Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modelowanie makrofagów związanych z nowotworami in vitro: rola czynników wydzielanych w dynamice mikrośrodowiska nowotworowego

446 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69406

⸱

30 grudnia 2025

 ,  ,  , 
1Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET, Academia Nacional de Medicina

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy manuskrypt przedstawia protokół in vitro polegający na generowaniu komórek makrofagowych związanych z nowotworami poprzez ekspozycję ludzkich monocytów na warunkowane podłoża z linii komórek nowotworowych.

Streszczenie

Makrofagi wykazują niezwykłą plastyczność, co pozwala im nabywać odrębne stany funkcjonalne w odpowiedzi na różne bodźce środowiskowe. W guzach litych często stanowią najliczniejszą populację komórek odpornościowych w mikrośrodowisku nowotworowym, gdzie nazywane są makrofagami związanymi z nowotworem (TAM). TAMs ściśle współdziałają z komórkami złośliwymi, aktywnie wspierając postęp guza, angiogenezę i unikanie immunologii. Komórki nowotworowe mogą przeprogramować makrofagi poprzez bezpośredni kontakt z komórką oraz szeroki wachlarz czynników wydzielanych, kształtując ich polaryzację na kierunku fenotypów pronowotworowych. Aby badać te mechanizmy polaryzacji TAM in vitro, proponujemy metodę, która naraża ludzkie monocyty na czynniki rozpuszczalne obecne w ośrodkach uwarunkowanych linią komórek nowotworowych. Protokół ten umożliwia generowanie makrofagów podobnych do TAM w warunkach kontrolowanych, ułatwiając analizę zmian fenotypowych i funkcjonalnych wywołanych sygnałami pochodzącymi z nowotworów. Nasze podejście oferuje powtarzalny i fizjologicznie istotny model do badania interakcji między nowotworem a makrofagami, pogłębia naszą wiedzę o przeprogramowaniu makrofagów oraz wspiera badania nad nowatorskimi strategiami terapeutycznymi w immunologii i immunoterapii nowotworów.

Wprowadzenie

Makrofagi to wielofunkcyjne komórki odporności wrodzonej, których niezwykła plastyczność pozwala im przyjmować różnorodne fenotypy w odpowiedzi na sygnały środowiskowe1. W guzach litych makrofagi często stają się najliczniejszą populacją komórek odpornościowych i różnicują się w makrofagi związane z nowotworami (TAMs)2. Komórki te są aktywnie przeprogramowane przez mikrośrodowisko nowotworowe, aby wspierać wzrost guza, promować angiogenezę, ułatwiać przerzuty i tłumić skuteczne odpowiedzi immunologiczne przeciwnowotworowe. Komórki nowotworowe napędzają tę polaryzację zarówno poprzez bezpośrednie interakcje komórki, jak i złożony repertuar czynników wydzielanych, w tym cytokiny, chemokiny i czynniki wzrostu, które przekształcają transkrypcyjne i funkcjonalne programy makrofagów3. Ta dynamiczna interakcja stanowi podstawę centralnej roli TAMs w biologii nowotworów i podkreśla plastyczność makrofagów jako wyzwanie i szansę na interwencję terapeutyczną2.

Coraz bardziej dostrzega się znaczenie kliniczne TAM: ich obfitość w guzach często koreluje ze złym rokowaniem i opornością na terapie 4,5. W konsekwencji TAMs6 stały się atrakcyjnymi celami terapeutycznymi. Obecnie badane są strategie mające na celu blokowanie ich rekrutacji, hamowanie przeżycia lub przeprogramowanie ich na fenotypy zapalne i nowotworowe6. Zrozumienie mechanizmów, dzięki którym czynniki nowotworowe polaryzują makrofagi do TAM, jest zatem niezbędne dla opracowania skutecznych immunoterapii. Chociaż blokada punktów kontrolnych odporności wykazała duże sukcesy w wielu nowotworach, jej skutecznośćw innych pozostaje ograniczona 7. Połączenie terapii ukierunkowanych na komórki T, takich jak przeciwciała antyprogramowane przeciwko białkowi śmierci komórkowej 1 (PD-1) lub przeciwciałom przeciwko programowanej śmierci komórki 1 (PDL-1), ze strategiami reprogramowania makrofagów może wzmocnić ogólną odpowiedź immunologiczną przeciwnowotworową.

Tradycyjne modele eksperymentalne do badania biologii TAM obejmowały in vivo modele nowotworów myszy, które oferują złożone i fizjologicznie istotne środowisko8. Modele te dostarczyły fundamentalnych informacji na temat rekrutacji i funkcjonowania TAM. Jednak istotne różnice międzygatunkowe w sygnalizacji immunologicznej, biologii nowotworów i ontogenezie makrofagów mogą ograniczać bezpośrednie tłumaczenie na choroby ludzkie 9,10. Co więcej, złożoność systemów in vivo utrudnia izolację i badanie konkretnych szlaków sygnalizacyjnych lub zdarzeń molekularnych napędzających polaryzację makrofagów.

Natomiast modele in vitro oferują prostsze i kontrolowane warunki do analizy tych mechanizmów. Najczęściej stosowane podejście polega na polaryzacji makrofagów pochodzących z monocytów ludzkich za pomocą określonych bodźców: interferon gamma (IFN) i bakteryjny lipopolisacharyd (LPS) w celu wygenerowania prozapalnych makrofagów (M1), lub interleukiny 4 (IL-4) i interleukiny 10 (IL-10), lub deksametazonu w celu uzyskania różnych podtypów makrofagów przeciwzapalnych (M2) 11,12,13,14. Modele te pomogły zidentyfikować markery molekularne i programy transkrypcyjne związane z kanonicznymi stanami polaryzacji makrofagów. Niemniej jednak nie oddają one złożonego, wieloczynnikowego środowiska, z jakim makrofagi występują w guzach, gdzie polaryzacja wynika z jednoczesnego wpływu wielu rozpuszczalnych mediatorów, sygnałów metabolicznych oraz interakcji między komórkami15,16. Chociaż klasyczna klasyfikacja M1/M2 pozostaje użyteczna do opisu stanów funkcjonalnych makrofagów, obecnie jasne jest, że populacje makrofagów występują znacznie bardziej niż wcześniej sądzono. Prace grupy dr Ginhoux i innych, wykorzystujące podejścia transkryptomii jednokomórkowej, wykazały szeroką różnorodność podgrup makrofagów występujących zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i w chorobie17,18. To podkreśla, że TAM, choć często opisywane jako przypominające profile M2, nie są ściśle równoważne makrofagom rozróżnianym wyłącznie kanonicznymi cytokinami; zamiast tego dzielą pewne cechy, ale wykazują też wyraźne i zależne od kontekstu różnice.

Aby zniwelować tę lukę, przedstawiamy protokół in vitro, który modeluje polaryzację podobną do TAM, wystawiając makrofagi pochodzące z ludzkich monocytów na podłoża warunkowane pobrane z linii komórek nowotworowych. Metoda ta obejmuje wpływ sekretomu nowotworowego, bogatej mieszanki cytokin, chemokinów i czynników wzrostu wydzielanej przez komórki nowotworowe. Oferuje zatem istotny i eksperymentalnie dostępny system do badania fenotypowego i transkrypcyjnego przeprogramowania makrofagów w odpowiedzi na czynniki rozpuszczalne pochodzące z nowotworów. W przeciwieństwie do wcześniejszych podejść, w których monocyty były bezpośrednio narażone na podłoża warunkowane przez guz, protokół ten koncentruje się szczególnie na przeprogramowaniu makrofagów, co lepiej odzwierciedla zachowanie makrofagów rezydentnych w mikrośrodowisku nowotworowym19,20. Ponadto zawiera zoptymalizowany i przejrzysty panel markerów powierzchniowych do oceny polaryzacji makrofagów za pomocą cytometrii przepływowej, co jest łatwe do wdrożenia i może być rozszerzane zgodnie z potrzebami badacza14,21. Wreszcie, ponieważ wykazano, że M-CSF przygotowuje monocyty do fenotypupodobnego do M2 10,15,22,23,24, celowo go pominęliśmy, aby zapewnić, że każda obserwowana polaryzacja makrofagów wynika wyłącznie z ekspozycji na podłoża warunkowane z linii komórek nowotworowych.

To podejście ma kilka zalet: zachowuje powtarzalność i prostotę systemów in vitro, wykorzystuje pierwotne ludzkie komórki dla większego znaczenia translacyjnego oraz lepiej odzwierciedla heterogeniczny, wieloczynnikowy charakter mikrośrodowiska nowotworowego niż modele pojedynczych cytokin. 25,26,27,28. Ponadto ułatwia badania porównawcze odpowiedzi makrofagów na podłoża warunkowane z różnych typów nowotworów lub genetycznie modyfikowanych komórek nowotworowych oraz służy jako platforma do testowania czynników farmakologicznych, które mogą zmieniać polaryzację TAM. Poza ogólną zastosowalnością, metoda ta może być dostosowana do różnych modeli nowotworów poprzez wybór odpowiednich linii komórkowych lub korektę proporcji podłoża kondycjonowanego. Niemniej jednak użytkownicy powinni być świadomi, że zmienność między zdrowymi dawcami i liniami komórek nowotworowych może wpływać na powtarzalność, co podkreśla znaczenie starannego projektowania eksperymentów i standaryzacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki krwi obwodowej pobrano od zdrowych dawców po świadomej zgodzie, zgodnie z Deklaracją Helsińską. Protokół ten został zatwierdzony przez Komitet Etyki Instytucjonalnej Uniwersytetu w Buenos Aires. Zobacz Tabelę materiałów , aby poznać szczegóły dotyczące wszystkich materiałów i odczynników używanych w tym protokole.

UWAGA: Utrzymuj warunki sterylne przez cały protokół, pracując w szafie o poziomie biobezpieczeństwa 2 (BSL-2) i zapewnij żywotność komórek >90%. Do utylizacji wszystkie odpady biologiczne muszą najpierw zostać zdekontaminowane przez namoczenie się w roztworze podchlorynu sodu 10% przez co najmniej 30 minut, a następnie umieszczone w odpowiednim pojemniku do utylizacji zagrożeń biologicznych.

1. Hodowla linii komórek nowotworowych i przygotowanie podłoża warunkowego

  1. Rozmrażaj linię komórkową MDA-MB-231 z potrójnie ujemnym wynikiem raka piersi (lub innego wybranego guza) z magazynowania ciekłego azotu. Natychmiast zanurz kriotuby zawierające linie komórkowe w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i delikatnie mieszaj fiolkę, aby zapewnić szybkie i równomierne rozmrażanie. Natychmiast wyjmij fiolkę, gdy jest w dużej mierze rozmrożona.
  2. Przełóż rozmrożone komórki do probówki do wirówki o pojemności 15 mL zawierającej 5 mL bezpłodnej soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Wiruj zawiesinę ogniwową w stężeniu 400 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Proces rozmrażania musi być przeprowadzony szybko, aby zachować żywotność komórek.
  3. Ostrożnie wyrzuć supernatant i szybko ponownie zawiesijcie pellet komórkowy w 1 ml świeżego, kompletnego Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) zawierającego wysoką glukozę (4,5 g/L) z 10% surowicy płodowej bydła (FBS), 4 mM glutaminy i 1 mM piruianianu sodu. Policz komórki w zawieszonym pelletcie, wykonując następujące dwustopniowe rozcieńczanie seryjne:
    1. Najpierw przygotuj rozcieńczenie zawiesiny 1:5 w sterylnym medium DMEM, a następnie (1:2) barwieniem żywotności Trypan Blue, aby uzyskać ostateczne rozcieńczenie 1:10.
    2. Użyj mikroskopu świetlnego, aby policzyć żywotne komórki w hemocytometrze Neubauera (lub komorze liczącej). Policz żywotne komórki (tylko komórki wykluczające niebieski barwnik) i określ średnią liczbę żywotnych komórek na dużym polu narożnym.
    3. Oblicz końcowe stężenie według następującego wzoru: Komórki/mL = (Średnie komórki na kwadrat) x (Współczynnik rozcieńczenia) x 10 000.
      UWAGA: Ponownie zawiesij komórki w pożądanej objętości kompletnego medium DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie 1x 105 komórek/mL.
  4. Nasiać 2,5 x 10 owymiarach 5 do 5,0 x 10 komórek do kolby T25 zawierającej 5 mL kompletnego medium DMEM. Utrzymuj hodowlę w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 aż do osiągnięcia wymaganej gęstości komórek do zbioru.
  5. Następnego dnia po siewie sprawdź przyczepność komórek pod mikroskopem. Jeśli więcej niż 50% komórek unosi się (co wskazuje na śmierć komórek), delikatnie zasysaj stare medium i zamień je na 2,5 mL świeżego, wcześniej podgrzanego medium.
  6. Monitoruj wzrost komórek codziennie. Gdy hodowla osiąga około 90% konfluencji (szacunkowo 2,3 x 106 komórek w kolbie T25), zazwyczaj w ciągu 5 dni, komórki są gotowe do podhodowli (podziału). Aby podzielić komórki w stosunku 1:8, należy postępować zgodnie z następującymi krokami:
    1. Usuń zużyte medium sterylną pipetą Pasteura.
    2. Płucz monowarstwę komórki raz 3 mL sterylnego 1x PBS, aby usunąć surowicę resztkową, która hamuje trypsynę. Wsysaj i odrzuć 1x PBS.
    3. Do komórek dodaj 1 mL roztworu 0,25% trypsyny-1 mM kwasu etylendiaminetetraoctowego (EDTA) i inkubuj w temperaturze 37 °C, 5%CO2 na nawilżonym inkubatorze przez 3 minuty, aby odłączyć komórki.
      UWAGA: Optymalny czas inkubacji z trypsyną/EDTA zależy od konkretnej linii komórkowej i może wymagać korekty. Sprawdź komórki pod mikroskopem po 3 minutach, aby upewnić się, że są całkowicie odłączone.
    4. Zneutralizuj aktywność enzymatyczną, dodając 3 mL kompletnego nośnika DMEM. Zaraz po tym delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby całkowicie odłączyć i zawiesić komórki.
  7. Przelej 3,5 mL zawiesiny ogniwa do stożkowej rurki o pojemności 15 mL i wiruj ją przez 5 minut w temperaturze 400 x g w stanie RT.
  8. Ostrożnie usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet komórkowy w 1 mL medium zamrażającego (które musi zawierać 90% FBS oraz 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). Przenieś i aliquotuj zawiesinę komórkową do krioviali, zapewniając stężenie 5 x 10komórek w probówce do przyszłego użytku.
    1. Mrożenie należy stopniowo schładzać, umieszczając krioviale w pojemniku Mr. Frosty (lub podobnym pojemniku o kontrolowanej szybkości). Przełóż pojemnik do zamrażarki o temperaturze o temperaturze 80°C i pozostawij komórki do zamarzania przez noc. Komórki można przechowywać w temperaturze -80°C przez kilka dni, ale następnie należy je przenieść do ciekłego azotu do długoterminowego przechowywania.
      UWAGA: Prowadź szczegółowe zapisy przejść komórek i wykorzystuj wczesne fragmenty do eksperymentów. Zaleca się używanie komórek z mniej niż 20 przejściami.
  9. Gdy nowe kultury ponownie osiągną ~90% konfluentności, aspirują i zbierają supernatant do stożkowej rurki o pojemności 15 mL. Jeśli chcesz utrzymać hodowlę, zamień zebraną woluminę na świeże, kompletne medium DMEM.
    1. Wiruj zebrany supernatant w dawce 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby wypuścić granulki i usunąć zanieczyszczenia komórkowe. Zachowaj supernatant (oczyszczone podłoże kondicjonowane) i wyrzuć granulat.
  10. Zachowaj klarowane kondicjonowane podłoże na porcje po 1 mL, oznacz probówki i przechowuj je w temperaturze -20 °C do użycia.
    UWAGA: Dla kontroli jakości zawsze prowadź rejestr daty pobierania mediów warunkowych oraz tego, czy aliquot był wcześniej rozmrażony. Zdecydowanie zaleca się unikanie rozmrażania tego samego aliquota więcej niż dwa razy. Ponadto używaj kondycjonowanego w ciągu miesiąca od daty zamrożenia, aby zapewnić jego optymalną aktywność.

2. Izolacja jednojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC)

UWAGA: PBMC izoluje się z 40 mL krwi obwodowej antykoagulowanej 3,8% cytrynianem sodu. Izolacja przeprowadza się za pomocą gradientu gęstości Ficoll-Hypaque (1077) oraz wirowania. Cały protokół musi być przeprowadzany w warunkach sterylnych w szafie BSL2.

  1. Przed kolejnym krokiem wirowania należy pobrać antykoagulowaną próbkę krwi obwodowej do stożkowej probówki o pojemności 15 mL lub 50 mL.
  2. Próbki krwi w wirówce pobierać z niską prędkością, 200 × g przez 15 minut w RT, aby oddzielić składniki krwi. Proces ten daje osioco bogatopłytkowe (PRP) jako warstwę wierzchnią oraz frakcję komórkową (czerwone i białe krwinki) poniżej. Użyj ustawienia wirówki: przyspieszenie: 4 i zwolnienie: 2, gdy maksimum wynosi 5.
  3. Po wirowaniu zasysaj supernatant (górną frakcję), czyli PRP, i przelej go do nowej rurki sterylnej.
    UWAGA: W przypadku eksperymentów końcowych, zebrany PRP można ponownie wirować w napięciu 600 × g w RT przez 10 minut (maksymalne przyspieszenie i zwolnienie), aby usunąć płytki krwi, a plazmę bez płytek można przechowywać w -20 °C do innych testów.
  4. Dolna frakcja komórkowa uzyskana podczas początkowej wirowania w kroku 2 powinna być delikatnie rozcieńczona do 2- do 3-krotnej końcowej objętości przy użyciu sterylnej jednostki PBS w temperaturze pokojowej. Delikatnie ujednolic powstałą zawieszinę przez odwrócenie i wykorzystaj ją do wirowania gradientu gęstości Ficoll-Hypaque.
  5. Podawaj 15 mL Ficoll-Hypaque w temperaturze pokojowej do sterylnej probówki o pojemności 50 mL.
  6. Ostrożnie i powoli nakładaj 30 ml rozcieńczonej krwi na Ficoll-Hypaque, aby nie mieszać się z obiema fazami.
  7. Wiruj rurkę warstwową z krwią Ficoll przez 25 minut przy 600 × g w RT. Ustaw wirówkę bez hamulca (przyspieszenie: 1; Zwolnienie: 0).
  8. Użyj sterylnej pipety Pasteura, aby wyrzucić co najmniej 4 ml uzyskanej górnej frakcji, aby uniknąć rozlania. Następnie używaj tej samej pipety, aby odzyskać biały pierścień zawierający PBMC, utworzony między frakcją górną a przezroczystą frakcją Ficoll-Hypaque. Unikaj zbierania Ficoll z pierścieniem PBMC.
  9. Przenieś pierścień PBMC z probówki do sterylnej rurki wirówki o pojemności 15 mL z co najmniej 3 mL 1x PBS.
  10. Napełnij probówkę 15 mL kolejną 1x PBS i wiruj przy 600 × g (maksymalne przyspieszenie i zwolnienie) przez 10 minut w RT.
  11. Usuń supernatant przez inwersję, napełnij ponownie 1x PBS i wiruj przy 600 × g (maksymalne przyspieszenie i spowolnienie) przez 10 minut w RT.
  12. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulek PBMC w 2 do 3 mL sterylnego 1x PBS plus 2% inaktywowanego termicznie FBS (1x PBS-2% FBS), a następnie podnieś objętość do 10 mL. Policz komórki, przygotowując zawiesinę 1:5 rozcieńczoną w sterylnym zimnie 1x PBS, a następnie (1:2) w 0,4% Trypan Blue, aby uzyskać ostateczne rozcieńczenie 1:10. Użyj komory komórkowej na mikroskopie świetlnym, jak opisano w kroku 1.3.2 do liczenia.
  13. Rozmiesz zawiesinę PBMC w dawce 300 × g przez 5 minut w temperaturze 8-10 °C. Ponownie zawiesij komórki w pożądanej objętości sterylnej, zimnej 1x PBS-2% FBS, aby uzyskać końcowe stężenie 108 komórek /mL. Pozostawić te komórki w temperaturze 4 °C do następnego kroku.
    UWAGA: W tym momencie pobrane PBMC można zamrozić w fiolce kriogenicznej o stężeniu 10–8 komórek/mL w ośrodku zamrażającym (90% FBS-10% DMSO). Przechowuj w temperaturze -80 °C w pojemniku Mr. Frosty na noc, aby komórki mogły powoli zamarzać. Następnego dnia przełóż ogniwa do skrzynki magazynowej i pozostawij je w temperaturze -80 °C przez kilka dni lub przenieś do zbiornika z ciekłym azotem na dłuższy czas lub kontynuuj protokół.

3. Sortowanie monocytów CD14+ z użyciem kulek magnetycznych

UWAGA: Oczyszczone monocyty CD14+ są pozyskiwane z PBMC przy użyciu ludzkiego zestawu do pozytywnej selekcji magnetycznej11. Procent komórek CD14+ w PBMC zależy od dawcy, ale można go oszacować na 10% (w zakresie od 5 do 20%). Dostosuj początkową liczbę PBMC i końcowe objętości reakcji na podstawie wymaganej liczby monocytów do eksperymentu. Sugerowana minimalna objętość reakcji wynosi 100 μL, nawet przy przetwarzaniu mniej niż 1 × 107 PBMC.

  1. Dodaj 10 μL koktajlu pozytywnego selekcji na każde 100 μL PBMC, pipetuj w górę i w dół i trzymaj na lodzie przez 15 minut.
  2. Zawiesić kulki na 30 sekund przed użyciem. Następnie dodaj 10 μL kulek na każde 100 μL zawieszenia PBMC. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut na lodzie.
  3. Dodaj 1x PBS - 2% FBS -1 mM EDTA do końcowej objętości 2,5 mL, delikatnie wymieszaj zawiesina i włóż rurkę na magnes, inkubuj przez 5 minut.
  4. Odwróć magnes (bez zdejmowania rurki) na rurkę odrzucanej przez 2-3 sekundy, unikając drgań. Komórki dodatnie pozostają w tubie.
  5. Wyjmij rurkę z magnesu i dodaj 1x PBS- 2% FBS -1 mM EDTA nad ściankami rurki, aż uzyskasz końcową objętość 2,5 mL.
  6. Włóż rurkę ponownie do magnesu i inkubuj przez 5 minut.
  7. Odwróć magnes (bez zdejmowania rurki) na rurkę odrzucanej przez 2-3 sekundy, unikając drgań. Wyjmij rurkę z magnesu i dodaj 3 mL 1x PBS-2% FBS na ściany rurki, aby odzyskać wszystkie ogniwa.
  8. Należy policzyć liczbę komórek CD14+ w komorze Neubauera za pomocą mikroskopu świetlnego. Rozcieńcz Trypan Blue w stosunku 1:2.
    UWAGA: Oblicz liczbę komórek według tego równania: Liczba komórek CD14+ = liczba żywych komórek w medium na kwadrant x współczynnik rozcieńczenia x 10 000.
  9. Umieść zawiesinę ogniwa CD14+ w nowej sterylnej probówce 15 mL i płucz komórki, wirując w 600 × g (maksymalne przyspieszenie i spowolnienie) przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Ponownie zawiesz komórki CD14+ z podłożem RPMI 1640, uzupełnionym 10% FBS i 1% penicylin-streptomycyną (P/S) kompletnym medium w dogodnej objętości, aby uzyskać 2,5 x 106 komórek/mL w kolejnym kroku, biorąc pod uwagę liczbę pozyskanych komórek.
    UWAGA: Utrzymuj monocyty CD14+ na lodzie do następnego kroku, aby uniknąć przyczepienia tych komórek do plastikowej ścianki rurki.

4. Różnicowanie makrofagów

  1. Płyta oczyściła monocyty CD14+ w 2,5 x 105 komórek zawieszonych w 250 μL pełnego medium RPMI (10% FBS-1% PS) na dołek w 48-dobrze obtraktowanej płytce.
    UWAGA: Można to również wykonać na połowie komórek w płytkach z 96 dobrze obtraktowanymi komórkami.
  2. Dodaj sterylną wodę do otaczających pustych studni, aby ograniczyć parowanie podczas inkubacji płytowej.
  3. Inkubuj komórki przez 5 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ w nawilżonym inkubatorze bez zakłóceń, codziennie monitorując morfologię, różnicowanie i zdolność do życia.
    UWAGA: Chociaż można dodać M-CSF (25 ng/mL) dla różnicowania, potwierdzamy, że nasz protokół wykorzystuje 10% wysokiej jakości FBS do uzyskania makrofagów M0 po pięciu dniach hodowli. Zalecamy unikanie M-CSF ze względu na jego potencjał do skierowania monoocytów do fenotypu podobnego do M2 10,22.

5. Ekspozycja makrofagów na ośrodki warunkowe i analiza

  1. W 5. dniu różnicowania delikatnie usuń 50% (125 μL) medium z każdego dołka i zastąp go na albo na:
    1. 125 μL świeżego medium RPMI (kontrolnego),
    2. 125 μL podłoża warunkowanego linią komórek nowotworowych (np. z MDA-MB-231), lub
    3. 125 μL kompletnego medium DMEM (kontrola dla podłoża kondycjonowanego).
      UWAGA: Do początkowej optymalizacji z nowymi liniami komórek nowotworowych testuj zakres stężenia warunkowanego medium (np. 10%, 25% i 50%). Ten zakres jest sugerowany, aby zapewnić żywotność makrofagów i zmiany w różnicowaniu się w organizmie. Wybierz wyższe stężenie podłoża warunkowego, które wykazują wysoką żywotność makrofagów.
  2. Kondicjuj inkubację do 7. dnia.
    UWAGA: W piątym dniu pobierane są makrofagi M0, a następnie kolejne 2 dni hodowli w obecności podłoża warunkowanego wystarczają, aby wywołać ekspresję markerów polaryzacji powierzchniowej. Polaryzacyjne markery powierzchniowe są określane za pomocą cytometrii przepływowej, podobnie przy użyciu standaryzowanych cytokin do generowania makrofagów M1 lub M211,14.
  3. Codziennie oceniaj żywotność i morfologię makrofagów pod mikroskopem.
    UWAGA: Codziennie monitoruj różnicowanie makrofagów przez 7-dniowy okres hodowli. Przyleganie do komórek jest wykorzystywane jako wskaźnik zdrowej, żywotnej hodowli. Wyższy udział komórek wrzeciowatych wskazuje na zwiększoną różnicowanie i polaryzację w grupie objętej zabiegiem ośrodka warunkowanego (CM), jak pokazano na Rysunku 2.

6. Zbieranie makrofagów do oceny markerów polaryzacji za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Opcjonalnie, aby jeszcze bardziej rozszerzyć charakterystykę fenotypową makrofagów związanych z nowotworem, izolować RNA do pomiaru ekspresji genów związanych z polaryzacją (np. TGM2, IRF-4 i CXCL10) za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) lub zebrać supernatanty hodowli do pomiaru kanonicznej produkcji cytokin (np. TNFα, IL-6 i IL-10) za pomocą enzymatycznego immunosorbentu testu (ELISA), jak zgłosiła nasza grupa11, 14.

  1. Usuń przez delikatne zasysanie sterylnym pipetem Pasteura lub wysyp całkowitą objętość medium hodowlanego każdego dołka i dodaj 200 μL zimnego buforu 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA do pobierania komórek.
  2. Inkubuj przez 10 do 15 minut na lodzie, a następnie dodaj 200 μL 1x PBS-2% FBS, aby rozcieńczyć bufor EDTA. Zbieraj makrofagi, pipetując w górę i w dół (wciąż na lodzie) przez kolejne 5 minut, aż wszystkie komórki zostaną odłączone.
    UWAGA: Ten krok jest kluczowy, aby uzyskać odpowiednią liczbę żywotnych makrofagów. Ważne jest, aby nie przedłużać czasu pracy przy ekspozycji EDTA bardziej niż zalecane, aby zachować żywotność komórek. Sprawdź komórki pod mikroskopem po zakończeniu zabiegu, aby upewnić się, że są całkowicie odłączone.
  3. Zbieraj makrofagi na mikrorurce o pojemności 1,5 mL i myj je 1 mL 1x PBS-2% FBS przez wirowanie w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 8-10 °C.
  4. Ponownie zawiesij granulki makrofagów z 200 μL 1x PBS-5% FBS i przenieś je na mikropłytkę z 96 dołkami o okrągłym dnie w celu blokowania niespecyficznego w RT przez 15 minut. Wiruj ogniwa w dawce 400 x g przez 5 minut w temperaturze 8-10 °C.
  5. Usuń supernatant, szybko odwracając płytkę.
  6. Przygotuj odpowiedni koktajl bezpośrednio sprzężonych przeciwciał w 1x PBS - 2% FBS, używając współczynnika rozcieńczenia 1:50 dla każdego przeciwciała. Każdą próbkę barw 50 μL koktajlu przeciwciał i inkubuj przez 30 minut w ciemności na lodzie.
    UWAGA: Koktajl przeciwciał: CD11b-PE/Cy7 (200 μg/mL), CD64-AlexaFluor 647 (150 μg/mL), CD163-PerCP/Cy5.5 (200 μg/mL), hladr-pe (40 μg/mL) oraz CD206-AlexaFluor 488 (400 μg/mL). Stężenie przeciwciał przed tycerzowaniem wymieniono w Tabeli 1; numery katalogowe można znaleźć w Tabeli Materiałów.
  7. Przemyj zabarwione makrofagi, dodając 150 μL 1x PBS i wiruj w temperaturze 400 × g przez 5 minut w temperaturze 8-10 °C.
  8. Usuń supernatant, szybko odwracając płytkę.
  9. Aby zmierzyć żywotność komórek, dodaj 100 μL substancji do poprawnej żywotności Zombie Violet (1:1 000 w 1x PBS) i inkubuj w ciemności przez 30 minut na lodzie.
  10. Przemyj zabarwione komórki, dodając 100 μL 1x PBS i wirując w 400 x g przez 5 minut w temperaturze 8-10 °C. Powtórz procedurę mycia przy użyciu 200 μL 1x PBS.
  11. Napraw to przez ponowne zawieszenie pelletu komórkowego z 20 μL świeżo przygotowanego paradehydu o stężeniu 1% i inkubację przez 20 minut na lodzie i w ciemności.
    UWAGA: Do fiksacji użyto 1% paradehydu, bez permeabilizacji. Opcjonalnie: Do tego kroku11 można również użyć komercyjnego składnika utrwalacza (z zestawu do utrwalania/permeabilizacji BD).
  12. Płucz ogniwa, dodając 180 μL 1x PBS-2% FBS i wiruj w 400 x g przez 5 minut w temperaturze 8-10 °C. Powtarzaj procedurę mycia przy użyciu 200 μL 1x PBS-2% FBS.
  13. Usuń supernatant przez inwersję płyty i ponownie zawiesij pellet w 200 μL 1x PBS, aby zabrać go do urządzenia do pomiaru cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Jeśli barwione i utrwalone próbki nie mogą być wykonane cytometrią przepływową tego samego dnia, przechowuj je w temperaturze 4 °C i osłonij przed światłem. Przeanalizuj próbki jak najszybciej w kolejnych dniach.
  14. Analizuj wyniki cytometrii przepływowej za pomocą oprogramowania FlowJo. Strategia bramowania zaczyna się od wykluczenia zanieczyszczeń za pomocą rozpraszania przodo-bocznego (FSC/SSC). Następnie wybierz żywe makrofagi jako komórki CD11b⁺ Zombie Violet.
    UWAGA: Ponieważ autofluorescencja w makrofagach zależy od dawcy, niezbędne jest stosowanie kontrolnych źródeł pochodzących od tego samego dawcy dla każdego eksperymentu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Generowaliśmy potrójnie ujemne makrofagi związane z nowotworem piersi (TAM), traktując makrofagi pochodzące z monocyta w 50% warunkowanym medium (CM) z linii komórkowej MDA-MB-231. Monocyty zostały posortowane z komórek monojądrowych krwi obwodowej (PBMC) sześciu niezależnych, zdrowych dawców i zróżnicowane zgodnie z naszym protokołem. Preparat CM wykorzystywał komórki MDA-MB-231 przy 90% konfluencji (Rysunek 1). CM został dodany do hodowli m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół zapewnia powtarzalne i praktyczne podejście do badania polaryzacji makrofagów podobnej do guza poprzez ekspozycję makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów na ośrodki warunkowane linią komórkową nowotworową. System ten rejestruje wpływ czynników rozpuszczalnych wydzielanych przez komórki nowotworowe, które są znane z odgrywania kluczowej roli w przeprogramowaniu makrofagów w mikrośrodowisku nowotworowym 7,9,10,15,19,20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Doceniamy wsparcie finansowe udzielone przez Narodową Agencję Promocji Nauki i Technologii (ANPCyT-FONCYT) poprzez granty PICT 2021 I-INVI-00034 (dla DR), PICT 2021-I-A-00807 (dla E.A.C.S.) oraz PICT 2021-I-A-00716 (dla A.E.E.). Dziękujemy również Krajowej Radzie Badań Naukowych i Technicznych (CONICET) za grant 2022-0763 oraz Uniwersytetowi w Buenos Aires za PIDAE 2022, przyznany A.E.E.

M.C.L. otrzymał stypendium Legado Peruilh z Wydziału Medycyny Uniwersytetu Buenos Aires oraz jest laureatem stypendium doktoranckiego ANPCyT-FONCYT. D.R., E.A.C.S. oraz A.E.E. są zawodowymi badaczami w CONICET.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 488 mysz antyhumanna  Klon przeciwciał CD206 15-2BioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 321113; RRID:AB_571874
Alexa Fluor 647 myszy antyludzki klon przeciwciał CD64 10.1BioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 305012; RRID:AB_528867
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences, San Jose, CA, USACat# 554714Zestaw do utrwalania/permeabilizacji
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), wysokoglukozoweGibco   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA Cat# 11965092
EasySep Human CD14 Pozytywny Zestaw Selekcji; EasySep Positive Selection Cocktail; EasySep magnetyczne nanocząstki; Easy Sep MagnetSTEMCELL Technologies, Vancouver, KanadaCat# 18058
Cytometr FACS Canto & nbsp;Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA.
Serum płodowe bydło, kwalifikowane, Nowa Zelandia Gibco &hand;   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - Nauki o Życiu, USACat# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
GraphPad Prism   GraphPad Software Inc.RRID:SCR_002798
Partec CyFlow cytometr przestrzenny Sysmex Partec, Niemcy
Klon przeciwciał PE przeciwciał HLA-DR L243BioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 307605; RRID:AB_314683
PE/Cy7 przeciwciało szczurzy, przeciw myszom i człowiekowi CD11b, klon przeciwciał M1/70BioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 101216; RRID:AB_312799
PerCP/Cy5.5 myszy antyludzki klon przeciwciał CD163 GHI/61BioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 MediumGibco   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA Cat# 11875119
Roztwór pirowierianianu soduSigma-Aldrich Merck, San Luis, MO, USA.Cat#  S8636
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibco   Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA Cat# 25200056
Zestaw do poprawnej przydatności Zombie VioletBioLegend, San Diego, CA, USA.Cat# 423113

Bibliografia

  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  2. Goswami, S., Anandhan, S., Raychaudhuri, D., Sharma, P. Myeloid cell-targeted therapies for solid tumours. Nat Rev Immunol. 23 (2), 106-120 (2023).
  3. Christofides, A., et al. The complex role of tumor-infiltrating macrophages. Nat Immunol. 23 (8), 1148-1156 (2022).
  4. Umakoshi, M., et al. Macrophage numbers in the marginal area of sarcomas predict clinical prognosis. Sci Rep. 13 (1), 1290(2023).
  5. Toor, S. M., et al. Myeloid cells in circulation and tumor microenvironment of breast cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (6), 753-764 (2017).
  6. Chen, Y., et al. Targeting tumor-associated macrophages: A potential treatment for solid tumors. J Cell Physiol. 236 (5), 3445-3465 (2021).
  7. Caverzan, M. D., et al. Exploring monocytes-macrophages in immune microenvironment of glioblastoma for the design of novel therapeutic strategies. Brain Sci. 13 (4), 542(2023).
  8. Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).
  9. Linde, N., Gutschalk, C. M., Hoffmann, C., Yilmaz, D., Mueller, M. M. Integrating macrophages into organotypic co-cultures: A 3D in vitro model to study tumor-associated macrophages. PLoS One. 7 (7), e40058(2012).
  10. Karimova, A. F., et al. In vitro functional assays to assess the reciprocal interplay between tumor cells and macrophages. FASEB J. 38 (13), e23730(2024).
  11. Carrera Silva, E. A., Errasti, A. E. Reprograming model of human monocyte-derived macrophages for in-vitro assays. J Vis Exp. (218), e67651(2025).
  12. Colado, A., et al. The kinase inhibitors R406 and GS-9973 impair T cell functions and macrophage-mediated anti-tumor activity of rituximab in chronic lymphocytic leukemia patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (4), 461-473 (2017).
  13. Colado, A., et al. Effect of the BTK inhibitor ibrutinib on macrophage- and gammadelta T cell-mediated response against Mycobacterium tuberculosis. Blood Cancer J. 8 (11), 100(2018).
  14. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  15. Gattas, M. J., et al. A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro. Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).
  16. Risnik, D., et al. Immunoregulatory effects of lurbinectedin in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Immunol Immunother. 69 (5), 813-824 (2020).
  17. Mulder, K., et al. Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease. Immunity. 54 (8), 1883-1900.e5 (2021).
  18. Silvin, A., et al. Dual ontogeny of disease-associated microglia and disease inflammatory macrophages in aging and neurodegeneration. Immunity. 55 (8), 1448-1465.e6 (2022).
  19. Maeda, A., Digifico, E., Andon, F. T., Mantovani, A., Allavena, P. Poly(I:C) stimulation is superior than imiquimod to induce the antitumoral functional profile of tumor-conditioned macrophages. Eur J Immunol. 49 (5), 801-811 (2019).
  20. Ummarino, A., Anfray, C., Maeda, A., Andon, F. T., Allavena, P. In vitro methods to evaluate macrophage polarization and function in cancer. Methods Mol Biol. 2614, 81-91 (2023).
  21. Carestia, A., et al. Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice. Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).
  22. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  23. Ferrer, M. F., et al. Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity. Front Immunol. 10, 2499(2019).
  24. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype. Front Immunol. 14, 1162671(2023).
  25. Dunsmore, G., et al. Timing and location dictate monocyte fate and their transition to tumor-associated macrophages. Sci Immunol. 9 (97), eadk3981(2024).
  26. Wang, X., Chen, J., Jia, G. From dichotomy to diversity: Deciphering the multifaceted roles of tumor-associated macrophages in cancer progression and therapy. Cancer Biol Med. 21 (2), 132-138 (2023).
  27. Hochstadt, J., Martinez Pacheco, S., Casanova-Acebes, M. Embracing diversity: Macrophage complexity in cancer. Trends Cancer. 11 (4), 351-364 (2025).
  28. Xu, J., et al. Dual roles and therapeutic targeting of tumor-associated macrophages in tumor microenvironments. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 268(2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

polaryzacja makrofagówmodelowanie in vitroróżnicowanie monocytówpożywka kondycjonowanainterakcje guz-makrofagprzeprogramowanie makrofagówimmunologia nowotworów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.