Badanie przedstawia zoptymalizowane protokoły umożliwiające jednoczesne przeprowadzanie analiz metabolicznych testów stresu Mito i glikolizy na tej samej płytce. Procedury są dostosowane zarówno do komórek przylegających (BMDM), jak i nieprzylegających (limfocyty), umożliwiając dokładną, powtarzalną i równoległą ocenę funkcji mitochondrialnych i glikolitycznych komórek zainteresowanych.
Artykuł metodologiczny
Pojedyncze testy obciążenia mito i glikolizy z użyciem komórek przylegających lub nieprzylegających
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Analiza metaboliczna w czasie rzeczywistym zapewnia pomiary oddechu mitochondrialnego i glikolizy bez oznakowania, umożliwiając naukowcom powiązanie komórkowego metabolizmu energetycznego z mechanizmami chorób i odpowiedziami terapeutycznymi w różnych dziedzinach. Porównując metabolizm energii u różnych myszy, innych zwierząt, ludzi lub komórek poddanych różnym zabiegom, kluczowe jest przeprowadzenie pomiarów w ramach jednego testu, aby zapewnić dokładne i wiarygodne wyniki. Ponadto projekt eksperymentalny musi uwzględniać analizowany typ komórek, na przykład czy są one przylegające, jak makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM), czy nieprzywierające, jak limfocyty. Dlatego opracowano protokół umożliwiający jednoczesne przeprowadzanie testów stresu Mito i glikolizy na tej samej płytce, mimo że testy wymagały odrębnych zastrzyków leków i programów analitycznych. Oddzielne protokoły obsługi były zoptymalizowane do analizy zarówno silnie przylegających komórek (np. BMDM), jak i nieprzylegających "pływających" komórek (np. limfocytów T i innych limfocytów). Przedstawiono tutaj szczegółowe protokoły efektywnego i powtarzalnego przeprowadzania tych testów.
Wprowadzenie
Seahorse XF Analyzer to unikalne urządzenie, które umożliwia pomiar w czasie rzeczywistym oddychania mitochondrialnego i glikolizy w wielu typach komórek. Poprzez jednoczesne kwantyfikowanie tempa zużycia tlenu (OCR) i szybkości zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR), technologia ta umożliwia precyzyjną analizę szlaków bioenergetycznych w warunkach fizjologicznych lub stresowych. Jego wszechstronność uczyniła go niezbędnym w różnych dziedzinach badań, w tym w raku1, neurobiologii2, immunologii3, starzeniu się 3,4,5 oraz odkrywaniu leków 6, gdzie metaboliczne przeprogramowanie jest cechą charakterystyczną postępu choroby i odpowiedzi terapeutycznej. Łącząc bioenergetykę funkcjonalną z fenotypami komórkowymi 7,8, analiza stanowi potężną platformę do odkrywania mechanizmów, identyfikacji podatności metabolicznych oraz oceny skutków interwencji genetycznych lub farmakologicznych.
W wielu dziedzinach porównanie natychmiastowego efektu leków, małych cząsteczek, cytokin lub naturalnych związków na metabolizm komórkowy najlepiej przeprowadza się w identycznych warunkach eksperymentalnych, z tą samą płytą, czasem inkubacji, parametrami środowiskowymi i porą dnia. W związku z tym podejście polega na nakładaniu komórek o różnych zabiegach lub genetycznym tła na tej samej płycie i analizie wielu parametrów metabolicznych jednocześnie. Ta strategia zapewnia najdokładniejsze porównanie zmian związanych z lekami lub genetyką w metabolizmie energetycznym komórek.
Wiele typów komórek zachowuje się inaczej w hodowli kulturowej. Limfocyty pozostają w zawiesie i nigdy nie przyczepiają się do płyty9, makrofagi mocno się przyczepiają, co utrudnia ich transfer, a komórki nowotworowe mnożą się szybko, ale w różnym tempie w zależności od linii. Te różnice stanowią wyzwanie dla analizy metabolicznej w czasie rzeczywistym; dlatego każdy typ komórek w eksperymencie wymaga dostosowanego protokołu.
Niniejszy artykuł przedstawia protokoły krok po kroku dotyczące przeprowadzania tych testów z wykorzystaniem analizy metabolicznej w czasie rzeczywistym, zapewniając efektywność i powtarzalność. Protokoły te można stosować do wszystkich wersji analizatorów dostępnych na rynku.
Protokół
Myszy były opiekowane zgodnie z procedurami określonymi w protokole National Institutes of Health oraz Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Meharry Medical College. Instytucja ta posiada akredytację Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International i przestrzega Polityki Służby Zdrowia Publicznego dotyczącej leczenia i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych w warunkach wolnych od patogenów. Szczegóły dotyczące odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Optymalizacja gęstości komórek
UWAGA: Każdy typ komórki wykazuje unikalne cechy metaboliczne i znaczną zmienność rozmiaru. Oba czynniki są kluczowe przy określaniu odpowiedniej liczby komórek do załadunku na odwiert, aby uzyskać optymalne wyniki. Przed przeprowadzeniem wstępnego testu eksperymentalnego przygotuj i wykonaj płytkę testową z wybranymi komórkami o różnych gęstościach.
- Dla komórek przylegających (np. komórek nowotworowych) testuj gęstość zasiewania w zakresie od 20 000 do 100 000 komórek na dołek. Dla komórek o silnym przełożeniu metabolicznym i/lub dużych (np. ludzkich komórek nowotworowych lub fibroblastów) optymalizacja gęstości rozpoczyna się od 10 000 lub mniej komórek na odwiert.
- Dla komórek nieprzylegających (np. limfocytów) zoptymalizuj gęstość zasiewów w zakresie 100 000–500 000 komórek na dołek. Dla wszystkich typów komórek dąż do jednolitej monowarstwy pojedynczej komórki, aby osiągnąć optymalne wyniki (patrz Rysunek 1 , przykład: układ płytek próbek).
- Przeprowadź test stresowy Mito (jak poniżej). Dane z tego wstępnego testu mogą posłużyć do określenia optymalnej gęstości komórek dla głównego eksperymentu. Wybierz gęstość, która pokazuje największą różnicę między warunkami testowymi.
UWAGA: Protokół ten nie dotyczy analizy próbek 3D (np. sferoidów komórkowych, organoidów). Można ją jednak zmodyfikować, aby uwzględnić grubość próbki i nierówną powierzchnię.
2. Przygotowanie do testu
- Dzień przed przeprowadzeniem testu delikatnie wyjmij wkład czujnika z płyty użytkowej i dodaj 200 μL wody wolnej od RNAazy/DNA do każdej studni płyty użytkowej, a następnie opuszczaj wkład czujnika do płytki użytkowej, aż czujniki zostaną całkowicie zanurzone w wodzie.
UWAGA: Poziom wody musi być na tyle wysoki, aby czujniki były całkowicie zanurzone przez noc, ponieważ fluorofory w wkładzie czujników nie będą działać, jeśli nie zostaną odpowiednio nawodnione. Jeśli do nawilżania wkładu używa się hydroboostera XF, wkład można bezpośrednio umieścić w roztworze kalibracyjnym i wykluczyć etap nawodnienia wodnego. - Umieść nawilżony wkład/płytkę użytkową na noc do inkubatora bezCO2 o temperaturze 37 °C. Aby zapobiec parowaniu z płyty, umieść także pojemnik z podwójnie destylowaną wodą do inkubatora.
- W dniu badania wyjmij wkład/płytkę narzędziową czujnika z inkubatora bezCO2 i delikatnie wyjmij wkład czujnika z płyty użytkowej, umieszczając wkład czujnika do góry na stole.
- Usuń wodę z płyty użytkowej i wytrzep z luźnych kropelek, a następnie dodaj 200 μL roztworu XF Calibrant do każdego odwiertu.
- Delikatnie umieść wkład czujnika z powrotem do płyty użytkowej tak, aby czujniki były całkowicie zanurzone w roztworze kaliberantu, i umieść go z powrotem w inkubatorze 37 °C bezCO2.
3. Przygotowanie materiału do testu
- Przygotowanie do stosowania środków ze stresu Mito:
- W probówce o pojemności 50 mL dodaj do 45 mL medium XF RPMI: 500 μL 100x pirogrowinianu sodu (stężenie końcowe: 1 mM), 500 μL 100x L-glutaminy (stężenie końcowe: 2 mM) oraz 550 μL roztworu glukozy 45% (stężenie końcowe: 25 mM)
- Ustawij pH do 7,4. Uzupełnij XF RPMI medium do końcowej objętości 50 mL. Przed użyciem przechowuj przygotowane podłoże w kąpieli wodnej lub suchej o temperaturze 37 °C.
- Przygotowanie mediów do testu glikolizy:
- W probówce 50 mL dodaj 250 μL 100x L-glutaminy do 45 mL medium XF RPMI.
- Ustawiam pH do 7,4, a następnie uzupełniam medium XF RPMI do końcowej objętości 50 mL. Przed użyciem przechowuj przygotowane podłoże w wodzie lub w suchej kąpieli o temperaturze 37 °C.
UWAGA: pH zarówno podłoża do testów Mito Stress, jak i Glycolysis musi zostać ponownie skorygowane do 7,4 po dodaniu suplementów zmieniających pH, ponieważ nawet niewielkie odchylenia mogą znacząco wpłynąć na wyniki testu.
4. Płukanie komórek i zmiana ośrodka przed analizą
UWAGA: Etap mycia mikropłyt do hodowli komórek XFe96/XF Pro będzie się różnił w zależności od tego, czy używa się przylegających czy nieprzylegających typów komórek. Prosimy o odkrycie kroku 9, Komórki przylegające (komórki nowotworowe, pierwotne komórki BMDM) i komórki nieprzylepające (limfocyty T-komórki i inne limfocyty), aby określić najlepszą metodę mycia dla używanego typu komórek.
- Usuń 160–180 μl podłoża wzrostu z każdego dołku za pomocą wielopipetowego, pracując po jednym rzędzie/kolumnie, aby zapobiec wysychaniu komórek. Unikaj dotykania dna studni.
- Używając pipetmana z pojedynczym końcówką, usuń pozostałe 20–30 μL z otworów, unikając kontaktu z warstwą komórki na dnie otworu.
- Dodaj 180 μL materiału do testów glikolizowych lub Mito Stress (patrz krok 3) do każdego otworu, zgodnie z układem przedstawionym na Rysunku 1. Aby nie zakłócać warstwy komórkowej, delikatnie rozprowadzaj medium wzdłuż bocznej ścianki każdego dołku, aż wszystkie doły zostaną wypełnione. Oba testy są na tej samej tablicy.
UWAGA: Doły, które nie zawierają komórek i dołki kontrolne, również muszą być wypełnione mediami do testowania. - Umieść mikropłytkę w inkubatorze bez stężenia 37 °C bezCO2 na 40–45 minut przed rozpoczęciem badania i rozpocznij przygotowywanie leków.
5. Przygotowanie leku i załadowanie wkładu
UWAGA: Niektóre leki (FCCP, antymycyna A/Rotenon, oligomycyna) są niebezpieczne i należy je obchodzić ostrożnie. Potrzebne są odpowiednie środki ochrony personelu; obejmują one stosowanie rękawiczek i innych środków ochrony osobistej (PPE) oraz utylizację materiałów do zatwierdzonego przez instytucję pojemnika na odpady chemiczne.
UWAGA: Optimum stężenia FCCP/oligomycyny zależy od typu komórki i przed badaniem jest empirycznie titrowane podczas pracy z szczególnie wrażliwymi komórkami. Końcowe stężenia leków mogą się różnić w zależności od typu komórek. Przygotowuj leki i materiały testowe świeżo w dniu użycia. Nie zamrażaj ani nie używaj ponownie. Przygotowanie leku do testu można zakończyć w ciągu tych 45 minut, aby uzyskać optymalne rezultaty.
- Korzystając z wcześniej podgrzanego podłoża do testu stresu i glikolizy z kroku 3, rozcieńcz związki zgodnie z Tabelą 1 i/lub Tabelą 2 do odpowiednich stężeń dla każdego typu komórek. Każdy związek przygotuj w osobnej probówce 15 mL (jeśli używasz wszystkich sześciu związków, potrzebne będzie sześć probówek).
- Usuń wkład/płytkę narzędziową czujnika z inkubatora 37 °C CO2 i zdejmij pokrywę, ostrożnie umieszczając prowadnicę XF dołączoną do zestawu, a prowadnicę XF odpowiadającą portowi wtryskiwacza (Guide A dla portu A) bezpiecznie nad górną częścią wkładu czujnika (patrz Rysunek 2).
- Używając wielokanałowego pipetatora i rezerwuaru odczynnikowego dla każdego leku, powoli dodawaj potrzebną objętość do odpowiedniego portu (patrz Tabela 1 i Tabela 2 dla objętości). Trzymaj pipettor ściśle pionowo podczas ładowania leków (patrz Rysunek 2).
- Wymień lub użyj ponownie po dokładnym płukaniu i wysuszeniu prowadnicy ładunkowej w razie potrzeby dla każdego portu (port A, B, C i D) i wyrzucaj końcówki pipety po każdym ładowaniu.
UWAGA: Końcówki pipety powinny dobrze pasować do portu prowadzącego, ale nie zbyt ciasno, ponieważ końcówki mogą się zaklinować w prowadnicy! Zaleca się przetestowanie końcówek pipet/pipettora użytych w prowadnicach przed załadowaniem związków, aby uniknąć błędnego załadunku próbek. - Po załadowaniu wszystkich związków do odpowiednich portów wyjmij prowadnicę, wizualnie potwierdzi, że wszystkie porty są wypełnione, i zabezpiecz wkładkę pokrywką. Leki powinny odpowiadać testowi w każdej części tej samej płytki (Rysunek 1).
UWAGA: Końcowe stężenia dołka zalecane dla stresu mito to 1 μM oligomycyny, 1 μM FCCP oraz 0,5 μM rotenonu/antymycyny; do glikolizy 10 mM glukozy, 1 μM oligomycyny i 50 mM 2-DG.
6. Konfiguracja analizatora Seahorse XFe96
- Włącz analizator i otwórz oprogramowanie WAVE (patrz Rysunek 3).
- Wybierz test wytrzymałościowy XF Mito.
UWAGA: Dopóki użyte są odpowiednie media i związki testowe, analizator może jednocześnie wykonywać zarówno testy mitochondrialne, jak i glikolizowe na tej samej płytce za pomocą testu wytrzymałości XF Mito. - Wybierz liczbę "Grup" na podstawie ustawienia tablicy i oznacz każdą grupę. Przejdź do następnej zakładki, aby przypisać odwierty do mapy płyt (patrz Rysunek 3). Oba testy wykonuje się na tej samej płytce.
- Wyróżnij studnie dla każdej grupy w zależności od sposobu załadunku płyty.
- Dostosuj program do typu komórki i celu eksperymentalnego. Na przykład, jeśli układ zawiera grupę wstępnie aktywowaną przed analizą lub aktywator zostanie dodany podczas trwania cyklu, wydłuż czas inkubacji w każdym cyklu, aby umożliwić aktywację.
- Wybierz kolejną zakładkę, 'Uruchom testowanie' i wypełnij dane w razie potrzeby, aby zapisać plik danych.
- Załaduj do wcześniej nawodnionego wkładu leki (od kroku 5) do maszyny, gdy zostanie wskazane do inicjalizacji. Etap inicjalizacji wskaże, czy czujniki są odpowiednio nawodnione i sprawne.
- Rozpocznij badanie i ładuj oraz rozładowuj płytki zgodnie z instrukcjami podczas programu.
UWAGA: Podczas ładowania wkładu lub mikropłytki do analizatora upewnij się, że wszystkie pokrywki są zdjęte! Podczas gdy niektóre modele analizatorów mają funkcję bezpieczeństwa, która wykrywa pokrywy, wcześniejsze modele tego nie mają. Może to uszkodzić maszynę, jeśli pokrywa jest nienaruszona podczas przesuwania płyty.
7. Metody normalizacji: (SRB) i liczenie jądrowe (barwienie i obrazowanie DAPI)
UWAGA: Niektóre odczynniki w zestawie SRB są żrące i mogą poparzyć w kontakcie ze skórą. DAPI może wywołać reakcję alergiczną skórną. Zaleca się używanie rękawiczek i innych środków ochrony osobistej, a także utylizacja materiałów do zatwierdzonych przez instytucję pojemników na odpady chemiczne.
UWAGA: Wybierz metodę normalizacji na podstawie cech i wstępnych obróbki analizowanych komórek. Obie metody są odpowiednie do porównania komórek o różnym tempie proliferacji, ponieważ obie uwzględniają takie różnice. Jednak jeśli leczenie farmakologiczne wywołuje starzenie się, zatrzymując proliferację i zwiększając rozmiar komórek, preferowanym podejściem do normalizacji jest barwienie DAPI. DAPI może nie być odpowiednie dla typów komórek, gdzie barwienie jądrowe jest trudne do wizualizacji (np. adipocyty, erytrocyty) lub komórki mogą być wielojądrowe (np. hepatocyty przyduszkowe, miocyty).
- Aby normalizować komórki za pomocą testu SRB (Sulfohodamine B Cell Cytoxicity Assay Kit) po analizie metabolicznej w czasie rzeczywistym, należy usunąć płytkę z maszyny i dodać 1/4 objętości ośrodka (np. 50 μL w 200 μL pożywki hodowlanej) roztworu utrwalającego do każdego dołka.
- Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub przez noc w 4 °C.
- Usuń roztwór i delikatnie przepłucz doły trzy razy 200 μL wody wolnej od RNazy/DNazy, uważając, aby nie zakłócić warstwy komórkowej. Do krótkoterminowego przechowywania (jeśli jest to potrzebne) zamień ostatnie pranie na PBS i przechowywaj w temperaturze 4 °C.
- Aby natychmiast normalizować za pomocą testu SRB, usuń roztwór płukający i pozwól płytce całkowicie wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej.
- Dodaj 25 μL roztworu SRB do każdego dołku i barw przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności lub owiń płytkę folią aluminiową podczas okresu inkubacji.
UWAGA: Roztwór SRB jest światłoczuły i ta część eksperymentu musi być przeprowadzona w miejscu o słabym oświetleniu. - Usuń roztwór barwiący i dodaj 100 μL 1x roztworu płukającego, aby przepłukać każdy dołek 2–3 razy.
- Myj jak najszybciej, aby uniknąć wybielania i usuwaj roztwory płukania jak najwięcej za pomocą ssania próżniowego.
- Dodaj 100 μL 1 razu roztworu rozpuszczalności do każdego dołku i umieść płytkę na wstrząsance na 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Zmierz gęstość optyczną (O.D.) na 565 nm na czytniku płyt, aby określić gęstość studni na podstawie nasycenia kolorów (patrz Rysunek 3 dla odniesienia wizualnego).
- Wyeksportuj dane wartości O.D. jako plik Excel. Ten arkusz kalkulacyjny zostanie wklejony do oprogramowania WAVE w celu normalizacji (krok 8).
UWAGA: Jeśli zaobserwuje się intensywne kolory (> O.D. 3.5) z powodu przeciążenia ogniwa, może być użyta nieoptymalna długość fali (np. 490–530 nm), aby zmniejszyć odczyty z powrotem do zakresu liniowego instrumentu. Popraw tło, odejmując przedawkowanie kontroli zawierającej tylko pożywkę hodowlową (studnia kontrolna tła) od odczytów wszystkich próbek.
- Do barwienia DAPI rozcieńcz roztwór bazowy DAPI do 300 nM w 1x PBS.
- Przepłucz każdą jamkę płytki 3 razy delikatnie 200 μL 1x PBS.
UWAGA: Jeśli są komórki nieprzylegające, wiruj płytę w 200 x g przez 3 minuty bez hamulca, aby po każdym kroku płukania komórki były zawieszone na dnie każdego dołu. - Utrwalaj komórki w 2%–4% PFA rozcieńczonym w 1x PBS przez 10–15 minut w temperaturze pokojowej.
- Przepłucz każdą jamkę płytki 3 razy delikatnie 200 μL 1x PBS.
- Dodaj około 150 μL tego rozcieńczonego roztworu barwienia DAPI do każdego, upewniając się, że komórki są całkowicie pokryte w każdej dołku.
- Inkubuj 1–5 minut w temperaturze pokojowej w miejscu o słabym oświetleniu (lub w okładce aluminiowej).
- Usuń roztwór barwnika DAPI z każdego dołku.
- Przepłucz każdą jamkę płytki 3 razy delikatnie 200 μL 1x PBS.
- Usuń pozostałe PBS.
- Obrazuj komórki przy dowolnym wzbudzeniu/emisji między 358–461 nm lub przy dowolnym ustawieniu filtra DAPI na mikroskopie.
- Eksportuj dane wartości emisji jako plik Excel. Ten arkusz kalkulacyjny zostanie wklejony do oprogramowania WAVE w celu normalizacji (krok 8).
- Przepłucz każdą jamkę płytki 3 razy delikatnie 200 μL 1x PBS.
8. Analiza i normalizacja danych
UWAGA: Do analizy danych można użyć oprogramowania "Wave" lub innego oprogramowania. Dostarczony protokół jest stosowany do oprogramowania Wave.
- Otworzyć wyniki analizy w Wave (patrz Rysunek 3). Normalizacja jest wykonywana na podstawie wartości uzyskanych z pliku Excel wygenerowanego przez czytnik mikropłyt po barwieniu SRB (krok 7).
- Kliknij "Normalize".
- W otwartym oknie wybierz "wybierz wszystko", a następnie "wklej", aby wkleić dane skopiowane z arkusza Excel wygenerowanego podczas etapu normalizacji. Kliknij "Aplikuj". Ta procedura automatycznie normalizowała wszystkie dane eksperymentalne.
- Aby wygenerować raport, kliknij "Eksportuj do", w panelu otwierającym się po prawej stronie wybierz "XF Cell Mito Stress Test Report Generator". Zapisz wygenerowany plik. Podczas analizy wybierz tylko odwierty przypisane do testu naprężeń Mito (patrz Rysunek 3).
- Aby wygenerować raport, kliknij "Eksportuj do", w panelu otwierającym się po prawej stronie wybierz "XF Cell Glycolysis Stress Test" Report Generator." Zapisz wygenerowany plik. Podczas analizy wybieraj tylko dołki przypisane do testu stresu glikolizowego (patrz Rysunek 3).
9. Komórki przylegające vs. nieprzyczepne
UWAGA: Komórki przylegające i nieprzylegające różnią się zachowaniem wzrostowym, przyczepieniem powierzchniowym oraz wymaganiami dotyczącymi manipulacji. Komórki przylegające (np. komórki nowotworowe, BMDM) przyczepiają się do powierzchni hodowli, więc powłoka i mycie nie wymagają szczególnych środków ostrożności. Komórki nieprzylegające (np. limfocyty T, inne limfocyty) pozostają w zawiesie i wymagają różnych metod wirowania, ponownego zawiesienia i powłokowania. Zrozumienie tych różnic jest kluczowe dla dokładnego zasiewania komórek, leczenia farmakologicznego i spójności testów.
- Upewnij się, że wszystkie komórki użyte do eksperymentu są hodowane w podłożu i wybranym naczyniu hodowlanym tuż przed testem, a następnie przeniesione na mikropłytkę, aby przeprowadzić test.
UWAGA: Chociaż medium XF RPMI jest zalecane dla typów komórek opisanych w tym protokole, w przypadku innych typów komórek należy skonsultować się z producentem, aby upewnić się, że użyto odpowiedniego medium. - W przypadku komórek przylegających (komórek nowotworowych, komórek BMDM) należy zaszczepić komórki na mikropłytę XFe96/XF Pro Cell Culture na 4–5 godzin przed testem o zoptymalizowanej gęstości komórek (patrz krok 1) w objętości ośrodka 200 μL i umieścić je w inkubatorzeCO2 o temperaturze 37 °C.
UWAGA: Komórki BMDM można pokryć do 24 godzin przed testem, ponieważ nie proliferują się i zachowują tę samą gęstość komórek. W przypadku szybko rosnących komórek przylegających, takich jak linie nowotworowe, zaleca się nałożenie płytek w dniu badania, jeśli nie jest potrzebne dalsze leczenie, i analizę ich zaraz po przyłączeniu, aby zapobiec dalszemu wzrostowi komórek. Jeśli taki projekt nie jest możliwy, koniecznym krokiem jest normalizacja na ilość białek/studnię lub liczbę jąder/studnię. - Upewnij się, że narożne otwory na każde cztery rogi mikropłyty są wolne od komórek, ale wypełnione nośnikiem, ponieważ mierzy się to jako puste doły kontrolne.
- Po 3–5 godzinach inkubacji obserwuj mikropłytkę, aby upewnić się, że komórki są do niej przymocowane na jednolitym poziomie na dnie każdego dołka.
- Jeśli komórki nie są jeszcze przyłączone, płytka może zostać umieszczona w inkubatorzeCO2 o temperaturze 37 °C na dodatkowy czas, aż komórki zostaną dokładnie przymocowane.
- Następnie przygotuj mikropłytkę z przylegającymi komórkami do mycia zgodnie z krokiem 4, aby przejść do testu.
- W przypadku komórek nieprzylegających (limfocytów T) należy pokryć mikropłytę poli-D-lizyną przed dodaniem komórek do płytki.
UWAGA: Chociaż w tym protokole zalecana jest powłoka z poli-D-Lizyną, w zależności od typu komórki, bardziej odpowiednia może być inna powłoka płytowa (np. kolagen, fibronektyna, żelatyna). Jeśli używasz alternatywnej powłoki, prosimy o stosowanie instrukcji producenta. - Aby pokryć mikropłytkę, przygotuj 2,5 mL roztworu poli-D-Lizyny o pojemności 20 μg/mL (50-krotne rozcieńczenie roztworu wodnego 1 mg/1 mL) w 0,1 M wodorowęglanu sodu, pH 8,0 (wodorowęglan zapewnia optymalne pH adsorpcji adhezyjnej). Ten krok można wykonać przed wykonaniem testu lub w dniu jego przeprowadzenia.
- Nałóż 25 μL roztworu do każdego dołka płyty i inkubuj na stole lub na bujace w temperaturze pokojowej przez 20–30 minut.
- Aspiruj lub pipetuj pozostały roztwór i przepłucz każdy dołek dwukrotnie, używając 200 μL wody wolnej od RNAazy/DNA.
- Poczekaj, aż doły wyschną (1–2 godziny), zanim zasiewasz komórki do mikropłyty.
- Następnie przygotuj mikropłytę z nieprzylegającymi komórkami do etapu płukania, wirując płytkę w dawce 200 x g przez 3 minuty bez przerwy, aby upewnić się, że komórki są zawieszone na dnie każdego dołku.
- Przechodź do kroku 4 i kontynuuj resztę testu, jak opisano w krokach 5–7.
Wyniki
Ten zintegrowany protokół został opracowany, aby umożliwić wykonywanie obu testów na tej samej płytce. Na przykład ta metoda została użyta do wyjaśnienia sygnalizacji przesłuchowej mGluR1−TCR dotyczącej metabolicznej sprawności komórek T CD8+ podczas aktywacji10. Celem było ocenenie wpływu hamowania mGluR1 na przejście do glikolizy oraz zmiany w oddychaniu mitochondrialnym, procesach niezbędnych do optymalnego funkcjonowania limfocytów T, przy jednoczesnym minimalizowaniu liczby komórek T używanych w każdym eksperymencie. Ta sama technika pojedynczej płytki była skutecznie stosowana także do innych typów komórek, takich jak przylegające makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM; Rysunek 4 i Rysunek 5), oraz do komórek nieprzylegających, takich jak ludzkie komórki monojądrowe krwi obwodowej (PMBC; Rysunek 3). Wykazano, że blokada sygnalizacji mGluR1 na aktywowanych komórkach CD8+ T wpływa na produkcję energii mitochondrialnej i niemitochondrialnej. Natomiast naiwne komórki nie wykazały istotnych zmian w swoich profilach energetycznych metabolicznych (Rysunek 6A,B). Test stresowy Mito aktywowanych komórek CD8+ T wykazał wysoką bazalną i maksymalną zdolność oddechową oraz pojemność rezerw oddechowych (Rysunek 6C). Limfocyty T leczone CPCCOEt, niekonkurencyjnym antagonistą, który blokuje sygnały dalsze po wiązaniu glutaminianu z mGluR1, miały zmniejszone tempo zużycia tlenu (OCR) podobnie jak komórki naiwne i skutkowały zmniejszoną produkcją ATP (Rysunek 6C). Test glikolizy wykazał również, że tylko nieleczone aktywowane komórki CD8+ T produkowały ATP poprzez glikolizę, a leczenie CPCCOE wykazywało aktywność metaboliczną porównywalną z naiwnym stanem (rysunek 6D). Wyniki te potwierdzają, że sygnalizacja mGluR1 jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania limfocytów CD8⁺ T po aktywacji.
Rysunek 1: Ten rysunek ilustruje przegląd układu płyt mikropłytki, która obejmuje test stresu mito i glikolizy na tej samej płycie. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 2: Ładowanie wkładu do leku. (A) Szczegółowa mapa czujników i portów z tyłu i przodu naboju, oznaczająca, który lek należy załadować do którego portu. (B) Zalecana orientacja prowadnic na górze wkładki do ładowania odpowiednich portów oraz zalecane ustawienie do użycia wielokanałowego pipettora na prowadnicach. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 3: Używanie programu WAVE do przeprowadzenia i analizy testu. (A) Proces konfiguracji programu obejmuje wybór typu testu, przypisywanie grup, tworzenie mapy płyty oraz programowanie portów leków. (B) Kolejność leków do odpowiednich portów zależy od tego, czy próbka jest stresowana mito czy glikoliza. (C) Zbliżenie barwienia SRB podczas ostatniego etapu normalizacji. (D) Po normalizacji dane płyt mogą być eksportowane osobno jako test stresowy glikolizy i Mito dla tej samej płyty. (E) Dane dotyczące naprężeń Mito można wybrać poprzez edycję aktualnego wyboru tylko dla próbek naprężeń Mito. (F) Dane do glikolizy można wybrać poprzez edycję aktualnego wyboru tylko dla próbek glikolizy. Przykładowe dane użyte na tym rysunku pochodzą z analizy ludzkich obwodowych komórek monojądrowych krwi. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 4: Jednoczesne działanie Mito Stress na tej samej płytce. Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego, pochodzące od 2-miesięcznych myszy WT i Tusc2 KO, poddawano obu typom analiz. Komórki były albo pozostawiane bez leczenia (sham), albo stymulowane LPS (100 ng/mL) przez 5 godzin przed nałożeniem (30 000 komórek/dołek). Testy stresu mito i glikolizy przeprowadzono równolegle, aby umożliwić dokładne porównanie, jak pokazano na Rysunku 1. (A) Profile stresu Mito dla różnych typów komórek (WT i KO) oraz stanów (naiwne i aktywowane), generowane za pomocą oprogramowania Wave. Normalizację przeprowadzono za pomocą barwienia SRB, jak opisano w kroku 7. (B) Porównawcze wykresy słupkowe parametrów analizowanych w każdym teście. ∗p ≤ 0,05, ∗∗p ≤ 0,005, test Student T. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 5: Jednoczesne wykonywanie testów obciążenia glikolizy wykonywanych na tej samej płytce. Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego, pochodzące od 2-miesięcznych myszy WT i Tusc2 KO, poddawano obu typom analiz. Komórki były albo pozostawiane bez leczenia (sham), albo stymulowane LPS (100 ng/mL) przez 5 godzin przed nałożeniem (30 000 komórek/dołek). Testy stresu mito i glikolizy przeprowadzono równolegle, aby umożliwić dokładne porównanie, jak pokazano na Rysunku 1. (A) Profile stresu glikolizowego dla różnych typów komórek (WT i KO) oraz warunków (naiwne i aktywowane), generowane za pomocą oprogramowania Wave. Normalizację przeprowadzono za pomocą barwienia SRB, jak opisano w kroku 7. (B) Porównawcze wykresy słupkowe parametrów analizowanych w każdym teście. ∗p ≤ 0,05, ∗∗p ≤ 0,005, test Student T. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Rysunek 6: Testy stresu mito i glikolizy na jednej płytce z użyciem komórek T CD8⁺ oczyszczonych z myszy splenocytów. (A) Reprezentatywne profile mitochondrialnego testu stresowego porównujące zmiany zależne od leku w tempie spożycia tlenu (OCR) komórek T CD8+ wykonywanych z naiwnymi, aktywowanymi i aktywowanymi grupami inhibitorów T + mGluR1. (B) Reprezentatywne profile testu glikolizy porównujące zmiany zależne od leku w szybkości zakwaszania zewnątrzkomórkowego (ECAR) komórek CD8+ T wykonywanych na grupach inhibitorów naiwnych, aktywowanych i aktywowanych + mGluR1. (C) Wykresy słupkowe pokazujące ilościowe zmiany w różnych parametrach oddychania mitochondrialnego komórek T CD8+ w grupach inhibitorów naiwnych, aktywowanych i aktywowanych + mGluR1. Kreski oznaczają średnią ± SEM (n = 4). (D) Wykresy słupkowe pokazujące ilościowe zmiany w różnych parametrach glikolizy w naiwnych, aktywowanych i aktywowanych komórkach CD8+ T inhibitora + mGluR1. Słupki oznaczają średnią ± SEM (n = 4). ∗p ≤ 0,05, ∗∗p ≤ 0,005, Test T-ucznia. Ten rysunek został zaadaptowany z Aquino i in.10. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
| Ostateczna studnia (μM) | Objętość roztworu zapasowego (μL) | Media Volume (uL) | 10x port (μM) | Objętość dodana do portu (μL) | |
| Oligomycyna z Port A | 0.5 | 150 | 2850 | 5 | 20 |
| 1.5 | 450 | 2550 | 15 | 20 | |
| 2.5 | 630 | 1890 | 25 | 20 | |
| Port B FCCP | 0.125 | 37.5 | 2962.5 | 1.25 | 22 |
| 0.25 | 75 | 2925 | 2.5 | 22 | |
| 0.5 | 150 | 2850 | 5 | 22 | |
| 1 | 300 | 2700 | 10 | 22 | |
| 2 | 600 | 2400 | 20 | 22 | |
| Port C Rotenone/Antymycyna | 0.5 | 300 | 2700 | 5 | 24 |
Tabela 1: Przygotowanie złożone do ładowania nabojów sensorów XFe96 dla obciążenia Mito.
| Ostatnia studnia | Objętość roztworu zapasowego (μL) | Objętość mediów (μL) | Port 10x | Objętość dodana do portu (μL) | |
| Port A Glukoza | 250 mM | 100 | 2400 | 20 | |
| Oligomicyna z portu B | 0,5 μM | 150 | 2850 | 5 uM | 22 |
| 1,5 μM | 450 | 2550 | 15 uM | 22 | |
| 2,5 μM | 630 | 1890 | 25 uM | 22 | |
| Port C 2-DG | 50 mM | 3000 | 0 | 500mM | 24 |
Tabela 2: Przygotowanie związków do ładowania wkładów sensorowych XFe96 do glikolizy.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół umożliwia dokładne i wiarygodne porównania dwóch głównych szlaków wytwarzających energię: fosforylacji oksydacyjnej (produkcja mitochondrialnego ATP) oraz glikolizy beztlenowej (produkcja ATP poza mitochondriami, nie wymagająca tlenu) oraz dwóch różnych testów obciążeniowych w jednym przebiegu. Dodatkowo, projekt eksperymentu uwzględnia typ analizowanych komórek, co pozwala na szersze zrozumienie analizy metabolizmu komórkowego, jednocześnie minimalizując ilość użytych próbek i odczynników.
Różnice między testami stresu Mito a glikolizą wykonywanymi na protokołach analizy metabolicznej w czasie rzeczywistym zaprojektowanych i sprzedawanych przez Agilent, Inc. są znaczne. Te dwa testy wymagają różnych mediów testowych, konkretnych leków oraz różnych narzędzi. Test stresowy Mito wykorzystuje media testowe zawierające glukozę, L-glutaminę i pirosurowian, podczas gdy test stresowy glikolizy wykorzystuje nośniki bezglukozowe uzupełnione wyłącznie L-glutaminą. Testy są analizowane z różnymi związkami: oligomycyna → FCCP → antymycyna A + rotenon do testu obciążeniowego mito oraz oligomycyna → glukoza → 2-DG do testu stresowego glikolizy. W związku z tym testy te są zazwyczaj wykonywane na oddzielnych płytkach w różnych momentach, ponieważ analizator metaboliczny w czasie rzeczywistym obsługuje tylko jedną płytkę naraz.
Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowano wspólny protokół umożliwiający wykonywanie obu testów na tej samej płytce przy użyciu zestawu Mito Stress Test z poprzedniego artykułu10. Przedstawiono zalecenia dotyczące analizy różnych typów komórek, w tym komórek odpornościowych, nowotworowych, komórek adherentnych oraz komórek zawiesiny. Wytyczne te mogą być stosowane indywidualnie lub w kombinacji, oferując elastyczność w zależności od celów eksperymentatora i dostępnych zasobów.
Normalizacja komórek za pomocą testu SRB (DAPI) pozwala również na większą elastyczność, w przypadku użycia wielu typów komórek o różnym tempie wzrostu/rozmiarze 9,11. Ponadto, ponieważ technika ta wymaga tylko jednej płytki na dwa testy, można ją łączyć z różnymi typami próbek do pomiaru procesów metabolicznych.
Czynniki wpływające na skuteczność metody: (1) optymalna liczba komórek na studnię; (2) efektywne przyczepianie komórek; oraz (3) ostrożne ładowanie nabojów, ponieważ należy załadować dwa odrębne zestawy leków w oddzielnych częściach naboju.
Zalety naukowe i eksperymentalne metody obejmują bezpośrednie porównania w tym samym kontekście biologicznym. Stosowanie tych samych komórek w identycznych warunkach hodowli eliminuje zmienność między płytkami lub seriami i pozwala na dokładniejsze porównanie funkcji mitochondrialnej i glikolizycznej w tej samej próbce. Zawiera także zintegrowany obraz metabolizmu komórkowego. Równoległe mierzenie fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) i glikolizy daje kompleksowy obraz ogólnego metabolizmu energetycznego komórki oraz jej elastyczności w przełączaniu się między szlakami. Ten równoległy test zmniejsza również zmienność biologiczną. Różnice w gęstości płytek komórkowych, liczbie przejścia czy warunkach środowiskowych są minimalizowane, ponieważ oba testy przeprowadza się na tej samej populacji komórek, co prowadzi do lepszej powtarzalności. Wykonywanie obu testów jednocześnie zmniejsza zmienność między cyklami spowodowaną kalibracją wkładu czujnika, zmianami temperatury lub przygotowaniem odczynnika.
Korzyści techniczne tej techniki obejmują zwiększoną efektywność poprzez łączenie testów, co oszczędza czas, odczynniki i materiały zużywalne na płytach, co czyni ją ważną dla badań na dużą skalę lub o dużej przepustowości. Pozwala to na niższe wymagania dotyczące próbek. Potrzebna jest tylko jedna płytka komórek, co jest korzystne przy pracy z ograniczonymi lub rzadkimi komórkami pierwotnymi (np. limfocytami, komórkami pochodzącymi z mózgu). Lepsza normalizacja w różnych testach wynika, ponieważ oba testy używają tej samej płytki, normalizacji (np. do zawartości białka lub liczby komórek) i są bardziej spójne oraz wiarygodne. Dzięki tej spójności korelacja danych jest zwiększona. Bezpośrednie parowanie parametrów mitochondrialnych i glikolitycznych z tej samej próby ułatwia profilowanie metaboliczne i analizy statystyczne.
Jedynym znanym ograniczeniem tej techniki jest to, że połączenie dwóch protokołów na jednej płycie zmniejsza liczbę dostępnych replikacji studni. Zaleca się ograniczenie liczby warunków na płytę, aby zapewnić co najmniej 8 replikacji studni na jeden warunek.
Podziękowania
Badania te zostały sfinansowane przez National Institute on Minority Health and Health Disparities (NIMHD), grant numer 5U54MD007586-37, projekt pilotażowy dla A. Ivanovej; Grant NHGRI Diversity Center for Genome Research UG3HG013248, projekt badawczy 2, PI-Ivanova, a także część wsparcia zapewniła Genprex Inc. Ponadto badania te prowadzono w zakładach podstawowych Meharry Medical College, które otrzymują wsparcie z grantów NIH MD007586, CA163069 i S10RR025497.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 15 mL probówki do wirówek, zapakowane w woreczki śrubowe, sterylne, 500 probówek na jednostkę | Genesee Scientific | 21-408B | |
| Biologix Pipet Tips-200 μ L Extended (Pack, Sterile) | Biologix USA | SKU 21-0200 | |
| BioTek Synergy H1 | BIOSPX | ||
| Mikroskop fluorescencyjny BZ-X700 | Keyence | ||
| Corning Sterylne jednorazowe rezerwuary odczynników Costar | Fisher | 4873 | |
| Roztwór D-(+)-glukozy 45% w H20 | Sigma | G9769 | |
| DAPI, chlorowodorek | Thermofisher Scientific | D1306 | |
| Wirówka Eppendorf 5810 R | Eppendorf | ||
| GenClone Fetal Bovine Serum Inaktywowane | Genesee Scientific | 25-514H | |
| L-Glutamina 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Olympus Plastics 22-284, Olympus 1,7ml mikrorurki, przezroczysty, sterylny polipropylen, odporny na wrzenie, ster, 50/worek, 250 tubek/jednostka | Genesee Scientific | 22-284 | |
| Olympus Plastics 28-108, 50ml stożkowe rurki wirówkowe, polipropylenowe hurtowo, sterylne, 20 worków po 25 probówek, 500/jednostka | Genesee Scientific | 28-108 | |
| Paraformaldehyd 16% roztworu EM | Nauka o mikroskopii elektronowej | 15710 | |
| Poli-D-lizynowy hydrobromik liofilizowany | Sigma | P6407 | |
| Precision 180 Kąpiel Wodna | Precision Scientific | 51221060 | |
| Precyzyjny Naukowy Inkubator GCA Model 26 | Thelco | 51221091 | |
| QBI 120-095-671 Mieszanka penicylina i streptomycyna, 100x mieszanka pen/streptokok, 10 x 10 mL/jednostka | Genesee Scientific | 25-827 | |
| QBI PBS, 1x, bez Ca, Mg, Phenol Red, 0,1um sterylnie filtrowany | Genesee Scientific | 25-507B | |
| RPMI 1640, z L-glutaminą | Genesee Scientific | 25-506 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH 7,4, 500 mL | Agilent | 103576-100 | |
| Analizator Seahorse XFe96 | Agilent | ||
| Seahorse XFe96/XF Pro FluxPak | Agilent | 103792-100 | zawiera 18 wkładów sensorowych XFe96/XF Pro, 18 mikropłyt do hodowli komórek XFe96/XF Pro, 1 butelkę roztworu Seahorse XF Calibrant Solution 500mL oraz 3 pary prowadnic załadowania XF |
| Wodorowęglan sodu | Sigma | S6014 | |
| Pirowęglan sodu (100mM) 100x | Gibco | 11360-070 | |
| Test SRB (zestaw testowy na siarkę B z siarką) | Abcam | ab235935 | |
| VWR Signature Ergonomiczny, Wysokowydajny wielokanałowy pipettor | Avantor | 89079-956 | |
| Zestaw do testu wytrzymałości XF Cell Mito | Agilent | 103015-100 | |
| Zestaw do testowania szybkości glikolitycznej XF | Agilent | 103344-100 |
Bibliografia
- Caines, J. K., Barnes, D. A., Berry, M. D. The use of Seahorse XF assays to interrogate real-time energy metabolism in cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 225-234 (2022).
- Marinangeli, C., Kluza, J., Marchetti, P., Buee, L., Vingtdeux, V. Study of ampk-regulated metabolic fluxes in neurons using the Seahorse XF Analyzer. Methods Mol Biol. 1732, 289-305 (2018).
- Tan, W. J. T., Santos-Sacchi, J., Tonello, J., Shanker, A., Ivanova, A. V. Pharmacological modulation of energy and metabolic pathways protects hearing in the fus1/tusc2 knockout model of mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Antioxidants (Basel). 12 (6), 1225(2023).
- Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40, 365-375 (2018).
- Hammoud, S., et al. Tubular CPT1a deletion minimally affects aging and chronic kidney injury. JCI Insight. 9 (6), e171961(2024).
- Wei, C., Heitmeier, M., Hruz, P. W., Shanmugam, M. Evaluating the efficacy of glut inhibitors using a Seahorse extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1713, 69-75 (2018).
- Zhu, Y., et al. The role of PKM2-mediated metabolic reprogramming in the osteogenic differentiation of BMSCs under diabetic periodontitis conditions. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 186(2025).
- Liu, J., Zhang, X., Fan, X. Liensinine reshapes the immune microenvironment and enhances immunotherapy by reprogramming metabolism through the AMPK-HIF-1α axis in hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 208(2025).
- Van Der Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113 (3), 3.16B.1-3.16B.14 (2016).
- Teresa P de Aquino, M., et al. Glutamate receptor–TCR signaling potentiates full CD8+ T cell activation and effector function in tumor immunity. iScience. 28 (10), 112772(2025).
- Hammoud, S., Kern, J., Mukherjee, S. Assays to enhance metabolic phenotyping in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 328 (4), 563-577 (2025).
Przedruki i uprawnienia
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny