Artykuł metodologiczny

Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

330 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69483

⸱

13 lutego 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Condensed Matter, Applied Physics and Nanoscience, Brazilian Center for Research in Physics, 3Alberto Luiz Coimbra Institute for Graduate Studies and Research in Engineering (COPPE), Federal University of Rio de Janeiro, 4Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM)

W tym artykule

Podsumowanie

Proponujemy protokół oceny regeneracji kości na różnych poziomach hierarchicznych. To podejście multimodalne umożliwia analizę strukturalną na różnych skalach długości, skutecznie rozwiązując wyzwania związane z przygotowaniem próbek. Zapewnia również wiarygodny sposób oceny skuteczności biomateriałów w wspieraniu regeneracji kości.

Streszczenie

Kliniczny sukces implantu w dużej mierze zależy od jego zdolności do wspierania naprawy kości i ułatwiania osteointegracji. Chociaż poczyniono znaczące postępy w projektowaniu nowych rusztowań, dokładna ocena skuteczności implantów na różnych skalach długości kości nie została wystarczająco zbadana. Kość to hierarchicznie zorganizowana tkanka, o złożonej strukturze, obejmującej od organizacji włókien kolagenowych i ich mineralizacji na nanometrach i mikrometrach po makroskopowy układ kości zwartej i gębczastej. Ta hierarchiczna organizacja jest kluczowa dla zapewnienia funkcji kości i sprawności mechanicznej. W tym kontekście kompleksowa ocena wpływu biomateriałów na naprawę kości na wielu skalach długości jest niezbędna do oceny skuteczności i bezpieczeństwa wszczepionych materiałów. Jednak przygotowanie próbek do zintegrowanych analiz multimodalnych stanowi wyzwanie techniczne. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół mający na celu ocenę regeneracji kości na różnych poziomach hierarchicznych oraz analizę interfejsu między nowo powstałą kością a wszczepionym rusztowaniem. Takie podejście stanowi solidną metodę oceny skuteczności rusztowań w indukowaniu naprawy kości. Połączenie wybranych technik obrazowania 3D i 2D jest kluczowe dla właściwej oceny złożonej tkanki mineralizowanej powstającej podczas procesu gojenia kości

Wprowadzenie

Kość to złożona, hierarchicznie zorganizowana tkanka 1,2. Zrozumienie jej struktury jest kluczowe dla rozstrzygnięcia fundamentalnych pytań dotyczących tego, jak komórki przyczyniają się do architektury tkanek oraz jak zmiany strukturalne wpływają na funkcje mechaniczne3. W tym kontekście remodelacja kości po urazie pozostaje centralnym tematem badań. Gojenje złamań to złożony, wieloetapowy proces, rozpoczynający się od początkowej reakcji zapalnej, następnie angiogenezy i różnicowania komórek progenitorowych na chondrocyty i osteoblasty 4,5. Wiele debat toczyło się na temat roli biomateriałów w stymulacji osteointegracji, szczególnie na temat biokompatybilności i ich zdolności do zapobiegania enkapsulacji włóknistej6.

Powszechnie stosowaną metodą oceny osteointegracji stymulowanej biomateriałem jest mikroskopia optyczna, która umożliwia zarówno analizy histologiczne ilościowe, jak i jakościowe. To podejście okazało się wiarygodnym i skutecznym sposobem oceny skuteczności implantów kostnych 7,8. Niemniej jednak, kilku zagadnień związanych z hierarchiczną organizacją kości nie może być zbadanych za pomocą jednej metody obrazowania3, szczególnie histologicznej, która jest przynajmniej częściowo ograniczona przez ograniczenie powiększenia metody.

Postępy w obrazowaniu trójwymiarowym okazały się niezbędne do zrozumienia hierarchicznej organizacji kości. Techniki takie jak tomografia mikrokomputerowa (microCT; promieniowanie synchrotronowe lub konwencjonalne laboratoryjne źródła rentgenowskie) 9,10,11, podwójna skaningowa mikroskopia elektronowa (FIB-SEM) związana z tomografią slice-and-view 12,13,14 oraz transmisyjną tomografia elektronowa15,16 dostarczyły nowych informacji o architekturze kości w wielu łuski.

Na podstawie różnych podejść do obrazowania 3D zaproponowano model hierarchicznej organizacji kości, który początkowo zidentyfikował dziewięć odrębnych poziomów struktury kości1. Ten schemat został niedawno zrewidowany i rozszerzony o około 12 poziomów hierarchicznych, służąc jako cenne źródło do badania relacji między strukturą a funkcją tkanki kostnej 2,17. Co ważne, proponowany model hierarchiczny stanowi podstawę do oceny skuteczności naprawy kości po urazie. Ocena, czy zregenerowana tkanka kostna odtwarza rodzimą strukturę hierarchiczną, jest kluczowym standardem przy ocenie jakości gojenia kości, szczególnie gdy w uszkodzonym miejscu stosuje się biomateriały.

Chociaż omówiono wykorzystanie wielu technik obrazowania do badania organizacji kości 6,7,18,19,20, niewiele zostało zbadane na temat workflow integrującego różne metody obrazowania w celu oceny organizacji minerałów kości na wielu skalach przestrzennych. Jak wspomniano, kość to złożona tkanka kompozytowa, składająca się z fazy organicznej (komórek, kolagenu i makrocząsteczek) oraz zmineralizowanej macierzycy. Z perspektywy przygotowania próbki ta złożoność wiąże się z wyzwaniami technicznymi dotyczącymi przenikania rozpuszczalnika przez próbkę, przekroju twardego preparatu oraz integracji różnych strategii obrazowania na tej samej próbce.

Kluczową innowacją w tych pracach jest ustanowienie powtarzalnego, korelacyjnego i wieloskalowego workflow obrazowania wykorzystującego obrazowanie trójwymiarowe oraz techniki komplementarne. Jak pokazano na rysunku 1A, workflow został zaprojektowany tak, aby ta sama próbka mogła być sekwencyjnie badana przy użyciu różnych metod obrazowania. Ponieważ niektóre z tych technik są destrukcyjne lub wymagają cięcia na części, proces pracy podąża za kolejnością zaczynającą się od metod niedestrukcyjnych, a następnie przechodząc do metod obejmujących cięcie lub usuwanie materiałów.

Ten proces przygotowania i analizy próbek jest szeroko stosowany do próbek twardych lub zmineralizowanych, w tym kości korowej i trabekularnej, rusztowań przedimplantacyjnych oraz oceny interfejsu kość i biomateriał po implantacji. Łącząc metody obrazowania obejmujące różne pola widzenia i zakresy rozdzielczości (Rysunek 1B), workflow umożliwia analizę próbek od skali centymetrowej aż po mikrometrową i nanometrową. Chociaż sekwencja jest zoptymalizowana do wspierania analizy korelacyjnej pojedynczej próbki, każda technika może być również stosowana niezależnie zgodnie z celem eksperymentalnym. Takie podejście umożliwia szczegółową ocenę osteointegracji biomateriałów oraz ocenę regenerowanego wzrostu kości w obszarze gojenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wyniki przedstawione w tym protokole zostały uzyskane na podstawie eksperymentalnej procedury przeprowadzonej w poprzednim badaniu21. Wszystkie procedury były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi etycznymi Komitetu Etycznego ds. Użycia i Opieki nad Zwierzętami Doświadczalnymi na Uniwersytecie Federalnym Fluminense w Brazylii (CEUA/UFF: 779). Krótko mówiąc, 20 samców szczurów Wistar ważących od 300 do 400 g zostało losowo przydzielonych do dwóch grup: implantacji z mikrosferą szmatem i cHA. Wszystkie zwierzęta przeszły operację, podczas której powstał defekt 2 mm w rozdziale piszczeli. Grupa Sham służyła jako kontrola zakrzepów do oceny regeneracji kości w niekrytycznym wadze, podczas gdy grupa eksperymentalna otrzymała mikrosfery CHA37 wszczepione w miejsce defektu. Po 7 i 21 dniach zwierzęta zostały uśpione przedawkowaniem znieczulenia ogólnego, a z każdej grupy i punktu czasowego (7 i 21 dni) pobrano bloki kości piszczelowej. Jakość kości oraz zakres nowo powstałej kości oceniono za pomocą mikroskopii optycznej i mikrokomputerowej komputerowej komputerów.

1. Utrwalanie próbek i osadzanie żywicy

  1. Bezpośrednio po eutanazji usuń piszczelę zawierającą wszczepiony biomateriał i przenieś ją do fiolki zawierającej roztwór utrwalacza Karnovsky'ego (2,5% glutaraldehyd, 4% formaldehyd w buforze kakodylatu 0,1 M). Przechowuj próbkę w temperaturze -4 °C przez co najmniej jeden dzień.
    UWAGA: Przygotuj i obsługuj utrwalacz pod okapem oparowym, aby zapobiec narażeniu na lotne substancje. Cały kontakt z chemikaliami musi być wykonywany przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE), a dodatkowe środki bezpieczeństwa technicznego powinny być wdrażane w razie potrzeby.
  2. Przenieś próbkę z utrwalacza do fiolki zawierającej 0,1 m buforu kakodylatu. Trzymaj próbkę delikatnie obracając, zmieniając bufor 2 razy co 10 minut. Na tym etapie przycinaj krawędzie próbki małą piłą, aby ułatwić infiltrację żywicy. Podczas cięcia próbki utrzymuj ją mokrą w buforze kakodylatowym o pojemności 0,1 M, aby zapobiec jej wysychaniu.
    UWAGA: Zawsze trzymaj próbkę w objętości buforowej co najmniej 2x większej niż objętość próbki. Należy stosować to dla wszystkich roztworów i żywicy stosowanych w tym protokole. Podczas obsługi wymienionych wcześniej komponentów chemicznych pracuj w okapie i noś odpowiednie środki ochrony osobistej. Zbieraj roztwór utrwalający i kakodylatuj odpady buforowe w wyraźnie oznakowanych, chemicznie kompatybilnych pojemnikach z odpowiednio dopasowanymi kapslami. Przestrzeganie instytucjonalnych Standardowych Procedur Operacyjnych (SOP) w celu bezpiecznego magazynowania i utylizacji niebezpiecznych odpadów chemicznych.
  3. Rozpocznij proces odwodnienia, stosując rosnące stężenia acetonu (10%, 30%, 50%, 70%, 90% i 100%). Trzymaj próbkę w obrócie przez 30 minut przy każdym stężeniu. Powtórz krok z acetonem 100% bezwodnym 3 razy.
    UWAGA: Podczas obsługi acetonu pracuj w okapie i zakładaj odpowiednie środki ochrony osobistej. Po użyciu zbieraj wszelkie pozostałości rozpuszczalnika w wyraźnie oznakowanych, chemicznie kompatybilnych pojemnikach na odpady z odpowiednio dopasowanymi kapslami. Przestrzegaj instytucjonalnych standardów operacyjnych dotyczących bezpiecznego przechowywania i utylizacji niebezpiecznych odpadów chemicznych.
  4. Infiltruj żywicą ostrogową, przechodząc próbkę przez serię stopniowych stosunków acetonu do żywicy: 2:1, 1:1, 1:2, a ostatecznie czysta żywica. Każdy etap powinien trwać 12 godzin i być wykonywany w temperaturze pokojowej. Po stopniowej infiltracji acetonu na żywicę wymień żywicę 2 razy. Na koniec przenosi próbkę do formy zawierającej czystą żywicę i polimeryzuje ją w temperaturze 70 °C przez 24 godziny.
    UWAGA: Żywica została przygotowana zgodnie z kartą katalogową, aby osiągnąć średnią twardość. Podczas pracy z żywicą ostrogową pracuj w okapie i używaj odpowiedniej ochrony osobistej. Po użyciu należy zebrać wszelkie pozostałości w wyraźnie oznakowanych, chemicznie kompatybilnych pojemnikach na odpady z odpowiednio dopasowanymi korekciami. Przestrzegaj instytucjonalnych standardów operacyjnych dotyczących bezpiecznego przechowywania i utylizacji niebezpiecznych odpadów chemicznych.

2. Wizualizacja próbek za pomocą mikrokomputerowej tomografii rentgenowskiej (microCT)

UWAGA: mikroCT służy do oceny położenia implantu i regeneracji kości. Pomaga także zidentyfikować potencjalne obszary zainteresowania do dalszej analizy. Ten krok należy wykonać z próbką osadzoną w żywicy.

  1. Wykorzystaj uchwyt na próbkę dostarczony przez producenta jako bazę, aby upewnić się, że próbka jest dobrze umieszczona, aby zapobiec ruchowi podczas skanowania. Do podparcia używaj materiałów o niskiej gęstości, takich jak polistyren, gaza czy rurki do mikrowirówki.
  2. Wizualizuj za pomocą następujących optymalnych parametrów skanowania: napięcie/prąd lampy = 60 kV/133 mA; kątowy krok = 0,33°; uśrednianie ram = 5; rozmiar woksela = 5 μm; tryb obrotu = 180°. W przypadku próbek zawierających implanty metalowe należy stosować obrót o 360° oraz filtr aluminiowy o średnicy 0,5 mm.
    UWAGA: Podczas regeneracji kości grubość tkanej kości przypominającej trabekularne zazwyczaj mieści się w granicach rozdzielczości konwencjonalnego obrazowania mikroCT. Aby dokładnie określić konwencjonalne parametry morfometryczne kości traweklarnej, takie jak grubość traweklarna, rozdzielenie i liczba, zaleca się stosowanie najmniejszego rozmiaru woksela (5 μm, zgodnie z określeniem). Jeśli Obszar Zainteresowania (ROI) przekracza pole widzenia (FOV) przy tej nominalnej rozdzielczości, najpierw użyj funkcji multiscan, aby pokryć ROI. Rozważ zwiększenie rozmiaru woksela tylko jako ostateczność, jeśli zwrot z inwestycji nie może zostać zarejestrowany przez multiscan.
  3. Po skanowaniu surowe dane akwizycyjne składają się z serii ponumerowanych plików obrazowych. Przeprowadz rekonstrukcję przy użyciu oprogramowania dostarczonego przez producenta, ze szczególnym uwzględnieniem minimalizacji artefaktów w obszarze zainteresowania próbką.
    UWAGA: Często spotyka się artefakty obrazów wzdłuż krawędzi obrazów, szczególnie w miejscach, które nie będą analizowane. Ostateczny wolumen można przyciąć za pomocą oprogramowania producenta, aby wyeliminować te obszary.
  4. Przeanalizuj zrekonstruowany tom, korzystając z różnych opcji oprogramowania do wizualizacji 3D, takich jak Avizo, VGStudio Max, CTVox i Dragonfly22. Stosuj cyfrowe filtry obrazów, aby usunąć artefakty. W tym przypadku należy użyć metody nielokalnych środków do usuwania szłomu19.
    UWAGA: Wartości wygładzania filtrów nielokalnych oznaczających usuwanie szumów powinny być jak najniższe, aby nie przeszkadzać w ważnych szczegółach interfejsu.

3. Przygotowanie próbek do mikroskopii optycznej

  1. Wybierz kierunek przekroju próbki zgodnie z celem eksperymentalnym. Piszczeń może być przecięta poprzecznie lub podłużnie wzdłuż długiej osi kości. Użyj przekroju poprzecznego, aby uzyskać przekroje seryjne pokrywające cały objętość defektów. Przecięcie podłużne jest odpowiednie do oceny regeneracji kości wzdłuż osi wzdłuż. Jednak to podejście dostarcza tylko jednej sekcji wady.
    1. Użyj niskoobrotowego tarczy diamentowej do pokrojonowania próbki na plastry o grubości 1 mm, zgodnie ze strategią eksperymentalną.
      UWAGA: Zaleca się używanie tarczy diamentowej o grubości od 0,006 do 0,012 cala. Cieńsze ostrza umożliwiają bardzo precyzyjne cięcia, przy minimalnej utracie materiału spowodowanej grubością ostrza.
    2. Napełnij zbiornik cieczy do poziomu, aż poziom cieczy zakryje dolną krawędź łopatki.
      UWAGA: Woda destylowana nadaje się do pobierania próbek kości. Jednak jeśli przewiduje się nadmierne nagrzewanie, na przykład przy próbkach zawierających metalowe implanty, użyj oleju dostarczonego przez producenta sprzętu do napełnienia zbiornika.
    3. Przymocuj próbkę do uchwytu na próbkę i przymocuj ją do ramienia instrumentu. Upewnij się, że próbka jest stabilna i leży poziomo względem powierzchni dysku. Użyj pokręteł pozycjonowania, aby dostosować obszar wycięcia próbki do dysku.
    4. Rozpocznij cięcie próbki przy wyższych ustawieniach prędkości (210 - 250 obr./min) i stosuj niskie ciśnienie, aż na próbce powstanie wgłębienie. Następnie zmniejsz prędkość (do 93 - 124 obr./min), aby zakończyć przekrojowanie płynnie i zapobiec nadmiernym drganiom.
    5. Zatrzymaj piłę natychmiast po zakończeniu cięcia. Prawidłowo dostosuj system, aby cięcie ustało zaraz po odłączeniu próbki od oryginalnego bloku.
  2. Zbadaj próbkę za pomocą stereomikroskopu. Zacznij od niskiego powiększenia (np. 5x-10x), aby obejrzeć cały preparat, a następnie zwiększ powiększenie (np. 20x-40x), aby wybrać obszar zainteresowania zgodnie z pytaniem naukowym. Dokładny zakres powiększenia może się różnić w zależności od używanego urządzenia. W tej pracy wybrano obszary o większej gęstości interfejsów między nowo powstałą kością a biomateriałem do dalszej analizy.
  3. Montaż próbek do rozrzedzania
    1. Zamontuj próbkę na podpórce, aby ułatwić prawidłowe obsługiwanie podczas polerowania. Jeśli próbka jest przeznaczona wyłącznie do analizy mikroskopii optycznej, należy ją bezpośrednio przymocować do plastikowej pokrywki za pomocą superglue na wcześniej wypolerowanej stronie.
      UWAGA: Plastikowe szkiełki są zalecane ze względu na lepszą przyczepność. Można także używać szkiełek szklanych (po dokładnym umyciu neutralnym mydłem). Jednak szkiełki szklane zwiększają ryzyko odklejania próbki podczas polerowania.
    2. Dla próbek, które będą dalej analizowane metodą korelacji, montuj na dwuczęściowej aluminiowej rurce. W ramach tego protokołu opracowano domowej roboty aluminiową rurę, składającą się z wewnętrznego cylindra stałego o średnicy 2,5 cm oraz zewnętrznego pustego cylindra, który zapewnia mechaniczne wsparcie podczas polerowania. Próbka jest przymocowana do wewnętrznego stałego cylindra.
    3. Umieść wewnętrzny aluminiowy cylinder na gorącej płycie i podgrzej go do temperatury odpowiedniej do topienia wosku (zazwyczaj około 60-70 °C, w zależności od rodzaju użytego wosku).
      UWAGA: Wosk pszczeli również jest odpowiedni. Podczas pracy z woskiem montującym pracuj w okapie i noś odpowiednie środki ochrony osobistej. Po użyciu zbieraj resztki w wyraźnie oznakowanych, chemicznie kompatybilnych pojemnikach na odpady z odpowiednio dopasowanymi korekami. Przestrzegaj instytucjonalnych standardów operacyjnych dotyczących bezpiecznego przechowywania i utylizacji niebezpiecznych odpadów chemicznych.
    4. Nałóż niewielką ilość wosku na powierzchnię cylindra i pozwól mu całkowicie się rozpuścić.
    5. Po stopieniu należy położyć próbkę z powierzchnią zainteresowania na powierzchni pokrytej woskiem i delikatnie ją dociskać, aby zapewnić pełny kontakt.
      UWAGA: Powierzchnia zainteresowania powinna być skierowana do powierzchni cylindra, tak aby przecieńczanie było przeprowadzane po przeciwnej stronie. Unikaj nadmiernego używania wosku, ponieważ może to prowadzić do nierównego montażu i wpływać na jakość polerowania.
    6. Usuń cylinder z płyty grzewcza i pozwól wosku zastygnąć w temperaturze pokojowej.
  4. Monitorowanie grubości próbki podczas polerowania
    1. Aby monitorować grubość próbki podczas procesu polerowania, stosuj mikroskopię odbiciową przy niskim i średnim powiększeniu (np. 10x-20x). Diagram ilustrujący kalibrację mikroskopu oraz pomiar grubości próbki przedstawiono na Rysunku 2.
    2. Kalibruj oś Z mikroskopu za pomocą standardowego pokrywaka, który zazwyczaj ma około 150 μm grubości. Oznacz jedną stronę pokrywki czerwonym permanentnym markerem, a sąsiednią część po przeciwnej stronie niebieskim markerem. Zamontuj pokrywkę na szklanym szkiełku.
    3. Używając precyzyjnego pokrętła ostrości i skali mikrometrycznej, najpierw skup się na dolnej powierzchni pokrywy, a następnie na górnej powierzchni.
    4. Zapisz wartość przemieszczenia Z. Ta wartość odpowiada grubości pokrywy (około 150 μm) i służy jako punkt odniesienia.
    5. Podczas polerowania próbki okresowo stosuj kalibrację osi Z, aby oszacować grubość próbki bez wyjmowania jej z aluminiowego cylindra.
      UWAGA: Ta technika pozwala na szybkie i nieniszczące oszacowanie grubości podczas polerowania. Alternatywnie próbkę można wyjąć z uchwytu i zmierzyć cyfrową zaciskiem lub mikrometrem.
  5. Przecieńczanie i polerowanie
    1. Rozpocznij grube i średnie polerowanie za pomocą papieru ściernego o rozmiarach 1200, 2500 i 4100. Celem tego etapu jest zmniejszenie grubości próbki do około 0,15 mm przy jednoczesnym usunięciu istotnych nierówności powierzchni.
    2. Zacznij od papieru ściernego o ziarnistości 1200, potem przejdź do 2500. Podczas tego procesu zastosuj lekki nacisk. Okresowo monitoruj grubość próbki za pomocą mikroskopii odbiciowej podczas polerowania.
    3. Po uzyskaniu pożądanej grubości poleruj obie strony próbki papierem ściernym o ziarnistości 4100. Polerowanie można wykonywać ręcznie lub za pomocą półautomatycznej maszyny polerskiej ustawionej na niską prędkość obrotową. Dokładnie czyść próbkę wodą destylowaną podczas każdego etapu polerowania.
      UWAGA: Utrzymywanie próbek i papierów ściernych w wilgotności podczas polerowania pomaga zmniejszyć temperaturę i zapobiega zanieczyszczeniu powierzchni przez bardziej szorstkie papiery ścierne.
    4. Do końcowego polerowania nałóż niewielką ilość pasty diamentowej (np. 6 μm lub 3 μm) na filcową tkaninę polerską zamontowaną na tarczy polerskiej. Wybierz rozmiar cząstek pasty diamentowej zgodnie z chropowatością powierzchni próbki.
      UWAGA: Pasta o grubości 6 μm nadaje się do wstępnego drobnego polerowania, natomiast do końcowego polerowania lustra zaleca się pastę o grubości 3 μm. Gdy to możliwe, stosowanie obu past po kolei daje najlepsze rezultaty. Niemniej jednak, satysfakcjonujące polerowanie można osiągnąć wyłącznie przy użyciu pasty o grubości 6 μm.
    5. Delikatnie poleruj obie strony próbki z minimalnym naciskiem. Użyj sprężonego powietrza lub bawełny do wysuszenia wypolerowanej powierzchni próbki przed badaniami mikroskopowymi.
    6. Aby odłączyć próbkę od cylindra, podgrzej wosk na gorącej płycie i usuń resztki wosku z próbki za pomocą bezwodnego acetonu.
      UWAGA: Podczas obsługi wosku montażowego i bezwodnego acetonu pracuj w okapie i używaj odpowiedniej ochrony osobistej. Po użyciu zbieraj resztki w wyraźnie oznakowanych, chemicznie kompatybilnych pojemnikach na odpady z odpowiednio dopasowanymi korekami. Przestrzegaj instytucjonalnych standardów operacyjnych dotyczących bezpiecznego przechowywania i utylizacji niebezpiecznych odpadów chemicznych.
    7. Zamontuj próbkę między szklanym szkiełkiem a pokrywką, używając oleju immersyjnego jako medium montażowego i oceń orientację włókien kolagenowych za pomocą mikroskopii światła polaryzacyjnego. Zacznij od niskiego powiększenia (np. 5x-10x), aby zbadać próbkę, a następnie zwiększyć do pośredniego powiększenia (np. 20x-40x), aby zidentyfikować potencjalne obszary do dalszej eksploracji za pomocą mikroskopii elektronowej.
      UWAGA: Aby kontynuować proces korelacji i późniejszą analizę próbki za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, zaleca się nie uszczelniać próbki.

4. Przygotowanie próbki do skaningowej mikroskopii elektronowej

  1. Ostrożnie wyjmij próbkę ze szkiełka. Delikatnie zsuń pokrywkę z szklanej szkła za pomocą końcówki pipety. Użyj papieru filtracyjnego, aby usunąć nadmiar oleju immersyjnego. Umyj próbkę neutralnym mydłem. Myj ją w małym pojemniku, aby uniknąć przypadkowej utraty próbki.
    UWAGA: Jeśli na próbce nadal jest pozostałość oleju immersyjnego, delikatnie wyczyść powierzchnię patyczkiem kosmetycznym lekko zwilżonym 70% etanolem.
  2. Zostaw próbkę do wyschnięcia na papierze filtracyjnym. Do suszenia próbki można również użyć sprężonego powietrza lub bawełny. Gdy próbka całkowicie wyschnie, zamontuj ją na okładce za pomocą taśmy węglowej. Powłoka sputter-coat na próbce warstwą złota o średnicy 10 nm, aby zapobiec ładunkowi podczas obrazowania.
  3. Wykorzystaj mikroskop dwuwiązkowy FIB-SEM do badania próbki różnymi metodami.
    1. W trybie SEM (skaningowa mikroskopia elektronowa), wykorzystując elektrony wtórne lub elektrony rozproszone wstecznie, oceniamy morfologię próbki, biomateriał oraz nowo powstałe granice kości w obszarach wcześniej wybranych przez mikroskopię optyczną.
    2. W trybie mikroskopii elektronowej z wiązką jonów (FIB-SEM) wykonuj tomografię typu slice and-view.
  4. W trybie SEM z detektorem elektronów wtórnych wybiera się obszary, które wcześniej analizowano za pomocą mikroskopii światła spolaryzowanego i SEM, aby przejść do akwizycji tomografii slice-and-view.
  5. Dostosuj parametry objętości rowu, rozmiaru pikseli i grubości przekroju w zależności od interesujących cech. W naszym zestawie wykonano tomografię typu slice and-view z objętością rowu 15 μm x 10 μm x 10 μm, rozmiarem piksela 20 nm i grubością przekroju 60 nm. Zaleca się stosowanie izometrycznego rozmiaru woksela, gdy tylko jest to możliwe, dla poprawy jakości obrazowania we wszystkich trzech wymiarach (XYZ).
    UWAGA: Parametry te mogą się różnić w zależności od konkretnego systemu FIB-SEM. Skonsultuj się z operatorem sprzętu, aby określić optymalne warunki na podstawie wymagań analitycznych i możliwości systemu.

5. Ustawianie, przetwarzanie filtrów i segmentacja tomografii FIB-SEM typu slice-and-view

  1. Tomografia typu slice-and-view generuje serię obrazów numerowanych kolejno. Aby przejść do wyrównania, przekonwertuj serię do pliku MRC, powszechnie nazywanego stosem.
  2. Generowanie plików MRC i wyrównywanie stosu obrazów za pomocą oprogramowania IMOD.
    UWAGA: Inne oprogramowanie, takie jak Avizo i FIJI/ImageJ, również oferuje wtyczki do wyrównania stosów. Szczegółowe wskazówki można znaleźć w dokumentacji specyficznej dla każdego oprogramowania. Dodatkowo, prace Peddiego i in.23. Przedstawia przegląd podejść stosowanych podczas wyrównywania stosów.
  3. Aby wygenerować plik MRC, otwórz terminal lub wiersz poleceń, przejdź do folderu zawierającego sekwencję obrazów i wykonaj następujące polecenie: tif2mrc imagerootfile*.tif stackname.mrc
    1. Dla obrazów niebędących formatem TIFF użyj zamiast tego raw2mrc. Dodaj -g (np. tif2mrc -g), aby przekonwertować 24-bitowe obrazy RGB na 8-bitową skalę szarości. To znacznie skróci czas obliczeń.
  4. Uruchom Etomo z terminala i wybierz opcję Wyrównanie sekcji szeregowych. Postępuj zgodnie z kolejnością wyrównania stosu: (1) Załaduj niewyrównany stos do jednej ramki. (2) zakładka Algin z użyciem początkowego automatycznego wyrównania. (3) Utwórz zakładkę Stos używając Zrób Wyrównany Stos, a następnie otwórz wyrównany stos.
    UWAGA: Proces ten może trwać kilka minut, w zależności od wielkości stosu i wydajności systemu.
  5. Po zakończeniu przejrzyj wynik. Plik stosu wyrównanego będzie nazywany stackname_ali.mrc.
    UWAGA: Ta procedura wykorzystuje domyślne ustawienia systemu do wyrównania stosów. Jednak parametry związane z początkowym wyrównaniem i końcowym generowaniem stosu mogą być modyfikowane zgodnie z preferencjami użytkownika. Szczegółowe wskazówki można znaleźć w dokumentacji IMOD: https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.
  6. Wykonaj dodatkowe filtrowanie obrazów za pomocą oprogramowania Avizo. Otwórz wyrównany stos i sekwencyjnie zastosuj następujące filtry: filtr szybkiej transformacji Fouriera (FFT), dostępny w wtyczce Sandbox Filter (wybierz opcję orientacji pionowego paska, wartość tolerancji: 2), kreator korekcji cieniowania (dostosuj wybór maski tak, aby pokrył cały obszar cienia obrazu, użyj współczynnika normalizującego 100), korekcja histogramu (domyślna konfiguracja) oraz środki nielokalne (dostosuj wartości do 5; 0,1; 10; 3).
    UWAGA: Równoważne filtry są dostępne w innych programach do analizy obrazów. W FIJI/ImageJ zalecamy następującą sekwencję: filtr FFT, Odjęcie tła, Wzmocnienie lokalnego kontrastu (CLAHE) oraz filtr środków nielokalnych.
  7. Przejdź do segmentacji obrazu i renderowania 3D za pomocą oprogramowania. Dostępne są różne strategie segmentacji, w tym segmentacja ręczna oraz segmentacja progowa. Dodatkowe narzędzia, takie jak algorytm Watershed, mogą pomóc zautomatyzować proces i skrócić czas potrzebny na segmentację.

6. Przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

  1. Przygotować lamele za pomocą skupionej mikroskopii elektronowej wiązki jonowej (FIB-SEM) do oceny granicy kości i biomateriału.
    UWAGA: Jeśli wszczepiony biomateriał nie jest ceramiczny ani metaliczny, jak w tym badaniu, ultracienkie przekroje odpowiednie do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) można przygotować za pomocą ultramikrotomu. Warto jednak pamiętać, że sekcjonowanie materiałów mineralizowanych może znacząco skrócić żywotność noża diamentowego.
  2. Po barwieniu ultracienkich fragmentów przez 20 minut w wodnym roztworze 5% octana uranilu.
    UWAGA: Podczas obsługi octanu uranylu pracuj w okapie i noś odpowiednią ochronę osobistą. Po użyciu należy zebrać wszelkie pozostałości rozpuszczalnika w wyraźnie oznakowanych, chemicznie kompatybilnych pojemnikach na odpady z odpowiednio dopasowanymi korekciami. Przestrzegaj instytucjonalnych standardów operacyjnych dotyczących bezpiecznego przechowywania i utylizacji niebezpiecznych odpadów chemicznych.
  3. Przeanalizuj przekroje za pomocą TEM. Dla kompleksowej analizy połącz obrazowanie z dyfrakcją elektronów wybranych obszarowych (SAED), spektroskopią rentgenowską dyspersyjnej o dyspersji energii (EDS) oraz tomografią elektronową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Początkowa analiza próbek w żywicy przeprowadza się za pomocą tomografii mikrokomputerowej (microCT). Ta technika nieniszcząca umożliwia wizualizację 3D całego obszaru defektu, umożliwiając zarówno analizy ilościowe, jak i jakościowe próbki. Kontrast w obrazowaniu mikroCT wynika głównie z różnic gęstości materiałów obecnych w próbce. Rysunek 1 ilustruje analizę mikroCT niekrytycznego defektu w kości piszczelowej szczura, który został wszczepiony biomateriałem CHA37. Próbka została pobrana 12...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zastosowano różne techniki obrazowania do badania architektury kości oraz oceny skuteczności biomateriałów w indukowaniu osteointegracji 7,21,22,23,24. W tym protokole ustaliliśmy workflow obejmujący mikrotomografię rentgenowską, mikroskopię optyczną oraz mikroskopię elektronową do analizy zmineralizowanej tkanki kostnej powstałej w wadze kości piszczelowej sz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają znanych konkurujących ze sobą interesów finansowych ani relacji osobistych, które mogłyby wpłynąć na prace opisane w tym artykule.

Podziękowania

Praca ta była wspierana grantami dla autorów od następujących brazylijskich agencji: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Brazylia) oraz Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). Dziękujemy LABNANO/CBPF oraz CENABIO/UFRJ za możliwości mikroskopii elektronowej. Udoskonalanie języka i poprawki gramatyki przeprowadzono za pomocą ChatGPT (OpenAI, GPT-5.1, 2025). Wszystkie poprawki zostały przejrzane i zweryfikowane przez autorów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aceton Merck67-64-1
Cylinder aluminiowydomowej robotyNie ma
Avizo wersja 2022.1ThermoFisherNie maoprogramowanie do filtrowania obrazów, segmentacji i wizualizacji 3D
Kwas kakodylowy, sól sodowa, trihydratTed Pella18851proszek do buforu Cacodylate. Przygotuj roztwór zapasowy 0,2 M
Pasta do polerowania diamentów 3 & mikro; rozmiar mTed Pella895-8
Pasta do polerowania diamentów 6 & mikro; rozmiar mTed Pella895-9
Diamentowe koło x.006South Bay TechnologyDWH 3063
Diamentowe koło x.012South Bay TechnologyDWH 4122
Filcowa tkanina polerskaTed Pella816-20
Kapsuły z płaskim osadzeniemEMS70021
Szklana pokrywaKnittelNie ma
Szklana zlewkaKnittelNie ma
Glutaraldehyd, 25% stężenia EMTed Pella18426/18427
Złoty sputter K550XEMITECHNie ma
ImageJNarodowe Instytuty Zdrowia (NIH)oprogramowanie do aligacji obrazów, filtrowania, segmentacji i wizualizacji 3D
IMOD wersja 5.1Uniwersytet Koloradooprogramowanie do alignmentu obrazów, segmentacji i wizualizacji 3D
Maszyna do polerowania Lapping eSouth Bay TechnologyModel 910
Piła diamentowa z niskimi prędkościami South Bay TechnologyModel 650
Zestaw do osadzania o niskiej lepkościEMS14300zestaw do żywicy SPURR. Przygotować się zgodnie ze specyfikacjami karty technicznej;
Micro-CT Skyscan 1273 BrukerNie ma
Mikroskop Jeol 2100F 200kV JeolNie ma
Mikroskop Olympus BX51OlympusNie ma
Mikroskop Tescan Lyra3TescanNie ma
Mikroskop Zeiss AxioplanZeissNie mawyposażona w płytę lambda pierwszego rzędu
Paraformaldehyd, stopień EMSigmaP6148Proszek do roztworu formacji formaldehydu. Przygotuj roztwór buljowy o stężeniu 16%
Plastikowy zamekExakt41500
Wosk montażowy QuickStick 135South Bay TechnologyNie ma
Papiery ścierne  Rozmiary ziarnistości 1200Nie maNie ma
Papiery ścierne  Rozmiary ziarnistości 2500Nie maNie ma
Papiery ścierne  Rozmiary ziarnistości 4100Nie maNie ma
SuperglueLoctiteNie ma
Płyn rozpuszczalny w wodzie & nbsp;South Bay TechnologyNie ma
Papier filtrujący Whatmann klasy 1SigmaWHA1001150

Bibliografia

  1. Reznikov, N., Shahar, R., Weiner, S. Bone hierarchical structure in three dimensions. Acta Biomater. 10 (9), 3815-3826 (2014).
  2. Buss, D. J., Kröger, R., McKee, M. D., Reznikov, N. Hierarchical organization of bone in three dimensions: A twist of twists. J Str Biol: X. 6, (2022).
  3. Grandfield, K., Gustafsson, S., Palmquist, A. Where bone meets implant: The characterization of nano-osseointegration. Nanoscale. 5 (10), 4302-4308 (2013).
  4. Loi, F., Córdova, L. A., Pajarinen, J., Lin, T., Yao, Z., Goodman, S. B. Inflammation, fracture and bone repair. Bone. 86, 119-130 (2016).
  5. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
  6. Shah, F. A., Thomsen, P., Palmquist, A. Osseointegration and current interpretations of the bone-implant interface. Acta Biomater. 84, 1-15 (2019).
  7. Palmquist, A. A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration. J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).
  8. Sim, J. H., Yeo, I. S. Light Microscopy Analysis of Bone Response to Implant Surfaces. Microsc Today. 24 (4), 28-33 (2016).
  9. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  10. Müller, R. Hierarchical microimaging of bone structure and function. Nat Rev Rheumatol. 5 (7), 373-381 (2009).
  11. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  12. Buss, D. J., Reznikov, N., McKee, M. D. Crossfibrillar mineral tessellation in normal and Hyp mouse bone as revealed by 3D FIB-SEM microscopy. J Str Biol. 212 (2), 107603(2020).
  13. Binkley, D. M., Deering, J., Yuan, H., Gourrier, A., Grandfield, K. Ellipsoidal mesoscale mineralization pattern in human cortical bone revealed in 3D by plasma focused ion beam serial sectioning. J Str Biol. 212 (2), 107615(2020).
  14. Reznikov, N., Almany-Magal, R., Shahar, R., Weiner, S. Three-dimensional imaging of collagen fibril organization in rat circumferential lamellar bone using a dual beam electron microscope reveals ordered and disordered sub-lamellar structures. Bone. 52 (2), 676-683 (2013).
  15. Reznikov, N., Bilton, M., Lari, L., Stevens, M. M., Kröger, R. Fractal-like hierarchical organization of bone begins at the nanoscale. Science. 360 (6388), 2189(2018).
  16. Grandfield, K., Vuong, V., Schwarcz, H. P. Ultrastructure of Bone: Hierarchical Features from Nanometer to Micrometer Scale Revealed in Focused Ion Beam Sections in the TEM. Calcified Tissue Int. 103 (6), 606-616 (2018).
  17. Micheletti, C., et al. mineral organization at the mesoscale: A review of mineral ellipsoids in bone and at bone interfaces. Acta Biomater. 142, 1-13 (2022).
  18. Micheletti, C., Shah, F. A. Bone hierarchical organization through the lens of materials science: Present opportunities and future challenges. Bone Rep. 22, (2024).
  19. Shah, F. A., Ruscsák, K., Palmquist, A. 50 years of scanning electron microscopy of bone-a comprehensive overview of the important discoveries made and insights gained into bone material properties in health, disease, and taphonomy. Bone Res. 7 (1), (2019).
  20. Georgiadis, M., Müller, R., Schneider, P. Techniques to assess bone ultrastructure organization: Orientation and arrangement of mineralized collagen fibrils. J Royal Soc Interface. 13 (119), (2016).
  21. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  22. Keklikoglou, K., et al. Micro-computed tomography for natural history specimens: a handbook of best practice protocols. Eur J Taxonomy. (522), (2019).
  23. Peddie, C. J., et al. Volume electron microscopy. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 51(2022).
  24. Costa De-Moraes, S. L., et al. Histomorphometric and microtomographic evaluation of hydroxyapatite coated implants and L-PRF in over drilled bone sites in sheep. Sci Rep. 15 (1), 14761(2025).
  25. Liu, Y., Xie, D., Zhou, R., Zhang, Y. 3D X-ray micro-computed tomography imaging for the microarchitecture evaluation of porous metallic implants and scaffolds. Micron. 142, (2021).
  26. Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. Assessment of Bone Fracture Healing Using Micro-Computed Tomography. J Vis Exp. (190), e64262(2022).
  27. Ramezanzadehkoldeh, M., Skallerud, B. H. MicroCT-based finite element models as a tool for virtual testing of cortical bone. Med Eng Physics. 46, 12-20 (2017).
  28. Shefelbine, S. J., et al. Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis. Bone. 36 (3), 480-488 (2005).
  29. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).
  30. Morgan, E. F., et al. Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical. Bone. 44 (2), 335-344 (2009).
  31. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  32. Zaborowska, M., Shah, F. A., Trobos, M., Palmquist, A. Retrieval, sample processing, and analyses of bone-anchored implants. Bone Repair Biomater Regenerat Clin Appl Second Edition. , 447-466 (2018).
  33. Thorfve, A., Palmquist, A., Grandfield, K. Three-dimensional analytical techniques for evaluation of osseointegrated titanium implants. Mater Sci Technol. 31 (2), 174-179 (2015).
  34. Mastrogiacomo, M., Campi, G., Cancedda, R., Cedola, A. Synchrotron radiation techniques boost the research in bone tissue engineering. Acta Biomater. 89, 33-46 (2019).
  35. Raguin, E., Rechav, K., Shahar, R., Weiner, S. Focused ion beam-SEM 3D analysis of mineralized osteonal bone: lamellae and cement sheath structures. Acta Biomater. 121, 497-513 (2021).
  36. McMahon, G., Malis, T. Ultramicrotomy of nanocrystalline materials. Microscopy Res Tech. 31 (4), 267-274 (1995).
  37. Bassim, N. D., et al. Minimizing damage during FIB sample preparation of soft materials. J Microsc. 245 (3), 288-301 (2012).
  38. Witzke, K., et al. Comparative Sample Preparation Using Focused Ion Beam and Ultramicrotomy of Human Dental Enamel and Dentine for Multimicroscopic Imaging at Micro- and Nanoscale. Materials. 15 (9), 3084(2022).
  39. Carter, J. L. W., Karakulak Uz, T., Ibrahim, B., Pigott, J. S., Gordon, J. V. A comparison of energy dispersive spectroscopy in transmission scanning electron microscopy with scanning transmission electron microscopy. Ultramicroscopy. 270, 114106(2025).
  40. Grandfield, K., McNally, E. A., Palmquist, A., Botton, G. A., Thomsen, P., Engqvist, H. Visualizing biointerfaces in three dimensions: electron tomography of the bone-hydroxyapatite interface. J Royal Soc Interface. 7 (51), 1497-1501 (2010).
  41. Grandfield, K., Palmquist, A., Engqvist, H. Three-dimensional structure of laser-modified Ti6Al4V and bone interface revealed with STEM tomography. Ultramicroscopy. 127, 48-52 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie multimodalneregeneracja ko ciocena biomateria winterfejs ko biomateriamikroskopia w wietle spolaryzowanymskaningowa mikroskopia elektronowatransmisyjna mikroskopia elektronowaenergodispersyjna spektroskopia rentgenowska

Powiązane artykuły