Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Summary

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) znacznie wzrastają w kilku chorobach. LDN są zwykle izolowane poprzez sortowanie komórek. Przedstawiamy praktyczną metodę uzyskania czystego i skutecznego LDN. Po wirowaniu krwi obwodowej z gradientem gęstości komórki są inkubowane za pomocą mikrogranulek magnetycznych, a następnie LDN rozdzielane przez kolumny magnetyczne.

Abstract

Neutrofile, ważne leukocyty wrodzonej odporności, tradycyjnie uważane są za jednorodną populację komórek. Niemniej jednak najnowsze dowody wykazały, że neutrofile występują w kilku podpopulacjach. Jedną z takich subpopulacji są neutrofile o niskiej gęstości (LDN). LDN występuje w niewielkich ilościach we krwi zdrowych osób, ale ich liczba znacznie wzrasta w chorobach takich jak toczeń rumieniowaty układowy, choroby autoimmunologiczne, nowotwory i infekcje. W takich przypadkach LDN może uczestniczyć w patogenezie choroby. Jedynym sposobem izolowania LDN jest wirowanie gęstościowo-gradientowe krwi obwodowej. Jednak po wirowaniu LDN współoczyszcza się z komórkami jednojądrowymi. Dlatego badanie tej subpopulacji neutrofili jest wyzwaniem. Nie istnieje standardowa metodologia oddzielania LDN od komórek jednojądrowych. Zazwyczaj LDN są rozdzielane przez sortowanie komórek w cytometrze przepływowym. Jednak ta metoda wymaga długich godzin sortowania, aby uzyskać wystarczającą liczbę czystych komórek do dalszych badań funkcjonalnych. To poważnie wpływa na żywotność i funkcjonowanie komórek. Proponujemy tutaj praktyczną metodę uzyskania dużych ilości czystej i żywotnej LDN w krótkim czasie. Po wirowaniu w gęstości-gradiencie frakcja komórki monojądrowej jest inkubowana z mikrokulkami magnetycznymi anty-CD66b, a następnie LDN są rozdzielane przez kolumny magnetyczne w ciągu < 30 minut. Oczyszczone LDN (komórki CD66b⁺ ) są oznaczane przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b i CD98 i są analizowane cytometrią przepływową w celu potwierdzenia. Oczyszczone LDN są całkowicie funkcjonalne, co potwierdza ich zdolność do produkcji reaktywnych form tlenu oraz tworzenia pułapek zewnętrznych neutrofilowych. Ta nowa metoda oczyszczania skutkuje wysoką czystością LDN (ponad 90%) i żywotnością (ponad 96%) w krótkim czasie. Metodę tę można łatwo skalować, aby uzyskać duże ilości czystego LDN i ocenić funkcje LDN w różnych chorobach za pomocą analizy biochemicznej lub innej omiki.

Introduction

Neutrofile, dominujące leukocyty we krwi ludzkiej¹, są kluczowymi uczestnikami wrodzonego układu odpornościowego. Docierają w dużych ilościach do tkanek z zapaleniem lub infekcją². Tam neutrofile aktywują kilka funkcji efektorowych, takich jak fagocytoza ^3,4, degranulacja ^5,6 oraz tworzenie pułapek zewnętrznych neutrofili (NETs)^7. Dodatkowo neutrofile również uczestniczą w adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej⁸. Klasyczne podejście do neutrofilów traktuje ....

Protocol

Wszystkie procedury w tym protokole są zgodne z wytycznymi Komitetu Bioetyki Badań Ludzkich w Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę.

1. Izolacja jednojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC) i neutrofilów z ludzkiej krwi

1. Pobierz około 10 ml krwi od zdrowego dorosłego ochotnika poprzez nakłucie żył. Dodaj 10 U/mL heparyny jako środek przeciwzakrzepowy.
   UWAGA: Umieść igłę w pojemniku na igły niebezpieczne dla biohazardu. Strzykawki i inne materiały mające kontakt z krwią należy umieścić w worku i podłączyć do autoklawu przed utylizac....

Results

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) u zdrowych osobników stanowią około 5% PBMC (Rysunek 2A). Opisany tutaj protokół zazwyczaj dostarcza czysty (> 90%) LDN. Komórki są również efektywnie odzyskiwane (plon około 98%) z wysoką żywotnością (> 95%; Rysunek 2B). Dla porównania, LDN również zostały oczyszczone przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnym, jak opisano^{wcześniej 22}. Krótko mówiąc, PBMC by.......

Discussion

Ogólnie neutrofile uważano za komórki jednorodne. Jednak najnowsze dowody wykazały, że neutrofile mogą istnieć jako komórki o różnych stanach aktywacji i/lub wielu fenotypach. W związku z tym mogą istnieć różne podpopulacje neutrofili 13,14,15. Jedna z podpopulacji neutrofili, neutrofile o niskiej gęstości (LDN), zyskała duże zainteresowanie ze względu na swoje specyficzne właściwości wewnętrzne, a także ze względu na ich wzrost.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Przeciwciało anty-cytrulinowe dla królika poliklonalnego	AbCam	ab100932	Rozcieńczenie 1/50
Płytka do hodowli tkanek z 96 dołkami	Costar; Corning, Inc.	3596
Alexa Fluor 488 antyludzkie przeciwciało IgG1 u myszy CD11b	BioLegend	301317	0,25 μ g/mL
Alexa Fluor 647 antyludzkie przeciwciało IgM CD66b	BioLegend	305109	0,05 μ g/mL
Przeciwciało przeciwmysze IgG (H+L) dla koz, Alexa Fluor 488	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-11001	Rozcieńczenie 1/50
Przeciwciało monoklonalne IgG1 przeciwko elastazie antyneutrofylowej myszy	Santa Cruz Biotechnology	SC-55549	10 & mikro; g/mL
Przeciwciało przeciwkróliczego IgG (H+L) dla osła, Alexa Fluor 555	Invitrogen - Thermo Fisher Scientific	A-31572	Rozcieńczenie 1/50
Przeciwciało IgG1 myszy APC CD62L anty-human	BioLegend	304809	0,03 μ g/mL
Przeciwciało IgG1 na myszy przeciwciało APC/Cyjanina7 CD14	BioLegend	367107	0,25 μ g/mL
Attune NxT przepływowy cytometr	Thermo Fisher Scientific, Inc.	(niebieskie/czerwone lasery)
Albumina surowicy bydła (BSA) Fraction V	MP Biomedicals	810025
Brilliant Violet 510 antyludzkie przeciwciało IgG1 dla myszy CD33	BioLegend	366609	0,30 μ g/mL
DAPI	Calbiochem/EMD Millipore	268298
Dextran T500	Pharmacosmos A/C	5.51005E+11
Dihydrorodamina-123	Anaspec, Inc.	AS-85711
Sorter komórek FACS	Becton Dickinson	Model FACSAria
Serum bydła płodu (FBS)	Gibco	16000-044
Ficoll-Paque	Merck KG	GE 17-1440-03
Przeciwciało FITC CD98 na mysie IgG1 przeciwciało	BioLegend	315603	0,30 μ g/mL
FlowJo Software	Becton Dickinson	Wersja 10, 2019
Mikroskop fluorescencyjny odwrócony	Olympus	Model IX-70
Heparyna	Inhepar - PiSA Farmaceutica	3660149	5000 UI/mL
Hepes	Sigma Aldrich	H7006
MACSprep Chimerism CD66b Microbeads	Miltenyi Biotec	130-111-552
Magnes	Miltenyi Biotec	130-042-102
Kolumna separacji magnetycznej	Miltenyi Biotec	130-042-201
Mikrowirówka	Eppendorf	Model 5415C
Czytnik mikropłyt	BioTek Instruments	Model Synergy HT
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich	158127
PE antyludzkie na mysie CD10 – przeciwciało IgG1	BioLegend	312203	0,05 μ g/mL
PE antyludzkie przeciwciało CD16b IgG2a u myszy	BD Pharmingen	550868	Rozcieńczenie 1/40
PE/Cyjanina5 przeciwciało IgG1 u myszy CD15	BioLegend	323013	0,25 μ g/mL
Phorbol 12-myrystat 13-octan (PMA)	Sigma Aldrich	P8139
poli-L-Lizyna	Sigma Aldrich	P2658
Wirówka chłodzona	Eppendorf	Model 5702R
Pożywka do hodowli tkanek RPMI-1640	Gibco	23400-021
SYTOX Green	Molecular Probes, Inc.	S-7020
Tween-20	Sigma Aldrich	P2287
Vectashield	Laboratoria Vector	H-1000