Artykuł metodologiczny

Obrazowanie wapnia oparte na fluorescencji w pierwotnych hodowlach nabłonka dróg oddechowych z wykorzystaniem zautomatyzowanej segmentacji komórek

DOI:

10.3791/69470

⸱

22 maja 2026

 ,  , 
1Molecular Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Physiology, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie żywymi komórkami sygnalizacji wapnia jest szeroko wykorzystywane do badania mobilizacji wapnia w stabilnych liniach komórkowych hodowanych w monowarstwach. Protokół ten opisuje obrazowanie fluorescencji żywych komórek sygnalizacji wapnia z użyciem barwników komórek żywych na złożonych, pierwotnych tkankach, a także wykorzystuje oprogramowanie uczenia maszynowego do ilościowego określania intensywności fluorescencji tysięcy pojedynczych komórek jednocześnie, co usprawnia analizy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja wapnia jest kluczowa w wielu procesach biologicznych, co wzmacnia potrzebę opracowania metod badania przepływu wapnia w tkankach pierwotnych. Badanie sygnalizacji wapnia z rozdzielczością pojedynczej komórki w złożonych hodowlach nabłonka pierwotnego jest trudne i dlatego pozostaje słabo zbadane. Niniejsze badanie przedstawia metody dostosowane do monitorowania sygnalizacji wapnia na żywo w hodowlach nabłonka dróg oddechowych oraz nowe podejścia do analiz opartych na uczeniu maszynowym. Za pomocą hodowli nabłonka pierwotnych dróg oddechowych pochodzących od pacjenta, zróżnicowanych na ALI (styku powietrze-ciecz) naładowanych zewnętrznym fluorescencyjnym barwnikiem wskaźnikowym, mobilizację wapnia mierzono z rozdzielczością pojedynczych komórek za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Opracowaliśmy nowatorskie oprogramowanie wykorzystujące segmentację komórek opartą na uczeniu maszynowym do przypisywania intensywności fluorescencji różnym komórkom w czasie. Ogólnie rzecz biorąc, dostosowany zestaw obrazowania oraz oprogramowanie umożliwiają szybkie i bezstronne podejście do analizy pojedynczych komórek w hodowlach nabłonkowych pierwotnych. Przedstawiony tutaj protokół krok po kroku umożliwi przyszłe badania wapnia w pojedynczych komórkach oraz typach komórek tworzących pierwotne hodowle nabłonkowe.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmiany w mobilizacji wapnia wewnątrzkomórkowego wywołują szeroki zakres procesów komórkowych, w tym zmiany w ekspresji genów i modulacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej 1,2. Poziom wapnia wewnątrzkomórkowy może być zmieniany poprzez uwalnianie z wewnątrzkomórkowych zapasów wapnia, takich jak siatkówka endoplazmatyczna i mitochondria 1,2,3. Zewnątrzkomórkowy napływ wapnia do przestrzeni wewnątrzkomórkowej może również zmieniać wapń cytosolowy zarówno poprzez transport pasywny, jak i aktywny2. Obrazowanie mobilizacji wapnia przez żywe komórki jest przeprowadzane głównie za pomocą barwników wewnątrzkomórkowych lub genetycznie kodowanych barwników, GCaMP (Green Calcium-activated Multimer/Protein)4. Powszechnie w literaturze są sprzężone barwniki AM (acetoksymetylo), które umożliwiają barwnikowi przenikanie błony plazmatycznej 5,6,7,8. Po wejściu do komórki część AM jest rozszczepiana przez endogenne estery wewnątrzkomórkowe, a barwnik zyskuje ładunek ujemny, który zatrzymuje go w przestrzeni cytosolowej9. Dzięki temu zyskanemu ładunku barwnik może być wypompowywany przez kanały organiczne anionów w błonie plazmatycznej. Dlatego dodaje się probenecyd, inhibitor transporterów wydzielania anionu organicznego, aby zapobiec komórkowemu wypływowi barwnika i zachować optymalny sygnał cytosolowy10,11. Badania często wykorzystują Fura-2AM, barwnik ratiometryczny, oraz Fluo-4AM, barwnik intensytometryczny, do analizy sygnalizacji wapnia na stabilnych liniach komórkowych hodowanych w monowarstwie. Badanie to wykorzystuje protokół dostosowany do obrazowania epifluorescencyjnego wielowarstwowych hodowli na granicy powietrze-ciecz, wykorzystując niedawno opracowany intensywny barwnik wapniowy Cal-520 AM, który zwiększył czułość w porównaniu do Fluo-4AM. Dlatego nadaje się do solidnej wizualizacji subtelnych sygnałów w rozdzielczości pojedynczej komórki ze złożonych hodowli nabłonka pierwotnego. Obecna literatura jest bogata w obrazowanie wapnia na żywo odpowiedzi masowych stabilnych linii komórkowych. Jednak obecnie powszechnie wiadomo, że in vivo tkanki stanowią zróżnicowany krajobraz komórkowy wspierający różne, specyficzne dla typu komórek role w utrzymaniu homeostazy tkanek 12,13,14,15. Pomimo tej powszechnej wiedzy, mechanizmy, dzięki którym różne typy komórek koordynują sygnały wapnia i regulują homeostazę jonów wapnia, pozostają nieznane. Dlatego przedstawione tutaj metody umożliwią wykrywanie sygnalizacji wapnia przez pojedyncze komórki oraz zwiększą przepustowość analiz w pierwotnych tkankach dróg oddechowych.

Wykorzystujemy nasze wcześniej opublikowane i rygorystycznie zweryfikowane modele hodowli nabłonka nosowego człowieka jako narzędzie do obrazowania żywych komórek, wapnia cytosolowego, w bardziej biologicznie istotnym modelu 16,17,18. W skrócie, komórki nabłonkowe izolowane są z szczoteczek nosowych pacjentów i hodowane na półprzepuszczalnej błonie na przełęczce, która jest zawieszona w dołku hodowlowym, aby utrzymać granicę powietrze-ciecz (ALI). Ten interfejs, w połączeniu ze specjalistycznymi ośrodkami, został rygorystycznie przetestowany za pomocą technik ortogonalnych pod kątem obecności różnych typów komórek16, 17, 18. Ponadto wykazano, że obecne metody można przełożyć na pierwotne hodowle oskrzeli hodowane podobnie jak nasze pierwotne hodowle nosowe19.

W tym artykule przedstawiono dostosowaną metodę pomiaru i analizy sygnalizacji wapnia na żywo z rozdzielczością pojedynczych komórek w tych pierwotnych hodowlach nabłonka dróg oddechowych. Te wielowarstwowe kultury trudno zobrazować za pomocą mikroskopii; Jednak obecny układ pozwala nam niezawodnie skupić się na pojedynczych warstwach w wielowarstwowych kulturach, co pozwala wykrywać mobilizację wapnia z tych konkretnych warstw. Takie rozwiązanie ma kilka zalet, ponieważ nie wymaga systemu perfuzji, który często jest kosztowny i trudny do adaptacji, jeśli nie stosuje się specjalistycznych mikroskopów. Zastosowano mikroskopię epifluorescencyjną, która zapewnia lepszą rozdzielczość czasową w porównaniu do obrazowania konfokalnego. Zastosowanie diod światłoeminetowanych (LED) minimalizuje fototoksyczność w porównaniu do systemów konfokalnych opartych na laserach. W niniejszym protokole stosuje się barwniki intensjometryczne zewnętrzne, ponieważ umożliwiają szybkie, względne zmiany wapnia w całej populacji komórek i są kompatybilne z większością zestawów mikroskopii fluorescencyjnej. Jest to korzystniejsze niż powszechne barwniki proporcjonalne, które wymagają głębokiego wzbudzenia ultrafioletowego (UV), niedostępnego w wielu mikroskopach. Ponadto GCaMP wymaga transfekcji lub transdukcji, co wzmacnia technikę bardziej ukierunkowanego obrazowania wapnia w określonych typach komórek. Ze względu na niską efektywność transdukcji i transfekcji w hodowlach nabłonka pierwotnego, technika ta słabo nadaje się do monitorowania całej populacji komórek.

Dodatkowo w tym badaniu opracowano nowe, specjalistyczne oprogramowanie oparte na uczeniu maszynowym, które umożliwia segmentację pojedynczych komórek opartą na barwieniu jądrowym na żywo. Oprogramowanie jest wtedy w stanie rejestrować wartości intensywności fluorescencji dla każdej komórki w czasie. Do optymalizacji metod początkowo stosowano stabilną linię komórkową nabłonka (Calu-3). Następnie te metody zostały przeniesione do badania mobilizacji wapnia pojedynczych komórek w pierwotnych hodowlach nabłonkowych. Zoptymalizowano takie czynniki jak stężenie barwnika wapnia i probenecydu, czas inkubacji oraz konfigurację obrazowania. Tutaj sygnalizacja wapnia jest rejestrowana z częstotliwością 0,2 klatki na sekundę, co jest odpowiednie do monitorowania sygnalizacji wapnia. Liczbę klatek na sekundę można zwiększyć, aby mierzyć szybsze przejściowe jawory wapnia20. Optymalne zmienne zostały następnie zastosowane i dodatkowo zoptymalizowane w bardziej złożonych pierwotnych hodowlach nosa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Utrzymanie i kultywacja ogniw Calu-3

  1. Utrzymuj komórki Calu-3 w kolbach T-25 w mediach hodowlowanych EMEM, uzupełnionych 20% FBS i 1% penicyliną/streptomycyną. Podgrzewaj podłoże i wymieniaj co dzień (5 mL/piersiówka).
  2. Gdy komórki są w 70% zbiegające się w kolbie, zasysaj podłoże z kolby.
  3. Przemyj kolbę 5 mL 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS).
  4. Dodaj 1 mL TrypLE bezpośrednio do komórek przez 10-15 minut w temperaturze 37 °C, 5%CO2. Upewnij się, że wszystkie komórki odłączyły się od dna kolby i zostały rozdzielone do zawiesiny pojedynczej.
  5. Zneutralizuj reakcję 4 mL świeżego medium hodowlanego (krok 1.1), a następnie dobrze wymieszaj komórki pipetą serologiczną, aby zapewnić równomierne siew.
  6. Nakładaj komórki na płytę z 96 dołkami przy łączności 90%-100% (około 40 000 komórek/dołek).
    1. Aby zasiać dołki, dodaj 200 μL/studnię dobrze wymieszanej zawiesiny komórkowej.
    2. Pozwól komórkom przykleić się do płytki z 96 dołkami przez noc.
  7. Codziennie zmieniać medium (200 μL/studnia), aż do momentu gotowości do eksperymentów.
  8. Przed przeprowadzeniem eksperymentów należy odczekać 2-5 dni po zbiegu w odwiertach na rozpoczęcie eksperymentów, aby umożliwić różnicowanie.

2. Protokół ładowania komórek Calu-3 Cal 520 AM lub Fluo-4AM

UWAGA: Fluo-4 AM i Cal-520AM są rozpuszczane w DMSO, które jest uznawane za niebezpieczne. Probenecid jest wymieniony jako zagrożenie ostre. Prosimy o noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego podczas kontaktu z chemikaliami, aby uniknąć kontaktu ze skórą. Wszystkie chemikalia utylizuj do wyznaczonych pojemników na odpady chemiczne.

  1. W dniu eksperymentu należy usunąć podłoże z odwiertów przez pipetowanie i dwukrotnie przepłukać komórki (200 μL/odwierć) w podgrzanym buforze wapniowym (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 2 mM CaCl2 oraz 10 mM Hepes, dostosowane do pH 7,38 (NaOH) 291 mOsm), aby usunąć martwe komórki.
  2. Inkubuj komórki 200 μL/studni koktajlu 3 μM Cal-520 AM, 2,5 mM probenecydu i 1:5000 barwnika jądrowego Hoechst w buforze wapniowym (krok 2.1) przez 1 godzinę w inkubatorze ustawionym na 37°C i 5%CO2.
    1. W eksperymentach Fluo-4AM inkubuj komórki z 200 μL/well koktajlu 3 μM Fluo-4AM, 2,5 mM probenecydu i 1:5000 barwnika jądrowego Hoechst w buforze wapniowym (krok 2.1) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5%CO2.
      UWAGA: Trzymaj tubki z barwnikiem w ciemności, przykrywając je folią aluminiową.
  3. Podczas inkubacji przygotuj thapsigarginę w buforze wapniowym (krok 2.1). Dostosowywanie pośrednich stężeń zapasów, aby zapewnić właściwe końcowe stężenia w odwiercie.
    UWAGA: Tutaj do 100 μL istniejącego buforu wapnia dodaje się 50 μL leku. Dlatego przygotowano zapas pośredni 3x o masie 6 μM.
  4. Po 1 godzinie zasysaj barwnik pipetowaniem i dwukrotnie spłukuj barwnik zewnątrzkomórkowy buforem wapniowym (krok 2.1) (200 μL/studnia).
  5. Po płukaniu dodaj 100 μL/dołek 2,5 mM probenecydu rozcieńczonego w buforze wapniowym (krok 2.1), aby utrzymać barwnik w przestrzeni cytoplazmatycznej.
  6. Owiń płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem. Komórki są teraz gotowe do obrazowania.

3. Przygotowanie mikroskopii dla stabilnej linii komórkowej Calu-3

  1. Używając mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw SuperFluor, stabilne, półprzewodnikowe źródło światła oraz kamerę CMOS fluorescencyjną (piksel 6,5 μm). Natężenie oświetlenia jest ustawione na 500 mW.
  2. Umieść płytkę komórek na etapie za pomocą adaptera płyty 96-dołkowej. Używając Brightfield, skup się na warstwie komórki przy niskim powiększeniu, aby znaleźć monowarstwę komórek (użyj 5-10x obiektywu powietrznego).
    UWAGA: Ten krok jest opcjonalny, ale pomocny w efektywnym zdobyciu początkowego skupienia na warstwie komórki.
  3. Gdy warstwa komórkowa zostanie zidentyfikowana, użyj Brightfield, przełącz się na większe powiększenie (20x obiektyw powietrza) i ponownie skup na warstwie komórki.
    UWAGA: Upewnij się, że odpowiednio skupisz monowarstwę za pomocą Brightfield; Granice komórek powinny być wyraźne.
  4. Zidentyfikuj sygnał barwnika wapnia za pomocą GFP (dioda LED 475 nm). Upewnij się, że moc diod LED spada między 5% a 10%, aby uniknąć fotobielenia, a czas naświetlania jest odpowiedni do wizualizacji bazowego sygnału zielonego bez przesycenia sygnału, zazwyczaj w zakresie 300-500 ms.
    UWAGA: Aby zapewnić powtarzalność, a nawet ładunek barwnika, należy jakościowo przeanalizować warstwę komórkową; Większość ogniw powinna wykazywać taką samą jasność. Skup się na polu widzenia z ograniczoną liczbą martwych komórek, które będą intensywnie fluorescencyjne zanim dodasz jakikolwiek stymulant. Względną bazową intensywność fluorescencji można zmierzyć za pomocą Fidżi (krok 7.9). Wahania fluorescencji wyjściowej między komórkami powinna wynosić około 10%-15%, jeśli barwnik został załadowany równomiernie (krok 7.9).
  5. Zidentyfikuj barwę jądrową Hoechst za pomocą diody LED DAPI (405 nm). Moc diody LED powinna wynosić się między 2%-5%, a czas ekspozycji powinien wynosić 50-100 ms.
    UWAGA: Jeśli komórki są ostre, jądra powinny mieć wyraźne kontury. Upewnij się, że sygnał jądrowy nie osiąga nasycenia, ponieważ jądra mogą zakłócać zielony kanał.

4. Pozyskiwanie na żywo wideo wapnia

  1. Rozpocznij transmisję na żywo, stosując interwał 1 klatki co 5 sekund (0,2 klatki na sekundę) przez 10 minut.
    UWAGA: Rejestruj każdy kanał fluorescencyjny (DAPI 405 nm i GFP 475 nm) w każdej klatce.
  2. Po rozpoczęciu filmu pozwól na 5-minutowy odczyt bazowy przed dodaniem agonistów.
  3. Używając pipety P200, dodaj 50 μL tapsigarginy w 3x zapasie pośrednim do studni zawierającej 100 μL 2,5 mM probenecydu w buforze wapniowym (krok 2.1). Delikatnie zawiesz 1-2 razy w dołku, aby lek był równomiernie rozprowadzony. Czytaj dalej przez 5 minut po dodaniu thapsigargin.
    UWAGA: Krok dodawania leku jest kluczowy; Końcówka pipety nie powinna stykać się z płytą, aby przesunąć płaszczyznę ostrości. Zamiast tego unieś końcówkę pipety tak, aby stykała się tylko z buforem wewnątrz studni. Jeśli leki są mieszane zbyt intensywnie, komórki mogą odłączyć się od płytki i zakłócić sygnał.
    UWAGA: Pamiętaj, aby zanotować ramę, w której lek jest dodawany, do analizy dalszej.
  4. Zapisz nagranie i migawkę sprzed eksperymentu. Przejdź do analizy danych.

5. Protokół załadunku głównych komórek dróg oddechowych Cal 520 AM lub Fluo-4AM

  1. W dniu eksperymentu usuń ośrodek bazolateralny z dołka trans i dwukrotnie przemyj wierzchołkową i bazolateralną stronę wkładki, używając 750 μL bazolateralnej oraz 300 μL wierzchołkowej buforu wapnia (krok 2.1).
  2. Inkubować komórki z 600 μL bazolateralnie oraz 200 μL wierzchołkowo barwników Cal-520 AM lub Fluo-4 AM przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5%CO2. Przygotuj barwnik w taki sam sposób jak dla komórek Calu-3, czyli Cal-520 AM, 3 μM Cal-520 AM, 2,5 mM probenecyd, oraz 1:5000 Hoechst w buforze wapniowym (krok 2.1). Dla Fluo-4 AM, 3 μM Fluo-4AM, 2,5 mM probenecyd oraz 1:5000 Hoechst w tym samym buforze wapnia.
  3. W okresie inkubacji przygotować thapsigarginę w zapasie pośrednim 3× dla końcowego stężenia 2 μM (6 μM zapasu pośredniego).
  4. Następnie zasysaj barwnik i dwukrotnie przepłucz komórki 300 μL buforem wierzchołkowym oraz 750 μL bazolateralnym buforem zawierającym wapń (krok 2.1).
  5. Po płukaniu dodaj 100 μL apical i 500 μL basolateral o stężeniu probenecidu 2,5 mM w buforze wapniowym (krok 2.1).
  6. Trzymając skrzynię dobrze w płycie, owiń ją folią. Komórki są teraz gotowe do obrazowania.

6. Przygotowanie mikroskopii dla podstawowych wkładów nosowych

  1. Zdobądź szalkę Petriego z szklanym dnem odpowiednią do obrazowania, pęsetę i cienką taśmę maskującą. Upewnij się, że szalka Petriego jest czysta, szybko przetrzyj ją 70% etanolem i pozwól jej całkowicie wyschnąć.
  2. Umieść szklaną szalkę Petriego w małym okrągłym adapterze do mikroskopu epifluorescencyjnego.
  3. Używając pęsety, ostrożnie umieść wkładkę na środku naczynia z szklanym dnem.
    UWAGA: Uważaj, aby nie rozlać bufora, który znajduje się w przedziale wierzchołkowym wkładu.
  4. Aby upewnić się, że wkład nie przesuwa się podczas dodawania leku, użyj taśmy maskującej, aby zabezpieczyć górną część plastiku wkładu do boków szklanej dolnej miseczki.
  5. Umieść adapter z wkładką przymocowaną do stołu mikroskopu i zacznij od skupienia na komórkach za pomocą obiektywu 10x air brightfield.
  6. Zidentyfikuj sygnał barwnika wapnia za pomocą diody GFP (475nm LED). Upewnij się, że moc diody LED spada między 5% a 10%, aby uniknąć fotobielenia, a czas naświetlania jest odpowiedni do wizualizacji bazowego zielonego sygnału bez nadmiernego nasycenia, zazwyczaj między 300 a 500 ms.
    UWAGA: Prosimy zapoznać się z NOTATKĄ w kroku 3.4, aby zapewnić prawidłowe załadowanie barwnika wapniowego.
  7. Zidentyfikuj barwę jądrową Hoechst za pomocą diody LED DAPI (405 nm). Moc diody LED powinna wynosić się między 2%-5%, a czas ekspozycji powinien wynosić 50-100 ms.
    UWAGA: Jeśli komórki są ostre, jądra powinny mieć wyraźne, wyraźne kontury. Skup się na najbardziej wierzchołkowej warstwie komórek. Dostosuj oś z mikroskopu, aby zidentyfikować najwyższą płaszczyznę ogniskową, na której komórki pozostają ostre. Upewnij się, że jądra nie osiągają nasycenia sygnału, ponieważ sygnał jądrowy może zakłócać zielony kanał.
  8. Aby zdobyć na żywo wideo o wapniu, należy postępować zgodnie z krokami 5.1-5.4. Podczas procesu dodawania leku dodaj go do środka wkładu i powoli zawieszaj za pomocą pipety P200.
    UWAGA: Pamiętaj, aby zanotować ramę, w której lek jest dodawany, do analizy dalszej.

7. Analiza z wykorzystaniem oprogramowania Fiji

  1. Otwórz aplikację Fiji i wybierz File \ Otwórz, prześlij plik wideo i w wyskakującym oknie zachowuj wszystkie domyślne ustawienia.
  2. Jeśli chcesz, w sekcji Obraz \ Reguluj \ Jasność/Kontrast zmień jasność i kontrast poszczególnych kanałów fluorescencyjnych, aby uzyskać najbardziej optymalny widok komórek.
  3. Aby ułatwić śledzenie komórek, połącz kanały barwy jądrowej lub jasnego pola za pomocą kanałów Obraz \ Kolor \ Połączenie i wybierz odpowiednie pliki dla każdego kanału w wyskakującym okienku.
  4. Aby śledzić konkretne komórki na podstawie granic komórek i barwienia jądrowego, użyj Analyze \ Tools \ ROI Manager i zaznacz zarówno show all, jak i etykiety w wyskakującym okienku.
  5. Ostrożnie odrysuj komórki za pomocą narzędzia wolnoręczne wybory i naciśnij t, aby dodać komórkę.
    UWAGA: Upewnij się, że komórki są przerysowane we wszystkich 4 rogach oraz w centrum filmu.
  6. Gdy wszystkie komórki zostaną dokładnie prześledzone, w otwartej zakładce ze wszystkimi zwrotami z inwestycji kliknij Więcej \ Mierz i naciśnij OK na wyskakującym okienku.
  7. Skopiuj cały arkusz w wyskakującym okienku zatytułowanym Wyniki do pliku Excel.
    UWAGA: Powstały arkusz będzie miał 6 podnagłówków (Area1, Mean1, Min1, Max1, IntDen1, RawIntDen1) dla każdego ROI, z wartością liczbową po każdej, która odpowiada odpowiedniej komórce, która została prześledzona. Ważną wartością dla analizy dalszej będzie średnia każdego ROI.
  8. Aby monitorować zmienność między intensywnością fluorescencji, oblicz średnią fluorescencję podczas pomiaru wyjściowego dla każdej komórki oraz wylicz procentową wariancję. Eksperymenty zazwyczaj mają wariancję od 20%-30%.
    figure-protocol-1
  9. Normalizuj wszystkie odczyty, dzieląc wartości średniej intensywności przez pierwszy odczyt wartości bazowej dla każdej z śledzonych komórek.
  10. Utworz dodatkową kolumnę dla czasu w sekundach, przy czym pierwsza klatka odpowiada klatce 0, a kolejne punkty czasowe zwiększają się o 5, co odpowiada interwałowi 0,2 fps.
  11. Skopiuj dane do oprogramowania do analizy i wykresów oraz wygeneruj krzywą zmian fluorescencji względem wartości wyjściowej w czasie.
    UWAGA: Aby wygenerować wykresy maksymalnych pojedynczych komórek, użyj funkcji =MAX() w Excelu, aby znaleźć ramkę, przy której osiąga się maksymalną intensywność fluorescencji dla każdej komórki i wyrenderuj za pomocą GraphPad Prism.

8. Analiza z użyciem Pakietu Wapnia

  1. Korzystając z Fiji, otwórz plik wideo i postępuj zgodnie z krokami 8.1 i 8.2.
  2. Gdy kanały nuklearne i zielone są zoptymalizowane do oglądania, zdubluj pojedynczą klatkę wideo, klikając na Obraz \ Duplikacja. W wyskakującym okienku odznacz Duplicate Hyper stack. W tym samym okienku, w kanałach, wpisz 1. Zapisz to jako plik obrazu PNG.
  3. Powtórz krok 9.2 i kanały poniżej, wpisz 2.
    Połącz oba obrazy, podążając za krokiem 8.3. Prześlij obraz do interfejsu graficznego (Cell-Pose GUI), aby wygenerować maskę komórki.
  4. Prześlij obraz do interfejsu GUI Cell-pose i segmentuj za pomocą barwnika jądrowego (Kanał 1) oraz barwników cytoplazmatycznych (Kanał 2), wybierając model Cyto3.
  5. Zapisz obraz jako plik PNG, następnie otwórz plik PNG na Fidżi i przekonwertuj go na plik TIFF.
    UWAGA: Interfejs GUI do pozycji komórki generuje czarno-biały plik PNG.
  6. Otwórz zarówno plik maski, jak i pliku wideo w Calcium Suite, przeciągając i upuszczając, a następnie kliknij Analizuj dane , aby wygenerować wykres do pobrania oraz plik .csv do pobrania zawierający znormalizowane i surowe wartości intensywności dla wszystkich komórek liczonych przez oprogramowanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zmierzyć mobilizację wapnia w komórkach żywych, komórki Calu-3 lub zróżnicowane pierwotne hodowle nosa są inkubowane barwnikiem wewnątrzkomórkowym. Względna zmiana sygnału zależnego od wapnia mierzona jest jako wzrost mobilizacji wapnia zarówno z wewnątrzkomórkowych zapasów wapnia, jak i z przestrzeni zewnątrzkomórkowej do cytosolu. Utrzymujący się wzrost wapnia do cytosolu reprezentowany jest wzrostem fluorescencji po dodaniu thapsigarginu, dobrze scharakteryzowanego nieodwracalnego inhibitora białka SERCA (Sarco/En...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono metody analizy sygnalizacji wapnia pojedynczej komórki w żywych pierwotnych hodowlach nosa i oskrzeli oraz stabilnej linii komórkowej nabłonka. Zarówno raporty wapnia Cal-520 AM, jak i Fluo-4AM są przydatnymi wskaźnikami wapnia w obu konfiguracjach. Cal-520 AM jest bardziej czuły, ponieważ ma wyższą wydajność kwantową 0,75 w porównaniu do Fluo-4AM (0,16) oraz nieco wyższą afinitet do wapnia (Kd Cal-520 AM wynosi 320 nM, a Fluo-4 AM 345 nM). Ponadto Cal-520 AM wykazuje poprawę retencji komórkowej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Tarini Gunawardenie za pomoc w hodowli pierwotnej tkanki nosowej. A także Wu Shu z Uniwersytetu Iowa za hojne hodowanie i wysyłkę pierwotnych oskrzeli kulturowych. A także Gabrielle Langeveld i Dian Liu za pomoc w analizie i projektowaniu adapterów obrazujących. Chcielibyśmy również podziękować Ośrodku Obrazowania w Szpitalu dla Chorych Dzieci. Dziękujemy również za wsparcie finansowe od Cystic Fibrosis Canada oraz US Cystic Fibrosis Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowa płyta Thermofisher  142475
wkłady z 24 otworami przetworniowymi Corning  CLS3470-48EA
96-dołkowe mikropłyty z czarnego polistyrenu TC z obróbką Flat Clear BottomCorning  3603
Cal-520 AMAAT Bioquest 21130Alikotowany i przechowywany w temperaturze -20 stopni; C, rozpuszczony w DMSO
Oprogramowanie Calcium SuiteKod można zamówić, kontaktując się z naszą grupą laboratoryjną
EMEM, 1xsWisent 320-005-CLPrzechowywany w temperaturze 4 stopni; C 
Serum bydlęce płodowe (Embone Serum );Wisent 080-450Alikotowany i przechowywany w temperaturze -20 stopni; C
Fluo-4 AM AAT Bioquest 20550Alikotowany i przechowywany w temperaturze -20 stopni; C, rozpuszczony w DMSO
HEPESBioshopHEP001.5Przechowywane w temperaturze pokojowej
Hoechst Thermofisher  H3570Przechowywany w temperaturze 4 stopni; C 
Linia komórkowa nabłonka jelita grubego i raka jelita grubego (linia komórkowa)ATCCHTB-55
Chlorek magnezu  Sigma 7786-30-3Przechowywane w temperaturze pokojowej
Mikro-antena 35mm, niskie szklane dnoIbidi 80137Przechowywane w temperaturze pokojowej 
Roztwór penicylina i streptomycynaWisent 450-200-ELPrzechowywany w temperaturze 4 stopni; C
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)Wisent 3111-010-CLPrzechowywane w temperaturze pokojowej 
Chlorek potasu  Sigma 7447-40-7Przechowywane w temperaturze pokojowej 
Probenecid ThermofisherP36400Alikotowany i przechowywany w temperaturze -20 stopni; C , rozpuszczalny w wodzie  
Chlorek sodu Bioshop SOD004Przechowywane w temperaturze pokojowej 
Thapsigargin ThermofisherT7458Alikotowany i przechowywany w temperaturze -20 stopni; C Rozwiązany w DMSO 
Enzym TripLE Express (1X), fenol red Thermofisher12605010Przechowywany w temperaturze 4 stopni; C

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).
  2. Jairaman, A., Prakriya, M. Calcium signaling in airway epithelial cells: Current understanding and implications for inflammatory airway disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (4), 772-783 (2024).
  3. Sammels, E., Parys, J. B., Missiaen, L., De Smedt, H., Bultynck, G. Intracellular Ca2+ storage in health and disease: a dynamic equilibrium. Cell Calcium. 47 (4), 297-314 (2010).
  4. Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), e1796(2008).
  5. Ren, C., et al. Melatonin protects RPE cells from necroptosis and NLRP3 activation via promoting SERCA2-related intracellular Ca2+ homeostasis. Phytomedicine. 135, 156088(2024).
  6. Dwivedi, R., et al. The TMEM16A blockers benzbromarone and MONNA cause intracellular Ca2+ release in mouse bronchial smooth muscle cells. Eur J Pharmacol. 947, 175677(2023).
  7. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, e1067(2009).
  8. Hirst, R. A., Harrison, C., Hirota, K., Lambert, D. G. Measurement of [Ca2+]i in whole cell suspensions using fura-2. Methods Mol Biol. 114, 31-39 (1999).
  9. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  10. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Swanson, J. A., Silverstein, S. C. Fura-2 secretion and sequestration in macrophages. A blocker of organic anion transport reveals that these processes occur via a membrane transport system for organic anions. J Immunol. 140 (3), 915-920 (1988).
  11. Liao, J., et al. A novel Ca2+ indicator for long-term tracking of intracellular calcium flux. BioTechniques. 70 (5), 271-277 (2021).
  12. Kageyama, T., Ito, T., Tanaka, S., Nakajima, H. Physiological and immunological barriers in the lung. Semin Immunopathol. 45 (4), 533-547 (2024).
  13. Quach, H., et al. Early human fetal lung atlas reveals the temporal dynamics of epithelial cell plasticity. Nat Commun. 15 (1), 5898(2024).
  14. Deprez, M., et al. A single-cell atlas of the human healthy airways. Am J Respir Crit Care Med. 202 (12), 1636-1645 (2020).
  15. Prescott, R. A., et al. A comparative study of in vitro air-liquid interface culture models of the human airway epithelium evaluating cellular heterogeneity and gene expression at single cell resolution. Respir Res. 24 (1), 213(2023).
  16. Gunawardena, T. N. A., et al. Correlation of electrophysiological and fluorescence-based measurements of modulator efficacy in nasal epithelial cultures derived from people with cystic fibrosis. Cells. 12 (8), 1174(2023).
  17. Laselva, O., et al. Functional rescue of c.3846G>A (W1282X) in patient-derived nasal cultures achieved by inhibition of nonsense-mediated decay and protein modulators with complementary mechanisms of action. J Cyst Fibros. 19 (5), 717-727 (2020).
  18. Terrance, M., et al. Primary human nasal epithelial cell culture. Methods Mol Biol. 2725, 213-223 (2024).
  19. Karp, P. H., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 115, 115-137 (2002).
  20. Perniss, A., et al. A succinate/SUCNR1-brush cell defense program in the tracheal epithelium. Sci Adv. 9 (31), eadg8842(2023).
  21. Sehgal, P., et al. Inhibition of the sarco/endoplasmic reticulum (ER) Ca2+-ATPase by thapsigargin analogs induces cell death via ER Ca2+ depletion and the unfolded protein response. J Biol Chem. 292 (48), 19656-19673 (2017).
  22. Cal 520® AM. , AAT Bioquest Inc. https://www.aatbio.com/products/cal-520-am (2025).
  23. Fluo 4® AM. , AAT Bioquest Inc. https://www.aatbio.com/products/fluo-4-am?unit=20552 (2025).
  24. Zaderer, V., Hermann, M., Lass-Flörl, C., Posch, W., Wilflingseder, D. Turning the world upside-down in cellulose for improved culturing and imaging of respiratory challenges within a human 3D model. Cells. 8 (10), 1292(2019).
  25. Becker, M. E., et al. Live imaging of airway epithelium reveals that mucociliary clearance modulates SARS-CoV-2 spread. Nat Commun. 15 (1), 9480(2024).
  26. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia fluorescencyjnasygnalizacja wapniowaanaliza z wykorzystaniem uczenia maszynowegorozdzielczo pojedynczych kom rekstymulacja tapsygarginfluorescencyjny barwnik wska nikowygenerowanie maski kom rkowej

Powiązane artykuły