Artykuł metodologiczny

Charakterystyka morfologii Regeneracji przedniej u Diopatra claparedii

DOI:

10.3791/69421

⸱

13 marca 2026

 ,  ,  , 
1Faculty of Science and Marine Environment, Universiti Malaysia Terengganu, 2STEM Foundation Centre, Universiti Malaysia Terengganu

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten stanowi skoncentrowane ramy do charakteryzacji procesu regeneracji przedniej u Diopatra claparedii, stanowiąc kluczowy krok w kierunku przyszłych badań regeneracyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poliszczęty mają zdolność regeneracji przednich i tylnych segmentów po urazie lub samoamputacji, co stanowi łatwy sposób do badania naprawy ran i wzorowania tkanek. Aby wesprzeć badania porównawcze i mechanistyczne w zakresie regeneracji pierścienia, badanie przedstawia protokół indukowania i charakteryzowania przedniej regeneracji u Diopatra claparedii (D. claparedii). Protokół określa kroki dotyczące obsługi okazów, ich unieruchomienia i precyzyjnej amputacji, a następnie zaplanowanych punktów obserwacyjnych dokumentujących morfologiczny postęp w trakcie regeneracji. D. claparedii były delikatnie wyjmowane z rurek za pomocą tępego końcówki i unieruchomiane w 4% chlorku magnezu, aby wywołać relaksację. Amputacja przednia została przeprowadzona w czwartym chaetigerze pod stereomikroskopem, a proces regeneracji monitorowano w dniach 1, 6, 15, 30 i 60 po amputacji. Procedura umożliwia stałą indukcję przedniej regeneracji i obejmuje kluczowe cechy morfologiczne we wczesnym zamykaniu ran, tworzeniu blastemy oraz ponownym nawiązywaniu segmentów. Dzięki dostarczaniu powtarzalnego przepływu pracy i odniesienia morfologicznego dla D. claparedii, protokół ten stanowi praktyczną podstawę, która wspiera przyszłe badania mające na celu powiązanie obserwacji morfologicznych z procesami komórkowymi lub molekularnymi w regeneracji pierścieni.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poliszczety stanowią niemal 65% wszystkich opisanych gatunków pierścieni, co czyni je jedną z najbardziej zróżnicowanych grup bezkręgowców morskich1. Niedawna zaktualizowana lista kontrolna gatunków polichaetów (Annelida) odnotowała łącznie 57 gatunków należących do 47 rodzajów w 30 rodzinach z wód przybrzeżnych Malezji, z większością gatunków (53 gatunki) zgłoszonymi z Półwyspu Malajskiego2. Wśród nich Diopatra claparedii (D. claparedii) Grube, 1878, lokalnie znana jako ruat sarung, jest jednym z komercyjnie wykorzystywanych gatunków poliszczęków w Malezji. Występuje głównie wzdłuż błotnistych równin na zachodnim wybrzeżu Półwyspu Malajskiego, w tym na stanowiskach takich jak Jeram Beach, Selangor 2,3.

D. claparedii należy do rodziny Onuphidae i jest osiadłym wieloszczatem żyjącym w rurkach, znanym ze zdolności regeneracji zarówno przednich, jak i tylnych segmentów ciała. Obejmuje to elementy centralnego i obwodowego układu nerwowego4. Jego dobrze zdefiniowany segmentowy plan ciała oraz wyraźna zdolność regeneracyjna czynią D. claparedii obiecującym i przystępnym do wykonania modelem bezkręgowców do badania regeneracji tkanek w stosunkowo złożonych systemach biologicznych. Wybór D. claparedii jako organizmu modelowego do badań regeneracyjnych wynika z jego znaczenia ekologicznego, regionalnego oraz obecnych luk w wiedzy naukowej dotyczącej jego zdolności regeneracyjnej. Gatunek ten jest pozyskiwany komercyjnie i szeroko wykorzystywany jako przynęta do wędkowania w Malezji, co wskazuje, że jest dobrze znany lokalnym społecznościom i nie jest uważany za rzadki 2,3. Dlatego badanie regeneracji u D. claparedii ma wartość praktyczną i ekonomiczną, ponieważ wyniki mogą pomóc rozpowszechniać wiedzę naukową wśród lokalnych interesariuszy, a jednocześnie potencjalnie wspierać strategie wspierające zrównoważony rozwój populacji poprzez lepsze zrozumienie mechanizmów regeneracji.

Ponadto D. claparedii wykazuje specyficzny zasięg geograficzny w Azji Południowo-Wschodniej, ze szczególną obecnością w malezyjskich ekosystemach przybrzeżnych 2,3. Jednak większość badań regeneracyjnych poliszczęt i innych pierścików koncentrowała się na gatunkach z obu Ameryk lub innych regionów nieazjatyckich 5,6. Na przykład dobrze zbadana Diopatra neapolitana (D. neapolitana), często wykorzystywana jako gatunek biomarkerowy regeneracyjny, ma szeroki zasięg obejmujący Morze Czerwone, Ocean Indyjski, Morze Śródziemne i OceanAtlantycki 7. W konsekwencji badania regeneracyjne pierścieni rodzimych dla Azji Południowo-Wschodniej, w tym D. claparedii, pozostają ograniczone.

Wcześniejsze badania na poliszczetach wykazały wyraźne i powtarzalne etapy regeneracji, w tym zamykanie ran, tworzenie blastemy oraz segmentalne zróżnicowanie tkanek 7,8. Chociaż badania molekularne D. claparedii były wcześniej zgłaszane, badania skupiające się wyłącznie na regeneracji są rzadkie. Co więcej, dotychczasowe prace w dużej mierze kładą nacisk na charakteryzację molekularną, a nie na eksperymentalne protokoły regeneracji. Co więcej, D. claparedii wykazuje zarówno procesy dedyferencjacji, jak i redyferencjacji, odzwierciedlając mechanizmy bardziej porównywalne do tych u organizmów wyższych9. Ta złożoność odpowiedzi regeneracyjnej podkreśla rosnące uznanie poliszczetów jako cennych modeli pośrednich, skutecznie łącząc proste bezkręgowce i złożone w badaniach regeneracji.

Niniejsze badanie wypełnia tę lukę poprzez ustanowienie i optymalizację protokołu regeneracji dla D. claparedii, zapewniając solidne ramy dla przyszłych badań funkcjonalnych, rozwojowych i molekularnych nad regeneracją tego regionalnie ważnego gatunku polichaetu. Konkretnie, protokół ten oferuje wiarygodne podejście do badania kolejnych etapów i mechanizmów regeneracji u polichaetów. Umożliwia to systematyczną obserwację i charakteryzację kluczowych procesów regeneracyjnych, w tym gojenia ran, tworzenia blastemy i segmentacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Uniwersytetu Malezji Terengganu pod numerem zatwierdzenia UMT/JKEPH/2026/173

1. Kolekcja i habituacja D. claparedii

  1. Zlokalizować D. claparedii na błotnistym obszarze strefy międzypływowej estuarii (średni poziom pływów ze średnim drobnym piaskiem), który stanowi jego naturalne siedlisko.
  2. Wykopuj górną część rurek polichaetów, delikatnie wbijając łopatą w osady, aby nie uszkodzić rur.
  3. Potwierdź obecność robaka w każdej rurce, delikatnie ściskając rurkę i sprawdzając, czy nie jest ruchu lub oporu.
  4. Wybieraj tylko osobniki o minimalnej rozluźnionej długości ciała 5 cm.
    UWAGA: Wybieraj poliszczety według długości ciała, aby zmniejszyć uszkodzenia podczas manipulacji i uniknąć fragmentacji podczas ważenia.
  5. Zbieraj osady łopatą z tych samych miejsc, aby utrzymać spójność środowiska w laboratorium.
  6. Przetransportuj zebrane próbki do laboratorium w przenośnych pojemnikach chłodzących w temperaturze pokojowej. Przykryj rurki ręcznikiem zwilżonym wodą morską, aby utrzymać wilgotność i zmniejszyć stres podczas transportu.
  7. W laboratorium ręcznie oddzielaj zanieczyszczenia od osadów, a następnie susz materiał na powietrzu pod bezpośrednim słońcem, aż będzie całkowicie suchy i wolny od resztek wilgoci.
  8. Usuń lub oczyścij inne organizmy (np. małe kraby, muszle lub substancje obce), aby upewnić się, że osad jest wolny od zanieczyszczeń.
  9. Przepłucz rurki z poliszczetów sztuczną wodą morską (ASW), aby usunąć zanieczyszczenia i wszelkie żywe organizmy przyczepione do powierzchni.
    UWAGA: Aby przygotować ASW, wymieszaj 1/4 szklanki Instant Ocean Sea Salt z 1,9 L oczyszczonej wody bez chloru.
  10. Przygotuj akwaria w akwarium plastikowym, z osadami z oryginalnego miejsca i wypełnij sztucznym ASW dostosowanym do 23-25 ppt zasolenia (Rysunek 1). Utrzymuj temperaturę wody na stałym poziomie 28 °C przez cały okres habituacji.
    UWAGA: Objętość użytej ASW wynosiła 58 L, ustalana na podstawie wymiarów akwarium: 61,5 cm (L) x 32 cm (W) x 33,5 cm (V).
  11. Przenieś D. claparedii do cylindrycznych plastikowych pojemników (7 cm średnicy, 15 cm wysokości) wypełnionych do połowy osadem, z gęstością jednego polichaeta na pojemnik.
  12. Zanurz pojemniki całkowicie w akwarium z napowietrzanym ASW. Pozwól polichaetom zakopać się i na nowo się osiedlić.
  13. Karm polichaety pokarmem dla ryb tonących regularnie 2-3 razy w tygodniu, aby zapewnić ciągłe pożywienie przez cały okres habituacji. Regularnie usuwaj nadmiar jedzenia, aby zapobiec gromadzeniu się, rozwojowi grzybów i zanieczyszczeniu.
  14. Przyzwyczajenie oceniano poprzez obserwacje behawioralne, przy czym aktywna eksploracja (ruchy ciała) oraz zachowania związane z poszukiwaniem pożywienia (reakcja na bodźce) wskazywały na powrót do normalnego stanu fizjologicznego.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentalnych zabiegów należy wytrzymać dwutygodniowy okres habituacji, aby robaki mogły się zregenerować po ewentualnym stresie lub przypadkowej amputacji podczas pobierania.

2. Regeneracja

  1. Wybierz chaetiger 4 jako standardowe miejsce amputacji, aby zapewnić spójne i skuteczne wyniki regeneracji 7,9.
    UWAGA: Wybór miejsca amputacji w 4. ulicy opiera się na wstępnych ustaleniach. Używaj segmentu 10 tylko wtedy, gdy jest to konieczne, ponieważ regeneruje się wolniej.
  2. Przygotuj roztwór znieczulający zawierający 4% (masa/objętość) heksahydratu chlorku magnezu (MgCl₂·6H₂O) w ASW (4 g MgCl₂·6H₂O w 1 L ASW).
  3. Delikatnie wypchnij polichaetę z rurki, używając tępego patyczka włożonego w przednie otwór.
    UWAGA: Unikaj uszkodzenia ciała podczas usuwania.
  4. Następnie zanurz poliszczeta w roztworze znieczulającym aż do całkowitego rozluźnienia i unieruchomienia (około 15 minut).
  5. Amputuj w miejscu chaetigera 4 za pomocą sterylnego skalpela pod stereomikroskopem, zapewniając precyzyjność i minimalne uszkodzenia tkanek (Rysunek 1).
    UWAGA: Zawsze nosz odpowiedni sprzęt ochronny i uważaj, aby uniknąć skaleczenia podczas manipulacji skalpelem.
  6. Zwróć tylną część robaka do pierwotnej rurki za pomocą kleszczy, wkładając najpierw przedni koniec, aby ułatwić naturalne ponowne zakopanie.
  7. Po tym zabiegu codziennie monitoruj robaki pod kątem zmian zachowań i stanu fizycznego, w tym oznak infekcji, rozkładu tkanek lub śmiertelności.
    UWAGA: Osoby wykazujące nieprawidłowe zachowania, widoczną martwicę lub postępujące pogorszenie były uznawane za nieudane w wyzdrowieniu i wykluczone z dalszej analizy.
  8. Wstrzymaj jedzenie na tym etapie do czasu postępu regeneracji, ponieważ okolica jamy ustnej jest nieobecna z powodu amputacji przedniej. Wracaj do normalnego zachowania karmienia, gdy usta się rozwiną, około 60 dni po amputacji (p.a).
    UWAGA: Utrzymuj te same warunki środowiskowe (zakres zasolenia wody 23-25 ppt oraz stała temperatura wody 28 °C) przez cały proces regeneracji.
  9. Rejestruj obrazy skutecznie zregenerowanych poliszczętów za pomocą stereomikroskopu w określone dni (1, 6, 15, 30 i 60) rocznie.
  10. Pełne monitorowanie regeneracji po 60 p.a.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proces regeneracji u D. claparedii był monitorowany nieprzerwanie aż do całkowitej regeneracji głowy. Ogólny wzorzec regeneracji był porównywalny z tym zgłoszonym dla D. neapolitana (Rysunek 2). Zamknięcie rany w miejscu amputacji zakończono w ciągu 1 dnia po amputacji (p.a.). Do 6. dnia p.a. u osób ocalałych zaobserwowano wyraźnie zdefiniowaną blastemę, wskazującą na aktywną regenerację tkanek. Na tym etapie około 90% robaków wykazało skute...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierścieniowce, składające się z segmentowanych robaków zamieszkujących środowiska morskie, słodkowodne i lądowe, posiadają niezwykłe zdolności regeneracyjne na wielu poziomach organizacji biologicznej. Obejmują one regenerację komórek i odnawianie komórek rozrodczych, odbudowę strukturalną, a w niektórych przypadkach całkowitą regenerację ciała z małych fragmentów ciała 8,10. Obecny protokół koncentruje się na przedniej regeneracji D. claparedii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace badawcze zostały wsparte przez grant badawczy TAPE Talent and Publication Enhancement (55269), przyznany SZA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sztuczna woda morskaNatychmiastowy ocean
Cyfrowy ręczny hydrometr zasoleniaScionix
MgCl2· 6H2OSigmaM2670
Scapel
StereomikroskopLeica Microsystem
TeraBits Kompletna Karma dla rybTetra
Pęseta

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, D. T. Embryology and Phylogeny in Annelids and Arthropods. International Series of Monographs in Pure and Applied Biology Zoology. 50, Elsevier. (2013).
  2. Razmi Shah, R. S. B., Ibrahim, Y. S., Villalobos-Guerrero, T. F., Sato, M. Updated Checklist of Polychaete Species (Annelida) Recorded from Malaysia, with Remarks on the Research History. Biodivers. Data J. 11, e110021(2023).
  3. Idris, I., Arshad, A. Checklist of Polychaetous Annelids in Malaysia with Redescription of Two Commercially Exploited Species. Asian J. Anim. Vet. Adv. 8, 409-436 (2013).
  4. Rouse, G., Pleijel, F. Polychaetes. , Oxford University Press. (2001).
  5. Lindsay, S. M., Jackson, J. L., Forest, D. L. Morphology of Anterior Regeneration in Two Spionid Polychaete Species: Implications for Feeding Efficiency. Invertebr. Biol. 127, 65-79 (2008).
  6. Whitford, T. A., Williams, J. D. Anterior Regeneration in the Polychaete Marenzelleria viridis (Annelida: Spionidae). Invertebr. Biol. 135, 357-369 (2016).
  7. Pires, A. Studying Annelida Body Regeneration under Environmental Stress in Diopatra neapolitana. Methods Mol. Biol. 2450, 195-206 (2022).
  8. Kozin, V. V., Filippova, N. A., Kostyuchenko, R. P. Regeneration of the Nervous and Muscular System after Caudal Amputation in the Polychaete Alitta virens (Annelida: Nereididae). Russ. J. Dev. Biol. 48 (3), 198-210 (2017).
  9. Nazri, M. U. I. A., Mahmud, M. H., Saidi, B., Mat Isa, M. N., Ehsak, Z., Ross, O., Idris, I., Ismail, W. I. W. Cellular and Molecular Profiles of Anterior Nervous System Regeneration in Diopatra claparedii Grube, 1878 (Annelida, Polychaeta). Heliyon. 7 (2), e06307(2021).
  10. Bely, A. E. Early Events in Annelid Regeneration: A Cellular Perspective. Integr. Comp. Biol. 54 (4), 688-699 (2014).
  11. Górska, B., Gromisz, S., Włodarska-Kowalczuk, M. Size Assessment in Polychaete Worms-Application of Morphometric Correlations for Common North Atlantic Taxa. Limnol. Oceanogr. Methods. 17, 254-265 (2019).
  12. Qu, F., Nunnally, C., Rowe, G. T. Polychaete Annelid Biomass Size Spectra: The Effects of Hypoxia Stress. J. Mar. Sci. 983521, (2015).
  13. Galasso, H. L., Richard, M., Lefebvre, S., Aliaume, C., Callier, M. D. Body Size and Temperature Effects on Standard Metabolic Rate for Determining Metabolic Scope for Activity of the Polychaete Hediste (Nereis) diversicolor. PeerJ. 6, e5675(2018).
  14. Kostyuchenko, R. P., Kozin, V. V. Comparative Aspects of Annelid Regeneration: Towards Understanding the Mechanisms of Regeneration. Genes. 12 (8), 1148(2021).
  15. Pugliese, C., Mazza, R., Andrews, P. L., Cerra, M. C., Fiorito, G., Gattuso, A. Effect of Different Formulations of Magnesium Chloride used as Anesthetic Agents on the Performance of the Isolated Heart of Octopus vulgaris. Front. Physiol. 26 (7), 610(2016).
  16. Vervoort, M., Gazave, E. Studying Annelida Regeneration using Platynereis dumerilii. Methods Mol. Biol. 2450, 207-226 (2022).
  17. Wibowo, E. S., Atang, A., Setiyono, E., Hana, H., Simanjuntak, S. B. I., Susilo, U., Sucharitakul, P., Apriyanti, Y., Pamungkas, J. Biological Aspects of Diopatra claparedii Grube, 1878 (Onuphidae, Polychaeta) Maintained at Different Salinity Levels. Ilmu Kelaut.: Indones. J. Mar. Sci. 30 (1), 1-6 (2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Regeneracja wieloszczet wregeneracja pier cienicformowanie blastemyodtwarzanie segment wobserwacja pod stereomikroskopemzamkni cie ranyprotok amputacji

Powiązane artykuły