Artykuł metodologiczny

Barwienie peroksysomów w komórkach ssaków za pomocą sond specyficznych dla peroksysomów

DOI:

10.3791/69405

⸱

19 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, University of Southampton, 2The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University, 3Biosciences, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, 4Institute of Bioengineering, Faculty of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), 5Biomolecular Screening Facility, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), 6Conquest

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sondy PeroxiSPY są używane do wykrywania peroksysomów w komórkach ssaków. Tutaj pokazujemy, jak używać sond do barwienia peroksysomów w żywych i stałych komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peroksysomy to wszechobecne organelli, odgrywające istotną rolę w zdrowiu człowieka, a ich dysfunkcja prowadzi do spektrum zaburzeń genetycznych. Wizualizacja peroksysomów jest kluczowa do identyfikacji dysfunkcji peroksysomów; Jednak postępy zostały ograniczone przez brak sond specyficznych dla peroksysomów. Opracowując PeroxiSPY, sondy specyficzne dla peroksysomów naśladujące naturalne metabolity peroksysomów, umożliwiliśmy w czasie rzeczywistym wykrywanie, śledzenie i ilościowe określanie dynamiki peroksysomów w żywych komórkach ssaków. Dodatkowo, zastosowania tej techniki u komórek pacjentów z zaburzeniami peroksysomowymi ujawniają fenotypy patologiczne. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół wykrywania peroksysomów w żywych komórkach ssaków, a także wykrywania peroksysomów po barwieniu w komórkach stałych. Pokazujemy, jak barwić peroksysomy w żywych komórkach za pomocą sond specyficznych dla peroksysomów, koncentrując się na przygotowaniu komórek, czasie zabiegu, powtarzalności i rozwiązywaniu problemów. Sondy te umożliwiają szybkie, specyficzne i nietoksyczne wykrywanie peroksysomów w żywych komórkach, oferując unikalną, ilościową metodę oceny funkcji peroksysomów i ich dysfunkcji w zaburzeniach związanych z peroksysomami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peroksysom jest najliczniejszym organellem eukariotycznym, z niektórymi komórkami przekraczającymi tysiąc peroksysomów1. Ich funkcje są kluczowe dla rozwoju organizmu i adaptacji metabolicznej 1,2, co potwierdzają różne ludzkie zaburzenia peroksysomowe, zazwyczaj nieuleczalne neurodegeneracyjne i neurometaboliczne schorzenia u małych dzieci 3,4. Z naszej wiedzy wynika, że wcześniej brakowało selektywnych metod oznaczania peroksysomów w żywych komórkach i tkankach. Narzędzia te są nieocenione w badaniach i zastosowaniach diagnostycznych, umożliwiając bezpośrednie i ilościowe pomiary kilku aspektów powstawania i funkcji peroksysomów6. Te sondy są na tyle wszechstronne, że z jednej strony dostarczają ilościowego odczytu funkcji peroksysomu w komórkach, a z drugiej strony mogą być stosowane w testach skuteczności translacyjnej lub jako diagnostyka zaburzeń peroksysomów6. Barwienie PeroxiSPY to szybka, specyficzna, niecytotoksyczna technika wykrywania peroksysomów w nieinwazyjnych żywych komórkach. Tutaj opisujemy, jak barwić peroksysomy w liniach komórkowych ssaków za pomocą sond peroksysomowych (sondy wykazały również specyficzne barwienie peroksysomów w embrionach danio pręgowanego, ale nie są odpowiednie do barwienia peroksysomów w komórkach roślin Arabidopsis thaliana 6). Barwienie można wykonać w mniej niż 10 minut. Sonda może być wykrywana przez wiele godzin lub fiksowana za pomocą protokołu utrwalania paraformaldehydu do dalszego immunobarwienia.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Barwienie żywych komórek

  1. Przygotowanie hodowli komórek do obrazowania żywych komórek (czas: 24 godziny)
    UWAGA: Badanie stosowało standardowe protokoły hodowli komórek we wszystkich eksperymentach. Linie komórkowe były utrzymywane w DMEM lub DMEM/F12 dla SH-SY5Y, uzupełnione o 10% surowicy płodowej bydła (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C oraz 5%CO2. Niektóre systemy obrazowania są wrażliwe na skład ośrodka. Jeśli mikroskop wykryje sygnał z czerwieni fenolowej w ośrodku, należy użyć alternatyw wolnych od fenolu czerwonego. Dodatkowo, jeśli mikroskop nie jest wyposażony w komoręCO2 , zamień ośrodek na medium zawierające HEPES (pH 7,4).
    1. Dzień przed eksperymentem rozdziel komórki na szklaną płytę obrazującą, aby następnego dnia osiągnąć 30-70% konfluencję.
      UWAGA: W tym protokole stosowano płytki 4-wiertowe o średnicy 35 mm.
      1. (Krytyczne) Nie używaj wygłodniałych lub zestresowanych komórek do rozdzielania na potrzeby eksperymentu. Upewnij się, że linie komórkowe regularnie zmieniają świeże media (co najmniej co 2-3 dni) i są rozdzielane zanim osiągną 90% konfluencji. Celem jest posiadanie zdrowej linii komórkowej, aby zapewnić jednolite barwienie.
        UWAGA: Niektóre komórki, np. komórki macierzyste, wymagają powlekania szkłem odpowiednią warstwą powłoki, np. Matrigel, która nie przeszkadza w barwieniu.
  2. Przygotowanie zestawu obrazowego (czas trwania: 1 godzina)
    UWAGA: Obrazowanie organelli i dynamiki organelli wymaga wysokiej rozdzielczości przestrzennej. Do tego protokołu użyto mikroskopu konfokalnego wyposażonego w moduł fotopowielacza GaAsP, komoręCO2 oraz jednostkę do regulacji temperatury. Obrazowanie wykonano w trybie dwukierunkowego skanowania galwanometru z obiektywem CFI Plan Apo Lambda 60x oil NA 1.42, a do sondy 555 zastosowano laser o mocy 561 nm (50 mW). Użyj lasera 640 nm lub odpowiednika do sondy 650. Peroksysomy były wizualizowane w ludzkich liniach komórkowych. Czas inkubacji sondami może się różnić w zależności od linii komórkowych. Zaleca się optymalizację czasu poprzez wizualizację komórek w różnych punktach po barwieniu (Rysunek 2A).
    1. Inicjuj układ konfokalny. Upewnij się, że stężenieCO2 i temperatura (37 °C) są ustabilizowane przez 20 minut przed rozpoczęciem barwienia i wprowadzeniem komórek pod mikroskop.
      UWAGA: (Krytyczne) Niezbędne jest zweryfikowanie, czy komórki pozostają zdrowe przez cały eksperyment poprzez wizualną inspekcję oraz utrzymanie pH i temperatury podłoża. Można to osiągnąć poprzez wykorzystanie jednostek sterujących parametrów i wizualną analizę koloru medium, jeśli używa się czerwieni fenolowej. Do tego można użyć regulatorów temperatury iCO2 .
    2. Ustaw oprogramowanie mikroskopu konfokalnego. Uruchom oprogramowanie i włącz laser 561 nm do barwienia sondą 555. Dostosuj parametry akwizycji i mocy lasera. Protokół ten wykorzystuje 1% mocy lasera, wzmocnienie HV (wzmocnienie) 100 oraz rozdzielczość 1024 1024 pikseli z 3 zoomami do obrazowania komórek.
  3. Barwienie peroksysomem (czas trwania: 1-5 min)
    1. Pipeta to aliquot sondy dla końcowego stężenia roboczego 1 μM, np. dla 0,5 mL ośrodka, pipeta 0,5 μL sondy.
    2. Wybierz dołek do bejcowania i oznacz go na zewnątrz markerem.
    3. Z wybranego dołku pipetować cały (0,5 mL) medium i przeprowadzić je do rurki mikrowirówki zawierającej aliquot sondy z etapu 1.3.1.
      UWAGA: Kluczowe jest usunięcie wszystkich mediów z studni na tym etapie, aby zapewnić jednolite barwienie.
    4. Pipetą połącz w górę i w dół trzy razy, żeby połączyć nośnik z sondą. Wssaj całą mieszankę do pipety.
      UWAGA: Zamiast pipetowania można stosować mieszanie przez wirowanie.
    5. Dozuj mieszankę z powrotem do wybranej studni kropla po kroplu, upewniając się, że pipeta styka się ze ścianą studni. Po ponownym wlaniu mieszanki do studni rozpocznij 10-minutowy timer.
    6. Zamknij pokrywkę, dodaj kroplę oleju immersyjnego na obiektyw (ten protokół wykorzystuje obiektyw olejowy 60×) i umieść płytkę na mikroskopie do obrazowania.
      UWAGA: Zaleca się optymalizację stężenia sondy dla każdej linii komórkowej, aby zapewnić jednolite barwienie. Zaleca się badanie w stężeniach 0,25, 0,5, 1 i 2 μM przez 5-20 minut; niższe stężenia zazwyczaj barwią się o niższym tle (Rysunek 2A). W zależności od linii komórkowej i czułości detektora mikroskopu, barwione komórki można obrazować od 5 minut po dodaniu sondy do 24 godzin po dodaniu. W niektórych przypadkach, na przykład obrazowanie komórek macierzystych, wizualizacja komórek może trwać ponad 180 minut po dodaniu sondy bez zmiany sygnału. W dowolnym momencie można zmienić nośnik, aby wypłukać sondę. To prowadzi do stopniowej utraty barwienia w ciągu około 30 minut dla HEK293T komórek.
  4. Konfokalne obrazowanie peroksysomów w żywych komórkach (czas trwania: 10 min-3 godziny)
    1. Gdy płytka zostanie umieszczona na mikroskopie, dostosuj ostrość na komórki w dołku, które są barwione, i rozpocznij obrazowanie.
    2. Gdy ogniwa są ostre, dostosuj wzmocnienie (czułość HV lub detektora) oraz ustawienia mocy lasera, stosując standardowe zasady ustawienia mikroskopu konfokalnego.
    3. Znajdź i pozycjonuj (Zoom-In) na grupie komórek. Po skupieniu ostrości na komórkach dostosuj parametry akwizycji do wymaganej jakości obrazu.
      1. Ustaw parametry obrazowania do akwizycji obrazu: 0,5-1% mocy lasera, 100 HV (wzmocnienie) w oprogramowaniu NIS-Elements. Sprawdź, czy obraz nie jest przesycony (jeśli tak, zmień intensywność i wzmocnienie).
      2. Wybierz rozmiar skanu. Pobierz 1024 obrazy o długości 1024 pikseli, prędkość skanowania (1/2-1/4), uśrednianie linii (2), powiększenie (3) odpowiednie do wykonywanego obrazowania.
        UWAGA: Peroksysomy przesuwają się podczas akwizycji obrazu, co może prowadzić do powstawania artefaktów. Zalecane parametry są zoptymalizowane tak, aby zminimalizować ślady ruchu, jednocześnie zapewniając odpowiednią jakość obrazów do ilości. Podczas tworzenia time-lapse upewnij się, że przed rozpoczęciem filmu określono interwał, czas trwania i pętle. Sondy są fotowalne.
    4. Pobierz i zapisz wszystkie obrazy z dostępnymi etykietami (tutaj używany jest format oprogramowania Nikon .nd2 NIS-Elements).

2. Barwienie komórek stałych

  1. Przygotowanie hodowli komórek do obrazowania żywych komórek (czas: 24 godziny)
    UWAGA: Stosowano standardowe protokoły kultywacji komórek we wszystkich eksperymentach. Komórki Huh7 były utrzymywane w DMEM/F12 z dodatkiem 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, w temperaturze 37 °C i 5%CO2.
    1. Dzień przed eksperymentem podziel komórki na płytkę z pokrywkami, aby następnego dnia uzyskać 30-70% konfluentności.
      UWAGA: Zasiewaj 50 000 komórek/studnię na płytach 12-dołkowych z pokrywkami 18 mm lub 15 000 komórek/odwierć na płytach 24-dołkowych z pokrywkami 13 mm.
  2. Barwienie peroksysomem (czas trwania: 1-5 min)
    1. Rozcieńcz sondę nowym medium do końcowego stężenia roboczego 4 μM w pustej, światłoczułej mikrowirówce, np. dla 0,5 mL medium pipetą 2 μL sondy (roztwór zapasowy: 1 mM).
    2. Wybierz dołek do bejcowania i oznacz go na zewnątrz markerem.
    3. Z wybranego otworu zasysaj cały (0,5 mL) medium i zamień je na medium sondujące od kroku 2.2.1. Podawaj medium sondowego do wybranego dołka kropla po kroplu, upewniając się, że pipeta styka się ze ścianą studni.
    4. Po ponownym włożeniu mieszaniny do studni inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 10-15 minut.
      UWAGA: Od tej chwili ogniwa są światłoczułe i powinny być pokryte folią aluminiową.
  3. Fiksacja po barwieniu i peroksysomy obrazowania w ustalonych komórkach
    1. Po barwieniu ostrożnie usuń medium i dwukrotnie przemyj komórki solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS).
    2. Stosuj 4% roztwór paradehydu (PFA) w PBS w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    3. Ostrożnie usuń PFA do specjalnie wyznaczonego pojemnika na odpady. Umyj komórki raz za pomocą PBS.
      UWAGA: PFA jest toksyczna i musi być utylizowana zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
    4. Aby przejść do immunofluorescencji, postępuj zgodnie z poniższymi krokami
      1. Dodaj 0,5% Triton-X (rozcieńczony w PBS), aby przeniknąć komórki. Wyjedź na 2,5 minuty.
      2. Ostrożnie usuń Triton-X. Myj komórki dwa razy, przez 10 minut z PBS.
      3. Blokuj z 5% roztworem surowicy bydłej (BSA) w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C.
      4. Przejdź do standardowego zabiegu immunofluorescencji.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sondy PeroxiSPY są zaprojektowane tak, aby naśladować naturalne podłoża peroksysomów – rozgałęzionych i bardzo długołańcuchowych kwasów tłuszczowych5. W związku z tym barwienie spowoduje zależny od adenozynotrifosforanu (ATP) importu kasetowych podrodziny D (ABCD) sond z cytoplazmy do peroksysomów 5,6,7. W zależności od stanu metabolicznego komórki, transport ABCD zależny od ATP może efektywnie i szybko importować sondy, co skutkuje wysokim stosunkiem intensywności fluorescencji peroksysomów do cytoplazmy (Rysunek 1A). Kluczowe kroki mające na celu zapewnienie wysokiego stosunku obejmują unikanie głodzenia komórek poprzez regularną wymianę podłoża komórkowego oraz niewzrost komórek przy dużej konfluencji.

Aby zweryfikować specyficzność barwienia peroksysomem, zaleca się uwzględnienie kilku środków kontrolnych (Rysunek 1B,C). Analiza współlokalizacji z użyciem referencyjnego markera peroksisomalnego, na przykład markera importu białek - GFP-SKL (rysunek 1B,C). Dodatkowo, jeśli dostępne są linie komórkowe z niedoborem peroksysomu, np. PEX19 KO, barwienie będzie nieobecne w tych komórkach (rysunek 1B)5,8.

Sondy peroksysomowe mogą być używane do pomiaru gęstości peroksysomów (rysunek 1C)5,9 i są rozwijane w celu oceny importu podłoża, dynamiki peroksysomów oraz interakcji. W przypadku obrazowania ilościowego ważne jest ustandaryzowanie procedury barwienia, czasu akwizycji obrazu (np. 10-20 minut po barwieniu), przygotowania linii komórkowej oraz parametrów pozyskiwania. Niektóre linie komórkowe wymagają optymalizacji stężenia sondy oraz czasu w celu poprawy intensywności sygnału peroksysomów względem tła cytosolowego, np. 250 nM i 20 min lepiej sprawdzają się dla komórek COS-7 (Rysunek 2A). Komórki metabolizują sondy, co prowadzi do stopniowego zmniejszania barwienia peroksysomów z czasem; jednak stosunek peroksysomu do cytoplazmy może poprawić się w ciągu 24 godzin (rysunek 2B). Dodatkowo opracowaliśmy procedurę fiksacji, która pozwala na współbarwienie z przeciwciałami oraz wizualizację peroksysomów w późniejszym czasie (rysunek 2C,D).

figure-results-1
Rysunek 1: Obrazowanie żywych komórek peroksysomów. (A) Schemat barwienia. (B) Mikroskopia konfokalna WT i PEX19 KO HEK293T komórek nadekspresjonujących GFP-SKL i barwionych czerwoną sondą peroksysometyczną (1 μM przez 10 minut). Pręty skalowe - 1 μm i 10 μm. Przedstawiony jest reprezentatywny profil intensywności. (C) Mikroskopia konfokalna ludzkich fibroblastów o nadekspresji GFP-SKL i barwieniu PeroxiSPY (1 μM przez 10 minut). Pręty skalowe - 1 μm i 10 μm. Przedstawiony jest reprezentatywny profil intensywności. (D) Mikroskopia konfokalna komórek SW13 (kora nadnerczy), SH-SY5Y (neuroblasty), CCL-136 (miocyty), HaCat (keratynocyty), U2OS (osteoblasty) oraz HEK293T (ludzka nerka embrionalna) zabarwionych czerwoną sondą peroksysometyczną (1 μM przez 10 minut). Pręty skalowe - 2 μm i 10 μm. Ilościowość przeprowadzono na Fidżi zgodnie z wcześniej opisaną liczbą9 i pokazuje liczbę peroksysomów na mikron kwadrat, średnią ± SEM, N = 100 komórek zebranych z 3 powtórzeń biologicznych, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, Test Kruskala-Wallisa. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Optymalizacja obrazowania peroksysomów i barwienie stałych komórek. (A) Mikroskopia konfokalna komórek COS-7 (afrykańska zielona małpa) barwiona czerwoną sondą peroksysometyczną zgodnie z protokołem (1 μM przez 10 minut; przed optymalizacją) i w warunkach optymalizowanych (250 nM przez 20 minut; po optymalizacji). Pasek skali - 10 μm. Średnia intensywność pikseli peroksysomów i cytosolu została zidentyfikowana za pomocą Fidżi i wyrażona jako stosunek. N = 7 komórek (przed optymalizacją) i 21 komórek (po optymalizacji). Średnia ± SEM, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, test Shapiro-Wilksa. (B) Mikroskopia konfokalna HEK293T komórek barwionych czerwoną sondą peroksysometyczną (1 μM) przez 15 minut i 24 godziny. Ilościowa analiza pokazuje intensywność fluorescencji peroksysomów i cytoplazmy, a także stosunek peroksysomów do cytoplazmy, średnią ± SEM, N = 680 peroksysomów zebranych z 3 powtórzeń biologicznych, **** - p < 0,0001, test Shapiro-Wilksa. (C) Mikroskopia konfokalna komórek Huh7 barwionych sondami peroksysomowymi za pomocą protokołu fiksacji. Peroksysomy były współbarwione przeciwciałem pierwotnym przeciwciałem anty-PEX14 (1:100 w roztworze blokującym, 1 godzina inkubacji w RT) oraz przeciwciałem wtórnym (1:1000 w roztworze blokującym, Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488, 1 godzina inkubacji w RT). Prezentowane są reprezentatywne obrazy konfokalne. Skala - 10 μm. (D) Ilościowa analiza pokazuje zmiany intensywności fluorescencji peroksysomów podczas fiksacji i permeabilizacji przeprowadzonej na HEK293T komórkach zgodnie z protokołem, średnia ± SEM, N = 100 komórek zebranych z trzech powtórzeń biologicznych, **** - p < 0,0001, test Shapiro-Wilksa. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To proste wykrycie peroksysomem można wykonać w mniej niż 10 minut w komórkach zwierzęcych. Barwienie PeroxiSPY umożliwia wizualizację, ilościową i śledzenie peroksysomów w żywych komórkach i jest dostępne jako czerwona (Tabela materiałów) oraz sonda dalekoczerwona5 (Tabela materiałów). Barwienie to zapewnia podobną wizualizację peroksysomów do klasycznego barwienia opartego na sygnałach peroksysomów (PTS1)l10 (Rysunek 1B) bez potrzeby nadmiernej ekspresji. Fluorofory są fotostabilne i mogą być wykorzystywane do obrazowania superrozdzielczości oraz długoterminowego pozyskiwania dynamiki peroksysomów w różnych warunkach eksperymentalnych 5,9,11. Dodatkowo sondy są wrażliwe na działanie peroksysomów; dlatego mogą być wykorzystywane do wykrywania i ilościowego określania patologii peroksysomów5 w badaniach i zastosowaniach diagnostycznych. Barwienie peroksysomem zależy od metabolizmu peroksysomów oraz ich zdolności do importu i utleniania kwasów tłuszczowych. Dlatego ważne jest optymalizacja stężenia i czasu dla używanych linii komórkowych. Przedstawiamy tutaj standardową procedurę, która działa dla testowanych linii komórkowych; jednak czas barwienia można wydłużyć do 24 godzin bez utraty stosunku intensywności fluorescencji peroksjomom do cytoplazmy (rysunek 2B).

Sondy były testowane w wielu liniach komórkowych ssaków (Rysunek 1 i Rysunek 2) oraz w komórkach i embrionach danio Danio rerio 5, wykazując specyficzność wobec peroksysomów i łatwość użycia. Te sondy nie były testowane w innych liniach komórkowych zwierząt, a warunki oraz stężenia sond będą musiały zostać zoptymalizowane pod kątem nich. Sondy nie barwią peroksysomów w komórkach roślin Arabidopsis thaliana 5.

Omówiono tutaj niektóre problemy oraz ich rozwiązania w zakresie rozwiązywania problemów. Jeśli stosunek peroksysomów do cytoplazmy jest zbyt niski (niskie barwienie peroksysome), upewnij się, że komórki są świeżo rozdzielone, a następnie ponownie je rozdziel dla barwienia. Do bejcowania używaj 30-70% konfluencji. Zoptymalizuj stężenie sondy (zbyt wysokie stężenie spowoduje przekroczenie zdolności peroksysomowej do pochłaniania sond) oraz czas (na przykład patrz Rysunek 2A). Użyj naczynia o szklanym dnie o średnicy 35 mm (barwienie na płytach z 96 dołkami jest trudniejsze ze względu na niewielką ilość mieszania). Upewnij się, że sondy są dodane do rurki mikrowirówki i dokładnie wymieszane z medium przed dodaniem do komórek. Różne linie komórkowe i różne warunki wpływają na barwienie. Na koniec, wypłukanie sondy zmniejsza tło; jednak sygnał będzie stopniowo tracony, skracając czas efektywnego przeprowadzania obrazowania.

Jeśli nie ma widocznych peroksysomów, upewnij się, że sonda została zmieszana z ośrodkiem. Zwiększ stężenie sondy (np. do 2 μM). Wprowadź dodatkowy marker peroksysomowy, aby umożliwić wizualizację peroksysomów. Jeśli występują różnice w barwieniu między komórkami, ważne jest, aby usunąć wszystkie nośniki i dokładnie je wymieszać z aliquotami przed ponownym dodaniem do komórek. Zapewnia to jednolite barwienie. Jeśli nadal występuje zmienność, możliwe, że populacja komórek jest niejednorodna pod względem zdolności importu substratów peroksysomów. Synchronizacja komórek poprzez regularne rozszczepienie pomaga w jednolitym barwieniu. Jeśli nie wykryje się sygnału, sprawdź, czy ustawienia lasera na mikroskopach są zgodne z parametrami wzbudzenia/emisji sondy. Jeśli tło poza komórką jest zbyt jasne, wypłukaj sondy, aby usunąć to tło; jednak sygnał będzie stopniowo tracony, skracając okno czasowe, w którym obrazowanie może być skuteczne. Dodatkowo fiksacja może być użyta do redukcji tła. Jeśli sygnał po fiksacji jest bardzo słaby, sprawdź, czy sygnał nie został utracony po dodaniu Triton-X 100. Ten etap może być modyfikowany lub usuwany w zależności od dalszej aplikacji. Ogranicz liczbę kroków mycia.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LR posiada akcje Spirochrome AG. Wszyscy inni autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Centrum Obrazowania i Mikroskopii Szkoły Nauk Biologicznych (IMC) za udostępnienie niezbędnego sprzętu. TA była finansowana przez długoterminowe stypendium HFSP (LT000559/2021-L), Uniwersytet w Southampton, Wessex Medical Research Innovation Grant oraz European Leukodystrophy Association (ELA). Studia magisterskie są wspierane przez program ELISIR Szkoły Nauk Przyrodniczych EPFL, Fundację Bryn Turner-Samuels oraz Fondation Bios pour la recherche. CH był finansowany przez letnie stypendium Royal Microscopical Society. REC jest wspierany przez stypendium Odkryć Rady ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BB/Z514767/1). MSvA był wspierany przez letnie studia Stowarzyszenia Biochemicznego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało przeciw PEX14Proteintech10594-1-AP
Mikroskop konfokalnyNikonA1rKażdy mikroskop konfokalny z obiektywem o wysokiej NA, np. 60x olejowy NA1.4
DMEMPan Biotech  P04-03590Medium hodowli komórkowych
Płyty obrazujące ze szklanym dnemCellvisD35C4-20-1.5-N
Kozi antykróliczy Alexa Fluor 488 ABCAMab150081
HEK293TATCCCRL-3216 
PeroxiSPY555Spirochromhttps://spirochrome.com/product/peroxi_spy555/  https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2
PeroxisPY650Spirochromhttps://spirochrome.com/product/peroxi_spy650/  https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Myelin peroxisomes - essential organelles for the maintenance of white matter in the nervous system. Biochimie. 98, 111-118 (2014).">Kassmann, C. M. Myelin peroxisomes - essential organelles for the maintenance of white matter in the nervous system. Biochimie. 98, 111-118 (2014).
  2. Biochemistry of peroxisomes. Annu Rev Biochem. 61, 157-197 (1992).">van den Bosch, H., Schutgens, R. B., Wanders, R. J., Tager, J. M. Biochemistry of peroxisomes. Annu Rev Biochem. 61, 157-197 (1992).
  3. Peroxisomal disorders. Handb Clin Neurol. 113, 1593-1609 (2013).">Aubourg, P., Wanders, R. Peroxisomal disorders. Handb Clin Neurol. 113, 1593-1609 (2013).
  4. Peroxisome biogenesis disorders. Adv Exp Med Biol. 1299, 45-54 (2020).">Honsho, M., Okumoto, K., Tamura, S., Fujiki, Y. Peroxisome biogenesis disorders. Adv Exp Med Biol. 1299, 45-54 (2020).
  5. Fluorescent fatty acid conjugates for live cell imaging of peroxisomes. Nat Commun. 15, 4314(2024).">Korotkova, D., et al. Fluorescent fatty acid conjugates for live cell imaging of peroxisomes. Nat Commun. 15, 4314(2024).
  6. Incidence of X-linked adrenoleukodystrophy and the relative frequency of its phenotypes. Am J Med Genet. 76 (5), 415-419 (1998).">Bezman, L., Moser, H. W. Incidence of X-linked adrenoleukodystrophy and the relative frequency of its phenotypes. Am J Med Genet. 76 (5), 415-419 (1998).
  7. Metabolite transport across the peroxisomal membrane. Biochem J. 401 (2), 365-375 (2007).">Visser, W. F., van Roermund, C. W., Ijlst, L., Waterham, H. R., Wanders, R. J. Metabolite transport across the peroxisomal membrane. Biochem J. 401 (2), 365-375 (2007).
  8. Human PEX19: cDNA cloning by functional complementation, mutation analysis in a patient with Zellweger syndrome, and potential role in peroxisomal membrane assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2116-2121 (1999).">Matsuzono, Y., et al. Human PEX19: cDNA cloning by functional complementation, mutation analysis in a patient with Zellweger syndrome, and potential role in peroxisomal membrane assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2116-2121 (1999).
  9. Protein Kinase C promotes peroxisome biogenesis and peroxisome-endoplasmic reticulum interaction. J Cell Biol. 224 (9), e202505040(2025).">Borisyuk, A., Howman, C., Pattabiraman, S., Kaganovich, D., Amen, T. Protein Kinase C promotes peroxisome biogenesis and peroxisome-endoplasmic reticulum interaction. J Cell Biol. 224 (9), e202505040(2025).
  10. Identification of a peroxisomal targeting signal at the carboxy terminus of firefly luciferase. J Cell Biol. 105 (6 Pt 2), 2923-2931 (1987).">Gould, S. G., Keller, G. A., Subramani, S. Identification of a peroxisomal targeting signal at the carboxy terminus of firefly luciferase. J Cell Biol. 105 (6 Pt 2), 2923-2931 (1987).
  11. A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins. Nat Chem. 5 (2), 132-139 (2013).">Lukinavicius, G., et al. A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins. Nat Chem. 5 (2), 132-139 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sondy peroksyomalneobrazowanie ywych kom rekdynamika peroksysom wsondy fluorescencyjnedysfunkcja peroksysom wbarwienie immunofluorescencyjnekwantyfikacja peroksysom wbarwienie utrwalonych kom rek

Powiązane artykuły