Method Article

Zoptymalizowana sekwencyjna izolacja krypt i komórek mezenchymalnych stromalnych od tkanki jelitowej świń

DOI:

10.3791/69429

⸱

December 19th, 2025

 , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to przedstawia stopniowy protokół sekwencyjnej izolacji krypt jelitowych oraz komórek mezenchymalnych (iMSC) jelitowych z tkanki jeczowej wieprzowinki. Metoda generuje dwuwymiarowe monowarstwy enteroidalne oraz iMSC odpowiednie do tworzenia powtarzalnych, fizjologicznie istotnych modeli kokultury nabłonkowej i stromalnej, aby badać przesłuchy komórkowe podczas homeostazy i regeneracji jelit.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek jelitowy ściśle współdziała z leżącymi u podstawą mezenchymalnymi komórkami stromalnymi jelita (iMSC), regulując rozwój, homeostazę i regenerację. Jednak standaryzowane metody sekwencyjnego izolowania frakcji nabłonkowej i stromalnej z tkanki wieprzowej są ograniczone. Protokół ten opisuje zoptymalizowany proces stopniowy izolowania krypt i iMSC z tego samego segmentu jejunalnego prosiaczk. Metoda wykorzystuje bufor dysociacyjny na bazie etylendiaminetetraoctowego kwasu octowego/ditiotreitolu (EDTA/DTT) do uwalniania krypt, a następnie trawienie matrycy zewnątrzkomórkowej kolagenazą/dyspazą w celu izolacji iMSC. Takie podejście minimalizuje zmienności przestrzenne w izolowanych komórkach. Izolowane krypty zostały pomyślnie hodowane i utworzyły typowe rozszerzające się, dwuwymiarowe (2D) monowarstwy enteroidalne na płytkach pokrytych kolagenem hydrożelem. Hodowane iMSC przylegały do kolb hodowlanych i wyrażały markery stromalne, takie jak receptor alfa (PDGFRα) pochodzący z płytek krwi (PDGFRα) oraz klaster różnicowania 81 (CD81), co zostało określone przez immunobarwienie. Ogólnie rzecz biorąc, ten zoptymalizowany protokół izolacji daje zarówno komórki nabłonkowe, jak i stromalne z tego samego segmentu czegowiny prosiatka, co stanowi powtarzalną podstawę dla przyszłych badań nad organoidami jelitowymi i systemami kokultury iMSC, aby wyjaśnić mechanizmy kontrolujące interakcje nabłonkowo-stromalne u świń, będąc translacyjnie istotnym modelem replikującym fizjologię człowieka i rozwijającym nauki o zwierzętach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek jelit to dynamiczna tkanka, która przechodzi ciągłą samoodnowę i różnicowanie, aby utrzymać homeostazę jelita i ułatwić regenerację po uszkodzeniach błony śluzowej 1,2. Komórki nabłonkowe jelita pochodzą z komórek macierzystych jelit (ISC) i oddziałują z różnymi czynnikami mikrośrodowiskowymi 3,4,5,6,7,8. Przedziały podnabłonkowe, głównie błonka propria i muscularis mucosa, składają się z różnorodnych populacji komórek z różnych linii9. Wśród tych populacji komórek komórki mezenchymalne jelita (iMSC), w tym fibroblasty i miofibroblasty, produkują czynniki troficzne i wzrostowe, które modulują stem, proliferację i różnicowanie ISC, regulując homeostazę nabłonka i regenerację 6,7,10,11.

Aby zbadać te interakcje komórkowe, najnowsze badania opracowały nowe metody rozplątywania możliwych mechanizmów działania napędzających komórki nabłonkowe jelitowe i przesłuchy iMSC. Systemy współhodowli łączące organoidy z komórkami stromalnymi lub odpornościowymi pogłębiły naszą wiedzę o interakcjach komórkowych nabłonk-podnabłonek podczas rozwoju, regeneracji, badań lekowych oraz modelowania chorób 12,13,14,15,16,17. Jednak większość badań nad współkulturą organoidów wykorzystuje tkanki mysze, które często nie są w stanie skutecznie odwzorować fizjologii i fenotypów chorób człowieka, ograniczając ich znaczenie translacyjnekliniczne 18.

W większości protokołów izolacji jelit myszy komórki nabłonkowe i stromalne są pozyskiwane z oddzielnych segmentów tkanek, co może dawać próbki o nieco innych cechach, potencjalnie wpływając na powtarzalność w eksperymentach19,20. Obecnie nie istnieją ustandaryzowane, zoptymalizowane protokoły izolujące świńskie krypty jelitowe i iMSC z tej samej próbki tkanki. Ponadto praktyczne ograniczenia w pozyskiwaniu odpowiednich próbek jelitowych u ludzi skłoniły wielu badaczy do polegania na niedopasowanych typach komórek z różnych narządów (takich jak ludzkie jelita z fibroblastami skóry) do oceny przesłuchu komórkowego nabłonka i mezenchymalnego, co potencjalnie zakłóca interpretację danych 21,22,23.

Chociaż niedawno opublikowany protokół biopsji jelita u ludzi izolował krypty i uzyskał fibroblasty poprzez wyrost z pozostałej tkanki pozbawionej nabłonka, u świń brakuje porównywalnych standaryzowanych metod24. Świnie są wykorzystywane jako odpowiedni model zwierzęcy do badań translacyjnych ze względu na ich anatomiczne i fizjologiczne podobieństwo do ludzi 2,18,25,26,27,28,29. Dlatego ta metoda przedstawia sekwencyjny protokół izolacji, który odzyskuje krypty jelitowe i iMSC z tego samego segmentu jelenia na podstawie struktury fizjologicznej, anatomicznej i morfologicznej jelita 4,30. Procedura ta zapewnia powtarzalne ramy do izolowania zarówno krypt, jak i iMSC, odpowiednich do przyszłych badań kokultury jelitowej świń.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Segment o długości 5 cm został wycięty z wyciętego bliższego jej jej 21-dniowych prosięt przechowywanych w ośrodku hodowli świń na Uniwersytecie Maryland w College Park. Procedura (R-JUN-22-30) użyta do składania prosiaczka w ofierze była zgodna z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i politykami użytkowania zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użycia Zwierząt Instytucjonalnych uniwersytetu. Przed przejściem do kroków izolacji, zarys protokołu przedstawiono na Rysunku 1, a lista odczynników i urządzeń używanych do sekwencyjnej izolacji świńskich krypt jelitowych i iMSC znajduje się w Tabeli Materiałów.

1. Etap przygotowań przed izolacją

  1. Przygotuj 30 mL buforu do płukania na segment tkanki o powierzchni 5 cm w stożkowych probówkach o pojemności 50 mL.
  2. Dostosuj objętość na podstawie liczby pobranych próbek tkanek.
    UWAGA: Sprawdź Tabelę 1 pod kątem składu buforu płukania. Wszystkie etapy przygotowania tkanek i izolacji komórek odbywają się na stole.

2. Etap przygotowania tkanek jelit

  1. Wyciętą tkankę jelitową umieść w 30 mL bufora do płukania w stożkowych probówkach o pojemności 50 mL.
    UWAGA: Wycięte tkanki można umieścić w buforze do zimnego mycia na godzinę przed użyciem.
  2. Przepłucz tkankę 3× schłodzonym buforem do mycia za pomocą strzykawki 21 G, aby usunąć zawartość luminalną.
  3. Umieść tkankę na sterylnej powierzchni z pianki polistyrenowej i ostrożnie usuń tkankę krezkową i tłuszczową z serosy.
  4. Rozciąć tkankę podłużnie, używając ostrza chirurgicznego do otwarcia lumenu (Rysunek 2A).
  5. Przenieś częściowo oczyszczoną tkankę do świeżego bufora do mycia i myj dwa razy lub do momentu, aż bufor stanie się przezroczysty.
  6. Włóż tkankę do bufora do mycia w szalce Petriego o średnicy 100 mm i pokrój ją na kawałki o średnicy 10-15 mm za pomocą nowego ostrza chirurgicznego (rysunek 2B,C). Ten etap zwiększa powierzchnię ekspozycji na bufor trawienny.
  7. Przenieś posiekany tkańkę do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mL.
  8. Delikatnie umyj buforem do płukania i pozwól posiekaniu tkance osiąść grawitacją przez około 30 sekund (rysunek 2D).
  9. Delikatnie zasysaj supernatant, pozostawiając tylko tyle buforu, by pokryć fragmenty tkanki w stożkowej rurce.
  10. Etap dysocjacji nabłonka
    1. Dodaj 30 mL podgrzanego buforu dysocjacyjnego nabłonka (Tabela 2) i inkubuj przez 20-30 minut w temperaturze 37 °C w statycznej kąpieli kulkowej lub w wstrząsającej kąpieli wodnej o stężeniu około 9× g.
    2. Delikatnie potrząsaj rurką co 15 minut, aby zwiększyć uwalnianie krypt z błony nabłonkowej.
    3. Pozwól tkance się ułożyć i delikatnie zasysaj supernatant pipetą serologiczną, pozostawiając jedynie tyle buforu, by pokryć osadniętą tkankę w stożkowej rurce.
    4. Dodaj 30 ml świeżego buforu do osadu tkanek i energicznie potrząśnij, aby uwolnić kosmki, krypty i zanieczyszczenia (Rysunek 3A). Pozwól resztkom tkanek osadzić się, a następnie delikatnie przelej supernatant buforowy płukania, zawierający zawieszone segmenty krypt, przez sitko komórek o pojemności 100 μm do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mL.
      1. Powtórz proces dodawania świeżego buforu do resztek i przelewania trzy razy (3×). Pipeta 10 μL buforu z kryptami do szalki Petriego o średnicy 100 mm i obejrzyj gęstość krypt pod mikroskopem stereoskopowym.
        UWAGA: Po każdym płukaniu zachowaj każdy bufor z kryptami.
    5. Po trzecim płukaniu bufor z kryptami powinien być przezroczysty i z minimalnym zanieczyszczeniem (Rysunek 3B).
      UWAGA: Pozostałości tkanek z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) należy przechowywać w stożkowej rurce do dalszego przetwarzania izolacyjnego iMSC.
    6. Wirówkuj zawiesinę krypty w stężeniu 150 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, aby rozpylić fragmenty krypty.
    7. Aspiruj i ponownie zawiesij granulat kryptowy w podłożu nabłonkowym.
    8. Ponownie wiruj ponownie zawieszone krypty przy 150 × g przez 2 minuty, aby zebrać granulki fragmentów krypt.
    9. Dodaj podłoże nabłonkowe w celu ponownego zawieszenia krypt i pipetuj 5× używając końcówki pipety o pojemności 1 000 μL.
    10. Na przygotowanych płytkach z 6 dołkami pokrytych kolagenem typu 1 zawieszonych ponownie około 100 zawieszonych krypt w celu hodowli i rozszerzenia krypt na dwuwymiarowe (2D) monowarstwy enteroidalne.
      UWAGA: Sprawdź przygotowanie płytki pokrytej kolagenowym hydrożelem w Tabeli 3. Ostateczne stężenie kolagenu typu 1 powinno wynosić 1,0 mg/mL. Unikaj nakładania zbyt gęstych krypt lub fragmentów zanieczyszczeń, aby zapobiec zakażeniu drożdżami lub grzybami. Antybiotyk przeciwmykotyczny (anty-anti) w buforze płukania i pożywce hodowlowej powinien zapewniać ochronę.
    11. Przed inkubacją w nawilżonym inkubatorze 5%CO2 należy zbadać komórki pod mikroskopem z odwróconym kontrastem fazowym w temperaturze 37 °C.
    12. Wymień podłoże hodowlane w ciągu 12 godzin po wysiewie, aby usunąć unoszące się zanieczyszczenia i zmniejszyć zanieczyszczenie bakteryjne.
    13. Hodować enteroidy przy użyciu pożywki nabłonkowej (Tabela 4) i wymieniać podłoże co drugi dzień aż do około 8 dnia, kiedy rozszerzone monowarstwy 2D osiągają ≥85% zbiegu do subkultury.
  11. Etap dysocjacji macierzy zewnątrzkomórkowej
    UWAGA: Kontynuuj proces izolacji pozostałymi fragmentami tkanek zawierającymi matrycę zewnątrzkomórkową w stożkowej rurce (Rysunek 3C i Rysunek 4A).
    UWAGA: Chociaż EDTA w buforze dysocjacji nabłonka może hamować aktywność kolagenazy, poprzednie trzy etapy płukania usuwają całą EDTA i DTT. Dlatego aktywność kolagenazy nie powinna być zakłócona w kolejnym procesie.
    1. Ponownie posiekać pozostałe tkanki na małe kawałki, zanim przystąpi do izolacji iMSC w lamina propria.
    2. Dodaj 25 mL buforu trawienia zewnątrzkomórkowego (Tabela 5) do tkanki i inkubuj w statycznej kąpieli kulkowej przez 15-20 minut w 37 °C (Rysunek 4B).
    3. Po wysiadaniu mocno potrząśnij.
      UWAGA: Supernatant stanie się mętny i pojawi się mniej unoszących się fragmentów tkanek. Pipeta 10 μL supernatantu pod mikroskopem odwróconym, aby zbadać gęstość iMSC w supernatancie. Kontynuuj inkubację tkanki w koralikowej kąpieli przez dodatkowe 15 minut, jeśli zaobserwowana gęstość iMSC jest niska.
    4. Delikatnie przelej supernatant (bezpośrednio po intensywnym wstrząsaniu w kroku 2.2.3) przez sitko o pojemności 100 μm do nowej stożkowej rurki, aby zminimalizować zanieczyszczenia.
    5. Wiruj zawiesinę ogniwa w stężeniu 280 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby rozpylić iMSC.
    6. Aspiruj supernatant i ponownie zawiesij iMSC w mezenchymalnym medium hodowlanym (patrz iMSC culture media w Tabeli 6).
    7. Ponownie wiruj ponownie zawiesowane iMSC na 280 × g przez 5 minut, aby usunąć bufor dysocjacyjny.
    8. Aspiracja i ponowna zawiesja iMSC w pożywce mezenchymalnej.
    9. Nakładaj iMSC do kolby hodowli T75 w ilości około 5 × 105 komórek na kolbę.
      UWAGA: Upewnij się, że powłokowane komórki pokrywają około 60% powierzchni kolby, ponieważ komórki mezenchymowe wymagają umiarkowanej do wysokiej gęstości nasiew, aby rosnąć optymalnie.
    10. Należy wymienić podłoże hodowlane w ciągu 12 godzin po nakryciu, aby usunąć nadmiar zanieczyszczeń i zapobiec zakażeniu bakteryjnym.
    11. Zbadaj komórki podobne fibroblastom pod mikroskopem odwróconym fazowym drugiego dnia po zasiewaniu.
      UWAGA: Zmieniaj pośrednik mezenchymalny co drugi dzień. iMSC powinny osiągnąć około 85% zbiórki i być gotowe do subkulturowania do 4. dnia.

3. Badanie immunocytochemiczne

  1. Hodować około 5 000 iMSC na odwiert w 96-dołkowej płycie z pożywką mezenchymalną przez 2-3 dni, aż komórki osiągną około 80% zbiegu.
  2. Delikatnie zasysaj podłoże i dwukrotnie przepłucz hodowane iMSC 100 μL 1× PBS/dołek w temperaturze pokojowej31. Wszystkie odniesienia do zestawów immunodawizacji znajdują się w Tabeli Materiałów.
  3. Dodaj 100 μL 4% paradehydu (PFA) na odwiert, aby utrwalić hodowane iMSC i inkubuj na statycznym blacie stołowym w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  4. Ustalone hodowane iMSC przemyj dwukrotnie 100 μL 0,1% Tween-20/PBS (PBST) przez 5 minut każdy, a następnie przepuszczaj 100 μL 0,5% Triton X-100/PBS przez 30 minut.
  5. Dodaj 100 μL 5% surowicy bydłej (BSA)/PBST na dołek, aby zablokować niespecyficzne wiązanie na stałych komórkach.
    UWAGA: Zostawić w temperaturze pokojowej 1 godzinę przed dwukrotnym praniem 100 μL PBST przez 5 minut każdy.
  6. Do każdego dołka dodaj 100 μL rozcieńczonych przeciwciał pierwotnych (1:250; czyli 1 μL przeciwciała pierwotnego w 250 μL rozcieńczalnika przeciwciał) i inkubuj komórki przez noc w temperaturze 4 °C. Główne przeciwciała to PDGFRα i CD81.
    UWAGA: Uwzględnij dołki kontrolne ujemnie, dodając tylko rozcieńczalnik przeciwciał bez przeciwciał pierwotnych.
  7. Drugiego dnia dwa razy zmyj przeciwciała pierwotne 100 μL PBST przez 5 minut każdy.
  8. Rozcieńcz przeciwciała wtórne w 1× PBS przy użyciu następujących stosunków: Alexa Fluor Plus 555 (1 μL:100 μL), Alexa Fluor Plus 647 (1 μL:100 μL) oraz DAPI (1 μL:800 μL).
  9. Rozcieńczone przeciwciała wtórne w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę zabarwić komórki rozcieńczonymi przeciwciałami wtórnymi.
  10. Myj komórki dwa razy 1× PBS przez 5 minut każda.
  11. Dodaj 100 μL medium montażowego na odwiert, przykryj płytę, owiń folią aluminiową i przechowuj w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 6 miesięcy aż do wykonania obrazowania fluorescencyjnego.

4. Izolacja RNA i test qPCR

  1. Ekstrakt całkowitego mRNA z iMSC hodowanych w kolbach T75 przy użyciu techniki separacji kwasowego guanidyniu, tiocyjanianu i fenol-chloroformu.
    UWAGA: Określ stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru.
  2. Odwrotne przetranskrybowanie całkowitego mRNA do cDNA, aby użyć jako wzorca do ilościowego testu reakcji łańcuchowej z odwrotną transkrypcją polimerazą (qRT-PCR) w celu weryfikacji wykresów amplifikacyjnych dla wybranego primeru genu Sus scrofa, GAPDH (do przodu: ATCCTGGGCTACACTGAGGAC; odwrotnie: AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG), jak przedstawiono w poprzednich badaniach 2,28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas dysocjacji nabłonka kwas etylendiaminetetraoctowy (EDTA) cheluje jony wapnia, zakłócając zależne od wapnia zrosty komórki, podczas gdy ditiotreitol (DTT) rozszczepia wiązania dwusiarczkowe w glikoproteinach mucynu, ułatwiając mukolizę. W związku z tym połączenie związku chelatującego (EDTA) i środka redukującego (DTT) umożliwia skuteczne uwalnianie krypt z błony nabłonkowej bez zakłócania struktury macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) 2,32 (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolowanie krypt jelitowych i iMSC z tego samego segmentu jedźunalnego wieprzu oferuje nowatorskie podejście do zachowania specyficznych dla segmentu tkanki cech komórkowych i funkcjonalnych. Jest to kluczowe, ponieważ tkanki jelit wykazują tożsamości regionalne i przestrzenne, co wykazano w wcześniejszych badaniach świń 2,36,37,38. Wcześniejsze badania organoidów u świń lub innych gatunków, k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy doceniają wsparcie finansowe z programu MAES Competitive Grant Program na Uniwersytecie Maryland w College Park, USA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,5 mln EDTAPromegaPR-V4231
1 m bufor HEPESThermoFisher15630080Do przygotowania płytki hydrożelu kolagenowego
Końcówki pipetów o pojemności 1000 uLAlkali Scientific FT1000104027-530
10x PBSInvitrogenAM9624Do przygotowania płytki hydrożelu kolagenowego
1N wodorotlenek soduThermoSS266-1Do przygotowania płytki hydrożelu kolagenowego
1x HBSSThermoFisher14025092
1X PBSHiklonSH30256FS
4% paradehydu (PFA)ThermoFisherAAJ61899AK
Stożkowe lampy o pojemności 50 mLThermoFisher12-565-271
6 płyt studniFisherbrandFB012927
Roztwór wodorowęglanu sodu 7,5%CorningMT25035CIDo przygotowania płytki hydrożelu kolagenowego
Zaawansowany DMEM/F12 Gibco  12634-010
Alexa Fluor plus 647InvitrogenA32728Przeciwciało wtórne
Alexa plus 555 - A32732 InvitrogenA32732Przeciwciało wtórne
Folia aluminiowaReynoldshttps://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
ANTY-ANTYGibco15240096
B27ThermoFisher12587010
BSAFisherbrandBP1600-100
CD81 Proteinintech66866-1-igPrzeciwciało pierwotne
Woda jakości do hodowli komórkowychHiklonSH30529FSDo przygotowania płytki hydrożelu kolagenowego
Kolagen, typ 1Corning356236Do przygotowania płytki hydrożelu kolagenowego
Kolagenaza IVGibco17104019
Szalka Petriego Corning 100 mmCorning07-202-011
Mediów kriokonserwacyjnych z komórek kriostorowychTechnologie komórek mamiennych7930
kriovialny dla komórek  Fisherbrand1050026
Rozcieńczalnik przeciwciał DakoDako/AgilentNumer części: S302283-2Rozcieńczalnik przeciwciał pierwotnych
Nośnik montażowy Dako fluorescencyjnyDako/AgilentNumer części: S302380-2
DAPIPromocell/VWR10180-470Barwienie DNA
Dispase IIRoche4942078001
DMEM, wysoki poziom glukozyCorningMT10013CV
DTTSigma646563
EGFPeprotech315-09
FBS (HI)Avantor1300-500H
GastrynaAnaspecAS-64149
GentamicinMP BiomedicalsICN1676045
GlutaMaxThermoFisher35050061
HEPESThermoFisher15630-080
Odwrócona fluorescencja mikroscrropeNikonECLIPSE Ti2Obrazowanie fluorescencyjne
Odwrócony mikroskop fazowo-kontrastowyNikonEclipse TS100Do obrazowania komórek hodowlanych 
Zaawansowany zestaw do syntezy cDNA iScriptBio-Rad1725038Zestaw RT-PCR
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725122Zestaw qPCR
Nośniki warunkowe LWRNATCCCRL-3276Media LWRN były przygotowywane wewnętrznie zgodnie z procedurą ATCC
N-acetylocysteinaBiografia posła194603
Nanodrop 2000 spektrofotometrThermoFisherND 2000
NikotynamidSigmaN0636-100G
Optyczne płytki 384-studniowe z kodem kreskowymBiosystemy stosowane4483285Zestaw qPCR
PDGFRαAbcamab230457Przeciwciało pierwotne
Prostaglandyna E2 (PGE2)chemikalia Kajmanów  14010
QuantStudio 5Biosystem stosowanyA28570Instrument qPCR
SB202190LC LaboratoriesS-1700
Mikroskop stereoNikon  SMZ745
Kolba T 75FisherbrandFB012937
Triton X100FisherbrandPI85111
Odczynnik Trizol Invitrogen15596026
Tween 20, 100% detergent niejonowyBio-rad1706531
Y27632ApexBioA3008-200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: New insights into intestinal stem cells. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (1), 19-34 (2019).
  2. Yin, L., et al. Changes in progenitors and differentiated epithelial cells of neonatal piglets. Anim Nutr. 8 (1), 265-276 (2022).
  3. Pastula, A., Marcinkiewicz, J. Cellular interactions in the intestinal stem cell niche. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 67 (1), 19-26 (2019).
  4. Mccarthy, N., Kraiczy, J., Shivdasani, R. A. Cellular and molecular architecture of the intestinal stem cell niche. Nat Cell Biol. 22 (9), 1033-1041 (2020).
  5. Beumer, J., Clevers, H. Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (1), 39-53 (2021).
  6. Pasztoi, M., Ohnmacht, C. Tissue niches formed by intestinal mesenchymal stromal cells in mucosal homeostasis and immunity. Int J Mol Sci. 23 (9), 5181(2022).
  7. Kraiczy, J., et al. Graded BMP signaling within intestinal crypt architecture directs self-organization of the Wnt-secreting stem cell niche. Cell Stem Cell. 30 (4), 433-449 (2023).
  8. Niec, R. E., et al. Lymphatics act as a signaling hub to regulate intestinal stem cell activity. Cell Stem Cell. 29 (7), 1067-1082 (2022).
  9. Paerregaard, S. I., et al. The small and large intestine contain related mesenchymal subsets that derive from embryonic gli1(+) precursors. Nat Commun. 14 (1), 2307(2023).
  10. Maimets, M., et al. Mesenchymal-epithelial crosstalk shapes intestinal regionalisation via Wnt and Shh signalling. Nat Commun. 13 (1), 715(2022).
  11. Ayansola, H., Mayorga, E. J., Jin, Y. Subepithelial stromal cells: Their roles and interactions with intestinal epithelial cells during gut mucosal homeostasis and regeneration. Biomedicines. 12 (3), 668(2024).
  12. Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
  13. Xia, X., et al. Mesenchymal stem cells promote healing of nonsteroidal anti-inflammatory drug-related peptic ulcer through paracrine actions in pigs. Sci Transl Med. 11 (516), eaat7455(2019).
  14. Zhang, W., et al. Dietary calcium and phosphorus amounts affect development and tissue-specific stem cell characteristics in neonatal pigs. J Nutr. 150 (5), 1086-1092 (2020).
  15. Zhou, J. Y., et al. Zinc l-aspartate enhances intestinal stem cell activity to protect the integrity of the intestinal mucosa against deoxynivalenol through activation of the Wnt/beta-catenin signaling pathway. Environ Pollut. 262, 114290(2020).
  16. Yang, S., et al. Organoids: The current status and biomedical applications. MedComm (2020). 4 (3), e274(2023).
  17. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  18. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Porcine models of digestive disease: The future of large animal translational research. Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).
  19. Nieuwenhuis, T. O., et al. Patterns of unwanted biological and technical expression variation among 49 human tissues. Lab Invest. 104 (6), 102069(2024).
  20. Pastula, A., et al. Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: A method to characterize the gastrointestinal stem cell niche. Stem Cells Int. 2016, 3710836(2016).
  21. Kraski, A., et al. Structured multicellular intestinal spheroids (SMIS) as a standardized model for infection biology. Gut Pathog. 16 (1), 47(2024).
  22. Darling, N. J., Mobbs, C. L., Gonzalez-Hau, A. L., Freer, M., Przyborski, S. Bioengineering novel in vitro co-culture models that represent the human intestinal mucosa with improved Caco-2 structure and barrier function. Front Bioeng Biotechnol. 8, 992(2020).
  23. Freer, M., Cooper, J., Goncalves, K., Przyborski, S. Bioengineering the human intestinal mucosa and the importance of stromal support for pharmacological evaluation in vitro. Cells. 13 (22), 1859(2024).
  24. Meran, L., Tullie, L., Eaton, S., De Coppi, P., Li, V. S. W. Bioengineering human intestinal mucosal grafts using patient-derived organoids, fibroblasts and scaffolds. Nat Protoc. 18 (1), 108-135 (2023).
  25. Burrin, D., et al. Translational advances in pediatric nutrition and gastroenterology: New insights from pig models. Annu Rev Anim Biosci. 8, 321-354 (2020).
  26. Lunney, J. K., et al. Importance of the pig as a human biomedical model. Sci Transl Med. 13 (621), eabd5758(2021).
  27. Barnett, A. M., et al. Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration. Am J Physiol Cell Physiol. 320 (5), C794-C805 (2021).
  28. Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), e66465(2013).
  29. Stieler Stewart, A., Freund, J. M., Blikslager, A. T., Gonzalez, L. M. Intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia. J Vis Exp. (135), e57647(2018).
  30. Meran, L., Baulies, A., Li, V. S. W. Intestinal stem cell niche: The extracellular matrix and cellular components. Stem Cells Int. 2017, 7970385(2017).
  31. Mahe, M. M., et al. Establishment of gastrointestinal epithelial organoids. Curr Protoc Mouse Biol. 3 (4), 217-240 (2013).
  32. Koliaraki, V., Kollias, G. Isolation of intestinal mesenchymal cells from adult mice. Bio-Protocol. 6 (18), 1940(2016).
  33. Chang, C. W., et al. Mesenchymal stem cell seeding of porcine small intestinal submucosal extracellular matrix for cardiovascular applications. PLoS One. 11 (4), e0153412(2016).
  34. Chen, J., et al. Human intestinal organoid-derived PDGFRα+ mesenchymal stroma enables the proliferation and maintenance of Lgr4+ epithelial stem cells. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 16(2024).
  35. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Vet Res. 52 (1), 33(2021).
  36. Wiarda, J. E., Becker, S. R., Sivasankaran, S. K., Loving, C. L. Regional epithelial cell diversity in the small intestine of pigs. J Anim Sci. 101, skac318(2023).
  37. Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. Porcine small intestinal organoids as a model to explore etec-host interactions in the gut. Vet Res. 52 (1), 94(2021).
  38. Wiarda, J. E., Trachsel, J. M., Sivasankaran, S. K., Tuggle, C. K., Loving, C. L. Intestinal single-cell atlas reveals novel lymphocytes in pigs with similarities to human cells. Life Sci Alliance. 5 (10), e202201442(2022).
  39. Uniken Venema, W. T. C., et al. Gut mucosa dissociation protocols influence cell type proportions and single-cell gene expression levels. Sci Rep. 12 (1), 9897(2022).
  40. Schaaf, C. R., et al. A lgr5 reporter pig model closely resembles human intestine for improved study of stem cells in disease. FASEB J. 37 (6), e22975(2023).
  41. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals (Basel). 12 (3), 372(2022).
  42. Gomez-Martinez, I., et al. A planar culture model of human absorptive enterocytes reveals metformin increases fatty acid oxidation and export. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 409-434 (2022).
  43. Jacob, J. M., et al. Pdgfralpha-induced stromal maturation is required to restrain postnatal intestinal epithelial stemness and promote defense mechanisms. Cell Stem Cell. 29 (5), 856-868 (2022).
  44. Modina, S. C., et al. Stages of gut development as a useful tool to prevent gut alterations in piglets. Animals (Basel). 11 (5), 1412(2021).
  45. Tang, W., et al. Ileum tissue single-cell mRNA sequencing elucidates the cellular architecture of pathophysiological changes associated with weaning in piglets. BMC Biol. 20 (1), 123(2022).
  46. Dong, X., et al. Identification of optimal reference genes for gene expression normalization in human osteosarcoma cell lines under proliferative conditions. Front Genet. 13, 989990(2022).
  47. Mccarthy, N., et al. Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient. Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).
  48. Mussard, E., et al. Culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers. J Vis Exp. (192), e64917(2023).
  49. Zhang, M., et al. Long-term expansion of porcine intestinal organoids serves as an in vitro model for swine enteric coronavirus infection. Front Microbiol. 13, 865336(2022).
  50. Benz, P., Plenge, M., Wagner, S., Mazzuoli-Weber, G. Two-dimensional porcine intestinal organoids reflecting the physiological properties of native gut. J Vis Exp. (215), e67666(2025).
  51. Lee, B. R., Ock, S. A., Park, M. R., Lee, M. G., Byun, S. J. Establishing porcine jejunum-derived intestinal organoids to study the function of intestinal epithelium as an alternative for animal testing. J Anim Reproduction Biotechnol. 39 (1), 2-11 (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Crypt IsolationMesenchymal Stromal CellsPorcine Intestinal TissueSequential IsolationEDTA DTT DissociationCollagenase DigestionEnteroid MonolayersCollagen HydrogelStromal MarkersEpithelial Stromal Interactions
Video Coming Soon

Related Articles