Hodowla jajników noworodków myszy i ilościfikacja pęcherzyków w całości: efektywne podejście in vitro do badania pierwotnej regulacji pęcherzyków

Podsumowanie

Niniejsze badanie przedstawia protokoły hodowli jajników myszy poporodowych na wkładkach błonowych oraz ilościową ilościową w całym jajniku. Wyniki wykazały, że techniczne traktowanie podczas hodowli jajników znacząco wpływa na liczbę pierwotnych pęcherzyków, podkreślając znaczenie utrzymania spójności w celu minimalizowania niebiologicznych zmienności.

Streszczenie

U samic ssaków pierwotne pęcherzyki powstają podczas rozwoju jajnika płodu i stanowią jedyne źródło utrzymania funkcji jajnika u dorosłych. Mechanizmy leżące u podstaw procesu powstawania pęcherzyków pierwotnych, utrzymywania uśpienia, aktywacji dla rozwoju pęcherzyków i umierania komórek są istotne dla zrozumienia fizjologii jajnika i schorzeń patologicznych. Niniejsze badanie przedstawia protokół hodowli jajników myszy poporodowych na wkładkach błonowych, co umożliwia hodowlę i leczenie farmaceutyczne nienaruszonych jajników do 10 dni, w zależności od etapu rozwoju jajnika. Zmiany warunków hodowli można osiągnąć poprzez przenoszenie wkładów zawierających hodowlane jajniki między dołkami na płytce, co pozwala uniknąć fizycznej ingerencji w tkanki podczas hodowli. Jajniki P5 zostały wyizolowane i hodowane na instytucie o średnicy 12 mm w płytkach z 24 dołkami jako przykład. Każdy jajnik był rozdzielany w kropli z DMEM/F12 z dodatkiem 10% FBS, 3 mg/mL BSA, 10 mIU/mL FSH oraz antymikotycznym lekiem antymykotycznym, a następnie delikatnie stabilizowany na wkładce błonowej. Medium zmieniano co dwa dni, a kultura była utrzymywana łącznie przez pięć dni. Po hodowli jajniki były utrwalane w 4% paradehydu przez 2 godziny i przetwarzane pod kątem barwienia przeciwciał na całość markera oocytu DDX4. Pęcherzyki były etapowane i ilościowo określane na podstawie wielkości oocytu oraz morfologii jądrowej komórek pęcherzyków somatycznych. Wyniki wykazały, że liczba pierwotnych pęcherzyków w każdym jajniku była istotnie zależna od prawidłowego umiejscowienia tkanek na wstawce błonowej. Ponadto różnice w liczbie jajników na każdej wkładce mogą wprowadzać niebiologiczne wariacje i należy ich unikać.

Wprowadzenie

Oogeneza to wysoce regulowany i złożony proces, który prowadzi do produkcji dojrzałych oocytów. U ssaków oogeneza rozpoczyna się w jajnikach płodowych, gdzie pierwotne komórki rozrodcze (PGC) różnicują się w pierwotne oocyty. Każdy pierwotny oocyt jest otoczony warstwą płaskokątnych komórek pregranulozy, tworząc pierwotny pęcherzyk. Większość tych pierwotnych pęcherzyków staje się uśpiona po utworzeniu, pełniąc funkcję rezerwy jajnika ^1,2,3. W dorosłym jajniku okresowa aktywacja pierwotnych pęcherzyków dla rozwoju pęcherzyków, znana jako folikulogeneza, jest niezbędna do utrzymania produkcji dojrzałych oocytów oraz hormonów sterydowych jajników ^4,5. W przypadku braku sygnałów aktywacji ludzkie pierwotne pęcherzyki mogą pozostawać nieruchome nawet do 50 lat. Przedłużona spoczynek może przyczyniać się do obniżenia jakości jajków, a także do zwiększonej liczby ubytków pierwotnych w starzejących się jajnikach⁶. Mechanizmy leżące u podstaw aktywacji konkretnej puli mieszków mieszkowych, podczas gdy inne pozostają nieruchome i ulegają okresowej śmierci komórki, pozostają otwarte.

Proces oogenezy jest silnie zachowany u ssaków, co czyni myszy idealnym modelem do badania oogenezy ssaków⁷. U myszy powstawanie pierwotnych pęcherzyków kończy się do 4. dnia poporodowego (P4). Niewielka część pierwotnych pęcherzyków przechodzi rozwój pęcherzyków bezpośrednio po ich powstaniu. Podczas rozwoju pęcherzyków oocyt zwiększa rozmiar dzięki zwiększonej organogenezie oraz syntezie mRNA i białek⁴. Komórki ziarnistka płaskoskórej przechodzą w komórki ziarnistka sześciennego i stają się proliferacyjne⁸. Te rozwijające się pęcherzyki osiągają stadium owulacyjne około 21. dnia, czyli wtedy, gdy samice myszy osiągają okres dojrzewania. Ta faza rozwoju pęcherzyków w jajnikach poporodowych jest powszechnie określana jako "pierwsza fala folikulogenezy". Ponieważ pierwsza fala folikulogenezy bardzo odzwierciedla proces rozwoju pęcherzyków, jajniki myszy poporodowe stanowią idealny model do badania regulacji pierwotnych pęcherzyków i folikulogenezy jajników⁹.

Klasyfikacja pęcherzyków jajników opiera się głównie na morfologii jądrowej komórek somatycznych mieszków oraz wielkości oocytu. W jajnikach myszy uśpiony pierwotny pęcherzyk rozpoznaje się po pojedynczej warstwie płaskokątnych komórek pregranulozy, które otaczają pierwotny oocyt, o średnicy około 20 μm. Rozwijające się pęcherzyki można podzielić na pęcherzyki pierwotne, wtórne, trzeciorzędne i antralne. Główny pęcherzyk zawiera oocyt o średnicy zwykle ponad 25 μm i otoczony jest pojedynczą warstwą komórek ziarnistych sześciennych (Rysunek Uzupełniający 1). Mieszek wtórny składa się z dwóch warstw komórek ziarnistych, natomiast pęcherzyk trzeciorzędowy składa się z trzech lub więcej warstw komórek ziarnistych. Pęcherzyk antralny jest większy niż pęcherzyk trzeciorzędowy, zawiera wiele warstw komórek ziarnistych i posiada wypełnioną płynem jamę zwaną antrum. W miarę rozwoju mieszków jajkowy oocyt zwiększa rozmiar, osiągając około 80 μm w momencie owulacji. Dodatkowo rozwijające się mieszki są otoczone przez kilka warstw cienkich komórek teki, które znajdują się poza komórkami ziarnistymi 10,11,12.

Stosunkowo niewielki rozmiar jajników myszy po porodzie sprawia, że hodowla całych jajników jest praktycznym podejściem do badań. Ta metoda skutecznie umożliwia badanie rozwoju jajnika i mieszków mieszkowych w nienaruszonym jajniku, ponieważ zachowuje fizyczne i fizjologiczne mikrośrodowiska, jednocześnie minimalizując zakłócenia ze strony otaczających tkanek¹². Takie podejście pozwala na eksperymenty, które byłyby trudne do przeprowadzenia w modelach in vivo. Przykłady to obrazowanie na żywo rozwoju jajnika, kontrolowane w czasie terapie wielolekowe oraz analiza aktywności wydzielniczej jajnika poprzez profilowanie białek w podłożu hodowlowym^13,14. Ponadto to podejście można zastosować do badania wpływu czynników wydzielniczych bez bezpośredniej interakcji komórka-komórka poprzez eksperymenty współhodowlania. W tych eksperymentach różne typy tkanek można umieścić na oddzielnych wkładkach błonowych w ramach wspólnego medium¹⁵. Dodatkowo, stosowanie warunkowych jajników myszy in vitro może pomóc wyjaśnić kluczowe mechanizmy zaangażowane w aktywację i wzrost pierwotnych pęcherzyków pierwotnych.

W tym artykule przedstawiamy metody hodowli jajników myszy poporodowych z wykorzystaniem wkładek błonowych oraz ilościową ilościową w całym jajniku (Rysunek 1). Techniki opisane tutaj obejmują: 1) sekcję jajników noworodków myszy, 2) hodowlę jajników noworodków myszy, 3) zmianę ośrodka podczas hodowli, 4) utrwalanie tkanek i barwienie przeciwciał na całość, a także 5) obrazowanie tkanek i ilościową identyfikację mieszków mieszkowych. Dodatkowo w badaniu zastosowano doksorubicynę do eksperymentalnego wywołania utraty pierwotnych pęcherzyków, co stanowiło model do badania mechanizmów leżących u podstaw wyczerpania rezerwy jajników. Wyniki wykazały, że liczba jajników na wkładkę oraz ich położenie w środku podczas hodowli wpływały na liczbę pierwotnych pęcherzyków. Podkreśla to znaczenie utrzymania spójnego układu hodowlanego, aby zapobiec niebiologicznym zmianom wyników eksperymentalnych.

Protokół

Samce i samice myszy CD-1 były trzymane razem w stosunku 1:1 jako pary lęgowe. Data narodzin młodych została wyznaczona jako dzień poporodowy 0. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Missouri (numer protokołu: 36647).

1. Odczynniki i media kulturowe

1. Wszystkie odczynniki użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów. Przygotuj wszystkie materiały i podłoża przed hodowlą jajników.
2. Podłoże hodowlane: Przygotuj ~5 mL podłoża DMEM/F-12 uzupełnionego o 3 mg/mL w surowicy bydłej (BSA), 10% surowicy płodowej bydła (FBS) oraz 10 mIU/mL hormonu folikulostymulującego (FSH).
   UWAGA: Media powinny być świeżo przygotowane poprzez dodanie akcji BSA (30 mg/mL), FBS i FSH (10 IU/mL) do mediów DMEM/F-12. Wyrównuj podłoże w szalce Petriego przez około 30 minut w inkubatorze 5%_CO2 w temperaturze 37 °C. Przechowuj buliony w temperaturze -20 °C i rozmroz je tuż przed użyciem. Aliquot magazynują zapasy w odpowiednich ilościach, aby uniknąć powtarzającego się zamarzania i rozmrażania zapasów.

2. Hodowla jajników

1. Uśpienie samic myszy P5 przez dekapitację. Usuń jajniki oraz przyczepioną tkankę kaletki za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy. Umieść jajniki w 60 mm szalce Petriego z wcześniej schłodzoną solą fizjologiczną Dulbecco (DPBS) zawierającą antybiotyk przeciwmykotyczny (Rysunek 2A,B).
2. Używając pary strzykawek insulinowych (1 mL), rozcina i usunięcie tkanki kaletki z jajnika pod stereoskopią (rysunek 2C,D). Przenieś jajniki za pomocą pipety o pojemności 1 mL do szalki Petriego o średnicy 30 mm zawierającej 3 mL pożywki hodowlanej i umieścić naczynie w inkubatorze_CO2.
   UWAGA: Unikaj kłucia lub ściskania jajników. Wykonuj czyste i równomierne nacięcia przez kaletkę jajnika, używając strzykawek insulinowych, aby uwolnić jajnik. Napełnij końcówkę pipety około 50 μL podłoża, umieść końcówkę obok jajnika i wciągnij ją do końcówki do transferu.
3. Pod maską laminarną przygotuj płytę, umieszczając 400 μL medium i wkładkę w każdej dołce (Rysunek 2E,E'). Nośnik znajduje się poza wkładką, a membrana wstawki staje się nieprzezroczysta po nasączeniu przez podłoże.
4. Do hodowli z 24-godzinnym zabiegiem Dox przygotuj podłoże zawierające Dox w stężeniu 0,1 mg/mL świeżo poprzez rozcieńczenie materiału Dox (10 mg/mL) z podłożem.
   UWAGA: Materiały zawierające Dox powinny być odpowiednio utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnych komitetów ds. bezpieczeństwa biologicznego oraz ochrony środowiska.
5. Pod stereoskopem przenieś do wkładki do wstawki za pomocą pipety o pojemności 1 mL (rysunek 2F,G). Minimalizuj ilość nośników przenoszonych do wkładki i natychmiast usuń nadmiar po transferze. Po delikatnym umieszczeniu jajników w wkładzie, użyj pipety o pojemności 200 μL, aby przenieść około 200 μL podłoża z dołku do wkładu, upewniając się, że błona jest całkowicie pokryta przez podłoże. Przenieś ośrodek z powrotem do dołka i wycentruj jajniki na błonie. Napełnij końcówkę pipety mediem hodowlowym, aby zapobiec wciągnięciu jajnika do końcówki podczas centrowania. Upewnij się, że pozostawisz odpowiednią przestrzeń między jajnikami i że są one ustabilizowane na wkładce błonowej (rysunek 2H), zamiast pozostawać zawieszone w ośrodku (rysunek 2I). Uważaj, żeby nie kłuć jajników i błony.
6. W kulturze 5-dniowej zmieniaj podłoże co dwa dni, usuwając 200 μL podłoża (połowę całkowitej ilości) z odwiertu i dodając 200 μL świeżego medium hodowlanego z powrotem do studni (Rysunek 2J).
7. W przypadku hodowli z 24-godzinnym leczeniem lekowym przenieś wkładkę z jajnikami do nowej dołki z 400 μL świeżego pożywki po początkowych 24 godzinach, wykonując następujące kroki:
   1. Usuń wkładkę zawierającą jajniki z dołka za pomocą kleszczy.
   2. Krótko opłucz dno wkładu, zanurzając go w naczyniu o średnicy 60 mm ze świeżym medium hodowlanym.
   3. Delikatnie stuknij dnem wkładu w pustą miskę o średnicy 60 mm, aby usunąć nadmiar materiału z wstawki. Włóż wkład do studni z świeżym medium hodowlarskim.
      UWAGA: Usuń nadmiar ośrodka z wkładu, aby jajniki były ustabilizowane na błonie natychmiast po wymianie ośrodka lub przeniesieniu wkładki.

3. Fiksacja i immunobarwienie całkowite

1. Aby naprawić wyhodowane jajniki, usuń wkład z płytki za pomocą kleszczy i umieść go w szalce Petriego o średnicy 60 mm zawierającej 5 mL DPBS. Przenieś około 100 μL DPBS obok jajników i ponownie je zawiesij, używając pipety o pojemności 1 mL.
2. Za pomocą pipety o pojemności 1 mL przenieś jajniki z wkładu do rurki Eppendorfa o pojemności 1,5 mL. Wyjmij DPBS z rurki i dodaj 500 μL 4% paradehydu. Ustaw jajniki w temperaturze 4°C przez 2 godziny.
   UWAGA: Koniec końcówki pipety może wymagać szerszego przycięcia, aby zapobiec uszkodzeniu tkanek, jeśli jajniki są zbyt duże, by przez nie przejść.
3. Myj stałe jajniki w 1 mL PBST₂ (PBS, 0,1% Tween [v/v], 0,5% Triton [v/v]) co najmniej trzy razy, po godzinie na obracającym się shakere. Zaleca się pozostawienie tkanek w PBST₂ na noc (12-16 godzin) w temperaturze 4 °C, aby zwiększyć penetrację przeciwciał.
   UWAGA: To może być punkt zatrzymania; tkanki mogą być przechowywane w PBST₂ do trzech dni przed inkubacją przeciwciał pierwotnych.
4. Inkubuj jajniki helikazą antymartwą 4 (DDX4) w 100 μL buforu rozcieńczania przeciwciał (1% BSA [w/v], 10% surowica Donkey [v/v], 0,1 M glycyna, 0,1% Tween i 0,5% Triton w PBS) w rozcieńczeniu 1/400 (2,3 μg/mL) w temperaturze 4 °C przez 12-16 godzin.
5. Następnego dnia usuń pierwotne przeciwciało i dodaj 1 ml PBST₂ do probówki. Umyj chusteczki co najmniej trzy razy, po godzinie na obrotowej shakerze.
   UWAGA: To może być punkt zatrzymania; tkanki mogą pozostać w PBST₂ do trzech dni po inkubacji pierwotnych przeciwciał.
6. Rozcieńcz przeciwciało wtórne, osioł, przeciwkróliczy AF488 przy rozcieńczeniu 1/500 (1,5 μg/mL) w PBST₂. Inkubuj tkankę z co najmniej 100 μL rozcieńczonego przeciwciała wtórnego w temperaturze 4 °C przez 12-16 godzin.
7. Następnego dnia dokładnie umyj chusteczki w PBST₂ co najmniej trzy razy, po godzinie na _obrotowym shakerze. Zaleca się mycie chusteczek do 8 godzin, aby zmniejszyć tło. Upewnij się, że rurki są osłonięte, aby chronić je przed światłem z tego kroku do przodu.
8. Usuń PBST₂ i dodaj 100 μL DAPI w rozcieńczeniu 1/1000 (1 μg/mL) w PBS do rurki. Inkubuj tkanki w DAPI przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
9. Przemyj jajniki w PBST₂ raz na 30 minut i zamontuj je na mikroskopijnym szkiełku z dystansem obrazującym. Przenieś jajniki do środka dystansu za pomocą pipety 1 mL i usuń nadmiar PBST₂. Dodaj około 5 μL nośnika antyfade i umieść szkiełko mikroskopowe na górze dystansu. Zabezpiecz krawędzie dystansu przezroczystym lakierem do paznokci dla długotrwałego przechowywania.
   UWAGA: Przed wykonaniem zdjęć szkiełek upewnij się, że lakier do paznokci jest całkowicie suchy i że na zewnętrznej stronie pokrywy nie ma medium mocującego. Te odczynniki mogą uszkadzać obiektywy mikroskopu. Dodatkowo unikaj nadmiernego stosowania nośników montażowych, ponieważ jajniki muszą pozostawać nieruchome podczas obrazowania.
10. Obrazuj jajniki mikroskopem konfokalnym z powiększeniem 10x i krokiem Z 10 μm. Dostosuj ustawienia i użyj Z-kompensacji (wzmocnienia pobudzenia), aby obrazować cały jajnik. Można to zrobić za pomocą następujących kroków:
    1. Dostosuj moc pobudzenia i wzmocnienie detektora, monitorując nasycenie sygnału za pomocą histogramu, ponieważ może ono różnić się w zależności od tkanek. Zacznij od niskiej mocy lasera i stopniowo zwiększ ją w zależności od potrzeby.
    2. Aby obrazować głębsze obszary, należy umożliwić kompensację Z dla detektora wzmocnienia, ponieważ intensywność sygnału może spadać wraz z głębokością. Użyj uśrednionej liczby klatek co najmniej 10 i włącz dwukierunkowe skanowanie X z prędkością 600 Hz.
       UWAGA: Przy tych ustawieniach obrazowanie nie powinno przekraczać 10 minut na jajnik (~200 μm). Całkowite immunofluorescencyjne barwienie jajników anty-DDX4 jest zazwyczaj silne i rzadko powoduje fotowybielanie.

4. Kwantyfikacja mieszków mieszkowych

1. Aby zmierzyć mieszki mieszkowe w każdym jajniku, otwórz obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ. Po otwarciu upewnij się, że tryb kolorów jest wybrany jako kolorowany i że podział kanałów jest zaznaczony w polu podzielony na osobne okna. Wybierz interesujący Cię obraz, a następnie użyj narzędzia obraz/transformacja/obrót, aby symetrycznie umieścić jajnik w obrazie.
   UWAGA: Obrazy uzyskane przez konfokalnego można oglądać i analizować w 3D za pomocą oprogramowania Imaris (Rysunek 3A,B) lub oprogramowania ImageJ¹⁶.
2. Użyj narzędzia analiza/narzędzia/siatka, aby podzielić jajnik na siatki (rysunek 3C, C').
3. Użyj narzędzia wtyczki/analiza/licznik komórek, aby zaznaczyć wszystkie siatki pokrywające jajnik (Rysunek 3D, D', siatki oznaczone 4). Spośród tych siatek zaznacz każdą drugą siatkę w każdym wierszu do kwantyfikacji mieszków mieszkowych (Rysunek 3E,E', siatki oznaczone przez 8). Siatki na krawędzi jajnika, które mają mniej niż 10 oocytów, nie są uwzględniane do ilościowego określenia mieszków.
   UWAGA: Zainicjalizuj licznik komórek i wybierz typy liczników , które uważasz za łatwe do odczytania.
4. Oocyty można zidentyfikować po obecności DDX4-dodatniej struktury pierścieniowej otaczającej jądro, która jest pozytywna na DAPI. Pierwotne pęcherzyki mają oocyty o średnicy około 20 μm, otoczone przez płaskoskostyczne komórki somatyczne. Rozwijające się pęcherzyki mają oocyty o średnicy większej niż 25 μm i otoczone jedną lub więcej warstwami komórek ziarnistych sześciennych (Rysunek uzupełniający 1).
5. Policz pierwotne pęcherzyki w każdej oznaczonej siatce (jak widać na Rysunku 3E,E' z licznikiem typu 8). Przejdź przez mieszki mieszkowe, używając optycznych przekrojów/stosów w siatce i zaznacz je odpowiednio narzędziem do liczenia komórek. Upewnij się, że nie liczysz dwukrotnie pęcherzyków pierwotnych na dwóch kolejnych przekrojach/stosach optycznych. Policz rozwijające się pęcherzyki we wszystkich siatkach oznaczonych licznikem Typ 4.
   UWAGA: Użyj opcji powiększenia , aby lepiej zobrazować i policzyć oocyty przez stosy.
6. Obliczamy liczbę pierwotnych pęcherzyków w całym jajniku (nf), mnożąc średnią liczbę pęcherzyków pierwotnych na siatkę (nfgrid) przez liczbę siatek obejmujących jajnik (ngrid). nf = siatka nf × ngrids.
   UWAGA: Przeprowadzono analizy statystyczne, a wykresy wygenerowano przy użyciu oprogramowania Prism 10.2.0 (GraphPad Software, wersja 10, Inc., CA). Różnice między grupami oceniono za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnego porównania Tukeya. Istotność statystyczna oceniano na poziomie p < 0,05. Dane są prezentowane jako średnia ± błędu standardowego (SE).

Wyniki

W tym artykule demonstrujemy metody hodowli jajników noworodków, barwienia przeciwciał w całości, obrazowania konfokalnego oraz ilościowania mieszków mieszkowych, aby ocenić, czy liczba i pozycja jajników we wstawce podczas hodowli wpływają na wynik eksperymentalny, a w szczególności na liczbę mieszków w jajniku. Hodowaliśmy jajniki w następujących konfiguracjach: jeden, dwa lub trzy jajniki na wkładkę dla stabilizowanej hodowli oraz trzy jajniki na wkładkę dla hodowli pływającej. Jajniki były hodowane w dwóch warunkach:...

Dyskusja

W tym badaniu zademonstrowaliśmy metody hodowli jajników myszy noworodków oraz ilościowej identyfikacji pęcherzyków jajnika w całości. Podejście hodowli pozwala podtrzymać pierwotne i wczesnie rozwijające się pęcherzyki in vitro. Metoda ilościfikacji mieszków na całość wymaga minimalnego przetwarzania tkanek, co oszczędza czas i zachowuje integralność tkanek, zapewniając dokładne ilościowe określenie mieszków.

Liczba pierwotnych pęcherzyków zaobserwowanych w grupie kontrolnej sugeruje, że mimo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki hodowli komórek z 24 dołkami	Fisher Scientific	09-761-146
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-546-152
Anti-Anti (100X)	Gibco	15240-062
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A1470-25G
Mysz CD-1 IGS	Charles River Laboratories	022	Myszy
Wkładki do hodowli komórkowych	Millipore	PICM01250
Strzykawka insulinowa Comfort Point z igłą 1cc 28G x 1/2	Exel	26027
DAPI	Thermo Scientific	62248
DDX4 Rabbit mAb	abcam	AB13840
DMEM/F12 (1:1) (1X)	Gibco	11320-033
Hydrochlorek doksorubicyny	Sigma-Aldrich	PHR1789
DPBS (1X)	Gibco	14190-144
Serum bydlęce płodowe	Sigma-Aldrich	F0926-500ML
Fiji-ImageJ	NIH, USA (https://imagej.net/ij/)	ImageJ 1.52p
Mieszacze nutacyjne Fisherbrand - zmienna prędkość	Fisher Scientific	88-861-043	Shaker
Hormon stymulujący pęcherzyki	Sigma-Aldrich	F4021-10UG
Forma Steri-Cycle i160	Termo Naukowo-handlowe;	i160	Inkubator CO2
Glycine	Fisher Scientific	BP381-500
Imaris	Oxford Instruments (https://imaris.oxinst.com/)	Imaris 10.2
Leica TCS SP8	Leica Microsystems	SN 8100001409	Konfokalna
Normalne osiołko serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-121
Olympus SZ61	Mikroskopy Olympus	SZ61	Stereoscope
Paraformaldehyd	Fisher Scientific	15714
Dystans obrazowania SecureSeal	Grace Bio-Labs	654002
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379-500ML
Medium montażowe VECTASHIELD Antifade	Laboratoria Vector	H-1000