Artykuł metodologiczny

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

DOI:

10.3791/69400

⸱

28 października 2025

 ,  , 
1Department of Convergent Bioscience and Informatics, and Graduate School of Biological Sciences, Chungnam National University (CNU)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zapewnia uproszczony proces obliczeniowy do ilościowej identyfikacji początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Integrując dostępność chromatyny, cechy chromatyny oraz dane transkrypcyjne, umożliwia dokładne wykrywanie i analizę aktywności wzmacniacza specyficzną dla nici w złożonych regionach intragenowych, pozostając jednocześnie dostępnym dla badaczy bez rozległego szkolenia bioinformatycznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podstawowe elementy cis-regulacyjne, zwane wzmacniaczami, odgrywają kluczową rolę w umożliwianiu precyzyjnej regulacji transkrypcji genów docelowych kontrolujących różnorodne funkcje komórkowe i procesy rozwojowe. Wzmacniacze te są często transkrybowane w obu kierunkach, tworząc długie, niekodujące transkrypcje zwane enhancer RNA (eRNA). Ekspresja eRNA jest ściśle powiązana z aktywnymi cechami chromatyny, takimi jak rekrutacja H3K27ac i współaktywatorów, i funkcjonalnie przyczynia się do transkrypcyjnej aktywacji genów docelowych. Niemniej jednak wykrywanie i ilościowe określenie eRNA pozostają trudne, zwłaszcza gdy pokrywają się one z transkrypcją genu gospodarza. Aby temu zaradzić, przedstawiamy ustandaryzowany, przyjazny dla użytkownika workflow obliczeniowy do analizy transkrypcji wzmacniającej na podstawie początkujących danych sekwencjonowania RNA. Protokół prowadzi użytkowników przez wstępne przetwarzanie danych, mapowanie odczytu i kontrolę jakości, a następnie kwantyfikację transkrypcji związanej z wzmacniaczami specyficzną dla pasma, z dedykowanymi procedurami dla wzmacniaczy wewnątrzgenowych, gdy przypisanie sygnału jest złożone. Moduły wizualizacyjne umożliwiają jasną inspekcję aktywności wzmacniaczy w kontekstach genomowych, a wbudowane opcje wspierają analizy zarówno wzmacniaczy intergenowych, jak i wewnątrzgenowych. Zaprojektowany dla badaczy z ograniczoną wiedzą w bioinformatyce, ten workflow zapewnia praktyczne ramy do spójnych, powtarzalnych i skalowalnych badań transkrypcji wzmacniaczej, ułatwiając szersze zastosowanie biologii wzmacniającej w różnych systemach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzmacniacze to elementy DNA cis-regulacyjne, które kontrolują transkrypcję docelowych genów poprzez organizowanie pętli chromatyny i rekrutację mechanizmów transkrypcyjnych 1,2,3. Ich specyficzna aktywność tkankowa umożliwia precyzyjną regulację podczas rozwoju i zaangażowanie linii genezji 4,5,6,7,8. Aktywne wzmacniacze wykazują charakterystyczne cechy chromatyny, takie jak H3K4me1 (histon H3 lizyno-4 mono-metylacja) i H3K27ac (acetylacja histonu H3 Lizyny 27) i zwykle występują w obszarach nadwrażliwych na DNazę I, które oznaczają otwartą chromatynę 9,10,11,12. Te cechy umożliwiają czynnikom transkrypcyjnym i polimerazie RNA II dostęp do DNA, inicjując początkową transkrypcję w locusach wzmacniających 13,14,15,16.

Ten sekwencyjny proces biologiczny wytwarza transkrypcje pochodzące z wzmacniaczy, zwane eRNA, które są dwukierunkowe, niekodujące i zazwyczaj niepoliadenylowane RNA 13,14,15,16. eRNA pełnią rolę markerów aktywności wzmacniającej i funkcjonują jako efektorysame w sobie 16,17,18,19,20,21,22,23,24. Sprzyja one produktywnej elongacji poprzez uwalnianie Ujemnego Czynnika Elongacyjnego (NELF) z wstrzymanej polimerazy RNA II16,19 oraz pomagają stabilizować pętle wzmacniająco-promotorowe 17,18,20. Wspierają również powstawanie kondensatów transkrypcyjnych, potencjalnie poprzez modyfikację m6A(N 6-metyladenozyny) 21,22,23.

Niemniej jednak funkcja transkrypcji wzmacniacza wewnątrzgenowego, inicjowanej z elementów regulacyjnych w ciałach genów, pozostaje kontrowersyjna. Niektóre badania informują, że eRNA pochodzące z downętrznych wzmacniaczy zwiększają ekspresję genu gospodarza25, potencjalnie poprzez promowanie uwalniania NELF i wydłużenia produktywności zależnej od bodźca 26,27. Dla porównania, inne badania sugerują, że ta transkrypcja może hamować geny gospodarza poprzez kolizje polimerazy RNA II lub interferencję transkrypcyjną, prowadząc do osłabienia lub przedwczesnego zakończenia28,29. Te sprzeczne obserwacje, wraz z podwójną rolą eRNA jako markerów i regulatorów, podkreślają potrzebę starannej ilościowej analizy i funkcjonalnej sekcji. Jednak pomiar intragenowych eRNA jest trudny, ponieważ często nakładają się one na transkrypcje gospodarza zmysłowego 13,25,26,30. Wyzwanie nasila się, gdy wzmacniacze znajdują się w regionach z zagnieżdżonymi genami lub nakładającą się transkrypcją na obu niciach, co zaciemnia specyficzne sygnały wzmacniacze.

Aby pokonać te wyzwania, opracowaliśmy pipeline bioinformatyczny do wykrywania, ilościowego określenia i wizualizacji transkrypcji związanych z wzmacniaczami, ze szczególnym uwzględnieniem regionów wewnątrzgenowych. Pipeline integruje test chromatyny dostępnej do transpozazy z wykorzystaniem sekwencjonowania (ATAC-seq), sekwencjonowania immunoprecipitacji chromatyny (ChIP-seq), sekwencjonowania globalnego run-on (GRO-seq) oraz adnotacji genomowych, aby osiągnąć rozdzielczość na poziomie wzmacniacza nawet w złożonych kontekstach genomowych.

Potok składa się z czterech głównych etapów: (i) wstępnego przetwarzania, wyrównania, wywoływania szczytów oraz generowania sygnału31; (ii) identyfikację wzmacniaczy za pomocą cech chromatyny; (iii) przypisywanie orientacji nici, szczególnie wewnątrz ciał genów; oraz (iv) ilościowość i wizualizację początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Te ramy są szczególnie przydatne dla systemów z danymi sekwencjonowania o wysokiej rozdzielczości, takich jak analizowane w tym badaniu embrionalne komórki macierzyste myszy, a także mogą być rozszerzane na inne organizmy, gdy dostępne są odpowiednie zbiory danych. Umożliwiając specyficzną ilościową ilościowość w sytuacjach, gdy istniejące procesy zawodzą, ten workflow oferuje praktyczne narzędzie do benchmarkingu i badania transkrypcji eRNA wewnątrzgenowej w różnych kontekstach genomowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie surowe zbiory danych używane w przepływie pracy są wymienione w Tabeli 1. Szczegóły dotyczące narzędzi bioinformatycznych znajdują się w Tabeli Materiałów. Liczbę wątków używanych w tym potoku można dostosować poprzez modyfikację zmiennej THREADS zdefiniowanej na górze każdego skryptu. Użytkownicy mogą zwiększyć liczbę danych, aby przyspieszyć analizę w zależności od zasobów CPU użytkownika.
Po każdym kroku generowany jest plik dziennika. Do szybkich sprawdzeń niepowodzenia użyj poleceń takich jak cat StepXX_log.txt; grep, -qF, "ERROR" StepXX_log.txt & echo "ERROR found. Napraw przed kolejnym krokiem." || echo "OK: brak znaczników BŁĄD". Jeśli pojawi się jakiś BŁĄD, traktuj go jako nieudany i najpierw go rozwiąż.

1. Pobieranie pełnego pipeline'u analitycznego z repozytorium GitHub

(https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/)

  1. Uruchom interfejs wiersza poleceń (CLI) odpowiedni dla używanego systemu operacyjnego.
    1. Windows: Skonfiguruj środowisko Linux z użyciem Windows Subsystem for Linux (WSL). Postępuj zgodnie z oficjalnymi instrukcjami instalacji i konfiguracji WSL przed przejściemdo 32.
    2. macOS: Kontynuuj bez dodatkowej konfiguracji, ponieważ macOS jest oparty na Unixie. Skorzystaj z oficjalnego przewodnika po otwarciuterminala 33.
    3. Użytkownicy Linuksa, szczególnie ci korzystający z Ubuntu: Otwórz terminal zgodnie z instrukcjami34.
  2. Uruchom wget https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/archive/refs/heads/main.zip -O ~/pipeline.zip w terminalu, aby pobrać pipeline do identyfikacji wzmacniaczy i ilościowej identyfikacji RNA wzmacniacza.
  3. Wpisz rozpakuj ~/pipeline.zip -d ~/ w terminalu. To wypakuje wszystkie potrzebne pliki do katalogu głównego.
  4. Uruchom rm ~/pipeline.zip i wpisz mv ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization-main ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization , aby usunąć archiwum i zmienić nazwę wypakowanego folderu.
  5. Wpisz cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization/, i uruchom chmod +x scripts/* , aby wszystkie skrypty w katalogu "scripts/" były wykonywalne.

2. Tworzenie środowiska mamba/conda dla pipeline'u analitycznego

  1. Wpisz skrypty/Step1_conda_environment_formation.sh bash , aby stworzyć i uruchomić wirtualne środowisko mamba. Jeśli podczas wykonania zostanie zapytany, wpisz Y i naciśnij Enter , aby potwierdzić instalację pakietu. Dla macOS postępuj zgodnie z krokiem 2.1.1; w przypadku systemów z już zainstalowanymi Mamba lub Conda, postępuj zgodnie z krokiem 2.1.2.
    1. MacOS: Otwórz skrypt i zamień link do pobrania minicondy wersją macOS:
      https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-MacOSX-x86_64.sh
      Następnie postępuj zgodnie z krokiem 2.1.
    2. Gdy w poleceniu pojawi się (enhancer-env), wpisz skrypty/Step2_package_installation.sh bash , aby zainstalować wymagane pakiety do dalszych analiz. Wpisz Y i naciśnij Enter , jeśli podczas instalacji pojawi się próś.
    3. Po uruchomieniu kroku 2.2 sprawdź wyjście terminala pod kątem komunikatów o błędach. Rozwiązuj wszelkie problemy; następnie ponownie uruchom Krok 2.2.
    4. (OPCJONALNIE) Uruchom listę mamba , aby potwierdzić, że wszystkie pakiety zarządzane mamba w Tabeli Materiałów są zainstalowane. HOMER jest instalowany ręcznie i nie pojawi się na liście mamba. Sprawdź HOMER, sprawdzając, czy istnieje katalog "~/homer/".

3. Pobierz publicznie dostępne zbiory danych ChIP-seq, ATAC-seq i GRO-seq z (Sequence Read Archive)

  1. Uruchom skrypty cp/Step{3..12}_*.sh ./ , aby skopiować niezbędne skrypty powłoki do surowego przetwarzania odczytu.
  2. Wpisz bash Step3_download_file_list.sh > Step3_log.txt 2>&1 i naciśnij Enter , aby pobrać i przetworzyć surowe dane sekwencjonowania z.
    UWAGA: Ten skrypt automatyzuje pobieranie i przygotowywanie publicznych danych sekwencjonowania do analizy. Tworzy to ustandaryzowaną strukturę teczek pod "MATERIAŁ/", uporządkowaną według typu testu i replikacji (biologiczne: rep1/rep2; techniczne: trep1/trep2). Wbudowana lista numerów przystępnych napędza pobieranie z prefetchem (v3.2.0), konwersję do FASTQ z fastq-dump (v3.2.0) (parowanie: --split-files) oraz kompresję za pomocą pigz (v2.8) w celu zmniejszenia pamięci. Przetwarzanie następuje po prefetch, fasterq-dump, pigz, a wyjścia zapisywane są do odpowiednich katalogów "00.Rawdata/".

4. Przeprowadzanie kontroli jakości i przycinanie surowych odczytów

  1. Wpisz bash Step4_read_trimming_and_QC.sh > Step4_log.txt 2>&1 , aby wykonać przycinanie odczytu i kontrolę jakości surowych plików FASTQ.
    UWAGA: Ten skrypt przetwarza surowe pliki FASTQ z GRO-seq, ATAC-seq i ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) wraz z odpowiednimi kontrolami wejściowymi. Uruchamia FastQC (v0.12.1)35 na surowych odczytach, a następnie przycina adaptery za pomocą Trim Galore (v0.6.10)36 , używając parametrów specyficznych dla testu. Dla GRO-seq najpierw usuwa się ogony NextSeq G i bardzo krótkie odczyty (--nextseq 20, --długość 20), następnie używa Cutadapt (v5.1)37 do usuwania długich kanałów poli-A, zachowując odczyty dłuższe niż 20 nukleotydów ( -a A{15}, -m 20). W przypadku ATAC-seq przetwarza biblioteki parowane i celuje w adaptery Tn5/Nextera (--paired, --nextera). Dla H3K27ac i odpowiadających wejść obsługuje on biblioteki ChIP-seq na końcu parowanym (--paired). Dla H3K4me1 i jego wejścia wykonuje standardowe przycinanie pojedynczych końców (domyślnie). FastQC uruchamia się ponownie na przyciętych odczytach. Wyjścia są zapisywane do katalogu "01.Clean/" każdego testu, a pliki przycięte przez adapter GRO-seq są usuwane.

5. Przygotuj indeks referencyjny Bowtie2

  1. Wybierz jedną z dwóch poniższych opcji, aby przygotować indeks genomu Bowtie2 (v2.5.4)38 dla genomu referencyjnego mm10 (Mus musculus).
    1. Uruchom bash Step5_1_download_reference_index.sh > Step5_1_log.txt 2>&1 , aby użyć gotowego indeksu Bowtie2 udostępnionego przez deweloperów.
    2. Biegać Bash Step5_2_download_reference_make_index_with_
      bowtie2.sh > Step5_2_log.txt 2>&1       , aby ręcznie pobrać surową sekwencję genomu mm10 i indeks budowy.
      UWAGA: Oba podejścia generują plik indeksowy do katalogu "reference_index/" i są funkcjonalnie równoważne dla standardowego wyrównania.

6. Spasuj przycięte odczyty do genomu referencyjnego mm10

  1. Wpisz bash Step6_alignment_to_make_bam.sh > Step6_log.txt 2>&1 , aby wyrównać odczyty każdego testu i odnosić się do plików BAM.
    UWAGA: Ten krok mapuje odczyty każdego testu na wcześniej indeksowane mm10. H3K27ac ChIP-seq i odpowiadające mu wejście wykorzystują mapowanie parowane dla zrównoważonej dokładności (-1, -2) z domyślną czułością. H3K4me1 ChIP-seq i odpowiadające mu wejście używają mapowania single-end w ustawieniach domyślnych (-U). ATAC-seq wykorzystuje mapowanie o wysokiej czułości, aby uwzględnić zmienne, długie fragmenty pochodzące z Tn5 (--bardzo czułe, -X 2000) z parowanym wejściem (-1, -2). GRO-seq wykorzystuje mapowanie o wysokiej czułości, aby lepiej umieścić krótkie, przycięte odczyty (--bardzo czułe) z jednokierunkowym wejściem (-U). Pliki SAM są konwertowane na BAM i filtrowane za pomocą widoku samtools (v1.22.1)39 , przy użyciu umiarkowanego MAPQ dla ChIP/input (-b, -q 10) oraz bardziej rygorystycznych progów dla ATAC-seq i GRO-seq (-b, -q 30); ostateczne pliki BAM są zapisywane do katalogu "02.Align/" każdego zbioru danych.

7. Scalanie technicznych replik danych H3K27ac ChIP-seq

  1. Uruchom bash Step7_merge_trep.sh > Step7_log.txt 2>&1 , aby połączyć techniczne repliki H3K27ac ChIP-seq oraz odpowiadające im pliki BAM.
    UWAGA: Ten skrypt sortuje pliki BAM do replikacji technicznych za pomocą sortowania sambamba (v1.0.1)40 , a następnie łączy H3K27ac ChIP-seq i odpowiadające mu wejścia replikuje się do skonsolidowanych BAM-ów z sambamba merge. Jeśli zbiór danych użytkownika nie zawiera żadnych technicznych replikacji, pomiń ten krok i przejdź do pojedynczych plików BAM.

8. Usuń duplikaty i chromosomy nieistotne

  1. Usuń duplikaty i sortuj odczyty mapowane dla ChIP-seq i GRO-seq.
    1. Wpisz bash Step8_1_duplicate_removal_sorting-ChIP_GRO.sh > Step8_1_log.txt 2>&1 , aby usunąć duplikaty z histonowych zbiorów danych ChIP-seq oraz sortować zarówno wyjściowe BAM-y ChIP-seq, jak i GRO-seq.
      UWAGA: Ten skrypt usuwa duplikaty PCR za pomocą sambamba markdup (-r) oraz sortowanie współrzędnych za pomocą sambamba sortowania. W H3K27ac przetwarzanie jest ukierunkowane na BAM-y z połączonych replikacji technicznych, obsługując ChIP i wejście osobno. Dla H3K4me1 każde replikowane i dopasowane wejście są przetwarzane indywidualnie. W przypadku GRO-seq pomijane jest usuwanie duplikatów i stosuje się jedynie sortowanie współrzędnych. Wyniki są zapisywane w katalogu "02.Align/" każdego zbioru danych.
  2. Usuń duplikaty i filtruj odczyty mapowane na chromosomy mitochondrialne z ATAC-seq.
    1. Wpisz bash Step8_2_duplicate_chrM_removal_sorting_ATAC.sh > Step8_2_log.txt 2>&1 , aby usunąć duplikaty PCR, filtrować odczyty mitochondrialne (chrM) oraz sortować pliki BAM ATAC-seq.
      UWAGA: Ten skrypt odnosi się do zaleceń potoku ENCODE dla przetwarzania danych ATAC-seq. Zaczyna się od sortowania nazw za pomocą sambamba sort (-n) oraz ustalania informacji o matach za pomocą samtools fixmate (-m). Ten etap zapewnia, że informacje o matach są prawidłowo przypisane przed oznaczaniem duplikatów. Następnie duplikaty PCR są usuwane za pomocą sambamba markdup (-r). Odczyty mitochondrialne są usuwane przez wygenerowanie listy keep-list z samtools idxstats (z wyłączeniem chrM i *) oraz zachowywanie tylko wymienionych odniesień w widoku samtools (-b). Ostateczne sortowanie współrzędnych odbywa się za pomocą sortowania sambamba. Wyczyszczone BAM-y są zapisywane do katalogu "02.Align/" każdej repliki.

9. Wykonaj wywołanie szczytowe dla każdego zbioru danych

  1. Uruchom skrypt kroku 9, wpisując bash Step9_peak_calling.sh > Step9_log.txt 2>&1 , aby wykonać szczytowe wywołania dla danych ChIP-seq i ATAC-seq.
    UWAGA: Ten skrypt wykonuje wywołania szczytowe z MACS3 (v3.0.3)41 dla ATAC-seq i ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1). ATAC-seq generuje szczyty, dostarczając wszystkie replikowane BAM-y jako sygnał w trybie no-model z przesunięciem/rozszerzeniem (-f BAMPE, --nomodel, --shift -100, --extsize 200, -q 0.01). H3K27ac wywołuje szerokie piki z połączonych replikacji technicznych z dopasowanym wejściem (-f BAMPE, --szerokie). Procesy H3K4me1 replikują się indywidualnie z dopasowanym wejściem w trybie jednokierunkowym (-f BAM, --szeroki), a nakładające się piki uzyskuje się za pomocą bedtools (v2.31.1)42 się przecina. Wyniki są zapisywane do katalogu "peak_calling/" każdego zbioru danych, z wysoko pewnym szczytem H3K4me1 pod "peak_calling/overlapped_peak/".

10. Scalanie biologicznych replik plików BAM ChIP-seq i ATAC-seq do analizy sygnału w dalszej części

  1. Uruchom bash Step10_merge_rep_forMakingSignal.sh > Step10_log.txt 2>&1 , aby połączyć pliki BAM z biologicznych replikacji ATAC-seq i H3K4me1 ChIP-seq.
    UWAGA: Ten skrypt łączy replikacyjne BAM-y z sambamba merge dla ATAC-seq, H3K4me1 ChIP-seq oraz odpowiadającym wejściem H3K4me1. Połączone BAM-y wspierają analizy downstream (np. generowanie sygnału bigWig, normalizacja). Wyjściowe BAM-y są zapisywane w katalogach "merge/02.Align/" pod każdą ścieżką próbki.

11. Generuj katalogi tagów i sygnalizuj pliki bigWig z mapowanych odczytów

  1. Uruchom bash Step11_make_tag_to_signal.sh > Step11_log.txt 2>&1 , aby tworzyć katalogi tagów i generować pliki sygnałowe bigWig dla mapowanych odczytów każdego zbioru danych.
    UWAGA: Ten skrypt buduje katalogi tagów HOMER za pomocą makeTagDirectory , a następnie generuje ścieżki sygnału bigWig za pomocą polecenia makeUCSCfile za pomocą pakietów HOMER (v5.1)43 oraz ucsc-bedgraphtobigwig (v482)44 . Wszystkie ścieżki sygnału są tworzone za pomocą plików o rozmiarze chromosomów z UCSC Genome Browser (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/mm10/). GRO-seq generuje ścieżki sygnału specyficzne dla pasma (-style rnaseq, -strand + / -, -bigWig). ATAC-seq generuje nieznormalizowane ścieżki z połączonych BAM-ów (-bigWig). ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1) generuje ścieżki znormalizowane wejściowe z pseudo-liczbą 1 (-bigWig, -i, -pseudo 1). Wyjścia są zorganizowane pod "03.TagDir/" oraz "04.bigwig/".

12. Przygotuj pliki do identyfikacji wzmacniacza

  1. Wpisz bash Step12_E_identification_material.sh > Step12_log.txt 2>&1 w terminalu, aby przygotować niezbędne pliki i referencje do identyfikacji wzmacniacza.
    UWAGA: Ten krok zbiera wszystkie niezbędne pliki do identyfikacji wzmacniaczy do folderów "01.E_identification/material/", zorganizowanych w foldery "ATAC/", "Histone/" oraz "Annotation/". Kopiuje pliki szczytowe (ATAC-seq, H3K27ac, H3K4me1) do odpowiednich katalogów. Plik adnotacji GENCODE M23 (mm10) jest pobierany automatycznie, a pliki referencyjne, w tym ENCODE blacklist45 (mm10-blacklist.v2.bed) oraz plik rozmiaru chromosomu (mm10.chrom.size), są kopiowane z wcześniej zdefiniowanej ścieżki.

13. Identyfikacja kandydatów na promotory i ciała genów na podstawie adnotacji

  1. Wpisz cd 01.E_identification/, aby wejść do katalogu roboczym, potem uruchom cp .. /scripts/Step{13..20}_*.sh ./ do kopiowania skryptów enhancer-identification scripts.
  2. Uruchom bash Step13_promoter_candidates_genebody_identification.sh > Step13_log.txt 2>&1 , aby wygenerować pliki BED dla regionów promotorów, ciał genów oraz genów kodujących białka (PCG) z wykorzystaniem adnotacji GENCODE.
    UWAGA: Ten skrypt przetwarza pobrany GENCODE M23 Gene Transfer Format (GTF) do tworzenia plików BED dla kandydatów na promotory, wszystkich ciał genów oraz ciał PCG, zapisując wyjścia do "materiał/Annotacja/". Promotory definiuje się jako okno o średnicy 2 kb wokół TSS (Transcription Start Site) każdego transkryptu z narzędziami łóżkowymi (-b 2000, -g mm10.chrom.sizes). Ciała kodujące geny i białka są wyprowadzane z wpisów GTF oznaczonych jako gen, a wpisy kodujące białka są dodatkowo filtrowane przez "gene_type = protein_coding".

14. Szczyty procesów identyfikacji wzmacniaczy

  1. Uruchom bash Step14_ATAC_ChIP-seq_processing.sh > Step14_log.txt 2>&1 , aby wstępnie przetworzyć pliki ATAC-seq i hisstone ChIP-seq peak dla identyfikacji wzmacniacza.
    UWAGA: Ten skrypt wstępnie przetwarza szczytowe zestawy dla wywołań wzmacniacza. Dla ATAC-seq usuwa regiony nakładające się na obszary czarnej listy z bedtools odejmuje (-A), a następnie wyklucza piki nakładające się na kandydatów promotorów z bedtools odejmowaniem (-A); dla znaków histonowych (H3K27ac, H3K4me1) symetrycznie rozszerza każdy szczyt o 1 kb z każdej strony za pomocą nałożenia (-b 1000 -g mm10.chrom.sizes), a następnie usuwa nakładki promotorów odejmując narzędzia łóżkowe.

15. Identyfikacja i klasyfikacja wzmacniaczy

  1. Uruchom bash Step15_inter_intragenic_E_sets_identification.sh > Step15_log.txt 2>&1 , aby zdefiniować i sklasyfikować wzmacniacze na podstawie danych o szczytach chromatyny.
    UWAGA: Ten krok definiuje i adnotuje wzmacniacze za pomocą narzędzi łóżkowych. Nakładania się pików ATAC-seq i slop-expandowanych szczytów H3K4me1 uzyskuje się z przecięciem (-wa, -u), a obszary nakładające się na flankowane piki H3K27ac klasyfikuje się jako aktywne wzmacniacze z przecięciem (-wa, -u); Nieaktywne wzmacniacze są wyprowadzane przez usunięcie aktywnych obszarów z pełnego zbioru wzmacniaczy przez odejmowanie. Szczyty ATAC-seq nakładające się na każdy zestaw wzmacniaczy są zbierane z przecięciem (-u), następnie szczyty dzielą się na intergenowe i wewnątrzgenowe z przecięciem (-v lub -u) względem ciała genu. Interwały wzmacniające są ostatecznie przypisywane do klas intergenowych/intragenowych na podstawie związanego z szczytem szczytu z przecięciem (-u). Wszystkie wyniki są zapisywane w "01.E_identification/" pod "01.allE/", "02.interE/" oraz "03.intraE/".

16. Przypisanie tymczasowej informacji o nici do wzmacniaczy wewnątrzgenowych

  1. Typ bash Step16_assign_temp_strand_from_gene_overlap.sh > Step16_log.txt 2>&1 do przypisania tymczasowej informacji o nici do intragenowego wzmacniacza BED.
    UWAGA: Ten krok przypisuje etykiety genowe do wzmacniaczy wewnątrzgenowych poprzez nakładanie się interwałów wzmacniających z ciałami genowymi wykorzystującymi narzędzia łóżkowe (-wa, -wb). Kolumny 1, 2, 3, 4, 5, 16 są zachowywane z awk, następnie rekordy są sortowane i deduplikowane. Wyjście jest zapisane jako "03.intraE/strand_designation/01.overlapped_gene_strand/ES_E_intragenic_strand_with_dup.bed".

17. Priorytetyzacja przypisywania nici dla wzmacniaczy nakładających się na geny obu nici

  1. Typ bash Step17_initial_strand_assignment_for_both_strand_enhancers_PCG_based.sh > Step17_log.txt 2>&1 w celu określenia kierunku nici dla intragenowych wzmacniaczy nakładających się genów na obu niciach.
    UWAGA: Ten skrypt rozwiązuje niejednoznaczność dotyczącą nakryć się genów wewnątrzgenowych na obu niciach, priorytetowo traktując nakładanie się PCG. Wzmacniacze obecne na obu włóknach są najpierw izolowane (grupowanie awk według chrom/start/end/id/nit), przypadki PCG nakładające się na tym samym nieniu są wybierane z przecięciem narzędzi łóżkowych (-s, -wa, -u), a przypadki nie-PCG zachowywane są z przecięciem narzędzi łóżkowych (-v). Wybrane i zachowane zestawy są łączone i uporządkowane. Wyjście: "03.intraE/strand_designation/02.enhancer_with_PCG_priority/ES_E_intragenic_PCG_priority.bed".

18. Obliczanie wartości odczytów specyficznych dla pasm (Reads Per Kilobase per Million Mapped reads) (RPKM) dla genów nakładających się na PCG intragenowe wzmacniacze

  1. Typuj bash Step18_RPKM_cal_from_partially_strand_assigned_enhancers.sh > Step18_log.txt 2>&1 , aby obliczyć specyficzne dla pasma RPKM dla genów nakładających się na wzmacniacze na tej samej nici.
    UWAGA: Ten krok wykorzystuje "ES_E_intragenic_PCG_priority.bed" z etapu 17, który zawiera wzmacniacze, które (i) nakładały się na PCG na jednym łańcuchu i otrzymały jedno pasmo, (ii) nakładały się PCG na obu włóknach i pozostawały niejednoznaczne, lub (iii) nie miały nakładania się PCG i zachowały oba łańcuchy. Geny nakładające się na tę samą nici są selekcjonowane przy przecięciu narzędzi łóżkowych (-s, -wa, -u), przekształcane w GTF za pomocą awk i ilościowe z GRO-seq za pomocą featureCounts (v2.1.1)46 trybu liczenia specyficznego dla nici (-s 1, gen -t, -g gene_id, -O, --fraction). Łączna liczba odczytów mapowanych jest uzyskiwana za pomocą flagstat sambamba, a RPKM obliczany jest na podstawie długości genu, liczby i sum. Wyjścia są zapisywane do "03.intraE/strand_designation/03.RPKM_calculation_of_overlapped_gene/".

19. Ostateczne przypisanie nici na podstawie ekspresji genów (RPKM) nakładających się genów

  1. Typuj Step19_second_strand_assignment_by_RPKM.sh > Step19_log.txt 2>&1 , aby sfinalizować przydział nici dla wzmacniaczy intragenowych.
    UWAGA: Ten krok przypisuje nici do wzmacniaczy wewnątrzgenowych z wykorzystaniem wsparcia ekspresji genów od kroku 18. Występują nakładki na te same nici między wzmacniaczami (ES_E_intragenic_PCG_priority.łóżko) i genami, a narzędzia łóżkowe się przecinają (-s, -wa, -wb). Wartości genu RPKM są łączone z przedziałami genów za pomocą awk/sort/join, tworząc gen-RPKM BED. Dla każdego wzmacniacza wybierany jest nakładający się gen o najwyższym RPKM, a wzmacniacz dziedziczy nić tego genu. Wyniki są zapisywane na "03.intraE/strand_designation/04.enhancer_strand_designation_by_RPKM_of_gene/ES_E_intragenic_PCG_priority_strand_by_gene_RPKM.bed."

20. Przydziel informacje o wątkach do szczytów wzmacniaczy intragenowych i wzmacniaczy

  1. Typ bash Step20_strand_assignment_for_intragenicE_and_summits.sh > Step20_log.txt 2>&1 , aby przypisać określone informacje o pasmach wszystkim wzmacniaczom intragenicznym i każdemu szczytowi.
    UWAGA: Ten etap finalizuje przydzielanie włin dla intragenowych wzmacniaczy i dopasowania szczytów przy użyciu narzędzi łóżkowych. Przedziały przeciwnych nici są usuwane przez odejmowanie (-S), wzmocniacze oznaczone przez pasma są przecinane z aktywnymi i nieaktywnymi zbiorami przy użyciu przecięcia (-wa, -u), a pliki szczytów są ponownie anotowane przez nakładające się szczyty z wzmocniającymi przypisanymi pasmami przez przecięcie (-wa, -wb) i uzyskanie łańcucha przez awk. Wyniki są zapisywane w "03.intraE/final_strand_IntragenicE/" oraz w jego podfolderze "summit/".

21. Przygotowanie plików wejściowych do walidacji wzmacniaczy, ilościowej identyfikacji eRNA oraz wizualizacji

  1. Typ cd... / lub cd ~/Enhancer-transcript-identification-from-read-to-visualization , aby przejść do root pipeline, następnie wpisać cp scripts/Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh ./ aby skopiować skrypt do przygotowania analizy dalszej.
  2. Uruchom bash Step21_preparing_quantification_and_visualization.sh > Step21_log.txt 2>&1 , aby przygotować wszystkie niezbędne pliki do agregacji wzmacniaczy, przetwarzania sygnałów GRO-seq oraz kwantyfikacji eRNA.
    UWAGA: Ten etap przygotowuje pliki wejściowe i strukturę katalogów do walidacji wzmacniaczy, kwantyfikacji eRNA oraz wizualizacji sygnałów pod "02.E_visualization_quantification/". Podfoldery tworzone są dla plików bigWig, enhancer BED, BAM, macierzy sygnałowych, liczeń i wykresów. Kluczowe dane wejściowe, takie jak BED-y szczytowe, bigWigs, listy wzmacniaczy i GRO-seq BAM-y, są kopiowane do odpowiednich lokalizacji.

22. Generuj wykresy agregacyjne do walidacji wzmacniaczy

  1. Wpisz cd 02.E_visualization_quantification/, aby wejść do katalogu roboczym, potem wpisz cp .. /scripts/Step{22..24}_*.* ./ do kopiowania niezbędnych skryptów do dalszej analizy.
  2. Uruchom bash Step22_generation_of_aggregation_plot.sh > Step22_log.txt 2>&1 , aby wygenerować wykresy agregacji sygnałów chromatyny wokół każdego typu szczytu wzmacniającego.
    UWAGA: Ten krok wizualizuje średnie wzbogacenie sygnału chromatyny skoncentrowane na szczytach wzmacniacza przy użyciu ComputeMatrix i plotProfile z deepTools (v3.5.6)47. Dla każdego zdefiniowanego zestawu wzmacniaczy punkt odniesienia Macierzy obliczeniowej (--centrePoint center, -a 5000, -b 5000, --missingDataAsZero) oblicza gęstość sygnału w oknie 10 kb wokół szczytów wzmacniaczy, używając plików bigWig dla ATAC-seq, H3K27ac i H3K4me1. Macierz wyjściowa jest przekazywana do plotProfile, który generuje krzywe agregacji sygnału do porównania między grupami wzmacniaczy. Wykresy agregacji są zapisywane w katalogu "01.Profiling/04_1.aggregation/".

23. Ilościowo i wizualizacja ekspresji RNA wzmacniającego

  1. Uruchom bash Step23_quantifing_eRNA_RPKM.sh > Step23_log.txt 2>&1 , aby ilościowo określić poziomy ekspresji eRNA z GRO-seq za pomocą featureCounts.
    UWAGA: Ten krok ilościowo określa transkrypcję eRNA z określonych obszarów wzmacniających w sposób specyficzny dla nici za pomocą GRO-seq. Wzmacniacze międzygenowe są liczone z FeatureCounts w trybie bezniakowym (-s 0, -t wzmacniacz, -g gene_id, -O, --ułamek), a wzmacniacze intragenowe są ilościowe w trybie antysensowym (-s 2), aby wykluczyć sygnał z nakładającej się transkrypcji genów. Regiony BED są konwertowane na GTF z awk przed liczeniem. Łączna liczba odczytów mapowanych pochodzi z flagstat sambamba, a liczenia są normalizowane do RPKM za pomocą długości wzmacniacza, liczby odczytów i łącznej liczby odczytów mapowanych. Wyniki są organizowane pod "02.eRNA_quantification/03.count_normalized_with_RPKM/" według "inter/" i "intra/".
  2. Uruchom Rscript Step24_visualization_of_enhancer_transcript. R > Step24_log.txt 2>&1 do wizualizacji i porównania poziomów ekspresji eRNA w grupach wzmacniaczych za pomocą R.
    UWAGA: Skrypt R wykorzystuje pakiety ggplot2 (v3.5.2)48 i cowplot (v1.2.0)49 do generowania wykresów skrzypiec i pudełek, porównujących ekspresję aktywnego i nieaktywnego wzmacniacza na podstawie wartości RPKM. Do wizualizacji i testów statystycznych wartości RPKM są przekształcane dologaritmu 2 (RPKM + 1). Istotność statystyczna ocenia się za pomocą testu sumy rangi Wilcoxona. Zarówno wykresy podsumowujące, jak i tabela wartości p są zapisywane do "03.eRNA_visualization/" do dalszej interpretacji.
    UWAGA: Jeśli jakikolwiek krok w tym potoku nie działa i utrzymuje się nawet po ponownym uruchomieniu, zgłoś problem na https://github.com/myunggeunO/Enhancer-transcript-identification-from-read-to wizualizacji/problemów. Jasne wskazanie błędnego kroku i dołączenie pliku loga zapewnia dokładne wsparcie w rozwiązywaniu problemów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczny workflow dla pipeline'u kwantyfikacji transkrypcji wzmacniacza
Publicznie dostępne zbiory danych ChIP-seq (H3K27ac, H3K4me1), ATAC-seq oraz GRO-seq (Tabela 1) zostały przetworzone za pomocą standaryzowanego potoku zaprojektowanego głównie do walidacji. Przycinanie adapterów i filtrowanie jakości wykonano za pomocą Trim Galore i Cutadapt, a następnie wyrównano do genomu referencyjnego mm10 za pomocą Bowtie2 (szczegółowo opisane w kroku prot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po odkryciu transkryptów pochodzących z wzmacniaczy13, 14, 15, dokładne ilościowe określenie eRNA pozostaje poważnym wyzwaniem, szczególnie w kontekstach intragenowych, gdzie eRNA często nakładają się na transkrypcje genów gospodarza. To nakładanie się komplikuje przypisanie nici i atrybucję sygnału, utrudniając odróżnienie prawdziwej transkrypcji wzmacniającej od ekspresji genów tła 13,25,26,30.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało wsparte przez fundusz badawczy Chungnam National University [2022-0582-01 (S.-K.K.) oraz 2023-0545-01 (S.-K.K.)], Korea Południowa. Rysunek 1 został stworzony za pomocą BioRender (https://biorender.com/).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Narzędzia łóżkoweLaboratorium Quinlan, Uniwersytet Utah v2.31.1Narzędzia do edycji plików BED
mucha2Laboratorium Langmead, Uniwersytet Johns Hopkinsv2.5.4Wielowątkowy aligner do mapowania odczytów na genom referencyjny
KrowiaLaboratorium Wilke, Uniwersytet Teksasuv1.2.0Narzędzia do łączenia i wyrównywania figurek opartych na ggplot2
cutadaptLaboratorium Nauki dla Życia, Uniwersytet Sztokholmskiv5.1Adapter i trymer do ogona z poliestrowanego A/G
deeptoolsZakład Bioinformatyczny, Instytut Maxa Planckav3.5.6Narzędzie do liczenia odczytów do ilościowego określania odczytów w określonych regionach genomowych
fastqcBioinformatyka Babrahama, Instytut Babrahamav0.12.1Kontrola jakości odczytów sekwencjonowania
featureCounts (subread)Shi Lab, Uniwersytet Monashv2.1.1Surowe narzędzia do liczenia odczytów dla określonych regionów genomowych
HomerLaboratorium Bennera, Uniwersytet Kalifornijski San Diego (UCSD)v5.1Zestaw narzędzi do analizy ChIP-seq, ATAC-seq oraz RNA w formie początku; obejmuje tworzenie katalogów tagów i profilowanie sygnałów
macs3Inicjatywa Chana Zuckerbergav3.0.3Szczytowe wywoływanie dla zbiorów danych ChIP-seq i ATAC-seq
pigz.v2.8Narzędzie do kompresji wielowątkowej do generowania plików skompresowanych gzip
sambambaUniwersytet Petersburskiv1.0.1Wielowątkowy zestaw narzędzi do przetwarzania plików SAM/BAM
samtoolsWellcome Trust Sanger Institutev1.22.1Narzędzia do przetwarzania i manipulacji plikami SAM/BAM
-ToolsNarodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej (NCBI)v3.2.0Do pobierania plików SRR z bazy danych NCBI
TidyversePosit PBCv2.0.0Kolekcja pakietów R do manipulacji i wizualizacji danych
Trim-GaloreAltos Labs, Cambridge Institute of Sciencev0.6.10Przycinanie podstaw z adapterem i niskiej jakości z użyciem wielogwintowania
Ubuntu 20.04Opracowywanie i testowanie pipeline'u
UCSC-Bedgraphtobigwig Kent Lab, Uniwersytet Kalifornijski Santa Cruzev482Narzędzia do generowania ścieżek sygnałowych bigWig

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  2. Smith, E., Shilatifard, A. Enhancer biology and enhanceropathies. Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).
  3. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nat Rev Genet. 17 (4), 207-223 (2016).
  4. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  5. Plank, J. L., Dean, A. Enhancer function: mechanistic and genome-wide insights come together. Mol Cell. 55 (1), 5-14 (2014).
  6. Alexander, J. M., et al. Brg1 modulates enhancer activation in mesoderm lineage commitment. Development. 142 (8), 1418-1430 (2015).
  7. Huang, J., et al. Dynamic control of enhancer repertoires drives lineage and stage-specific transcription during hematopoiesis. Dev Cell. 36 (1), 9-23 (2016).
  8. Xiong, L., et al. Genome-wide identification and characterization of enhancers across 10 human tissues. Int J Biol Sci. 14 (10), 1321-1332 (2018).
  9. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  10. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  11. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why. Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  12. Barakat, T. S., et al. Functional dissection of the enhancer repertoire in human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 23 (2), 276-288 (2018).
  13. Kim, T. -K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  14. Melgar, M. F., Collins, F. S., Sethupathy, P. Discovery of active enhancers through bidirectional expression of short transcripts. Genome Biol. 12 (11), R113(2011).
  15. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  16. Gorbovytska, V., et al. Enhancer RNAs stimulate Pol II pause release by harnessing multivalent interactions to NELF. Nat Commun. 13 (1), 2429(2022).
  17. Mousavi, K., et al. eRNAs promote transcription by establishing chromatin accessibility at defined genomic loci. Mol Cell. 51 (5), 606-617 (2013).
  18. Hsieh, C. -L., et al. Enhancer RNAs participate in androgen receptor-driven looping that selectively enhances gene activation. Proc Natl Acad Sci. 111 (20), 7319-7324 (2014).
  19. Schaukowitch, K., et al. Enhancer RNA facilitates NELF release from immediate early genes. Mol Cell. 56 (1), 29-42 (2014).
  20. Pnueli, L., Rudnizky, S., Yosefzon, Y., Melamed, P. RNA transcribed from a distal enhancer is required for activating the chromatin at the promoter of the gonadotropin α-subunit gene. Proc Natl Acad Sci. 112 (14), 4369-4374 (2015).
  21. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), eaar3958(2018).
  22. Nair, S. J., et al. Phase separation of ligand-activated enhancers licenses cooperative chromosomal enhancer assembly. Nat Struct Mol Biol. 26 (3), 193-203 (2019).
  23. Lee, J. -H., et al. Enhancer RNA m6A methylation facilitates transcriptional condensate formation and gene activation. Mol Cell. 81 (16), 3368-3385 (2021).
  24. Chen, Q., et al. Enhancer RNAs in transcriptional regulation: recent insights. Front Cell Dev Biol. 11, 1205540(2023).
  25. Moon, J., et al. Embryonic stem cell-specific intragenic enhancer RNA essential for NSUN2-mediated stem cell fate regulation. Int J Biol Macromol. 245, 470(2025).
  26. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. Elife. 10, e65161(2021).
  27. Cheng, F., et al. Intronic enhancers of the human SNCA gene predominantly regulate its expression in brain in vivo. Sci Adv. 8 (47), eabq6324(2022).
  28. Hobson, D. J., Wei, W., Steinmetz, L. M., Svejstrup, J. Q. RNA polymerase II collision interrupts convergent transcription. Mol Cell. 48 (3), 365-374 (2012).
  29. Cinghu, S., et al. Intragenic enhancers attenuate host gene expression. Mol Cell. 68 (1), 104-117 (2017).
  30. Bressin, A., et al. High-sensitive nascent transcript sequencing reveals BRD4-specific control of widespread enhancer and target gene transcription. Nat Commun. 14 (1), 4971(2023).
  31. Lee, J., et al. Introductory analysis and validation of CUT&RUN sequencing data. J Vis Exp. (214), e67359(2024).
  32. How to install Linux on Windows with WSL. , Microsoft. https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install (2025).
  33. Terminal user guide. , Apple. https://support.apple.com/guide/terminal/welcome/mac (2025).
  34. How to open terminal in Linux. , GeeksforGeeks. https://www.geeksforgeeks.org/linux-unix/how-to-open-terminal-in-linux/ (2025).
  35. Simon, A. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Version 0.10.1, (2010).
  36. Krueger, F. Trim Galore!: a wrapper around Cutadapt and FastQC to consistently apply adapter and quality trimming to FastQ files, with extra functionality for RRBS data. Babraham Inst. , (2015).
  37. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 3(2011).
  38. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  39. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  40. Tarasov, A., Vilella, A. J., Cuppen, E., Nijman, I. J., Prins, P. Sambamba: fast processing of NGS alignment formats. Bioinformatics. 31 (12), 2032-2034 (2015).
  41. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  42. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  43. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  44. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  45. Amemiya, H. M., Kundaje, A., Boyle, A. P. The ENCODE blacklist: identification of problematic regions of the genome. Sci Rep. 9 (1), 9354(2019).
  46. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  47. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160(2016).
  48. Wickham, H. ggplot2: elegant graphics for data analysis. , Springer. 189-201 (2016).
  49. Wilke, C. O. cowplot: streamlined plot theme and plot annotations for ggplot2. CRAN Contrib. Packages. , (2015).
  50. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  51. Spicuglia, S., Vanhille, L. Chromatin signatures of active enhancers. Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).
  52. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Res. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  53. Blinka, S., Reimer, M. H., Pulakanti, K., Rao, S. Super-enhancers at the Nanog locus differentially regulate neighboring pluripotency-associated genes. Cell Rep. 17 (1), 19-28 (2016).
  54. Zhao, S., Ye, Z., Stanton, R. Misuse of RPKM or TPM normalization when comparing across samples and sequencing protocols. RNA. 26 (8), 903-909 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Enhancery mi dzygeniczneenhancery intrageniczneanaliza GRO seqdane ATAC seqacetylacja H3K27dane o pikach chromatynykwantyfikacja specyficzna dla niciwykresy agregacji

Powiązane artykuły