EasyFiji: Graficzny interfejs do przyjaznego dla użytkownika przetwarzania obrazu fluorescencyjnego na Fidżi

Chen Li; Aaron Taylor

doi:10.3791/69441

Method Article

EasyFiji: Graficzny interfejs do przyjaznego dla użytkownika przetwarzania obrazu fluorescencyjnego na Fidżi

DOI:

10.3791/69441

⸱

February 20th, 2026

Chen Li¹ , Aaron Taylor²

¹Center for Bioimage Informatics, St. Jude Children's Research Hospital, ²Cell and Tissue Imaging Center, St. Jude Children's Research Hospital

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EasyFiji to wtyczka graficznego interfejsu użytkownika dla Fiji (ImageJ), która oferuje starannie opracowany zestaw narzędzi do wizualizacji i przetwarzania obrazów fluorescencyjnych, często wykorzystywanych przez naukowców zajmujących się przyrodą.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fiji (Fiji Is Just ImageJ) to rozbudowany i rozszerzalny pakiet do przetwarzania obrazów otwartego, szeroko stosowany przez społeczność zajmującą się analizą bioobrazów. Jednak dla osób nieznających się z zakresu obliczeniowych nauk o życiu ręczna interakcja z licznymi możliwościami Fidżi wymaga nauki i poruszania się po głęboko złożonym systemie menu. Co więcej, domyślne zachowania niektórych poleceń nie są idealne do wyświetlania i przetwarzania obrazu fluorescencyjnego. Aby zwiększyć efektywność pracy naukowców przyrodniczych z obrazami mikroskopii fluorescencyjnej, opracowaliśmy EasyFiji, starannie zaprojektowaną wtyczkę graficznego interfejsu użytkownika (GUI) dla Fidżi. Każde polecenie EasyFiji jest wykonywane za pomocą przycisków i suwaków z dodatkami i zawsze wyświetla wykonanie specyficzne dla kanału, zgodnie z wymaganiami dla obrazów fluorescencyjnych. Polecenia zmieniające intensywność pikseli są również niewykonalne jednym kliknięciem, umożliwiając bardziej interaktywne przetwarzanie, a także mogą być automatycznie nagrywane i zapisywane jako tekst do prowadzenia dokumentacji. Panel informacji o obrazie pokazuje ustawienia kluczowe dla interpretacji obrazu. Wprowadzono także nowe funkcje renderowania obrazu i korekcji wybielania. Wtyczka jest dostępna bezpłatnie na GitHub oraz jako strona z aktualizacjami Fiji. Protokół ten określa kroki korzystania z interfejsu EasyFiji do wizualizacji i przetwarzania obrazów mikroskopii fluorescencyjnej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fiji (Fiji Is Just ImageJ) to rozbudowany i rozszerzalny pakiet do przetwarzania obrazów otwartego, szeroko stosowany przez społeczność analiz bioobrazów ^1,2. Duża baza kodu Fidżi oparta na algorytmach ogólnego przeznaczenia, wraz z językiem makro i interfejsem wtyczek, może być wygodnie wykorzystywana przez analityków obliczeniowych do dostarczania rozwiązania niemal każdego problemu przetwarzania lub analizy obrazów. Jednak dla użytkowników nauk przyrodniczych z niewielkim doświadczeniem obliczeniowym, >1 100 poleceń FIJI rozłożonych w głęboko warstwowym systemie menu rozwijanego może być niezwykle skomplikowane w nawigacji i efektywnym wykorzystaniu. Podjęto kilka podejść do uproszczenia ręcznego korzystania z Fidżi. Pasek wyszukiwania Fidżi jest alternatywą dla nawigacji po menu, zapewniając dostęp do doskonałej dokumentacji pomocy, ale tylko wtedy, gdy użytkownik zna nazwę potrzebnego algorytmu. Przyciski na paskach Fiji można dostosować, aby zapewnić szybki dostęp do poleceń definiowanych przez użytkownika, ale ta procedura wymaga napisania kodu makro i przewidywania, które polecenia będą najbardziej przydatne. Wtyczka ActionBar zapewnia samodzielne okno graficznego interfejsu użytkownika (GUI) z konfigurowalnymi i organizowalnymi tablicami przycisków, ale ponownie, do skutecznego wypełniania przycisków potrzebne jest kodowanie i doświadczenie.³. Żadne z tych rozwiązań nie spełnia potrzeb naukowców przyrodniczych z niewielkim doświadczeniem w przetwarzaniu obrazów.

Poza problemami z interfejsem użytkownika, wielu naukowców pracujących z obrazami mikroskopii fluorescencyjnej wymaga specyficznych procedur wyświetlania i przetwarzania kanału. Jednak niektóre powszechnie używane polecenia Fiji domyślnie nie są świadome kanałów. Na przykład użytkownicy mogą chcieć renderować kanały pseudokolorowe razem w równie wyraźny sposób, albo specjalnie podkreślić obszary o podobnej intensywności między kanałami, albo zachować kontrast szarości sygnału morfologicznego, jednocześnie pokazując fluorescencję. W każdym z tych przypadków technika renderowania kompozytowego RGB Fidżi zaciera pożądane informacje na poziomie percepcji. Podczas przetwarzania obrazów wielokanałowych, natywne filtry obrazów Fiji (tj. Proces | Filtry), przetwarzają albo tylko aktywną 2D płaszczyznę bitową, albo wszystkie bitowe płaszczyzny w oknie obrazu (czyli "stos" zdefiniowany przez klasę ImageStack). Pierwsze zachowanie nie przetwarza się w całym wymiarze z- lub t- dla danego kanału, podczas gdy drugie jest niemal zawsze niewłaściwe, ponieważ każdy kanał zawiera unikalny wzór barwienia i stosunek sygnału do szumu, co wymaga zastosowania specyficznych dla kanału parametrów przetwarzania. Polecenia korekty wybielacza w Native Fiji (Obraz | Dostosuj | Korekta wybielacza) działają nieprawidłowo przy stosowaniu do wielokanałowych obrazów fluorescencyjnych, ponieważ ponownie korygują one na całym ImageStacku, gdzie dane kanałowe są przeplatane, zamiast korygować w wymiarze z lub t w każdym kanale osobno.

Aby rozwiązać te problemy dla naukowców pracujących z obrazami mikroskopii fluorescencyjnej, opracowaliśmy EasyFiji, starannie opracowaną i prowadzoną wtyczkę graficznego interfejsu użytkownika dla Fidżi. EasyFiji to starannie zorganizowany zestaw tematycznie zorganizowanych poleceń, które umożliwiają renderowanie i przetwarzanie świadome kanałów. Cztery panele tabelowane: Display, Process, Save i Image Info, zawierają tematycznie powiązane kolekcje przycisków i suwaków do wykonywania poleceń. Inne udogodnienia to funkcja cofania dla interaktywnego przetwarzania, prosty, zwykły rejestrator akcji, który automatycznie zapisuje akcje modyfikujące piksele wraz z obrazem, oraz sformatowany wyświetlacz ustawień akwizycji ważnych dla interpretacji obrazu. EasyFiji oferuje także nowe narzędzia do renderowania obrazów i korekcji wybielania. EasyFiji nie obsługuje funkcji analizy obrazów ilościowej ani przetwarzania wsadowego, ponieważ procedury te powinny być wykonywane wyłącznie z pomocą eksperta analityka bioobrazowego. Chociaż EasyFiji jest zwięzłe z założenia, wszystkie natywne polecenia Fiji są zawsze dostępne w natywnym systemie menu Fiji. Wierzymy, że projekt EasyFiji skierowany do odbiorców⁴ zwiększy wykorzystanie Fidżi wśród naukowców zajmujących się przyrodą. Przedstawiamy tutaj projekt, wdrożenie i zastosowanie EasyFiji w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. Wtyczka jest łatwa do zainstalowania przez serwis z aktualizacjami Fiji (https://imagej.github.io/list-of-update-sites/ i https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin), natomiast kod open source można pobrać przez GitHub; Wtyczka i kod źródłowy są dostępne bezpłatnie (https://github.com/stjude/EasyFiji).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak zainstalować i korzystać z EasyFiji.

1. Aby zainstalować EasyFiji...

Pobierz najnowszą wersję Fiji (>1.54g) odpowiednią dla systemu operacyjnego i zainstaluj ją w folderze, do którego użytkownik ma dostęp do odczytu i zapisu (zobacz Tabelę Materiałów , gdzie znajdziesz link do strony pobierania Fiji).
Uruchom Fiji i przejdź do Pomocy | Aktualizacja... w pasku menu.
W oknie Aktualizator kliknij Zarządzaj Aktualizacjami stron. Wybierz EasyFiji z listy i kliknij Apply oraz Zamknij. EasyFiji zostanie automatycznie zainstalowane, a Fiji będzie automatycznie aktualizowane o przyszłe wersje EasyFiji.
Restartuj Fidżi. Wybierz EasyFiji z menu Fiji Plugins.
UWAGA: EasyFiji jest w pełni kompatybilny z wieloma starszymi wersjami Fiji i głównie z ImageJ. Szczegółowe informacje o kompatybilności i zależności można znaleźć na stronie wiki EasyFiji na GitHubie (https://github.com/stjude/EasyFiji) oraz na stronie wiki EasyFiji ImageJ.net (https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start). Opinie można przekazywać na stronie GitHub lub wątku EasyFiji na forum Image.sc (https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617) (zobacz Tabelę materiałów , gdzie znajdziesz linki do tych zasobów).

2. Korzystanie z panelu wyświetlacza EasyFiji

UWAGA: Jak pokazano na rysunku 1A, panel wyświetlacza obsługuje pseudokolorowanie kanałów fluorescencyjnych za pomocą przycisków próbek kolorów, intuicyjne regulacje kontrastu oraz nowe opcje percepcyjne wielokanałowego renderowania obrazów. Dostępne są także natywne polecenia Fiji do projekcji i ponownego cięcia obrazów 3D/4D. Tabela 1 dokumentuje korespondencję między dowództwami EasyFiji a rodzimymi dowódcami Fidżi.

Ustaw kolor lub widoczność kanału (Panel wyświetlany , sekcja kolorów kanału ).
1. Wybierz pożądany kanał za pomocą suwaka kanału w oknie obrazu.
2. Naciśnij przycisk próbki kolorów , aby przypisać nową tabelę wyszukiwania kolorów (LUT).
3. Naciśnij przycisk próbki , aby wyłączyć wyświetlanie kanału.
4. Naciśnij przycisk AllChs , aby wyświetlić wszystkie kanały razem.
5. Naciśnij przycisk EachCh , aby wyświetlić każdy kanał kolejno, przewijając suwak kanału w oknie obrazu.
Ustaw kontrast kanałów w obrębie lub pomiędzy obrazami (Panel wyświetlania , sekcja Kontrast kanału ).
1. Aby zmienić zakres wyświetlania kanału (kontrast), wybierz kanał za pomocą suwaka kanału na dole okna obrazu.
2. Przesuń suwak wzmocnienia wyświetlania, aby określić intensywność pikseli obrazu (wartość pokazaną po prawej), która ma być wyświetlana jako najjaśniejszy na ekranie.
  UWAGA: Używamy terminu wzmocnienie wyświetlania, aby opisać tę akcję, ponieważ powoduje ona liniowo jaśniejszy kanał, podobnie jak zmiana wzmocnienia na detektorze podczas akwizycji obrazu.
3. Naciśnij przycisk resetu wzmocnienia wyświetlania, aby wyświetlić maksymalną możliwą intensywność pikseli kanału (określaną przez jego głębię bitową) jako najjaśniejszą wartość na ekranie.
4. Przesuń suwak przesunięcia wyświetlacza, aby określić intensywność pikseli obrazu (wartość pokazaną po prawej), która ma być wyświetlana jako najciemniejsza wartość na ekranie.
  UWAGA: Użyliśmy terminu display offset, aby opisać tę akcję, ponieważ ustawia ona poziom czerni obrazu, analogicznie do efektu ustawiania offsetu na detektorze podczas akwizycji obrazu.
5. Naciśnij przycisk resetu przesunięcia wyświetlacza, aby ustawić intensywność pikseli obrazu od zera na najciemniejszy poziom na ekranie.
6. Naciśnij przycisk AutoCh , aby automatycznie dostosować wzmocnienie i przesunięcie wyświetlania.
7. Naciśnij przycisk AutoAll, aby automatycznie dostosować wzmocnienie i przesunięcie wyświetlacza dla wszystkich kanałów.
8. Naciśnij przycisk Propagate , aby przenieść ustawienia wzmocnienia i przesunięcia obrazu z aktywnego obrazu na wszystkie pozostałe otwarte obrazy zawierające tę samą liczbę kanałów.
Stwórz wielokanałowy wyświetlacz (Panel wyświetlania , sekcja Widoki kanałów ).
1. Aby wyrenderować dwa kanały fluorescencji razem w obraz kolorowy, użyj przycisków z prefiksami FF (fluorescencja z fluorescencją). Aby odwzorować kanał(y) fluorescencji i morfologiczny kanał szarości razem jako obraz kolorowy, użyj przycisku z prefiksem FG (fluorescencja z skalą szarości). Renderowania są tworzone w nowym oknie obrazu.
  UWAGA: Przed utworzeniem dowolnego widoku kanału, najpierw dostosuj wzmocnienie i przesunięcie wyświetlacza dla każdego kanału tak, aby interesujący sygnał obejmował zakres dynamiczny wyświetlacza (sekcja 2.2), a następnie zastosuj te wzmocnienia i przesunięcia za pomocą przycisków Zastosuj wzmocnienie i przesunięcie w zakładce Przetwarzanie (sekcja 3.2.3). Renderowania będą nieoptymalne, jeśli wzmocnienia i przesunięcia nie zostaną dostosowane i zastosowane.
2. Naciśnij przycisk FFColoc , aby uzyskać odwzorowanie kolorów z dwóch kanałów fluorescencji, które podświetla się jako żółte piksele, gdzie intensywność jest podobna w obu kanałach (w granicach 25%).
  UWAGA: Piksele o różnej intensywności między kanałami są renderowane w skali szarości. Żółte piksele sugerują kolokalizację opartą na korelacji⁵ , gdy sygnał zainteresowania na każdym kanale obejmuje zakres dynamiczny wyświetlacza.
  UWAGA: Renderowanie FFColoc jest przeznaczone wyłącznie do eksploracji danych lub ilustracji. Nie zastępuje rygorystycznej ilościowej kolokalizacji z pomocą eksperta.
3. Naciśnij przycisk FFMerge , aby uzyskać odwzorowanie kolorów z dwóch kanałów fluorescencyjnych, gdzie sygnał w każdym kanale jest równie wyczuwalny.
  UWAGA: Na każdym pikselu luminancja jest ustalana zgodnie z sygnałem o wyższej intensywności, natomiast odcień jest funkcją stosunku intensywności między kanałami (zgodnie z koncepcjami opisanymi przez Taylora i ^in.6). Zobacz także sekcję Dyskusja.
4. Naciśnij przycisk FGMerge , aby uzyskać odwzorowanie kolorów z kanałów fluorescencyjnych i kanału w skali szarości, gdzie zachowuje się kolor kanałów fluorescencyjnych, a kontrast kanału szarości.
  UWAGA: Kanał w skali szarości to zazwyczaj niefluorescencyjna metoda zawierająca informacje morfologiczne, takie jak DIC, kontrast fazowy czy mikroskopia elektronowa.
5. Naciśnij przycisk montażu , aby podzielić kanały na pojedyncze obrazy, automatycznie je wykalewać na ekranie i zsynchronizować ich wizualizację.
6. Naciśnij przycisk SyncWins , aby zsynchronizować wizualizację wielu obrazów tego samego typu.
Stwórz widoki 2D 3D z- lub t-stack (Panel Display , sekcja Widoki stosu ).
UWAGA: Każde renderowanie jest wyświetlane w nowym oknie obrazu.
1. Naciśnij przycisk MIP, aby uzyskać maksymalną projekcję intensywności.
  UWAGA: Intensywność w każdym miejscu w powstałym obrazie 2D odpowiada intensywności najintensywniejszego piksela wzdłuż 3^. wymiaru obrazu 3D. Ta procedura może wzmocnić szumy, dlatego warto wygładzić stos (patrz zakładka Przetwarzanie ) przed utworzeniem MIP.
2. Naciśnij przycisk SIP, aby uzyskać projekcję intensywności sumy.
  UWAGA: Intensywność w każdym miejscu na powstałym obrazie 2D odpowiada sumie intensywności wzdłuż 3^. wymiaru na obrazie 3D. Procedura ta zachowuje całkowitą intensywność, co skutkuje mniej hałaśliwym obrazem niż pojedynczy fragment.
3. Naciśnij przycisk Ortho , aby utworzyć przegląd ortogonalnych wycinków, który interaktywnie renderuje trzy ortogonalne płaszczyzny stosu 3D (np. xy, xz, yz), które przecinają się w aktualnym miejscu kursora.
4. Naciśnij przycisk Kymo , aby stworzyć kymograph.
  UWAGA: Kymograf to obraz 2D, gdzie pionowa (y-) oś odpowiada trzeciemu wymiarowi stosu (zwykle t-), a oś pozioma (x-) pozycji na linii narysowanej przez użytkownika na stosie wejściowym. Gdy^trzecim wymiarem jest czas, do ilustrowania lub ilościowania ruchu używa się kymographu.
  Ten przycisk opiera się na wtyczce KymographBuilder⁷ , która jest dołączona do Fiji, ale trzeba ją pobrać osobno, jeśli korzystasz z ImageJ.
Ustaw różne opcje (Panel wyświetlania ).
1. Naciśnij przycisk DUP , aby zduplikować aktywne okno obrazu na Fidżi. Pojawi się nowe okno obrazu.
  UWAGA: Narysuj prostokątny obszar zainteresowania (ROI) na obrazie za pomocą narzędzia Fiji Rectangle ROI , a przycisk Dup przycina do granicy ROI. Określ zakresy kanałów, z i/lub t-, aby ukształtować wymiarowość zduplikowanego obrazu.
2. Naciśnij przycisk ToClip , aby skopiować aktywny obraz aktualnie wyświetlany na ekranie do systemowej schowki. Aby wkleić obraz do innej aplikacji (przygotowując slajdy lub edytować zdjęcia), aktywuj tę aplikację i wybierz wklej (Ctrl+V na Windows lub Cmd+V na Macu).
3. Naciśnij przycisk |--um--| , aby wyświetlić pasek skali na obrazie jako nakładkę. Przełącz przycisk |--um--| , aby usunąć pasek skali.

3. Korzystanie z panelu EasyFiji Process

UWAGA: Jak pokazano na Rysunku 1B, sekcja Funkcje kanału w panelu Process zawiera polecenia przetwarzania obrazu oparte na suwakach wraz z podpojkami, które mogą być używane do ulepszania wyświetlania obrazów. Przycisk Cofnij Ostatni umożliwia interaktywne przetwarzanie. Wymiary obrazu można zmieniać za pomocą przycisków Modify Dimensions. Tabela akcji służy do logowania jako poleceń przetwarzania tekstu zwykłego, które zmieniają wartości intensywności pikseli obrazu. Log można następnie automatycznie zapisać z obrazem o tym samym tytule (patrz panel Zapisz).

Zmodyfikuj cechy przestrzenne obrazu (Panel Proces, sekcja Modify Channel Features ).
UWAGA: Wszystkie polecenia dotyczą tylko aktywnego kanału, a wyniki są automatycznie wyświetlane w oryginalnym oknie obrazu. Nie tworzy się nowego okna obrazu.
1. Przesuń suwak Gładki, aby zastosować rozmycie Gaussa, zmniejszając tym samym normalnie rozkładaną zmienność piksel do piksela (~szum zdjęcia i szum odczytu).
  1. Dla ~obrazów próbkowanych przez Nyquista (70-150 nm xy pikseli), zacznij od suwaków między 1.0 a 2.0.
  2. Dla danego rozmiaru piksela należy zwiększać wartość suwaka wraz ze spadkiem stosunku sygnału do szumu (SNR) obrazu.
  3. Dla danych SNR zwiększ wartość suwaka wraz ze zmniejszającym się rozmiarem piksela.
  4. Dla stosów obrazów stosuje się wygładzanie 3D, gdzie promień z jest automatycznie ustawiony na jedną trzecią promienia xy, zgodnie z danymi próbkowanymi przez Nyquista.
    UWAGA: Wartość suwaka odpowiada odchyleniu standardowemu jądra Gaussa mierzonym w pikselach.
2. Przesuń suwak Denoise , aby zastosować filtr mediany, usuwając tym samym ekstremalne wartości odstające (gorące piksele kamery lub emisje termojonowe PMT).
  UWAGA: Wartość suwaka odpowiada promieniowi jądra pudełka w pikselach. Wartości między 0,5 a 1,0 to dobry punkt wyjścia.
3. Przesuń suwak Sharpen , aby nałożyć maskę 2D nieostrą, zmniejszając tym samym rozmycie lub mgiełkę, jaką może powodować nieostre światło. Ostrzenie również podkreśla szum.
  UWAGA: Wartość suwaka odpowiada odchyleniu standardowemu jądra Gaussa (w jednostkach pikseli) używanemu do definiowania skali rozmycia. Dla ~obrazów próbkowanych przez Nyquista (rozmiar piksela xy 70-150 nm) wartości suwaków między 2.0 a 4.0 są dobrym punktem wyjścia. Parametr wagi jest stały na 0,6.
Zmień intensywność pikseli obrazu (Panel procesowy , sekcja Modyfikacja intensywności kanału ).
UWAGA: Wszystkie polecenia dotyczą tylko aktywnego kanału, a wyniki są automatycznie wyświetlane w oknie obrazu. Nie tworzy się nowego okna obrazu.
1. Przesuń suwak Sub.Bkgd. , aby zastosować algorytm "toczącej się piłki", usuwając tło (czyli przestrzennie stopniowe zmiany intensywności).
  UWAGA: Wartość suwaka to promień toczącej się kuli w pikselach, więc większe wartości odejmą mniej całkowitego tła. Wartość zależy od zawartości obrazu, ale generalnie powinna być ≥2 razy większa niż rozmiar (mierzony w pikselach) cech do zachowania. Wartości między 10 a 20 są często dobrym punktem wyjścia.
2. Przesuwaj suwak Gamma , aby poprawić wizualizację słabszych sygnałów zmieszanych z jaśniejszymi, na przykład jeśli może być potrzebne do podkreślenia drobnych struktur podczas mieszania z dużymi strukturami.
  UWAGA: Po normalizacji wartość każdego piksela jest podnoszona do potęgi (wykładnika) określonej przez wartość suwaka. Wartość zależy od zawartości obrazu, ale wartości między 0,6 a 0,8 często są dobrym punktem wyjścia.
  UWAGA: Obrazy, na których zastosowano gamma, nie mogą być używane do ilościowego pomiaru intensywności.
3. Naciśnij przycisk Zastosowanie wzmocnienia i przesunięcia: ToCh lub przycisk ToAll, aby odwzorować zakres wyświetlania obrazu (określony przez suwaki wzmocnienia i przesunięcia wyświetlacza w panelu Display) na pełny zakres intensywności zapewnianych przez głębię bitową obrazu.
  UWAGA: Ten proces znany jest również jako stosowanie tabeli wyszukiwania (LUT). Wzmocnienie i przesunięcie wyświetlacza muszą być zastosowane w ten sposób przed utworzeniem widoków kanału w panelu Wyświetlacza .
4. Użyj przycisków Korekcji Intensywności , aby skorygować sztuczne zmiany intensywności w wymiarach z lub t obrazów 3D, takie jak te mogą być spowodowane fotobieleniem, aberracjami lub rozpraszaniem światła.
  UWAGA: Akcja jest stosowana tylko do aktywnego kanału. Korekty lokalne i globalne mogą być stosowane sekwencyjnie do tego samego zbioru danych. Zobacz sekcję Rezultaty, aby uzyskać dalsze wyjaśnienia podstawowych metod.
5. Naciśnij przyciski Global , aby skorygować stopniowe utraty intensywności sygnału występujące w całym wymiarze z lub t, zachowując przy tym większość biologicznie wywołanych zmian intensywności. Są dwie opcje:
  1. Naciśnij przycisk GlobalL , aby skorygować stosy z, gdzie początkowe fragmenty mogą być ciemne lub czarne, a całkowita utrata intensywności od pierwszej do ostatniej klatki jest łagodna (<50%). Algorytm modeluje stratę intensywności jako liniowy trend, a następnie stosuje współczynnik korekcji do każdego przekroju, tak że nachylenie linii dopasowania staje się zerowe.
  2. Naciśnij przycisk GlobalP , aby poprawić szeregi czasowe, gdzie pierwsze klatki są najjaśniejsze, a całkowita utrata intensywności od pierwszej do ostatniej jest znaczna (50%-95%). Algorytm modeluje stratę intensywności jako trend wielomianów^drugiego rzędu, a następnie stosuje współczynnik korekcji do każdego przekroju, tak aby krzywa dopasowania została przekształcona w linię o nachyleniu równym zero.
6. Naciśnij przycisk Local , aby skorygować nagłe zmiany natężenia sygnału lokalnego, zachowując stopniowe zmiany.
  UWAGA: Takie zmiany mogą być spowodowane wybielaniem kilku płaszczyzn w większym z-stacku lub wahaniami mocy pobudzenia (migotanie). Algorytm modeluje biologicznie istotne zmiany intensywności jako wielomian czwartego rzędu, a następnie stosuje współczynnik korekcji, aby zapewnić, że mediana intensywności każdego układu jest równa wartości dopasowanej krzywej.
7. Naciśnij przycisk Equalize , aby mediana intensywności sygnału każdej klatki była równa, podobnie jak metoda korekty wybielania Fiji 'prosty stosunek'.
  UWAGA: Wyrównanie może być przydatne do celów wizualizacji, gdy wszystkie inne metody zawodzą, ale wymaże biologicznie istotne zmiany w medianie intensywności i dlatego nie może być stosowane razem z ilościową ilościową ilością.
Zmień wymiarowość obrazu (Panel procesowy , sekcja Zmodyfikuj wymiary ).
UWAGA: Polecenia te dotyczą wszystkich kanałów w oknie obrazu i nie można ich cofnąć za pomocą przycisku Cofnij .
1. Naciśnij przycisk Obróc, aby obrócić obraz, na przykład tak, jak może być potrzebne, aby wyrównać osie anatomiczne zarodka lub tkanki z kartką lub ekranem.
2. Naciśnij przycisk Przycięcia , aby zmniejszyć wymiary xy obrazu. Szukaj automatycznie wybieranego narzędzia ROI prostokątnego i obserwuj komunikat o narysowaniu zwrotu zwrotu z inwestycji na obrazie, który będzie używany do kadrowania.
3. Naciśnij przycisk Podzbioru , aby utworzyć nowy stos obrazów z podzbioru wymiarów nie-xy obrazu wejściowego.
  UWAGA: Stosuje się to do usuwania kanałów i/lub obcinania fragmentów w z lub t.
Zapisz polecenia przetwarzające zastosowane do obrazu (Panel Procesów, sekcja Nagrań Akcji).
UWAGA: Celem Action Recordera jest automatyczne rejestrowanie akcji jako tekst zwykły, a następnie zapisywanie obrazu wraz z zastosowanymi akcjami, które zmieniają wartości intensywności pikseli. Dziennik jest wygodny, dzięki czemu użytkownik nie musi ręcznie robić notatek ani rozszyfrować wpisów w rejestratorze makro Fiji. Polecenia, które nie zmieniają intensywności pikseli, nie są rejestrowane.
1. Naciśnij przycisk Rekomendacji , aby rozpocząć nagrywanie poleceń.
  UWAGA: Na czołowej stronie przycisku widnieje "ON" podczas nagrywania przez rejestrator. Wykonywane polecenia i powiązane parametry pojawią się w Tabeli Akcji. Polecenia, które są "cofnięte", są usuwane ze stołu.
2. Naciśnij przycisk Clr , aby wyczyścić Stół Akcji.
3. Naciśnij przycisk Zapisz, aby zapisać Tabelę Akcji jako plik tekstowy. Jeśli zarejestrowano działania zastosowane do wielu obrazów, działania zostaną pogrupowane według tytułu obrazu podczas zapisu pliku tekstowego.
  UWAGA: Alternatywnie, zapisz obraz w panelu Zapisz (sekcja 4 poniżej). Zaznacz pole Zapisz Akcje , a wszystkie działania zastosowane do obrazu zostaną automatycznie zapisane jako plik tekstowy, używając nazwy obrazu i ścieżki do pliku.

4. Korzystanie z panelu zapisu EasyFiji

UWAGA: Jak pokazano na Rysunku 1C, panel Save został zaprojektowany, aby pomóc osobom niebędącym ekspertami w wyborze odpowiedniego formatu pliku obrazu do ich zamierzonego zastosowania. Gdy zaznaczy pole Zapisz Akcje , wszystkie działania przetwarzania zastosowane do obrazu, zgodnie z Tabelą Akcji, są automatycznie zapisywane wraz z obrazem, używając tej samej nazwy pliku i ścieżki, z wyjątkiem rozszerzenia *.txt. Jeśli wiele obrazów jest otwartych i przetwarzanych równolegle, wszystkie działania wykonane na wszystkich obrazach są wyświetlane w Tabeli Akcji. Jednak tylko działania zastosowane do zapisywanego obrazu są zapisywane razem z tym obrazem. Zapisany plik tekstowy pojawia się w systemie plików, ale nie otwiera się na Fidżi. W razie potrzeby pliki tekstowe można otworzyć na Fiji, przeciągając ikonę pliku na pasek taśmy Fiji.

Zapisz obraz (Panel zapisu , sekcja Metody zapisywania ).
1. Naciśnij przycisk Raw Data , aby zapisać obraz jako plik *.tif, gdzie zachowane są dokładne wartości pikseli, struktura kanałów oraz niektóre metadane. Używaj tej opcji, gdy celem jest dalsza ilościowa analiza lub analiza obrazu.
2. Naciśnij przycisk Zapisz do prezentacji , aby zapisać obraz w aktualnym stanie za pomocą kompresji jpeg do wysyłania e-maili lub wykorzystania w prezentacji slajdów.
  UWAGA: Ta opcja nigdy nie powinna być używana do tworzenia danych ani do analizy ilościowej.
3. Przesuń suwak Poziom Jakości , aby ustawić poziom kompresji jpeg.
  UWAGA: Większe wartości oznaczają lepsze zachowanie intensywności i cech pikseli (oraz większy rozmiar pliku), ale nigdy nie są wszystkie cechy zachowane.
4. Naciśnij przycisk Zapisz dla rysunku , aby zapisać obraz w aktualnie wyświetlanym formacie PNG kompatybilnym z innymi programami graficznymi (np. Photoshop, Illustrator, Publisher lub GIMP). Obraz jest zapisywany tak, jak jest wyświetlany na ekranie, ale kanały i metadane nie są zachowywane.
  UWAGA: Ta opcja nigdy nie powinna być używana do ilości.
5. Naciśnij przycisk Zapisz jako film , aby zapisać stos obrazów jako film w formacie MOV odtwarzany kolejno (z lub t).
  UWAGA: Odtwarzanie plików mov na systemie operacyjnym opartym na Windows wymaga otwartego odtwarzacza VLC Media Player.

5. Korzystanie z panelu EasyFiji Image Info

UWAGA: Jak pokazano na Rysunku 1D, panel Informacji o obrazie wyświetla zwykłe ustawienia pobierania specyficzne dla producenta, które są kluczowe dla interpretacji obrazu. Zobacz Tabelę 2 , aby znaleźć listę typów formatów obrazów konfokalnych, które są obecnie obsługiwane.

Naciśnij przycisk Channel Info , aby załadować ustawienia akwizycji .
Zobacz sekcję Channel Info dla specyficznych dla kanału ustawień akwizycji, w tym % mocy lasera, długości fali lasera, pasma emisyjnego, wzmocnienia i rozmiaru otworu.
Zobacz sekcję Konfiguracja Systemu , aby poznać ustawienia obejmujące cały obraz, w tymnazwę ystem, cel, tryb skanowania, czas zatrzymania oraz rozmiar woksela.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudokolorowe odwzorowania wielokanałowych obrazów fluorescencyjnych mogą być używane do ilustrowania zależności przestrzennych lub intensywności między sygnałami; jednak natywne Fiji oferuje jedynie technikę renderowania kompozytowego RGB, która z natury myli kolory i jasność na poziomie percepcji. Aby zilustrować ten problem, Rysunek 2 wykorzystuje dwukanałowy obraz N-Myc i polimerazy RNA II (RNAPolII). Na Rysunku 2A każdy kanał jest wyświetlany osobno w skal...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fiji to otwartoźródłowe oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazów, szeroko popularne wśród analityków obrazów. Jednak jego złożony interfejs menu oraz czasami nieintuicyjne zachowania związane z wyświetlaniem i przetwarzaniem obrazów fluorescencyjnych stanowią wyzwanie dla osób niezwiązanych z obliczeniami. EasyFiji oferuje naukowcom przyrodniczym zestaw tematycznie zorganizowanych, z podnośnikami ulepszonych przycisków i suwaków, które konsekwentnie wykazują zachowania specyficzne dla kanału, zgodnie z wymagania...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących ze sobą interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom St. Jude's Cell and Tissue Imaging Center oraz Center for BioImage Informatics za komentarze dotyczące manuskryptu. Zdjęcia biologiczne zostały uprzejmie udostępnione przez: Rysunek 2: Melissa Marzahn i Tanja Mittag; Rysunek 3: Peng Wei i James Morgan; Rysunek 4A: Aaron Pitre; Rysunek 4B: Aaron Pitre i Woo Jung Cho; Rysunek 5A: Helen Chen i Heather Mefford; Rysunek 5B: Sauradeep Sinha i Giedre Krenciute.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Comments
EasyFiji GitHub Site	Open Source	https://github.com/stjude/EasyFiji
EasyFiji Image.sc forum	Open Source	https://forum.image.sc/t/announcing-easyfiji-a-user-friendly-gui-plugin-for-fiji/117617
EasyFiji ImageJ.net strona	Open Source	https://imagej.net/plugins/EasyFiji_plugin#quick-start
FIJI Software	Open Source	https://imagej.net/software/fiji/downloads
VLC Media Player	Open Source	https://www.videolan.org/vlc/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
Mutterer, J. Custom toolbars and mini applications with Action Bar. Figshare. 10 (m9), (2017).
Levet, F., et al. Developing open-source software for bioimage analysis: opportunities and challenges. F1000Res. 10, 302(2021).
Aaron, J. S., Taylor, A. B., Chew, T. L. Image co-localization-co-occurrence versus correlation. J Cell Sci. 131 (3), (2018).
Taylor, A. B., Ioannou, M. S., Watanabe, T., Hahn, K., Chew, T. L. Perceptually accurate display of two greyscale images as a single colour image. J Microsc. 268 (1), 73-83 (2017).
Mary, H., Brouhard, G. KymographBuilder. , https://imagej.net/plugins/kymograph-builder (2016).
Schanda, J. Colorimetry: understanding the CIE system. , Wiley Interscience. Hoboken. (2007).
Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).
Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Res. 9, 1494(2020).
Reid, R. C. Jr, Shapley, R. Brightness induction by local contrast and the spatial dependence of assimilation. Vision Res. 28 (1), 115-132 (1988).
Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: an ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Sci Rep. 8 (1), 15764(2018).
Taylor, A. B., Ioannou, M. S., Aaron, J., Chew, T. L. Model-free quantification and visualization of colocalization in fluorescence images. Cytometry A. 93 (5), 504-516 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

EasyFiji: Graficzny interfejs do przyjaznego dla użytkownika przetwarzania obrazu fluorescencyjnego na Fidżi

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles