Zoptymalizowana sekwencyjna izolacja krypt i komórek mezenchymalnych stromalnych od tkanki jelitowej świń

Podsumowanie

Badanie to przedstawia stopniowy protokół sekwencyjnej izolacji krypt jelitowych oraz komórek mezenchymalnych (iMSC) jelitowych z tkanki jeczowej wieprzowinki. Metoda generuje dwuwymiarowe monowarstwy enteroidalne oraz iMSC odpowiednie do tworzenia powtarzalnych, fizjologicznie istotnych modeli kokultury nabłonkowej i stromalnej, aby badać przesłuchy komórkowe podczas homeostazy i regeneracji jelit.

Streszczenie

Nabłonek jelitowy ściśle współdziała z leżącymi u podstawą mezenchymalnymi komórkami stromalnymi jelita (iMSC), regulując rozwój, homeostazę i regenerację. Jednak standaryzowane metody sekwencyjnego izolowania frakcji nabłonkowej i stromalnej z tkanki wieprzowej są ograniczone. Protokół ten opisuje zoptymalizowany proces stopniowy izolowania krypt i iMSC z tego samego segmentu jejunalnego prosiaczk. Metoda wykorzystuje bufor dysociacyjny na bazie etylendiaminetetraoctowego kwasu octowego/ditiotreitolu (EDTA/DTT) do uwalniania krypt, a następnie trawienie matrycy zewnątrzkomórkowej kolagenazą/dyspazą w celu izolacji iMSC. Takie podejście minimalizuje zmienności przestrzenne w izolowanych komórkach. Izolowane krypty zostały pomyślnie hodowane i utworzyły typowe rozszerzające się, dwuwymiarowe (2D) monowarstwy enteroidalne na płytkach pokrytych kolagenem hydrożelem. Hodowane iMSC przylegały do kolb hodowlanych i wyrażały markery stromalne, takie jak receptor alfa (PDGFRα) pochodzący z płytek krwi (PDGFRα) oraz klaster różnicowania 81 (CD81), co zostało określone przez immunobarwienie. Ogólnie rzecz biorąc, ten zoptymalizowany protokół izolacji daje zarówno komórki nabłonkowe, jak i stromalne z tego samego segmentu czegowiny prosiatka, co stanowi powtarzalną podstawę dla przyszłych badań nad organoidami jelitowymi i systemami kokultury iMSC, aby wyjaśnić mechanizmy kontrolujące interakcje nabłonkowo-stromalne u świń, będąc translacyjnie istotnym modelem replikującym fizjologię człowieka i rozwijającym nauki o zwierzętach.

Wprowadzenie

Nabłonek jelit to dynamiczna tkanka, która przechodzi ciągłą samoodnowę i różnicowanie, aby utrzymać homeostazę jelita i ułatwić regenerację po uszkodzeniach błony śluzowej ^1,2. Komórki nabłonkowe jelita pochodzą z komórek macierzystych jelit (ISC) i oddziałują z różnymi czynnikami mikrośrodowiskowymi 3,4,5,6,7,8. Przedziały podnabłonkowe, głównie błonka propria i muscularis mucosa, składają się z różnorodnych popu....

Protokół

Segment o długości 5 cm został wycięty z wyciętego bliższego jej jej 21-dniowych prosięt przechowywanych w ośrodku hodowli świń na Uniwersytecie Maryland w College Park. Procedura (R-JUN-22-30) użyta do składania prosiaczka w ofierze była zgodna z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i politykami użytkowania zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użycia Zwierząt Instytucjonalnych uniwersytetu. Przed przejściem do kroków izolacji, zarys protokołu przedstawiono na Rysunku 1, a lista odczynników i urządzeń używanych do sekwencyjnej izolacji świńskich krypt jelitowych i iMSC znajduje się w Tabeli Materiałów.

<....

Wyniki

Podczas dysocjacji nabłonka kwas etylendiaminetetraoctowy (EDTA) cheluje jony wapnia, zakłócając zależne od wapnia zrosty komórki, podczas gdy ditiotreitol (DTT) rozszczepia wiązania dwusiarczkowe w glikoproteinach mucynu, ułatwiając mukolizę. W związku z tym połączenie związku chelatującego (EDTA) i środka redukującego (DTT) umożliwia skuteczne uwalnianie krypt z błony nabłonkowej bez zakłócania struktury macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) ^2,32 (

Dyskusja

Izolowanie krypt jelitowych i iMSC z tego samego segmentu jedźunalnego wieprzu oferuje nowatorskie podejście do zachowania specyficznych dla segmentu tkanki cech komórkowych i funkcjonalnych. Jest to kluczowe, ponieważ tkanki jelit wykazują tożsamości regionalne i przestrzenne, co wykazano w wcześniejszych badaniach świń 2,36,37,38. Wcześniejsze badania organoidów u świń lub innych gatunków, k.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,5 mln EDTA	Promega	PR-V4231
1 m bufor HEPES	ThermoFisher	15630080	Do przygotowania płytki hydrożelu kolagenowego
Końcówki pipetów o pojemności 1000 uL	Alkali Scientific FT1000	104027-530
10x PBS	Invitrogen	AM9624	Do przygotowania płytki hydrożelu kolagenowego
1N wodorotlenek sodu	Thermo	SS266-1	Do przygotowania płytki hydrożelu kolagenowego
1x HBSS	ThermoFisher	14025092
1X PBS	Hiklon	SH30256FS
4% paradehydu (PFA)	ThermoFisher	AAJ61899AK
Stożkowe lampy o pojemności 50 mL	ThermoFisher	12-565-271
6 płyt studni	Fisherbrand	FB012927
Roztwór wodorowęglanu sodu 7,5%	Corning	MT25035CI	Do przygotowania płytki hydrożelu kolagenowego
Zaawansowany DMEM/F12	Gibco	12634-010
Alexa Fluor plus 647	Invitrogen	A32728	Przeciwciało wtórne
Alexa plus 555 - A32732	Invitrogen	A32732	Przeciwciało wtórne
Folia aluminiowa	Reynolds	https://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
ANTY-ANTY	Gibco	15240096
B27	ThermoFisher	12587010
BSA	Fisherbrand	BP1600-100
CD81	Proteinintech	66866-1-ig	Przeciwciało pierwotne
Woda jakości do hodowli komórkowych	Hiklon	SH30529FS	Do przygotowania płytki hydrożelu kolagenowego
Kolagen, typ 1	Corning	356236	Do przygotowania płytki hydrożelu kolagenowego
Kolagenaza IV	Gibco	17104019
Szalka Petriego Corning 100 mm	Corning	07-202-011
Mediów kriokonserwacyjnych z komórek kriostorowych	Technologie komórek mamiennych	7930
kriovialny dla komórek	Fisherbrand	1050026
Rozcieńczalnik przeciwciał Dako	Dako/Agilent	Numer części: S302283-2	Rozcieńczalnik przeciwciał pierwotnych
Nośnik montażowy Dako fluorescencyjny	Dako/Agilent	Numer części: S302380-2
DAPI	Promocell/VWR	10180-470	Barwienie DNA
Dispase II	Roche	4942078001
DMEM, wysoki poziom glukozy	Corning	MT10013CV
DTT	Sigma	646563
EGF	Peprotech	315-09
FBS (HI)	Avantor	1300-500H
Gastryna	Anaspec	AS-64149
Gentamicin	MP Biomedicals	ICN1676045
GlutaMax	ThermoFisher	35050061
HEPES	ThermoFisher	15630-080
Odwrócona fluorescencja mikroscrrope	Nikon	ECLIPSE Ti2	Obrazowanie fluorescencyjne
Odwrócony mikroskop fazowo-kontrastowy	Nikon	Eclipse TS100	Do obrazowania komórek hodowlanych
Zaawansowany zestaw do syntezy cDNA iScript	Bio-Rad	1725038	Zestaw RT-PCR
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725122	Zestaw qPCR
Nośniki warunkowe LWRN	ATCC	CRL-3276	Media LWRN były przygotowywane wewnętrznie zgodnie z procedurą ATCC
N-acetylocysteina	Biografia posła	194603
Nanodrop 2000 spektrofotometr	ThermoFisher	ND 2000
Nikotynamid	Sigma	N0636-100G
Optyczne płytki 384-studniowe z kodem kreskowym	Biosystemy stosowane	4483285	Zestaw qPCR
PDGFRα	Abcam	ab230457	Przeciwciało pierwotne
Prostaglandyna E2 (PGE2)	chemikalia Kajmanów	14010
QuantStudio 5	Biosystem stosowany	A28570	Instrument qPCR
SB202190	LC Laboratories	S-1700
Mikroskop stereo	Nikon	SMZ745
Kolba T 75	Fisherbrand	FB012937
Triton X100	Fisherbrand	PI85111
Odczynnik Trizol	Invitrogen	15596026
Tween 20, 100% detergent niejonowy	Bio-rad	1706531
Y27632	ApexBio	A3008-200