Method Article

Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

DOI:

10.3791/69407

⸱

November 11th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) znacznie wzrastają w kilku chorobach. LDN są zwykle izolowane poprzez sortowanie komórek. Przedstawiamy praktyczną metodę uzyskania czystego i skutecznego LDN. Po wirowaniu krwi obwodowej z gradientem gęstości komórki są inkubowane za pomocą mikrogranulek magnetycznych, a następnie LDN rozdzielane przez kolumny magnetyczne.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile, ważne leukocyty wrodzonej odporności, tradycyjnie uważane są za jednorodną populację komórek. Niemniej jednak najnowsze dowody wykazały, że neutrofile występują w kilku podpopulacjach. Jedną z takich subpopulacji są neutrofile o niskiej gęstości (LDN). LDN występuje w niewielkich ilościach we krwi zdrowych osób, ale ich liczba znacznie wzrasta w chorobach takich jak toczeń rumieniowaty układowy, choroby autoimmunologiczne, nowotwory i infekcje. W takich przypadkach LDN może uczestniczyć w patogenezie choroby. Jedynym sposobem izolowania LDN jest wirowanie gęstościowo-gradientowe krwi obwodowej. Jednak po wirowaniu LDN współoczyszcza się z komórkami jednojądrowymi. Dlatego badanie tej subpopulacji neutrofili jest wyzwaniem. Nie istnieje standardowa metodologia oddzielania LDN od komórek jednojądrowych. Zazwyczaj LDN są rozdzielane przez sortowanie komórek w cytometrze przepływowym. Jednak ta metoda wymaga długich godzin sortowania, aby uzyskać wystarczającą liczbę czystych komórek do dalszych badań funkcjonalnych. To poważnie wpływa na żywotność i funkcjonowanie komórek. Proponujemy tutaj praktyczną metodę uzyskania dużych ilości czystej i żywotnej LDN w krótkim czasie. Po wirowaniu w gęstości-gradiencie frakcja komórki monojądrowej jest inkubowana z mikrokulkami magnetycznymi anty-CD66b, a następnie LDN są rozdzielane przez kolumny magnetyczne w ciągu < 30 minut. Oczyszczone LDN (komórki CD66b+ ) są oznaczane przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b i CD98 i są analizowane cytometrią przepływową w celu potwierdzenia. Oczyszczone LDN są całkowicie funkcjonalne, co potwierdza ich zdolność do produkcji reaktywnych form tlenu oraz tworzenia pułapek zewnętrznych neutrofilowych. Ta nowa metoda oczyszczania skutkuje wysoką czystością LDN (ponad 90%) i żywotnością (ponad 96%) w krótkim czasie. Metodę tę można łatwo skalować, aby uzyskać duże ilości czystego LDN i ocenić funkcje LDN w różnych chorobach za pomocą analizy biochemicznej lub innej omiki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile, dominujące leukocyty we krwi ludzkiej1, są kluczowymi uczestnikami wrodzonego układu odpornościowego. Docierają w dużych ilościach do tkanek z zapaleniem lub infekcją2. Tam neutrofile aktywują kilka funkcji efektorowych, takich jak fagocytoza 3,4, degranulacja 5,6 oraz tworzenie pułapek zewnętrznych neutrofili (NETs)7. Dodatkowo neutrofile również uczestniczą w adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej8. Klasyczne podejście do neutrofilów traktuje je jako jednorodne komórki produkowane w szpiku kostnym z ustaloną odpowiedzią 9,10. Jednak najnowsze badania pokazują, że neutrofile to komórki heterogeniczne z wieloma stanami fenotypowymi i funkcjonalnymi zarówno w zdrowych, jak i chorobowychstanach 11,12,13,14,15.

Wśród kilku subpopulacji neutrofilów o niskiej gęstości (LDN) wzbudziły duże zainteresowanie ze względu na swoje właściwości wewnętrzne oraz wzrost ich liczebności w kilku chorobach 16,17,18. LDN znaleziono we krwi pacjentów z toczniem rumieniowatym układowym (SLE) w 1986roku. Wykryto je po procesie separacji leukocytów w gradiencie gęstości20,21. Po wirowaniu krwi lub osocza bogatego w leukocyty w ośrodku gęstości (np. Ficoll-Paque), monocyty i limfocyty (znane jako komórki monojądrowe krwi obwodowej [PBMC]) tworzą pasmo w górnej (o niskiej gęstości) części rurki. Neutrofile osadzają się na dnie rurki. Wśród PBMC znaleziono także kilka neutrofilów; są to LDN (Rysunek 1). Niewielkie ilości LDN znajdują się we krwi zdrowych osób(22). Jednak wartości LDN znacząco wzrastają w stanach z wieloma immunosupresjami i przewlekłymi stanami zapalnymi, w tym SLE23,24, sepsa25, łuszica26, astma27, młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawówstawów 28, przeciwciała cytoplazmatyczne przeciw antyneutrofylowym (ANCA) związane z zapaleniem naczyń29, zakażenie HIV30, malarią31 oraz gruźlicą32. Chociaż liczba LDN wzrasta we wszystkich wymienionych patologiach, LDN była głównie badana w kontekście SLE17. LDN z krwi pacjentów z SLE wydaje się mieć większą zdolność do tworzenia NETs33, do wydzielania dużych ilości mediatorów prozapalnych34 oraz do aktywacji limfocytówT 24. Jednak w innych stanach, takich jak nowotwory, LDN składa się z dojrzałych i niedojrzałych neutrofilów35, z właściwościami supresyjnymilimfocytów T 36, 37, 38. Podobnie, u pacjentów z COVID-19 LDN również hamuje proliferację limfocytów T39, ale w przeciwieństwie do SLE, LDN wydaje się produkować mniej NET39. Dlatego pochodzenie, skład i właściwości funkcjonalne LDN wciąż budzą kontrowersje.

Ponieważ LDN występuje razem z PBMC, ich badanie jest technicznie skomplikowane. Aby w pełni zbadać właściwości LDN w różnych patologiach, konieczne jest ich oczyszczenie. Powszechną procedurą separacji LDN jest sortowanie fluorescencyjnymikomórkami 22,40,41,42,43,44,45. Jednak sortowanie komórek wymaga długiego czasu na separację komórek. Może to prowadzić do utraty komórek lub niskiej regeneracji, jeśli czas sortowania nie jest wystarczający. Ponadto komórki są narażone na nadmierny stres, co powoduje zmienne wyniki podczas badania ich funkcji. Długi czas sortowania zwiększa również koszty procedur eksperymentalnych i wymaga specjalistycznego personelu.

Przedstawiamy tutaj szybką i efektywną metodę uzyskania dużych ilości czystego i żywotnego ludzkiego LDN w bardzo krótkim czasie. Po wirowaniu gradientu gęstości LDN są rozdzielane przez sortowanie ogniw magnetycznych (MACS; Rysunek 1). Główną zaletą tej metody oczyszczania jest to, że LDN są rozdzielane o wysokiej czystości (ponad 90%) i żywotności (ponad 96%). Ponadto oczyszczone LDN są w pełni funkcjonalne, co potwierdza ich zdolność do wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) oraz uwalniania NET. Protokół ten można łatwo wdrożyć w każdym laboratorium zainteresowanym biologią neutrofilii, aby szybko oddzielić LDN od krwi osób z wieloma chorobami i umożliwić dalsze badania tych komórek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury w tym protokole są zgodne z wytycznymi Komitetu Bioetyki Badań Ludzkich w Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę.

1. Izolacja jednojądrowych komórek krwi obwodowej (PBMC) i neutrofilów z ludzkiej krwi

  1. Pobierz około 10 ml krwi od zdrowego dorosłego ochotnika poprzez nakłucie żył. Dodaj 10 U/mL heparyny jako środek przeciwzakrzepowy.
    UWAGA: Umieść igłę w pojemniku na igły niebezpieczne dla biohazardu. Strzykawki i inne materiały mające kontakt z krwią należy umieścić w worku i podłączyć do autoklawu przed utylizacją.
  2. W stożkowej wirówce o pojemności 15 mL dodaj 2 mL 6% dektranu T500 w PBS. Następnie dodaj 10 ml krwi, spuszczając ją wzdłuż rurki. Odwróć rurkę kilka razy, żeby połączyć krew z dektranem.
  3. Zostaw rurkę odpocząć przez 45 minut, podczas gdy erytrocyty się osadzą. Osocze bogate w leukocyty pojawia się powyżej warstwy erytrocytów.
  4. W kolejnej 15 mL rurce do wirówki dodaj 5 mL medium gradientowego gęstości. Ostrożnie pipetuj osocze, nie dotykając erytrocytów, i nakładaj je na ośrodek. Należy utworzyć dwie oddzielne fazy.
  5. Wiruj rurkę w 516 x g przez 20 minut w 4 °C. Ogniwa monojądrowe (PBMC) tworzą pasmo między plazmą a warstwami medium. Neutrofile tworzą pelet na dole (Rysunek 1).
  6. Izolacja PBMC
    1. Eliminuj przez aspirację osocza na PBMC bez dotykania komórek. Zbierz komórki z pasma między osoczem a ośrodkiem. Upewnij się, że aspirujesz jak najmniej medium.
    2. Umieść ogniwa w stożkowej rurce wirówki 50 mL. Dodaj 20 ml PBS. Wiruj probówkę w 400 x g przez 5 minut w 4 °C.
    3. Ostrożnie zasysaj supernatant i zeskrobaj rurkę, aby oddzielić komórki. Dodaj 10 ml zimnego PBS, aby ponownie zawiesić komórki. Policz PBMC za pomocą komory Neubauera.
      UWAGA: Nie używaj pipety do ponownego zawieszenia komórek, ponieważ może to uszkodzić komórki.
  7. Izolacja neutrofilów
    1. Usuń medium gradientu gęstości. Oddziel ogniwa, skrobując rurkę i dodając 10 ml zimnego PBS.
    2. Włóż komórki do świeżej rurki do wirówki o pojemności 50 mL i wiruj w dawce 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Aspiruj supernatant i rozdziel komórki zgodnie z krokiem 1.6.3.
  8. Aby wyeliminować pozostałości erytrocytów, dodaj 10 mL zimnego roztworu hipotonicznego (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4) i delikatnie mieszaj dokładnie przez 1 minutę.
  9. Szybko dodaj 10 mL zimnego roztworu hipertonicznego (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4), aby roztwór był izotoniczny.
  10. Policz neutrofile za pomocą komory Neubauera (czystość > 95%). Rozpylaj komórki przez wirowanie, jak w kroku 1.6.2. i ponownie zawiesić je w zimnym PBS. Utrzymuj rurkę na lodzie.
    UWAGA: Podawa się, że okres półtrwania neutrofilów in vitro wynosi 8 - 12 h 46,47,48. Z naszego doświadczenia z tym protokołem wynika, że neutrofile utrzymują swoją funkcję przez około 6 do 8 godzin.

2. Oczyszczanie neutrofilów o niskiej gęstości (LDN)

  1. Wiruj PBMC w 400 x g przez 5 minut w 4 °C. Usuń supernatant i ponownie zawiesij komórki w 120 μL buforu do zimnego mycia (1% BSA w PBS).
  2. Dodaj 35 μL magnetycznych mikrokulek CD66b. Inkubuj mieszankę w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Mieszaj delikatnie co 10 minut, aby zapobiec gromadzeniu się komórek.
  3. Dodaj 1 ml buforu do mycia w zimno. Umieść komórki w mikrowirówce i obracaj w 400 x g przez 3 minuty.
  4. Usuń supernatant, oddziel pellet ogniwa przez skrobanie rurki i ponownie zawiesij komórki w 1 ml buforu do płukania.
  5. Umieść na magnesie kolumnę separacyjną magnetyczną. Dodaj 0,5 mL buforu do kolumny i pozwól mu przejść przez kolumnę.
  6. Przenieś komórki (1 mL) na kolumnę. Niech bufor przechodzi przez kolumnę kropla po kroplu.
  7. Dodaj 0,5 mL bufora do przepłynięcia do kolumny i pozwól mu przejść. Dodaj kolejne 0,5 mL buforu do płukania.
  8. Wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w rurce mikrowirówki. Dodaj 1 ml buforu do prania do kolumny.
  9. Włóż tłok na górę kolumny i delikatnie wywieraj nacisk, aby wyłączyć komórki. Usuń tłok i połóż kolumnę na nowej rurce mikrowirówki.
  10. Dodaj kolejne 1 ml buforu do mycia. Włóż tłok na górę kolumny i delikatnie wywieraj nacisk, aby wyłączyć komórki.
  11. Obie probówki umieść w mikrowirówce i kręć je w 800 x g przez 3 minuty. Na koniec ponownie zawiesić komórki (LDN) z obu rurek do 1 mL zimnego PBS. Trzymaj się na lodzie.
    UWAGA: Pierwsze 2 mL przepływu zawiera resztę PBMC. Te komórki mogą być wykorzystywane w innych badaniach.

3. Wielokolorowa cytometria przepływowa

  1. Ponownie zawieszaj oczyszczone komórki w ilości 1 x10 6 komórek /mL w buforze znakującym (1% FBS w PBS). Dodaj 250 μL komórek do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
  2. Dodaj odpowiadające im przeciwciała przeciwko cząsteczkom błony neutrofili (szczegóły w Tabeli Materiałów). Inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc je przed światłem.
  3. Dodaj 1 ml PBS. Włóż probówki do mikrowirówki i obróć je w 800 x g przez 3 minuty.
  4. Aspiruj supernatant, rozbij granulkę komórkową przez stuknięcie w rurkę i ponownie zawiesij komórki w 0,5 mL 1% paraformaldehydu.
  5. Utrzymuj komórki w temperaturze 4 °C chronione przed światłem do czasu analizy cytometrii przepływowej. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej, rejestrując 10 000 zdarzeń na próbkę. Wykonaj sortowanie komórek zgodnie z opisaniemwcześniej 22.
    UWAGA: Paraformaldehyd drażni skórę i drogi oddechowe. Upewnij się, że nie wdychasz pary.

4. Wykrywanie reaktywnych substancji tlenu (ROS)

  1. W rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL dodaj 2,5 x 10 ogniw5 ogniw. Włóż probówki do mikrowirówki i obróć w 800 x g przez 3 minuty.
  2. Aspiracja supernatantu, zeskrobanie rurki, aby oddzielić komórki, i ponowna zawiesina komórek w 100 μL 15 μM dihydrorodaminy 123 w PBS.
  3. Inkubuj komórki chronione przed światłem w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Dodaj 1 ml PBS.
  4. Włóż probówki do mikrowirówki i obróć w 800 x g przez 3 minuty. Aspiracja supernatantu, zeskrobanie rurki, aby oddzielić komórki, i ponowna zawiesina w 100 μL 50 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) w PBS.
  5. Inkubuj komórki chronione przed światłem w temperaturze 37 °C przez 45 minut. Dodaj 1 ml PBS.
  6. Włóż probówki do mikrowirówki i obróć je w 800 x g przez 3 minuty. Aspiracja supernatantu, zeskrobanie rurki, aby oddzielić komórki, i ponowna zawieszenie w 0,5 mL 1% paradehydu w PBS.
  7. Utrzymuj komórki w temperaturze 4 °C, chronione przed światłem do czasu analizy cytometrii przepływowej. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej, rejestrując 10 000 zdarzeń na próbkę.

5. Wizualizacja pułapek zewnętrznych neutrofili (NET)

  1. Umieść pokrywy w dołkach płyty 12-dołkowej i przykryj je poli-L-Lizyną o stężeniu 10 μg/mL. Inkubuj płytkę przez noc w 4 °C z delikatnym mieszaniem.
  2. Usuń poli-L-Lizynę i umyj pokrywki PBS, inkubując płytkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Okładki wyprać PBS jeszcze dwa razy.
  3. Zdejmij PBS i pozwól wyschnąć pokrywy, umieszczając płytkę w laminarnym okapie na 2 godziny.
  4. Ponownie zawiesij LDN na 1 x 106 komórek /mL w RPMI-1640 medium z 5% FBS. Weź 350 μL (3,5 x 105 ogniw) zawiesiny komórkowej i umieść je w wgłębieniu płyty 12-dołkowej zawierającej pokrywki.
  5. Utrzymuj płytkę przez 30 minut w inkubatorze 5%CO2 w temperaturze 37 °C. Dodaj 3,5 μL 5 μM PMA rozcieńczonego w PBS do każdego dołku (końcowe stężenie PMA to 50 nM).
  6. Trzymaj talerz przez 4 godziny w inkubatorze 5%CO2 w temperaturze 37 °C. Dodaj 350 μL paraformaldehydu 8% w PBS i przechowuj płytę przez noc w inkubatorze 5%CO2 w temperaturze 37 °C.
  7. Na podstawce probówki należy nałożyć przezroczystą folię, jak opisanowcześniej 49, tak aby na otworach w rurkach powstały otwory.
  8. Wypełnij każdą jamkę różnymi roztworami do mycia lub bejcowania pokrywek, tworząc dużą kroplę. Zdejmij pokrywki i połóż je do góry nogami na kropli wody na 5 minut. W ten sam sposób umyj pokrywy jeszcze trzy razy wodą.
  9. Umieść pokrywki do góry nogami na kropli bufora blokującego (5% BSA w PBS) i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Przełóż slipy do kropli odpowiadającego mu przeciwciała pierwotnego (np. antyelastazy lub anty-cytruliny) w buforze blokującym i inkubuj przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Pokrywa się 2x w 0,01% Tween-20 w PBS. Przenieś pokrywki do kropli odpowiadającego przeciwciała wtórnego w buforze blokującym zawierającym 150 nM DAPI i inkubuj przez 60 minut w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem.
  12. Pokrywa się 2x w 0,01% Tween-20 w PBS. Połóż kroplę środka antyfade na szklanym szkiełku i połóż pokrywki do góry nogami.
  13. Zabezpiecz pokrywki wokół obwodu lakierem do paznokci. Zamki montowane w magazynie w temperaturze 4 °C, chronione przed światłem. Wizualizuj NET-y za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

6. Wykrywanie pułapek zewnętrznych neutrofili (NET)

  1. Ponownie zawiesz komórki 5 x 105 komórek /mL w 500 nM Sytox Green, rozcieńczonym w medium RPMI-1640 z 5% FBS.
  2. Weź 100 μL (5 x 104 komórek ) zawiesiny komórkowej i umieść je w dołku z płytą do hodowli tkankowej z 96 dołkami.
  3. Przechowywać płytkę przez 20 minut w inkubatorze 5%CO2 w temperaturze 37 °C. Do każdego dołka dodaj 20 μL 300 nM PMA rozcieńczonego w medium RPMI-1640 (końcowe stężenie PMA to 50 nM).
  4. Przenieś płytkę do wcześniej podgrzanego czytnika mikropłytek. Inkubuj płytę w temperaturze 35 °C przez 4 godziny, wykonując pomiary fluorescencji od spodu płytki co 5 minut (przy użyciu filtrów wzbudzających 485 nm i emisji 528 nm).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) u zdrowych osobników stanowią około 5% PBMC (Rysunek 2A). Opisany tutaj protokół zazwyczaj dostarcza czysty (> 90%) LDN. Komórki są również efektywnie odzyskiwane (plon około 98%) z wysoką żywotnością (> 95%; Rysunek 2B). Dla porównania, LDN również zostały oczyszczone przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnym, jak opisanowcześniej 22. Krótko mówiąc, P...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnie neutrofile uważano za komórki jednorodne. Jednak najnowsze dowody wykazały, że neutrofile mogą istnieć jako komórki o różnych stanach aktywacji i/lub wielu fenotypach. W związku z tym mogą istnieć różne podpopulacje neutrofili 13,14,15. Jedna z podpopulacji neutrofili, neutrofile o niskiej gęstości (LDN), zyskała duże zainteresowanie ze względu na swoje specyficzne właściwości wewnętrzne, a także ze względu na ich wzrost...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy twierdzą, że badanie to zostało przeprowadzone bez żadnych powiązań handlowych czy finansowych, które mogłyby być postrzegane jako potencjalny konflikt interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Césarowi Díaz-Godínezowi (Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM) za pomoc w mikroskopii fluorescencyjnej w wizualizacji NET-ów. Badania te zostały wsparte grantem PAPIIT IN205523 od Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Meksyk, oraz grantem CF-2023-I-610 od Secretaría de Ciencias, Humanidades, Tecnología e Inovación (Secihti), Meksyk.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  Przeciwciało anty-cytrulinowe dla królika poliklonalnegoAbCamab100932Rozcieńczenie 1/50
Płytka do hodowli tkanek z 96 dołkamiCostar; Corning, Inc.3596
Alexa Fluor 488 antyludzkie przeciwciało IgG1 u myszy CD11bBioLegend3013170,25 μ g/mL
Alexa Fluor 647 antyludzkie przeciwciało IgM CD66bBioLegend3051090,05 μ g/mL
Przeciwciało przeciwmysze IgG (H+L) dla koz, Alexa Fluor 488Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-11001Rozcieńczenie 1/50
Przeciwciało monoklonalne IgG1 przeciwko elastazie antyneutrofylowej myszySanta Cruz BiotechnologySC-5554910 & mikro; g/mL
Przeciwciało przeciwkróliczego IgG (H+L) dla osła, Alexa Fluor 555Invitrogen - Thermo Fisher ScientificA-31572Rozcieńczenie 1/50
Przeciwciało IgG1 myszy APC CD62L anty-humanBioLegend3048090,03 μ g/mL
Przeciwciało IgG1 na myszy przeciwciało APC/Cyjanina7 CD14BioLegend3671070,25 μ g/mL
Attune NxT przepływowy cytometr  Thermo Fisher Scientific, Inc.(niebieskie/czerwone lasery)
Albumina surowicy bydła (BSA) Fraction VMP Biomedicals810025
Brilliant Violet 510 antyludzkie przeciwciało IgG1 dla myszy CD33BioLegend3666090,30 μ g/mL
DAPICalbiochem/EMD Millipore268298
Dextran T500Pharmacosmos A/C5.51005E+11
Dihydrorodamina-123Anaspec, Inc.AS-85711
Sorter komórek FACSBecton Dickinson Model FACSAria
Serum bydła płodu (FBS)Gibco16000-044
Ficoll-PaqueMerck KGGE 17-1440-03
Przeciwciało FITC CD98 na mysie IgG1 przeciwciałoBioLegend3156030,30 μ g/mL
FlowJo SoftwareBecton DickinsonWersja 10, 2019
Mikroskop fluorescencyjny odwróconyOlympusModel IX-70
HeparynaInhepar - PiSA Farmaceutica36601495000 UI/mL
HepesSigma AldrichH7006
MACSprep Chimerism CD66b MicrobeadsMiltenyi Biotec130-111-552
MagnesMiltenyi Biotec130-042-102
Kolumna separacji magnetycznejMiltenyi Biotec130-042-201
MikrowirówkaEppendorfModel 5415C
Czytnik mikropłytBioTek InstrumentsModel Synergy HT
ParaformaldehydSigma Aldrich158127
PE antyludzkie na mysie CD10 – przeciwciało IgG1BioLegend3122030,05 μ g/mL
PE antyludzkie przeciwciało CD16b IgG2a u myszyBD Pharmingen550868Rozcieńczenie 1/40
PE/Cyjanina5 przeciwciało IgG1 u myszy CD15BioLegend3230130,25 μ g/mL
Phorbol 12-myrystat 13-octan (PMA)Sigma AldrichP8139
poli-L-LizynaSigma AldrichP2658
Wirówka chłodzonaEppendorfModel 5702R
Pożywka do hodowli tkanek RPMI-1640Gibco23400-021
SYTOX GreenMolecular Probes, Inc.S-7020
Tween-20 Sigma AldrichP2287
VectashieldLaboratoria VectorH-1000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yvan-Charvet, L., Ng, L. G. Granulopoiesis and neutrophil homeostasis: A metabolic, daily balancing act. Trends Immunol. 40 (7), 598-612 (2019).
  2. Liew, P. X., Kubes, P. The neutrophil's role during health and disease. Physiol. Rev. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  3. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: A fundamental process in immunity. Biomed Res Int. 2017, 9042851(2017).
  4. Uribe-Querol, E., Rosales, C. Phagocytosis: Our current understanding of a universal biological process. Front Immunol. 11, 1066(2020).
  5. Faurschou, M., Borregaard, N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation. Microbes Infect. 5 (14), 1317-1327 (2003).
  6. Lacy, P., Eitzen, G. Control of granule exocytosis in neutrophils. Front Biosci. 13, 5559-5570 (2008).
  7. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  8. Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. J Leukoc Biol. 108 (1), 377-396 (2020).
  9. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  10. Lawrence, S. M., Corriden, R., Nizet, V. The ontogeny of a neutrophil: Mechanisms of granulopoiesis and homeostasis. Microbiol Mol Biol. Rev. 82 (1), e00057-e00117 (2018).
  11. Aroca-Crevillén, A., Vicanolo, T., Ovadia, S., Hidalgo, A. Neutrophils in physiology and pathology. Annu Rev Pathol. 19, 227-259 (2024).
  12. Hellebrekers, P., Vrisekoop, N., Koenderman, L. Neutrophil phenotypes in health and disease. Eur J Clin Invest. 48 (Suppl 2), e12943(2018).
  13. Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nat Rev Immunol. 19 (4), 255-265 (2019).
  14. Qu, J., Jin, J., Zhang, M., Ng, L. G. Neutrophil diversity and plasticity: Implications for organ transplantation. Cell Mol Immunol. 20 (9), 993-1001 (2023).
  15. Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Front Physiol. 9, 113(2018).
  16. Silvestre-Roig, C., Fridlender, Z. G., Glogauer, M., Scapini, P. Neutrophil diversity in health and disease. Trends Immunol. 40 (7), 565-583 (2019).
  17. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes in systemic autoimmunity and autoinflammation. Immunol Rev. 314 (1), 313-325 (2023).
  18. Ning, X., Wang, W. M., Jin, H. Z. Low-density granulocytes in immune-mediated inflammatory diseases. J Immunol. 2022, 1622160(2022).
  19. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis Rheum. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  20. Böyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  21. García-García, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J Vis Exp. (74), e50410(2013).
  22. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Front Immunol. 12, 672520(2021).
  23. Midgley, A., Beresford, M. W. Increased expression of low-density granulocytes in juvenile-onset systemic lupus erythematosus patients correlates with disease activity. Lupus. 25 (4), 407-411 (2016).
  24. Rahman, S., et al. Low-density granulocytes activate T cells and demonstrate a non-suppressive role in systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 78 (7), 957-966 (2019).
  25. Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low-density subpopulations and CD10 (calla) negative neutrophils in severely infected patients. Surg Today. 22, 322-327 (1992).
  26. Lin, A. M., et al. Mast cells and neutrophils release IL-17 through extracellular trap formation in psoriasis. J Immunol. 187 (1), 490-500 (2011).
  27. Fu, J., Tobin, M. C., Thomas, L. L. Neutrophil-like low-density granulocytes are elevated in patients with moderate to severe persistent asthma. Ann Allergy Asthma Immunol. 113 (6), 635-640 (2014).
  28. Ramanathan, K., et al. Neutrophil activation signature in juvenile idiopathic arthritis indicates the presence of low-density granulocytes. Rheumatology (Oxford). 57 (3), 488-498 (2018).
  29. Grayson, P. C., et al. Neutrophil-related gene expression and low-density granulocytes associated with disease activity and response to treatment in antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis. Arthritis Rheumatol. 67 (7), 1922-1932 (2015).
  30. Cloke, T., Munder, M., Taylor, G., Müller, I., Kropf, P. Characterization of a novel population of low-density granulocytes associated with disease severity in HIV-1 infection. PLoS One. 7, e48939(2012).
  31. Rocha, B. C., et al. Type I interferon transcriptional signature in neutrophils and low-density granulocytes is associated with tissue damage in malaria. Cell Rep. 13 (12), 2829-2841 (2015).
  32. Deng, Y., et al. Low-density granulocytes are elevated in mycobacterial infection and associated with the severity of tuberculosis. PLoS One. 11 (4), e0153567(2016).
  33. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
  34. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  35. Sagiv, J. Y., et al. Phenotypic diversity and plasticity in circulating neutrophil subpopulations in cancer. Cell Rep. 10 (4), 562-573 (2015).
  36. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The multifaceted roles neutrophils play in the tumor microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (December), 125-158 (2015).
  37. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. J Leukoc Biol. 107 (5), 809-818 (2020).
  38. Vanhaver, C., et al. Immunosuppressive low-density neutrophils in the blood of cancer patients display a mature phenotype. Life Sci Alliance. 7 (1), e202302332(2023).
  39. Dwivedi, A., et al. Emergence of dysfunctional neutrophils with a defect in arginase-1 release in severe COVID-19. JCI Insight. 9 (17), e171659(2024).
  40. Cabrera, L. E., et al. Characterization of low-density granulocytes in COVID-19. PLoS Pathog. 17 (7), e1009721(2021).
  41. Dumont, B. L., et al. Low-density neutrophils and neutrophil extracellular traps (nets) are new inflammatory players in heart failure. Can J Cardiol. 40 (9), 1524-1535 (2024).
  42. Dumont, B. L., et al. Low-density neutrophils contribute to subclinical inflammation in patients with type 2 diabetes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1674(2024).
  43. Jones, B. E., et al. Anca autoantigen gene expression highlights neutrophil heterogeneity, where expression in normal-density neutrophils correlates with anca-induced activation. Kidney Int. 98 (3), 744-757 (2020).
  44. Li, Y., et al. The proportion, origin, and pro-inflammation roles of low-density neutrophils in SFTS disease. BMC Infect. Dis. 19 (1), 109(2019).
  45. Martin, K. R., et al. Cd98 defines a metabolically flexible, proinflammatory subset of low-density neutrophils in systemic lupus erythematosus. Clin Transl Med. 13 (1), e1150(2023).
  46. Murphy, M. P., Caraher, E. Mcl-1 is vital for neutrophil survival. Immunol Res. 62 (2), 225-233 (2015).
  47. Nauseef, W. M. Neutrophils, from cradle to grave and beyond. Immunol Rev. 273 (1), 5-10 (2016).
  48. Pérez-Figueroa, E., Álvarez-Carrasco, P., Ortega, E., Maldonado-Bernal, C. Neutrophils: Many ways to die. Front Immunol. 12, 631821(2021).
  49. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: How to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), e1724(2010).
  50. Emmendörffer, A., Hecht, M., Lohmann-Matthes, M. L., Roesler, J. A fast and easy method to determine the production of reactive oxygen intermediates by human and murine phagocytes using dihydrorhodamine 123. J Immunol Methods. 131 (2), 269-227 (1990).
  51. Pioch, J., Blomgran, R. Optimized flow cytometry protocol for dihydrorhodamine 123-based detection of reactive oxygen species in leukocyte subpopulations in whole blood. J Immunol Methods. 507, 113308(2022).
  52. Liu, X., et al. Pad4 takes charge during neutrophil activation: Impact of pad4 mediated net formation on immune-mediated disease. J Thromb Haemost. 19 (7), 1607-1617 (2021).
  53. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
  54. Alemán, O. R., Mora, N., Cortes-Vieyra, R., Uribe-Querol, E., Rosales, C. Transforming growth factor-β-activated kinase 1 is required for human fcγriiib-induced neutrophil extracellular trap formation. Front Immunol. 7, 277(2016).
  55. Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent net release with immune complexes. Autoimmun Rev. 15 (6), 577-584 (2016).
  56. Sanchez Gonzalez, A., Bardoel, B. W., Harbort, C. J., Zychlinsky, A. Neutrophil methods and protocols. , Humana Press - Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  57. Mishalian, I., Granot, Z., Fridlender, Z. G. The diversity of circulating neutrophils in cancer. Immunobiology. 222 (1), 82-88 (2017).
  58. Wright, H. L., Makki, F. A., Moots, R. J., Edwards, S. W. Low-density granulocytes: Functionally distinct, immature neutrophils in rheumatoid arthritis with altered properties and defective TNF signalling. J Leukoc Biol. 101 (2), 599-611 (2017).
  59. Bruger, A. M., et al. How to measure the immunosuppressive activity of mdsc: Assays, problems and potential solutions. Cancer Immunol Immunother. 68 (4), 631-644 (2019).
  60. Kimberly, R. P., Ahlstrom, J. W., Click, M. E., Edberg, J. C. The glycosyl phosphatidylinositol-linked FCγRIII PMN mediates transmembrane signaling events distinct from FCγRII. J Exp Med. 171 (4), 1239-1255 (1990).
  61. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Fc receptors: Cell activators of antibody functions. Adv Biosci Biotech. 4, 21-33 (2013).
  62. Unkeless, J. C., Shen, Z., Lin, C. W., Debeus, E. Function of human fcγriia and fcγriiib. Semin Immunol. 7 (1), 37-44 (1995).
  63. Ghaemdoust, F., Keshavarz-Fathi, M., Rezaei, N. Natural killer cells and cancer therapy, what we know and where we are going. Immunotherapy. 11 (14), 1231-1251 (2019).
  64. Lanier, L. L., Le, A. M., Civin, C. I., Loken, M. R., Phillips, J. H. The relationship of CD16 (leu-11) and leu-19 (NKH-1) antigen expression on human peripheral blood NK cells and cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 136 (12), 4480-4486 (1986).
  65. Huizinga, T. W., et al. The pi-linked receptor fcriii is released on stimulation of neutrophils. Nature. 333 (6174), 667-669 (1988).
  66. Jongstra-Bilen, J., Harrison, R., Grinstein, S. Fcγ-receptors induce mac-1 (cd11b/cd18) mobilization and accumulation in the phagocytic cup for optimal phagocytosis. J Biol Chem. 278 (46), 45720-45729 (2003).
  67. Tak, T., et al. Human CD62Ldim neutrophils identified as a separate subset by proteome profiling and in vivo pulse-chase labeling. Blood. 129 (26), 3476-3485 (2017).
  68. Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Exp Cell Res. 342 (2), 200-209 (2016).
  69. Schröder, A. K., Uciechowski, P., Fleischer, D., Rink, L. Crosslinking of CD66 b on peripheral blood neutrophils mediates the release of interleukin-8 from intracellular storage. Hum Immunol. 67 (9), 676-682 (2006).
  70. Skubitz, K. M., Campbell, K. D., Skubitz, A. P. Cd66a, cd66b, cd66c, and cd66d each independently stimulate neutrophils. J Leukoc Biol. 60 (1), 106-117 (1996).
  71. Basic principle of magnetic cell separation. , Miltenyi Biotec. https://www.miltenyibiotec.com/UN-en/products/macs-cell-separation/basic-principle-of-magnetic-cell-separation.html?query=:relevance:allCategoriesOR:10000089 (2025).
  72. Connelly, A. N., et al. Optimization of methods for the accurate characterization of whole blood neutrophils. Sci. Rep. 12 (1), 3667(2022).
  73. Hardisty, G. R., et al. High purity isolation of low density neutrophils casts doubt on their exceptionality in health and disease. Front Immunol. 12, 625922(2021).
  74. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. J Clin Invest. 126 (5), 1612-1620 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Low Density NeutrophilsMagnetic MicrobeadsNeutrophil PurificationDensity GradientPeripheral BloodFlow CytometryMononuclear CellsReactive Oxygen SpeciesNeutrophil Extracellular TrapsCD66b Marker

Related Articles