Artykuł metodologiczny

Podejście porównawcze do ilościowych badań liczenia komórek w bardzo różnych mózgach ssaków

DOI:

10.3791/69446

⸱

16 stycznia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, 2Department of Veterinary Sciences, University of Turin, 3Department of Anthropology and Center for the Advanced Study of Human Paleobiology, The George Washington University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Współczesne neurobiologie muszą badać różnice między wieloma gatunkami, w tym gryzoniami laboratoryjnymi i ludźmi. Jednak trudności techniczne pojawiają się, gdy w grę wchodzą ssaki o dużym mózgu. Podejście to dotyczy zmienności międzygatunkowej populacji neuronalnych u bardzo różnych ssaków, co pozwala na porównywalne wyniki do mapowania w celu ujawnienia wzorców ewolucyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość badań neurobiologicznych prowadzona jest na gryzoniach laboratoryjnych. Pomimo wielu podobieństw między mózgami ssaków, istnieją także istotne różnice, które mogą być mylące w tłumaczeniu. Stwierdzono wyraźne różnice międzygatunkowe w plastyczności mózgu, szczególnie w neurogenezie. Różne procesy neurogenne mogą być powszechne ze względu na ewolucyjne kompromisy, wykazując zmienność między strukturami mózgu i ssakami oraz przesuwając potencjał plastyczności u gatunków różnicowych, takich jak myszy i ludzie. Porównywanie szerokich gatunków rodzi wiele kwestii: badania porównawcze napotykają trudności techniczne, gdy w grę wchodzą duże mózgi; Stosowanie heterogenicznych podejść eksperymentalnych przez różne laboratoria może ograniczać porównania wyników; Heterogeniczność może być powiązana z różnymi biegami czasowymi procesów rozwojowych neurologicznych u różnych ssaków, co dodaje zmienne do porównania.

Aby przeciwdziałać tym ograniczeniom, opracowano podejście do badania zmienności międzygatunkowej populacji neuronów warstwy II korowych, niedojrzałych u ssaków znacznie różniących się rozmiarem mózgu, gyrencefalią, niszą społecznoekologiczną i wiekiem. Pomimo pewnych zmiennych, których nie da się w pełni ustandaryzować, proponuje się metodę łączącą zmniejszoną heterogeniczność w zbieraniu mózgów oraz ustanowienie wspólnych struktur anatomicznych jako punktów odniesienia do liczenia komórek na odpowiadających poziomach mózgu. Uzyskane dane (np. gęstość komórek) można mapować na drzewa filogenetyczne, aby ujawnić wzorce ewolucyjne i analizować pod kątem kowariancji z cechami neuroantycznymi (np. rozmiar mózgu, powierzchnia kory). To podejście wykazało niezwykłą zmienność liczby neuronów korowych, niedojrzałych pomiędzy grupami filogenetycznymi oraz odkrytą kowariancję z rozmiarem mózgu. Metoda ta może być również wykorzystywana do ilościowego określania różnic w różnych etapach rozwojowych u tego samego gatunku oraz rozszerzać ją na inne różnorodne ssaki i procesy biologiczne, aby mapować porównywalne wyniki umożliwiające dokładniejsze ilościowe określenie różnych populacji komórek w mózgach dorosłych w celu wspierania plastyczności.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania neurobiologiczne w dużej mierze wykorzystują mieszane myszy i szczury do przenoszenia wyników na ludzi. Pomimo wielu podobieństw molekularnych, komórkowych, a nawet anatomicznych, istnieją również istotne różnice międzygatunkowe, które mogą mylić interpretację danych przedklinicznych 1,2. Chociaż badania porównawcze są potrzebne, utrudniają je trudności techniczne i praktyczne, gdy w grze wchodzą duże mózgi (np. od średniej 0,5 g u myszy do 1300 g u ludzi; Rysunek 1A). Co więcej, heterogeniczne podejścia eksperymentalne stosowane przez różne laboratoria mogą ograniczać porównania wyników, zwłaszcza analiz ilościowych, co czasem wywołuje kontrowersje. To jest przypadek strukturalnej plastyczności mózgu, ze szczególnym uwzględnieniem procesówneurogennych 3,4,5, tematu interesującego dla zrozumienia neuroplastyczności rozwojowej i naprawy mózgu 6,7.

Najnowsze odkrycia w dziedzinie plastyczności mózgu silnie sugerują, że podczas ewolucji pojawiły się istotne różnice w występowaniu, tempie i anatomicznym położeniu różnych typów procesów neurogennych8. Przykładem jest widoczny spadek neurogenezy sterowanej przez komórki macierzyste występującej u dorosłych ssaków o dużym mózgu w porównaniu do gryzoni laboratoryjnych 5,9,10, prawdopodobnie związanych z różnym rozszerzaniem obszarów i funkcji mózgu jako adaptacja do presji ekologicznej 7,8, a także z różnymi cyklami neurorozwojowymi11,12. Tempo neurogenezy wydaje się znacząco różnić między myszy a ludźmi, co rodzi kwestię tłumaczenia13.

Z drugiej strony, przypuszcza się, że nowy rodzaj "neurogenezy bez podziału" reprezentowany przez neurony zablokowane w zatrzymanym dojrzewaniu (tzw. neurony niedojrzałe lub uśpione 14,15,16,17,18,19) ma się przysunąć jako wzrastający od gatunku o małym mózgu do dużego mózgu 20,21. Co ciekawe, niezależna od komórek macierzystych populacja niedojrzałych neuronów znajduje się w korze mózgowej (miejscu poznania wysokiego rzędu u gatunków gyrencefalicznych22,23) i daleko od kanonicznych miejsc neurogennych, które są głównie związane z węchem i nawigacją przestrzenną, które zachowują duże znaczenie w gatunkach lissencefalicznych 7,8. Te różnice między strukturami mózgu i gatunkami ssaków wykraczają poza zwykłe porównanie, ponieważ mogą mieć znaczenie w tłumaczeniu, zmieniając potencjał plastyczności u myszy i ludzi. Z tych powodów kluczowe jest ocenenie w "porównywalny sposób", w jakim stopniu różnice stanowią zmienność filogenetyczną wśród bardzo różnych ssaków, ze szczególnym uwzględnieniem gryzoni laboratoryjnych i naczelnych.

Opisano niedawno podejście do badania zmienności międzygatunkowej populacji neuronów warstwy II korowych niedojrzałych (cIN) u ssaków znacznie różniących się rozmiarem mózgu, gyrencefalią i niszą społecznoekologiczną 22,24,25. Metoda ta opiera się na trzech zasadach: i) rozważaniu kilku (różnorodnych) gatunków ssaków przetwarzanych równolegle przy użyciu tych samych procedur; ii) minimalizować zmienne, których nie da się w pełni ustandaryzować w bardzo różnych mózgach (procedura fiksacji, interwał pośmiertny, wiek) oraz uwzględnienie specyficzności gatunkowej przeciwciał dla immunocytochemii poprzez wykorzystanie szeroko wspólnych cech badanych populacji komórkowych jako wewnętrznych pozytywnych kontroli; oraz iii) ustalenie odpowiadających struktur anatomicznych jako punktów odniesienia do liczenia komórek na odpowiadających poziomach mózgowych różnych gatunków (Rysunek 1B i Rysunek 2). Dane uzyskane (np. gęstości komórek) poprzez liczenie komórek zidentyfikowanych z dobrze ugruntowanym markerem podwójnej kortyny (DCX 15,17,26) mogą być mapowane na drzewa filogenetyczne, aby ujawnić wzorce ewolucyjne i analizować pod kątem kowariancji przy różnych parametrach, takich jak wielkość mózgu, gyrencefalia i powierzchnia kory.

Rysunek 1
Rysunek 1: Przetwarzanie bardzo różnych mózgów ssaków w celu oceny rozkładu i ilości cin w płaszczu korowym. (A) Ssaki należące do różnych gatunków i rzędów charakteryzują się bardzo różnymi rozmiarami mózgów oraz stopniem gyrencefalii i ekspansji korowej. Ikony mózgu odtworzone na licencji BioRender. (B) Reprezentatywne przekroje koronne z niebieskim barwieniem toluidynowym wycięte z mózgów o bardzo różnych rozmiarach i o wydłużeniu płaszcza korowego. Histologicznie barwione sekcje seryjne (nacięcie kriostatowe, koronowe, o grubości 40 μm) służą do identyfikacji głównych struktur neuroanatomicznych u każdego gatunku zwierzęcego (patrz Rysunek 3); Zwróć uwagę na niezwykłe różnice w rozmiarze mózgu i obwodzie korowym. Ikony zwierząt w panelu A zostały odtworzone za zgodą La Rosy i in.22. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Wreszcie, ponieważ wszystkie procesy plastyczne zazwyczaj ulegają stopniowemu redukcji wraz ze wzrostem wieku27,28 lat, kolejnym problemem w porównawczej neuroplastyczności jest ocena różnych biegów czasowych takiej redukcji, które mogą być powiązane z różnymi przebiegami procesów neurorozwojowych u ssaków 12,29,30. W rzeczywistości istnienie gatunków szybko dojrzewających (myszy) i powoli dojrzewających (naczelnych) jest kolejnym powodem, dla którego najpopularniejszy system modelowy, mysz laboratoryjna, jest ograniczony w rozwiązywaniu wyzwań w naukach biomedycznych. Opisana tutaj metoda może być również przydatna do uwzględnienia populacji komórek w różnym wieku w całym okresie życia każdego gatunku, a następnie porównania powstałych trendów między gatunkami. Stwierdzono zmienność filogenetyczną gęstości cIN oraz różnice w ich trwałości na przestrzeni wieku, pomiędzy ssakami o małym mózgu a dużym mózgiem22,28.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne z odpowiednimi krajowymi i instytucjonalnymi przepisami. Tkanki myszy pozyskano z Instytutu Neurobiologii Cavalieri Ottolenghi (NICO) w Orbassano, Włochy, za zgodą włoskiego Ministerstwa Zdrowia (RRID: MGI:3696370), dzięki uprzejmości Sereny Bovetti i Charles River Laboratories. Nagie tkanki kretów zostały zebrane na Uniwersytecie Queen Mary w Londynie (Wielka Brytania) bezpośrednio po eutanazji zgodnie z Załączniku 1 ustawy o procedurach naukowych o zwierzętach z 1986 roku. Eksperymenty z królikami były zgodne z dyrektywą Rady Wspólnot Europejskiej 86/609/UE oraz włoskim prawem (DL.vo 116/92), z aprobatą włoskiego Ministerstwa Zdrowia (autoryzacja 66/99-A). Mózgi owiec i koni zostały pobrane pośmiertnie z komercyjnej rzeźni na podstawie dyrektywy 86/609/EWG i pod ciągłym nadzorem weterynaryjnym. Mózgi psów zostały dostarczone pośmiertnie przez MarshallBio Laboratories (Lyon, Francja) z wymaganymi zezwoleniami; Mózgi kotów zostały pobrane pośmiertnie na Uniwersytecie w Padowie podczas rutynowych diagnostycznych sekcji zwłok za zgodą właściciela. Wszystkie procedury były zgodne z prawem UE i Włoch. Próbki szympansów były przetwarzane zgodnie z międzynarodowymi zasadami przewodnimi Rady Międzynarodowych Organizacji Nauk Medycznych (CIOMS) oraz zgodnie z pozwoleniem National Institutes of Health - Office of Laboratory Animal Welfare (NIH-OLAW) A5761-01 (szczegóły dotyczące każdego gatunku zwierzęcia i eksperymentu można znaleźć w Tabeli Uzupełniającej 1 oraz Ref.22,25).

1. Zbieranie mózgów

  1. Zbieraj mózgi bezpośrednio lub z innych instytucji i banków tkanek, ale rozważ tylko całe półkule. Ustalenie z instytucjami najlepszej procedury usuwania mózgów od gatunków zwierzęcych, z uwzględnieniem zmniejszenia uszkodzeń półkuli oraz zapewnienia minimalnego interwału pośmiertnego (PMI, patrz UWAGA PONIŻEJ) i szybkiego zanurzenia w roztworze utrwalającym po ekstrakcji roztworu.
    UWAGA: W zależności od wrażliwości przeciwciała, które jest przedmiotem, należy zwracać uwagę na PMI. Biorąc pod uwagę wysoką wrażliwość podwójnej kortyny (DCX) na degradację, pobierać próbki o zakresie PMI 0-1 h (poza szympansem z PMI do 14 h, które jednak nie powodowały żadnej zmiany jakości barwienia, Tabela Uzupełniająca 1).
  2. Biorąc pod uwagę dużą zmienność długości życia zwierzęcia, należy z góry określić grupy wiekowe, które zostaną zebrane spośród różnych ssaków rozważanych w badaniu, aby uzyskać porównywalne dane.
    1. Aby zaprojektować to badanie i ustalić porównywalne grupy wiekowe, przeanalizuj informacje z dwóch baz danych dotyczących historii i różnorodności zwierząt: AnAge, kuratorowanej bazy danych starzenia się i historii życia zwierząt, oraz Animal Diversity Web, internetowej bazy danych biologii naturalnej, rozmieszczenia i klasyfikacji zwierząt.
    2. Podziel długość życia zwierzęcia na cztery etapy (jeden przedporodowy i trzy poporodowe, czyli "dorosłe"), zaczynając od klasyfikacji Amerykańskiego Stowarzyszenia Medycyny Weterynarii (AVMA) dla stadij życia u psów31, gdzie długość życia dzieliła się na sześć etapów: szczeniak, młodszy, dorosły, dojrzały, starszy i starszy.
    3. Poprzez zjednoczenie etapów starszych i starszych oraz dorosłych i dojrzałych, stosuj tę terminologię: przedporodowy, młododorosły, średni wiek oraz senior/22 lata.

2. Utrwalanie i przetwarzanie tkanki mózgowej

UWAGA: Procedury fiksacji mogą się różnić w zależności od wielkości mózgu i kwestii etycznych wobec niektórych gatunków zwierząt (większość naczelnych lub koni o dużym mózgu nie może być perfuzowana i musi być zanurzona w roztworze utrwalającym po ekstrakcji).

  1. Utrzymuj mózg całkowicie zanurzony w roztworze utrwalającym (zalecane 4% paradehydu lub 10% formaliny).
    UWAGA: Czas utrwalenia zależy od wielkości mózgu (np. 3 tygodnie dla mózgu psa; 3 miesiące dla mózgu konia, Tabela Uzupełniająca 1). Unikaj krótkiego/zbyt długiego czasu spędzonego w roztworze utrwalającym, aby zachować integralność interesującego się antygenu.
  2. Podziel preferowaną półkulę mózgu na równe kawałki (1-1,5 cm) za pomocą linijki (do cięcia prostego) i noża kłutego.
  3. Zanurz plasterki mózgu w buforze fosforanowym (PB) 0,1 M (28,49 g fosforanu sodu dwubazowego i 7,8 g fosforanu sodu monozasadowego rozpuszczonego w wodzie destylowanej, pH 7,4) i utrzymuj je pod delikatnym mieszaniem na shakerze przez 24 godziny. W razie potrzeby (patrz UWAGA poniżej) wyrzuć roztwór i zastąpić go świeżym roztworem o pH 0,1 M, pH 7,4 następnego dnia.
    UWAGA: Objętość i liczba płukań w PB 0,1 M różnią się w zależności od wielkości mózgu (np. 30 minut dla mózgu myszy, 3 dni dla mózgu konia). Upewnij się, że mózgi są całkowicie zanurzone w PB 0,1 M oraz że formalina, krew i tkanki odpady nie są już obecne, co zapobiega płukaniu.
  4. Krioprotecturz plasterki, zanurzając je w roztworach sacharozy o stopniowo rosnącym stężeniu (10%, 20%, do 30%) w stężeniu PB 0,1 M, pH 7,4, i utrzymuj je pod delikatnym mieszaniem na shakerze.
    UWAGA: Objętość roztworów sacharozy zależy od wielkości mózgu. Upewnij się, że mózgi są całkowicie zanurzone w roztworach sacharozy i całkowicie zapadają się, zanim przejdą do zwiększonego stężenia sacharozy.

3. Całokulowe cięcie kriostatu

  1. Usuwaj oponki z przekrojów mózgu za pomocą zakrzywionej pęsety, aby uniknąć problemów podczas cięcia.
  2. Umieść plasterki w formach wsadzających wypełnione masą o optimalnej temperaturze cięcia (OCT). Jeśli plasterek nie wypełni formy do osadzania, wytnij kwadratowy kawałek Parafilmu nieco większy od wycinka mózgowego i dodaj medium OCT do środka kawałka, a następnie umieść plasterek na OCT.
  3. Zamroź plasterek przez zanurzenie w 300 mL izopentanu schłodzonego ciekłym azotem w temperaturze -50 °C, aż medium OCT stanie się całkowicie białe. Plasterki mózgu można przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania aż do sekcji.
  4. Przed sekcjonowaniem utrzymuj przecięcie mózgu w temperaturze -20 °C przez co najmniej 5 godzin, aby tkanka mogła powoli i jednorodnie osiągnąć tę samą temperaturę co kriostat.
  5. Pokrój plaster na 40 μm szeregowe koronalne sekcje za pomocą kriostatu, utrzymując temperaturę wewnątrz komory od -20 °C do -25 °C.
  6. Zbierać wolno unoszące się fragmenty w płytkach 12-dołkowych i przechowywać je w roztworze krioprotekcjonantu (150 mL gliceroli, 150 mL glikolu etylenowego, 150 ml wody destylowanej i 50 mL buforu F [1,682 g jednozasadowego dwudrodku fosforanu sodu i 0,385 g wodorotlenku sodu rozpuszczonego w wodzie destylowanej, pH 7,4]) (1 mL/dołek lub więcej, aby całkowicie pokryć przekroje w przypadku dużych mózgów) w temperaturze -20 °C aż do barwienia.
    UWAGA: Całe półkule różnią się w zależności od wielkości mózgu. Większe mózgi (np. szympansy, konie) muszą być podzielone na dwa równe bloki (grzbietowy i brzuszny), aby mogły być przetwarzane w kriostacie. W takim przypadku wolno unoszące się sekcje można zbierać w dwóch płytach z 6 dołkami. Alternatywą jest przecięcie półkul u gatunków o dużych mózgach za pomocą przesuwającego się mikrotomu, co pozwala na bloki o większych rozmiarach.

Rysunek 2
Rysunek 2: Przetwarzanie bardzo różnych mózgów według tej samej procedury i radzenie sobie ze zmiennymi, których nie da się standaryzować. W opisanej powyżej metodzie wszystkie procedury, które można standaryzować, wykonuje się w ten sam sposób (fiksacja ogólna, cięcie kolejnych przekrojów koronowych o tej samej grubości na całej półkuli, ogólne procedury immunocytochemiczne, liczenie komórek). Figurka stworzona za pomocą BioRender (https://app.biorender.com/). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

4. Barwienie histologiczne

  1. Wybierz sekcje koronalne seryjne (1 sekcja na 12). Aby uzyskać takie odstępy, wybierz wszystkie sekcje jednego odwiertu z płyty 12-dołkowej. Użyj ich do uzyskania pełnej reprezentacji całej półkuli oraz jako odniesienia do wybierania przekroju koronowych na różnych porównywalnych poziomach mózgu u różnych badanych gatunków (patrz sekcja 5). Zamontuj je na 1% żelatynacyjnych zjeżdżalni. Pozwól im wyschnąć przez kilka godzin.
  2. Przygotuj następujące roztwory (150 mL/roztwór): etanol 50%, 70%, 96%, 100%, ksylol oraz błękit toluidyny.
  3. Protokół barwienia: Umieść szkiełka w rosnących stężeniach etanolu (50%-100%), po 1 minutę przy 50%-70%, po 2 minuty przy 96%-100%, a następnie przelej do roztworu ksylolu na 1 minutę.
  4. Umieść szkiełka w odwrotnej kolejności: roztwór ksylolu przez 1 minutę, a następnie malejące stężenia roztworów etanolu (100%-50%), po 2 minuty przy 100%-96%, po 1 minutę po 70%-50%.
  5. Umieść szkiełki w 150 mL destylowanego H2O (2 min).
  6. Umieść szkiełka w roztworze bejcy Toluidine Blue (5-10 min). Po tym etapie zabarwione fragmenty wyglądają na ciemnoniebieskie.
    UWAGA: Czasowe fragmenty przechowywane w roztworach do barwienia histologicznego mogą się różnić w zależności od gatunku. Testuj przekroje mózgu interesującego go gatunku, aby ustalić optymalny protokół barwienia.
  7. Płucz szkiełka w 150 mL destylowanego H2O przez 1 minutę.
  8. Przejdź do etapu różnicowania, umieszczając szkiełki w rosnącym stężeniu etanolu (70%-100%) przez 1 minutę przy 70%, po 2 minuty przy 96%-100%, a następnie przelewaj do roztworu ksylolu na 1 minutę i 30 sekund. Podczas tych etapów sekcje zmieniają kolor z ciemnoniebieskiego na niebieski jak niebo.
  9. Upewnij się, że fragmenty są nadal mokre po ostatnim kroku ksylolu, zanim przesuniesz pokrywę za pomocą medium mocującego (jeśli wyschną, płucz je w roztworze ksylolu przez 5 sekund). Następnie pozwól szkiełkom wyschnąć przez kilka dni.

5. Selekcja poziomów mózgu i barwienie immunohistochemiczne

  1. Korzystając z przekrojów zabarwionych histologicznie uzyskanych w sekcji 4 jako odniesienia, zidentyfikować poziomy mózgu w zależności od konkretnych cech neuroanatomicznych: Poziom 1 (L1) – od przedniego otworu komory bocznej do L2; Poziom 2 (L2) – od przedniego początku torebki wewnętrznej do L3; Poziom 3 (L3) – od przedniego początku ciała migdałowatego do L4; Poziom 4 (L4) – od tylnego zamknięcia komory bocznej do rozszerzenia równoważnego L2 (tyle samo 40 μm przekrojów szeregowych; Rysunek 3).
    UWAGA: Powyższe odniesienia neuroanatomiczne mają na celu umożliwienie porównania kory mózgowej należącej do mózgów o bardzo różnych rozmiarach i gyrencefalii. W zależności od interesującego obszaru mózgu, cechy anatomiczne używane jako odniesienie mogą się zmieniać.
  2. Wybierz trzy równomiernie rozmieszczone przekroje koronowe z każdego poziomu mózgu.
    UWAGA: Objętość każdego buforu używanego w kolejnych etapach zależy od wielkości mózgu (np. 0,5 mL/dołek dla sekcji myszy, 1,5 mL/dołek dla sekcji konia). Upewnij się, że wolno unoszące się sekcje są całkowicie przykryte przez każdy bufor.
  3. Przemyj fragmenty trzy razy w PBS 0,01 M, pH 7,4, przez 5 minut każda.
  4. Inkubować fragmenty w endogennym roztworze blokującym nadoksydazę (0,6%H2O2, 1% Triton X-100 w 0,01 M PBS, pH 7,4; 20 min) lub wykonać pobieranie antygenów z użyciem kwasu cytrynowego (10 mM kwasu cytrynowego w wodzie destylowanej z dodatkiem 0,05% Tween 20, pH 6,0), 5 minut w temperaturze 90 °C.
    UWAGA: W zależności od procedury/czasu utrwalania oraz interesującego mnie antygenu, może być konieczne pobranie antygenów, aby uzyskać optymalne barwienie (bufor, temperatura, pH i czas inkubacji mogą się różnić w zależności od interesującego antygenu).
  5. Przepłukaj ponownie sekcje w PBS 0,01 M, pH 7,4 (3 x 5 min płukania).
  6. Inkubuj sekcje w roztworze blokującym (1-5% albuminy surowicy bydłej (BSA), normalna surowica, 1-1,5% Triton X-100 w 0,01 M PBS, pH 7,4; 90 minut w RT).
  7. Inkubuj sekcje roztworem przeciwciał pierwotnych (1-5% BSA, 2-3% surowica normalna, 1-1,5% Triton X-100, przeciwciało pierwotne w 0,01 M PBS, pH 7,4; 48 h w 4 °C przy delikatnym mieszaniu).
    UWAGA: Przeciwciała przeciwko interesującemu się antygenowi mogą dawać różne wyniki pod względem jakości barwienia, gdy są stosowane w różnych obszarach mózgu i u różnych gatunków26. Do wyboru optymalnego narzędzia do zastosowania w różnych gatunkach rozważanych w badaniu (w celu zmniejszenia zmienności między próbkami) konieczne jest porównanie zestawu przeciwciał różnych producentów.
  8. Powtórz krok prania opisany w kroku 5.3.
  9. Inkubować sekcje wtórnym roztworem przeciwciał biotynylowanych (1-5% BSA, 2-3% normalna surowica, 1-1,5% Triton X-100, wtórne biotinylowane przeciwciało w 0,01 M PBS, pH 7,4; 2 godziny w RT).
    UWAGA: Metoda kompleksu peroksydazy awidyny-biotyny stosuje się do liczenia komórek na Neurolucidzie (patrz sekcja 6), ponieważ daje gęsty, długotrwały osad, co pozwala na skupienie ostrości przez grubość przekroju podczas liczenia. Do podwójnego lub potrójnego immunobarwienia w celu dalszej charakterystyki komórek można również stosować immunofluorescencję i analizę konfokalną (w przypadku protokołów patrz Ref.22,25,32).
  10. Przygotuj kompleks awidyny-biotyny-peroksydazy korzystając z dostępnego zestawu.
    UWAGA: Przygotuj roztwór kompleksu peroksydazy awidyny-biotyny w Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (co zapewnia stabilne pH dla tworzenia kompleksu) co najmniej 1 godzinę przed użyciem, aby umożliwić powstawanie złożonego.
  11. Fragmenty płukaj dwukrotnie w PBS 0,01 M, pH 7,4 (2 x 5 min) oraz raz w Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (5 min).
    UWAGA: Ponieważ kompleks awidyny-biotyny-peroksydazy znajduje się w roztworze z Tris-HCl 0,05M, płukanie Tris-HCl 0,05 M pozwala na przyzwyczajenie tkanki do roztworu.
  12. Inkubować fragmenty w kompleksie awidyny-biotyny-peroksydazy (1 godzina w RT).
  13. Fragmenty płukania w Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5 (3 x 5 min płukania).
  14. Pod osłoną oparową inkubuj przekroje w roztworze barwienia 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) (H2O2, DAB w Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5) aż do uzyskania optymalnego barwienia. W trakcie tego etapu sekcje zmieniają kolor z przezroczystego na brązowo-bordowoczerwony.
    UWAGA: Czas uzyskania optymalnego barwienia różni się w zależności od analizowanego gatunku (np. dla DCX, 2-5 minut dla sekcji myszy, 20-30 minut dla sekcji końskich). Sprawdzaj, czy fragmenty są barwione co 2 minuty, aby uniknąć przebarżenia.
  15. Fragmenty płukania w PBS 0,01 M, pH 7,4 (3 x 5 min płukania).
  16. Zamontuj sekcje na prowadnicy, gdy wyschną, przykryj pokrywką z medium mocującym i pozwól szkiełkom wyschnąć przez kilka dni.

Rysunek 3
Rysunek 3: Ustalanie neuroanatomicznych poziomów mózgu do badania rozkładu i ilości neuronów DCX+ w korze mózgowej. Cztery odpowiadające im struktury neuroanatomiczne (przedni początek komory bocznej [poziom 1, L1]; przedni początek torebki wewnętrznej [L2]; przedni początek ciała migdałowatego [L3]); tylne zamknięcie komory bocznej [L4]; oznaczone czerwonymi kółkami) zostały uznane za ustalenie czterech odpowiadających sobie "poziomów mózgowych" od przodu do tyłu u wszystkich rozważanych ssaków, aby zbadać liczbę cIN w korze mózgowej w sposób "porównywalny". (A) Przykład podany jest dla gryzoni laboratoryjnych (mysz, po lewej) i naczelnych (szympans, po prawej). Trzy przekroje koronne z każdego poziomu mózgu (łącznie 12 przekrojów; czerwone groty strzałek) są brane pod uwagę do liczenia komórek na całym obwodzie warstwy II każdego przekroju koronnego (UWAGA: wszystkie sekcje zawierają neokorteks, podczas gdy tylko niektóre zawierają paleokorteks). Celem tego podejścia jest umożliwienie przeprowadzania analiz na odpowiadających poziomach neuroanatomicznych w mózgach o bardzo różnej wielkości. (B) Podano przykład identyfikacji pierwszego poziomu (L1) w przekrojach zabarwionych histologicznie u bardzo różnych gatunków ssaków. Ikony mózgu i zwierząt stworzone za pomocą BioRender. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

6. Liczenie komórek

  1. Otwórz oprogramowanie Neurolucida na stanowisku roboczym i umieść preparat pod mikroskopem z wybranym celem do liczenia komórek.
    UWAGA: Do liczenia komórek DCX+ użyto celu 20x.
  2. Przy niskim powiększeniu (np. 4x) narysuj kontur warstwy kore II za pomocą narzędzia Freehand contour line w menu Trace w oprogramowaniu, aby uzyskać obwód długości (zarówno paleokorteks, jak i neokorteks).
  3. Wybierz preferowane symbole do liczenia komórek na pasku Znaczniki, widocznym po lewej stronie ekranu. W tej analizie różnicowanie dwóch różnych komórek w każdym obszarze zainteresowania (paleokorteks, neokorteks) w zależności od ich morfologii (odpowiadającej różnym stanom dojrzewania: typ 1, z małą somą i kształtem dwubiegunowym, zakres średnicy somy 3-9 μm; typ 2, z większą somą i złożoną dendrytyczną arboryzacją, zakres średnicy soma 9-18 μm).
    UWAGA: Do tej analizy na pasku narzędzi znaczników wybrane są dwa różne symbole/typy komórek dla każdego obszaru zainteresowania. Podział średnicy somy na różne zakresy jest kluczowy dla skrupulatnego kategoryzowania komórek bez wyraźnej morfologii, które mogą znajdować się w stanie pośrednim dojrzewania. Aby uniknąć nadmiernego liczenia, komórki wycięte na górnej powierzchni przekroju są wyłączane z analizy.
  4. Dane do analizy filogenetycznej należy zebrać z trzech różnych regionów: paleokorteksu, neokorteksu i kory mózgowej (ten ostatni uzyskano przez dodanie danych z paleokorteksu i neokorteksu).
  5. Zbierz w pliku arkusza kalkulacyjnego obwód warstwy korowej drugiej (mm), który jest widoczny w pasku narzędzi pomiarów konturu w oprogramowaniu.
  6. Na tym samym arkuszu kalkulacyjnym zbierz liczbę komórek typu 1 i typu 2 (widocznych w pasku Markers) oraz łączną liczbę komórek (uzyskaną przez sumowanie komórek typu 1 i typu 2) w każdym regionie mózgu i poziomie mózgu (trzy sekcje/poziom, łącznie 12 sekcji/próbkę).
  7. Wykorzystaj te dane, aby uzyskać dla każdej sekcji w każdym regionie liniową gęstość komórek (liczbę komórek/mm) oraz procent komórek typu 1 i typu 2 (liczba komórek typu 1/typ 2 podzielona przez całkowitą liczbę komórek i pomnożona przez 100).
  8. Oblicz wartość mediany gęstości (używając funkcji mediany w arkuszu kalkulacyjnym) dla 12 rozważanych sekcji/próbki, aby graficznie oddać liniową gęstość komórek. Użyj mediany jako centralnej miary, ponieważ próba na grupę jest stosunkowo mała (4 zwierzęta na grupę), a niektóre grupy wykazują rozkłady asymetryczne (mediana jest mniej zależna od wartości ekstremalnych).
  9. Oblicz procent komórek typu 1 i 2 w każdym okazie (używając opisanego powyżej wzoru), a następnie uzyskaj średnią wartość procentową między czterema rozważanymi okazami/gatunkami (używając funkcji średniej w arkuszu kalkulacyjnym). Następnie użyj liniowej gęstości komórek do analizy filogenetycznej (patrz sekcja 7) oraz wykorzystaj łączną liczbę komórek zliczonych w każdym przekroju koronalnym do oszacowania całkowitej liczby niedojrzałych neuronów/półkul.
  10. Użyj narzędzia do konturowania wolnoręcznego w oprogramowaniu Neurolucida, aby narysować linię przez średnicę soma prostopadle do jej głównej osi. Wykonując ten krok, oblicz średnicę co najmniej 100 losowo wybranych komórek DCX-dodatnich (DCX+) obu typów w każdym gatunku (25 komórek/próbkę) w każdej części mózgu, aby uzyskać zakres średnicy somy dla komórek typu 1 i typu 2.

7. Analizy filogenetyczne: Generowanie drzew filogenetycznych

  1. Stwórz listę analizowanych gatunków w Notatniku, używając ich nazw naukowych, a następnie przesłaj ją na https://timetree.org/ strony.
    UWAGA: Nazwy naukowe można sprawdzić na stronie: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy
  2. Wyeksportuj uzyskany plik drzewa, klikając przycisk do pliku Newick .

8. Analizy filogenetyczne: Liczenie integracji danych w drzewie filogenetycznym

  1. W osobnych kolumnach karty danych wypisz wszystkie przeanalizowane gatunki oraz odpowiadające im dane, które mają być powiązane (w tym przypadku: gęstość komórek DCX+ całej kory, gęstość komórek DCX+ w neokorteksie oraz gęstość komórek DCX+ w paleokorteksie). Jeśli na gatunek dostępnych jest kilka osobników, oblicz średnią mediany gęstości dla wybranych parametrów.
  2. Pobierz oprogramowanie Mesquite Project (https://www.mesquiteproject.org/), aby połączyć drzewo filogenetyczne z danymi liczenia.
    UWAGA: To oprogramowanie wymaga, aby Java była już obecna na komputerze.
  3. Otwórz plik Newick wcześniej zapisany przez Timetree, klikając na Otwórz plik. Następnie wybierz opcję Simple Newick/Phylip Treefile . Traktuj plik jako tekst i zapisz go jako ".nex".
  4. Na nowej stronie, która się otwiera, wybierz Taksony&Drzewa , następnie Nowe Trzy Okno i wybierz Z Drzewami od Źródła. W oknie wyskakującym wybierz Stored Tree i naciśnij OK. Pojawi się nowa zakładka o nazwie Importowane drzewa .
  5. Graficznie zmodyfikuj drzewo filogenetyczne (np. czcionkę, rozmiar, gałęzie proporcjonalne do długości) w sekcji Wyświetlanie .
  6. Dodaj nową zakładkę w Mesquite, wybierając Dodaj (Dodaj , a następnie Nowa Macierz Znaków ) i wybierając liczbę znaków (w tym badaniu liczba = 3, co odpowiada trzem gęstościom komórek DCX+). Traktuj znaki jako dane ciągłe.
    UWAGA: Znaki reprezentują dane do korelu z drzewem filogenetycznym.
  7. Skopiuj do nowo utworzonej zakładki dane, które będą powiązane z drzewem filogenetycznym (cz. 6.4) i zapisz je.
  8. Na zakładce Drzewa importowane wybierz Analiza: Drzewo i Śledz historię postaci, aby przeprowadzić analizę stanów przodków Parsimony .
  9. Zapisz plik jako PDF.

9. Analizy filogenetyczne: korelacja między rozmiarem mózgu a gęstością komórek DCX+

  1. W wcześniej utworzonej kartce danych dodaj kolumnę z rozmiarem mózgu dla każdego z gatunków.
  2. Oblicz naturalny logarytm gęstości komórek DCX+ oraz rozmiaru mózgu.
  3. Uruchom preferowany pakiet statystyczny (https://www.statskingdom.com/linear-regression-calculator.html) i wykonaj prostą regresję liniową
  4. Pobierz pliki wyników i zapisz reszty jako nowe kolumny w karcie danych.
    UWAGA: Reszty reprezentują odchylenie punktów danych od linii regresji.
  5. W kartce danych wybierz kolumnę reszt oraz kolumnę zawierającą nazwy gatunków. Następnie przejdź do wstawienia i wybierz graf histogramowy, aby graficznie wyświetlić reszty.

10. Analizy filogenetyczne: rozszerzenie neokortykalne i korelacja gęstości komórek DCX+ neokortykalnej

  1. W wcześniej utworzonej kartce danych dodaj kolumnę z danymi powierzchni powierzchni warstwy nekortykalnej II każdego z gatunków i oblicz logarytmy naturalne.
  2. W oprogramowaniu statystycznym wykonaj prostą regresję liniową, używając wartości powierzchni warstwy neokrortycznej II logarytmicznej jako zmiennej X oraz gęstości komórek DCX+ w logarytmicznym neokorteksie jako zmiennej Y.
  3. Pobierz uzyskane pliki i zapisz reszty w nowej kolumnie w arkuszu danych, gdzie można stworzyć wykres resztek zgodnie z krokiem 9.5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki DCX+ w korze mózgowej wszystkich badanych gatunków konsekwentnie wykazują szereg cech wskazujących na istnienie dobrze zachowanej populacji neuronów niezróżnicowanych (Rysunek 4A). W skrócie: (i) są topograficznie ułożone tak, aby tworzyć monowarstwę wzdłuż warstwy korowej II; (ii) wykazują morfologiczne podtypy opisane dla różnych stadiów dojrzewania u neuronów niedojrzałych, (a) z dużą częstością występowania małych, unipolarnych/dwubiegunowych komórek oraz niewielkim udziałem komó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda dostarcza porównywalnych danych ilościowych, gdy uwzględnimy różnorodne gatunki znacznie różniące się rozmiarami mózgu i neuroanatomią. Może być używany do oceny spójności populacji komórek w całym mózgu różnorodnych ssaków, a także do śledzenia ich rozwoju u pojedynczego gatunku na kolejnych etapach, od okresu poporodowego po starzenie. Zaczyna się od założenia, że zaangażowanych będzie stosunkowo duża liczba mózgów (całych półkul) i gatunków, przetwarzanych przez to samo laboratorium według standar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Matteo Piumattimu i Chiarze La Rosa za współdziałanie w definiowaniu protokołu opisanego tutaj dla neuronów niedojrzałych korowych. Prace były wspierane przez Fondazione CRT - Cassa di Risparmio di Torino (grant RF=2022.0618) dla LB; PRIN2022 (grant 2022LB4X3N) dla LB; National Science Foundation (granty EF-2021785, DRL-2219759) oraz National Institutes of Health (granty NS092988 AG067419) dla CCS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% formalnościSigma-AldrichHT501128
2-metylobutan Sigma-Aldrich320404Isopentane
3,3′-hydrat tetrahydrochlorku diaminobenzydynySigma-AldrichD5637
4% paraformaldehyduSigma-Aldrich441244
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9647
Kwas cytrynowy & nbsp;SigmaC0759
Montaż DPX do histologiiSigma-Aldrich  06522
EtanolMerck1.00983
Glikol etylenowySigma-Aldrich102466
GlicerolSigma-AldrichG7893
Roztwór nadtlenku wodoruSigma-AldrichH1009
Killik - kompleks O.C.T.Biooptika  05-9801
Oprogramowanie MesquiteProjekt MesquiteMesquite wersja 3.81 (wersja 955)
Neo-mountSigma-Aldrich1.09016
Buforowany fosforanem (PB)nanaWykonany na zamówienie
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)nanaWykonany na zamówienie
Wodorotlenek soduRiedel-de Haen6213
Dibazowy dihydrat fosforanu soduSigma-Aldrich71645
Fosforan sodu monozasadowy dihydratSigma-Aldrich71500
SacharozaSigma-AldrichS9378
Toluidine BlueSigma-Aldrich89640
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP9416
VECTASTAIN Elite zestaw ABC-HRP Peroksydaza (standardowa)Laboratoria VectorPK-6100
Xylol Sigma-Aldrich247642

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience. Trends Neurosci. 38 (5), 273-278 (2015).
  2. Bolker, J. A. Animal models in translational research: rosetta stone or stumbling block. Bioessays. 39 (12), 1-8 (2017).
  3. Moreno-Jiménez, E. P., Terreros-Roncal, J., Flor-García, M., Rábano, A., Llorens-Martín, M. Evidences for adult hippocampal neurogenesis in humans. J Neurosci. 41 (12), 2541-2553 (2021).
  4. Sorrells, S. F., et al. Positive controls in adults and children support that very few, if any, new neurons are born in the adult human hippocampus. J Neurosci. 41 (12), 2554-2565 (2021).
  5. Simard, S., Matosin, N., Mechawar, N. Adult hippocampal neurogenesis in the human brain: updates, challenges, and perspectives. Neuroscientist. 31 (4), 141-158 (2024).
  6. Bao, H., Song, J. Treating brain disorders by targeting adult neural stem cells. Trends Mol Med. 24 (12), 991-1006 (2018).
  7. Ghibaudi, M., Zanone, A., Bonfanti, L. Brain structural plasticity in large-brained mammals: not only narrowing roads. Neural Regen Res. 21 (5), 1669-1680 (2026).
  8. Bonfanti, L., La Rosa, C., Ghibaudi, M., Sherwood, C. C. Adult neurogenesis and "immature" neurons in mammals: an evolutionary tradeoff in plasticity. Brain Struct Funct. 229 (8), 1775-1793 (2024).
  9. Paredes, M. F., Sorrells, S. F., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Brain size and limits to adult neurogenesis. J Comp Neurol. 524 (3), 646-664 (2016).
  10. Parolisi, R., Cozzi, B., Bonfanti, L. Humans and dolphins: decline and fall of adult neurogenesis. Front Neurosci. 12, 497(2018).
  11. Snyder, J. S. Recalibrating the relevance of adult neurogenesis. Trends Neurosci. 42 (3), 164-178 (2019).
  12. Bonfanti, L., Charvet, C. J. Brain plasticity in humans and model systems: advances, challenges, and future directions. Int J Mol Sci. 22 (17), 9358(2021).
  13. Duque, A., Arellano, J. I., Rakic, P. An assessment of the existence of adult neurogenesis in humans and value of its rodent models for neuropsychiatric diseases. Mol Psychiatry. 27, 377-382 (2022).
  14. Gómez-Climent, M. A., et al. A population of prenatally generated cells in the rat paleocortex maintains an immature neuronal phenotype into adulthood. Cereb Cortex. 18 (10), 2229-2240 (2008).
  15. Rotheneichner, P., et al. Cellular plasticity in the adult murine piriform cortex: continuous maturation of dormant precursors into excitatory neurons. Cereb Cortex. 28 (7), 2610-2621 (2018).
  16. Sorrells, S. F., et al. Immature excitatory neurons develop during adolescence in the human amygdala. Nat Commun. 10 (1), 2748(2019).
  17. La Rosa, C., Parolisi, R., Bonfanti, L. structural plasticity: from adult neurogenesis to immature neurons. Front Neurosci. 14, 75(2020).
  18. Bonfanti, L., Seki, T. The PSA-NCAM-positive "immature" neurons: an old discovery providing new vistas on brain structural plasticity. Cells. 10 (10), 2542(2021).
  19. Benedetti, B., Couillard-Després, S. Why would the brain need dormant neuronal precursors. Front Neurosci. 16, 877167(2022).
  20. Luzzati, F., Bonfanti, L., Fasolo, A., Peretto, P. DCX and PSA-NCAM expression identifies a population of neurons preferentially distributed in associative areas of different pallial derivatives and vertebrate species. Cereb Cortex. 19 (5), 1028-1041 (2009).
  21. Palazzo, O., La Rosa, C., Piumatti, M., Bonfanti, L. Do large brains of long-living mammals prefer non-newly generated, immature neurons. Neural Regen Res. 13 (4), 633-634 (2018).
  22. La Rosa, C., et al. Phylogenetic variation in cortical layer II immature neuron reservoir of mammals. Elife. 9, e55456(2020).
  23. Sherwood, C. C., Gómez-Robles, A. Brain plasticity and human evolution. Annu Rev Anthropol. 46, 399-419 (2017).
  24. Piumatti, M., et al. Non-newly generated, "immature" neurons in the sheep brain are not restricted to cerebral cortex. J Neurosci. 38 (4), 826-842 (2018).
  25. Pattaro, A., et al. Phylogenetic variation of layer II cortical immature neurons in dog and horse confirms covariance with brain size and neocortical surface. Brain Struct Funct. 230 (6), 115(2025).
  26. Ghibaudi, M., et al. Consistency and variation in doublecortin and Ki67 antigen detection in the brain tissue of different mammals, including humans. Int J Mol Sci. 24 (3), 2514(2023).
  27. Ben Abdallah, N. M., Slomianka, L., Vyssotski, A. L., Lipp, H. P. Early age-related changes in adult hippocampal neurogenesis in C57 mice. Neurobiol Aging. 31, 151-161 (2010).
  28. Ghibaudi, M., et al. Age-related changes in layer II immature neurons of the murine piriform cortex. Front Cell Neurosci. 17, 1205173(2023).
  29. Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
  30. Charvet, C. J., de Sousa, A. A., Vassilopoulos, T. Translating time: challenges, progress, and future directions. Brain Res Bull. 221, 111212(2025).
  31. Bartges, J., et al. AAHA canine life stage guidelines. J Am Anim Hosp Assoc. 48, 1-11 (2012).
  32. Ghibaudi, M., et al. Multispecies characterization of immature neurons in the mammalian amygdala reveals their expansion in primates. PLoS Biol. 23 (8), e3003322(2025).
  33. Ghibaudi, M., Boda, E., Bonfanti, L. From mice to humans: a need for comparable results in mammalian neuroplasticity. Neural Regen Res. 20 (2), 464-466 (2025).
  34. Smulders, T. V. The relevance of brain evolution for the biomedical sciences. Biol Lett. 5, 138-140 (2009).
  35. Keck, T. Bridging theory and experiment in (statistical) learning. Curr Opin Neurobiol. 94, 103106(2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Quantitative Cell CountingComparative NeurobiologyMammalian Brain VariationCortical Immature NeuronsBrain PlasticityNeurogenesis DifferencesBrain Size ComparisonPhylogenetic AnalysisNeurodevelopmental ProcessesCell Population Quantification

Powiązane artykuły