sterylne szczypce chirurgiczne (proste i zakrzywione)
Inkubator kontrolowany temperaturą i składem gazów
Trypsyna	Corning	#25052-cl
Kąpiel wodna z regulacją temperatury