Artykuł metodologiczny

Prosta technika mikroaspiracji izolującej komórki somatyczne z kriokonserwowanego nasienia konia jako dawców jądrowych do klonowania

DOI:

10.3791/69404

⸱

19 grudnia 2025

 ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, 3Integrated Cell Culture & Bioimaging Laboratory, Division of Science, Mathematics & Agribusiness, Mayville State University, 4Conservation, Genetics & Biotech, LLC, 5Laboratorio de Manejo de la Reproducción Animal, Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia prostą technikę mikroaspiracji izolującą żywotne komórki somatyczne (SC) z krioprezerwacji nasienia koń. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod, ta technika unika długotrwałych hodowli in vitro i pozwala na natychmiastowe zastosowanie w klonowaniu komórek somatycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasienie to złożony płyn, który oprócz plemników zawiera także inne populacje komórek, w tym komórki odpornościowe, niedojrzałe męskie komórki rozrodcze, komórki nabłonkowe oraz fibroblasty. Te komórki mają stan diploidalny, co czyni je odpowiednimi kandydatami na dawcę jądra do klonowania komórkowego transferu jądra komórkowego (SCNT). Wykazano, że generowanie żywotnych zarodków i potomstwa jest wykorzystywane przy użyciu tych komórek. Skuteczne metody izolowania ich od nasienia obejmują wirowanie i techniki gradientu osmotycznego; jednak do ustanowienia pierwotnych hodowli z tych izolowanych komórek konieczne są długotrwałe okresy hodowli in vitro . Ponadto pobrane próbki zawierały dużą ilość plemników, co utrudnia powstawanie i utrzymanie hodowli in vitro . Do tej pory pierwotne hodowle zostały udane tylko ze świeżych próbek nasienia, podczas gdy próby z wykorzystaniem kriokonserwowanego nasienia konsekwentnie kończyły się niepowodzeniem. To ograniczenie znacząco ogranicza potencjał do generowania klonów z krioprezerwacji próbek nasienia. Niniejsze badanie proponuje prostą metodę opartą na mikroaspiracjach do izolowania komórek somatycznych z kriokonserwowanego nasienia końskiego. Takie podejście pozwala na szybkie pobranie wystarczającej liczby komórek do natychmiastowego zastosowania w procedurach klonowania SCNT.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonowanie komórkowe z transferem jądra komórkowego jest nieocenionym narzędziem do ratowania i rozmnażania osobników o zootechnice i naukowym znaczeniu. Wiele linii komórkowych zostało wykorzystanych jako dawcy jądrowe, w tym komórki pochodzące ze skóry, mięśni, ziarnisków, limfocytów oraz komórek moczu 1,2,3,4. Co ciekawe, nasienie pojawiło się jako nowatorska alternatywa do zbierania komórek somatycznych (SC), które mogą być wykorzystywane jako dawcy jądrowe do klonowania 5,6. To odkrycie jest szczególnie ważne dla ratowania osób, dla których zachowano wyłącznie nasienie. Jednak ustanowienie pierwotnych hodowli z SC wyizolowanych ze zamrożonego nasienia okazało się nieskuteczne i do dziś pozostaje główną przeszkodą w pozyskiwaniu sklonowanych zwierząt z tego źródła 7,8,9. Komórki te prawdopodobnie pochodzą z nabłonka gruczołowego i wyściełki kanalików, z wydzielin nasiennych oraz – co ważne – z zanieczyszczenia nasienia moczem, które jest dobrze znanym źródłem komórek somatycznych o wysokim potencjale proliferacyjnym i niezróżnicowanym3.

Zastosowano różne metody izolowania SC od nasienia, w tym wirowanie5, gradienty osmotyczne 7,8,10 oraz cytometria przepływowa11. Jednak komórki somatyczne, po wyizolowaniu tymi metodami, nadal wymagają optymalnych warunków do przyczepienia, wzrostu i proliferacji8. Specyficzne wymagania tych komórek czynią hodowlę in vitro bardziej skomplikowaną, ponieważ do ustanowienia pierwotnych hodowli komórek potrzebne są długie okresy inkubacji9. Ponadto wysokie stężenie plemników obecnych w próbkach zakłóca zarówno inicjację, jak i utrzymanie tych hodowli5.

W przeciwieństwie do wcześniej opisanych metod, ta technika mikroaspiracji oferuje kilka wyraźnych zalet. Pozwala na selekcję SC na podstawie rozmiaru i morfologii12 oraz umożliwia odzyskiwanie jąder zarówno z komórek żywotnych, jak i nieżywotnych, co jest skutecznie zademonstrowane na zamrożonej tkance bez krioprotektantów13 oraz liofilizowanych komórkach rozrodczych 14,15,16. Co ważne, SC mogą być stosowane bezpośrednio po rozmrażaniu nasienia, co zmniejsza ryzyko błędów ploidialnych typowych związanych z długotrwałą hodowlą in vitro pierwotnych komórek somatycznych stosowanych do klonowania zwierząt17,18. Technika koncentruje się konkretnie na krioprezerwacji nasienia końskiego, co pozwala natychmiast pobrać odpowiednią liczbę SC dla SCNT12.

Wytwarzanie mikropipet oraz rozwój technik mikroaspiracji znacznie się rozwinęły w ostatnich dekadach. Wykorzystanie tych narzędzi umożliwia precyzyjną manipulację gametami, embrionami i ich cytostrukturami, tworząc nowe możliwości w dziedzinie biotechnologii rozrodczej (https://www.jove.com). Techniki mikromanipulacji umożliwiają ocenę właściwości mechanicznych komórek i dostarczają cennych informacjio ich stanie fizjologicznym, jednak ta dziedzina pozostaje stosunkowo niezbadana.

Do tej pory żadne badania nie wykazały skutecznej metody izolowania SC od nasienia przy użyciu jakiejkolwiek odmiany procedur mikromanipulacji. Biorąc pod uwagę ograniczenia konwencjonalnych metod izolacji, niniejsze badanie proponuje praktyczny protokół oparty na mikroaspiracji, który izoluje SC z krioprezerwacji nasienia końskiego, umożliwiając ich natychmiastowe zastosowanie w somatycznych procedurach klonowania po pobraniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki nasienia z kriokonserwacji, przechowywane przez ponad 19 lat w ciekłym azocie, zostały pozyskane od komercyjnych dystrybutorów zatwierdzonych przez odpowiednie organy weterynaryjne w Meksyku, zgodnie z meksykańskim oficjalnym standardem NOM-027-ZOO-1995, który reguluje proces zoosanitarny pozyskiwania nasienia zwierząt domowych. Wszystkie próbki nasienia, niezależnie od tego, czy były użyte, czy nieodpowiednie do analizy, zostały inaktywowane i zdezinfikowane zgodnie z protokołami instytucjonalnego bezpieczeństwa biologicznego oraz obowiązującymi przepisami, w tym NOM-087-ECOL-SSA1-2002 do zarządzania odpadami biologiczno-zakaźnymi w Meksyku. Resztki kwasu fluorowodorowego (HF) były bezpiecznie neutralizowane pod osłoną oparową poprzez powolne przelanie go do plastikowego pojemnika i stopniowe dodawanie małych porcji CaCO3 lub Ca(OH)2, aż emerwacja ustała, tworząc nierozpuszczalny CaF2. pH zneutralizowanej zawiesiny potwierdzono na poziomie od 6 do 8, zanim została ona objęta traktowaniem jako odpadów chemicznych nieorganicznych zgodnie z lokalnymi przepisami. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Wytwarzanie igieł mikropipet do izolacji komórek somatycznych

  1. Wybrane kapilary szkła borokrzemowego (1,0 mm O.D. × 0,78 mm I.D. × 100 mm).
  2. Użyj mikropipety, aby uzyskać drobno końcówki naczyń włosowatych. Dostosuj punkt cięcia, aby zmienić średnicę grotu.
  3. Włóż kapilarę do wyciągacza i mocno ją zablokuj.
  4. Po wyciągnięciu ostrożnie zdejmij mikropipetę i umieść ją poziomo na mikrokuźni.
  5. Ustaw podgrzewacz i mikropipetę w polu widzenia mikroskopu.
  6. Zlokalizuj punkt cięcia za pomocą siatki celownika okularu (Rysunek 1A,B).
  7. Przyłóż końcówkę mikropipety do szklanej kulki (na żarniku grzewczym).
  8. Stopniowo zwiększ temperaturę, aż końcówka wtopi się w koralik.
    1. Wyłącz grzejnik.
    2. Pozwól, by końcówka przylegała do kulki i się rozdzieliła.
      UWAGA: Nie jest konieczne zginanie mikropipety; można go używać w formie prostej. Jednak jeśli operator preferuje taką preferencję, można utworzyć kąt (rysunek 1C).
  9. Nie wygładzaj końcówki, ponieważ ten krok nie jest potrzebny w zabiegu.
  10. Czyść końcówki pipety, zanurzając każdą końcówkę przez ~10 sekund kolejno w:
    1. 20% kwasu fluorowodorowego (HF).
      UWAGA: Kwas fluorowodorowy jest wysoce toksyczny i. Używaj środków ochrony osobistej wskazanych przez dostawcę. Podkreślaj stosowanie ochrony oczu/twarzy, rękawiczek i fartucha laboratoryjnego, a zawsze pracuj w kapturze przeciwspalinowej.
    2. Sterylna, podwójnie destylowana woda.
    3. Absolutny etanol.
      UWAGA: Aby ułatwić mycie końcówki pipety, przygotuj powyższe roztwory w sterylnych tubkach Corning o pojemności 15 mL.
  11. Susz mikropipety w piekarniku w temperaturze 50 °C.
  12. Przechowuj mikropipety w sterylnym pojemniku.

2. Układ mikroaspiracji

  1. Sprawdź, czy system mikroaspiracji działa prawidłowo, a joystick jest umieszczony na środku panelu sterowania.
  2. W przypadku systemów używających oleju upewnij się, że nie ma w nim pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one wpływać na precyzję ruchu.
  3. Włóż mikropipetę aspiracji komórek somatycznych do manipulatora trzymającego po stronie dominującej ręki operatora.
    UWAGA: Wymień mikropipetę na nową, jeśli czubek zatkał się podczas pobierania komórek somatycznych.

3. Rozmrażanie i rozcieńczanie kriopkonserwowanego nasienia końskiego

  1. Wyjmij słomki z ciekłego azotu, wystaw na działanie powietrza przez 10 sekund i rozmraź w 37 °C przez 30 sekund.
  2. Pierwsze rozcieńczenie nasienia: Pobierz próbkę z rozmrożonego nasienia (250 μL) i rozcieńcz 1,0 mL DMEM/F12 w podłożu, uzupełnionym 10% surowicą płodową, 0,1 mg/mL surowicą bydłą, 12,5 μM β-merkaptoetanolu oraz 1% antymikotycznym.
    1. Inkubuj mieszankę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  3. Drugie rozcieńczenie nasienia: Pobierz 25 μL z pierwszego rozcieńczenia, rozcieńcz je w 975 μL 1x DPBS z dodatkiem 0,1 mg/mL poli(alkohol winylowy) (PVA) lub poliwinylpirolidonu (PVP), umieść w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i delikatnie wymieszaj.
    1. Utrzymuj tę mieszankę w temperaturze 37 °C przez cały proces pobierania komórek.

4. Przygotowywanie dań do kolekcji SC

  1. Zbieraj SC za pomocą dwóch pokrywek z naczyń hodowlanych o średnicy 35 mm.
  2. Przygotuj pierwszą pokrywkę w następujący sposób (pokrywka #1, rysunek 2A).
    1. Pobierz 100 μL drugiego rozcieńczenia nasienia i umieść je w środku pokrywki (patrz Rysunek 2A).
    2. Wykonaj drugą mikrokroplę (10 μL) 1x DPBS uzupełnioną 0,1 mg/mL PVA lub PVP na wierzch pierwszej kropli (patrz Rysunek 2A).
    3. Obie mikrokrople całkowicie pokryj olejem parafinowym, aby zapobiec parowaniu i utrzymać stabilność temperatury podczas aspiracji SC.
  3. Przygotuj drugą pokrywkę, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe i towarzyszące plemniki (pokrywka #2, rysunek 2B).
    1. Umieść trzy krople po 30-50 μL 1x DPBS z 0,1 mg/mL PVA lub PVP na środek pokrywki; Nie pokrywaj ich olejem mineralnym.
      UWAGA: Przygotuj tę miskę hodowlę dopiero po wybraniu wszystkich komórek somatycznych, aby zapobiec zmianom właściwości fizykochemicznych roztworu DPBS spowodowanym ekspozycją na powietrze.
  4. Wszystkie etapy mikroaspiracji wykonuj pod mikroskopem odwróconym w temperaturze pokojowej. Unikaj nagłych zmian temperatury.

5. Procedura mikroaspiracji izolującej SC z kriokonserwowanego nasienia koni

  1. Umieść pierwszą pokrywkę (wieko #1, rysunek 2A) na scenie mikroskopu, gotową do zbierania SC.
  2. Wybierz mikropipetę o odpowiedniej średnicy, aby zebrać SC i podłączyć ją do mechanicznego systemu aspiracji.
  3. Ostrożnie włóż mikropipetę do mikrokropli i wyrównuj ją z dnem pokrywki naczynia. Gdy pipeta osiągnie aspirujące medium hodowlane, rozpocznij indywidualne wychwytywanie SC.
  4. Na dole talerza powinny być widoczne różne morfologie komórek (Rysunek 3).
  5. Umieść końcówkę mikropipety obok każdego SC i zasysaj je pod podciśnieniem. Aspiruj komórki okrągłe i wydłużone, niezależnie od ich rozmiaru. Objętość aspiracji różni się w zależności od przechwytu SC.
  6. Po przechwyceniu 10 komórek umieść je w mikrokropli umieszczonej na górze (10μL) (Rysunek 2A). Powtarzaj ten krok, aż uzyskasz wymaganą liczbę SC do eksperymentu klonowania.
  7. Trzymaj wszystkie przechwycone komórki somatyczne w tym mikrokroplu przez cały proces pobierania.
  8. Po uzyskaniu wymaganej liczby SC do klonowania wykonaj prostą procedurę mycia za pomocą mikrokropli do usunięcia towarzyszących plemników, zanieczyszczenia komórkowych i zanieczyszczeń mikroorganizmów.
  9. Weź drugą pokrywkę naczynia i wykonaj kolejne, trzystopniowe mycie SC (pokrywka #2, rysunek 2B):
    1. Uchwyć komórki somatyczne mikropipetą i ostrożnie nałożyć je na powierzchnię pierwszej kropli. Pozwól im zadowolić się 3-5 minutami (Rysunek 2B; Drop #1).
    2. Powtórz krok 5.9.1 i włóż je do drugiej kropli (Rysunek 2B; Drop #2).
    3. Powtórz krok 5.9.1 i umieść komórki somatyczne w trzeciej kropli (Rysunek 2B; Drop #3).
  10. Jako ostatni krok, złóż izolowane komórki somatyczne do ostatniej mikrokropli przygotowanej do dalszego wykorzystania w procedurach transferu jądra komórek somatycznych (Rysunek 4D).
    UWAGA: Aspiruj SC w możliwie najmniejszej średniej objętości podczas każdego ponownego wychwytu, aby zminimalizować plemniki, zanieczyszczenia i zanieczyszczenia mikrobiologiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tabela 1 pokazuje, że technika mikroaspiracji skutecznie odzyskuje komórki somatyczne z krioprezerwacji nasienia końskiego, z tempem wychwytywania od 317,7 ± 9,60 do 424,7 ± 33,65 komórek/godzinę u trzech ogierów. Ogier #03 miał najwyższą wydajność, co potwierdza skuteczność metody nawet przy długotrwałym przechowywaniu próbek. Dane wskazują, że technika konsekwentnie i skutecznie izoluje komórki somatyczne od nasienia, a średnie tempo wychwytywania i odchylenia standardo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikromanipulacja komórkami i gametami umożliwiła uproszczenie złożonych technik wspomaganego rozrodu. Przykładami takich przykładów są klonowanie somatyczne metodą Ręcznego Klonowania21, wspomagane wyklucie22, intracytoplazmatyczne wstrzykiwanie plemników (ICSI)23 oraz mikroiniekcje pronuklearne u zygot24, między innymi.

Opracowanie skutecznych metod izolowania komórek somatycznych od nasienia jest ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Laboratorium Zarządzania Reprodukcji, Katedrze Produkcji Rolnej i Zwierzęcej Uniwersytetu Autónoma Metropolitana-Xochimilco (UAM-X) za wsparcie techniczne i logistyczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 beta MerkaptoetanolSIGMAM7522Hodowla komórek somatycznych
1x DPBSGIBCOREF-21600010Manipulacja komórkami somatycznymi
Absolutny etanolHYCELEL CRISOL 50181-1L73Do produkcji pipetek
Antybiotykowo-antymikotyczny 100xINVITRO SA. Mé xicoHodowla komórek somatycznych
Naczynia włosowate borokrzemkowe (1,0 mm O.D. & razy; 0,78 mm I.D. & razy; 100 mm długości)APARAT HARVARDU, USAEC1-30-0035Do produkcji pipetek
BSASIGMAA3311Hodowla komórek somatycznych
Medium DMEM/F12GIBCOREF-12500-062Hodowla komórek somatycznych
Próbka kriokonserwowanego nasienia koniaPróbki nasienia z kriokonserwacji zostały pozyskane od komercyjnego dystrybutora i były przechowywane przez ponad 19 lat w ciekłym azocie. Wszystkie mrożone próbki nasienia koni zostały pobrane od komercyjnych dystrybutorów zatwierdzonych przez odpowiednie organy weterynaryjne w Meksyku, zgodnie z Meksykańskim Oficjalnym Standardem NOM-027-ZOO-1995, Zoosanitarny proces nasienia zwierząt domowych.
Celownik okularuNarzędzie do wytwarzania pipetekWymagany sprzęt
Serum bydlęce płodoweGIBCOREF-26140-079Hodowla komórek somatycznych
Kwas fluorycznySIGMA-ALDRICH339261Do produkcji pipetek
Mikroskop optyczny odwróconyZaćmienie, TE 200NIKONMikromanipulacja komórkami somatycznymi
Laboratory  Suchy piekarnikNarzędzie do wytwarzania pipetekWymagany sprzęt
MicroforgeNarzędzie do wytwarzania pipetekWymagany sprzęt
Zestaw mikromanipulatorów dla mikroskopu odwróconegoMikromanipulacja komórkamiWymagany sprzęt
Mikropipeta wyciągaczP-97, SUTTER INSTRUMENTNarzędzie do wytwarzania pipetekUżyj następujących ustawień/mdash; Ciepło: 720; Przyciąganie: 30; Prędkość: 50; Czas: 220; Ciśnienie
Olej mineralnySIGMAM8410Manipulacja komórkami somatycznymi
Nunclon  naczynia hodowli komórkowych, średnica i czas; H 35 mm i razy; 10 mmNUNKLONNunc 153066
PVASIGMAP8136Hodowla komórek somatycznych
PVPSIGMAP5288Hodowla komórek somatycznych
Roztwór trypanu niebieskiego 0,4%GIBCOREF- 15250061Barwnik komórkowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, A., Gupta, S. C., Gupta, N. Comparative potential of cultured skin fibroblast, cumulus, and granulosa cell to produce somatic cell nuclear transfer (SCNT) preimplantation embryos in buffaloes (Bubalus bubalis) in relation to gene expressions. Cell Reprogram. 12 (3), 357-368 (2010).
  2. Galli, C., Duchi, R., Moor, R. M., Lazzari, G. Mammalian leukocytes contain all the genetic information necessary for the development of a new individual. Cloning. 1 (3), 161-170 (1999).
  3. Olsson, P. O., Yeonwoo, J., Park, K., Yoo, Y. M., Hwang, W. S. Live births from urine derived cells. PLoS One. 18 (1), e0278607(2023).
  4. Vignon, X., et al. Developmental potential of bovine embryos reconstructed from enucleated matured oocytes fused with cultured somatic cells. C R Acad Sci III. 321 (9), 735-745 (1998).
  5. Nel-Themaat, L., et al. Isolation, culture and characterisation of somatic cells derived from semen and milk of endangered sheep and eland antelope. Reprod Fertil Dev. 19 (4), 576-584 (2007).
  6. Kjelland, M. E., Liu, J., Hyatt, D., Kraemer, D. Collection, isolation, and culture of somatic cells from avian semen. Avian Biol Res. 6 (4), 255-260 (2013).
  7. Nel-Themaat, L., et al. Cloned embryos from semen. Part 1: in vitro proliferation of epithelial cells on embryonic fibroblasts after isolation from semen by gradient centrifugation. Cloning Stem Cells. 10 (1), 143-160 (2008).
  8. Liu, J., et al. Evaluation of culture systems for attachment and proliferation of epithelial cells cultured from ovine semen. Anim Reprod Sci. 115 (1-4), 49-57 (2009).
  9. Liu, J., et al. Embryo production and possible species preservation by nuclear transfer of somatic cells isolated from bovine semen. Theriogenology. 74 (9), 1629-1635 (2010).
  10. Saini, M., et al. Isolation and culture of epithelial cells from stored buffalo semen and their use for the production of cloned embryos. Reprod Fertil Dev. 31 (10), 1581-1588 (2019).
  11. Brom-de-Luna, J. G., Canesin, H. S., Wright, G., Hinrichs, K. Culture of somatic cells isolated from frozen-thawed equine semen using fluorescence-assisted cell sorting. Anim Reprod Sci. 190, 10-17 (2018).
  12. Ramos, B., Rodríguez, A. A., Rosales, A. M., Montiel, A. J., Hernández, J. E. Identification of somatic cell populations in cryopreserved equine semen as a source of donor nuclei for somatic cloning: preliminary results. Reprod Fertil Dev. 37 (1), (2025).
  13. Moulavi, F., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer in Asiatic cheetah using nuclei derived from post-mortem frozen tissue in absence of cryo-protectant and in vitro matured domestic cat oocytes. Theriogenology. 90, 197-203 (2017).
  14. Wakayama, S., Ito, D., Ooga, M., Wakayama, T. Production of mouse offspring from zygotes fertilized with freeze-dried spermatids. Sci Rep. 12 (1), 18430(2022).
  15. Wakayama, S., Ito, D., Hayashi, E., Ishiuchi, T., Wakayama, T. Healthy cloned offspring derived from freeze-dried somatic cells. Nat Commun. 13 (1), 3666(2022).
  16. Loi, P., Fulka, J., Hildebrand, T., Ptak, G. Genome of non-living cells: Trash or recycle. Reproduction. 142 (4), 497-503 (2011).
  17. Wakayama, S., Wakayama, T., Wells, D. N. Encyclopedia of Life Sciences. , 1-10 (2023).
  18. Lanza, R., et al. Extension of cell life-span and telomere length in animals cloned from senescent somatic cells. Science. 288, 665-669 (2000).
  19. González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophys J. 116 (4), 587-594 (2019).
  20. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. J Biomech. 33 (1), 15-22 (2000).
  21. Vajta, G., et al. Production of a healthy calf by somatic cell nuclear transfer without micromanipulators and carbon dioxide incubators using the handmade cloning (HMC) and the submarine incubation system (SIS). Theriogenology. 62 (8), 1465-1472 (2004).
  22. Alteri, A., et al. Revisiting embryo assisted hatching approaches: A systematic review of the current protocols. J Assist Reprod Genet. 35 (3), 367-391 (2018).
  23. Briski, O., Salamone, D. F. Past, present and future of ICSI in livestock species. Anim Reprod Sci. 246, 106925(2022).
  24. Wall, R. J. Pronuclear microinjection. Cloning Stem Cells. 3 (4), 209-220 (2001).
  25. Selokar, N. L., et al. Hope for restoration of dead valuable bulls through cloning using donor somatic cells isolated from cryopreserved semen. PLoS One. 9 (3), e90755(2014).
  26. Selokar, N. L., et al. Buffalo (Bubalus bubalis) SCNT embryos produced from somatic cells isolated from frozen-thawed semen: Effect of trichostatin A on the in vitro and in vivo developmental potential, quality and epigenetic status. Zygote. 24 (4), 549-553 (2016).
  27. Guevorkian, K., Maître, J. L. Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo. Methods Cell Biol. 139, 187-201 (2017).
  28. Duah, E. K., et al. Production of hand-made cloned buffalo (Bubalus bubalis) embryos from nonviable somatic cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 52 (10), 983-988 (2016).
  29. Loi, P., et al. Nuclei of nonviable ovine somatic cells develop into lambs after nuclear transplantation. Biol Reprod. 67 (1), 126-132 (2002).
  30. Fahrudin, M., Otoi, T., Suzuki, T. Developmental competence of bovine embryos reconstructed by the transfer of somatic cells derived from frozen tissues. J Vet Med Sci. 63 (10), 1151-1154 (2001).
  31. Podico, G., et al. Single-layer colloid centrifugation as a method to process urine-contaminated stallion semen after freezing-thawing. J Equine Vet Sci. 87, 102910(2020).
  32. Zhang, Y. T., et al. Evaluation of porcine urine-derived cells as nuclei donor for somatic cell nuclear transfer. J Vet Sci. 23 (2), e40(2022).
  33. Mizutani, E., et al. Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells. Sci Rep. 6, 23808(2016).
  34. Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: a guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129(2022).
  35. Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
  36. Graber, M., Lane, B., Lamia, R., Pastoriza-Munoz, E. Bubble cells: Renal tubular cells in the urinary sediment with characteristics of viability. J Am Soc Nephrol. 1 (7), 999-1004 (1991).
  37. Rahmanian, N., Bozorgmehr, M., Torabi, M., Akbari, A., Zarnani, A. H. Cell separation: Potentials and pitfalls. Prep Biochem Biotechnol. 47 (1), 38-51 (2017).
  38. Håård, M. Use of frozen stallion semen in Europe. Acta Vet Scand Suppl. 88, 123-127 (1992).
  39. Klug, E., Treu, H., Hillmann, H., Heinze, H. Results of insemination of mares with fresh and frozen stallion semen. J Reprod Fertil Suppl. 23, 107-110 (1975).
  40. Pukazhenthi, B., Comizzoli, P., Travis, A. J., Wildt, D. E. Applications of emerging technologies to the study and conservation of threatened and endangered species. Reprod Fertil Dev. 18 (1-2), 77-90 (2006).
  41. Swanson, W. F., Magarey, G. M., Herrick, J. R. Sperm cryopreservation in endangered felids: developing linkage of in situ-ex situ populations. Soc Reprod Fertil Suppl. 65, 417-432 (2007).
  42. Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: Advancements and problems. Cell Reprogram. 15 (5), 374-384 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Microaspiration TechniqueSomatic Cell IsolationCryopreserved Equine SemenNuclear Donor CellsSomatic Cell Nuclear TransferEquine CloningCell Morphology SelectionMicropipette AspirationSequential Cell WashingDiploid Cell Recovery

Powiązane artykuły