Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja pierwotna, hodowla i fenotypowa weryfikacja chondrocytów stawowych kolana szczura

848 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69509

⸱

7 listopada 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Longfu Hospital, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje izolację i hodowlę pierwotnych chondrocytów stawowych kolana szczura przy użyciu sekwencyjnego trawienia enzymatycznego. Metoda ta daje chondrocyty o zweryfikowanych cechach fenotypowych, zapewniając naukowcom wiarygodne podejście do badań chrząstki.

Streszczenie

Uszkodzenia chrząstki wynikające z urazu, starzenia się lub schorzeń zapalnych pozostają istotnym wyzwaniem klinicznym ze względu na wrodzoną ograniczoną zdolność regeneracyjną tkanki. Chondrocyty, będące jedynym składnikiem komórkowym chrząstki, odpowiadają za utrzymanie struktury i funkcji macierzy zewnątrzkomórkowej, co czyni je niezbędnym do zrozumienia fizjologii, patologii i regeneracji chrząstki. Obecne badanie przedstawia kompleksowy i ustandaryzowany protokół izolacji, hodowli oraz weryfikacji fenotypowej pierwotnych chondrocytów stawowych szczurów z przeklenięcia kolana. Procedura wykorzystuje młode, ssące szczury, aby zapewnić maksymalną żywotność komórek, oraz stosuje sekwencyjne trawienie enzymatyczne z trypsyną i kolagenazą typu II dla efektywnej ekstrakcji komórek. Fenotyp chondrocytów jest weryfikowany poprzez immunofluorescencję kolagenu typu II, analizę cytometryczną przepływową oraz testy stymulujące interleukinę (IL)-1β, aby potwierdzić tożsamość komórkową i reakcję zapalną. Ten zoptymalizowany i powtarzalny workflow umożliwia generowanie hodowli chondrocytów o wysokiej czystości odpowiednich do badań lekowych, badań mechanistycznych oraz zastosowań inżynierii tkankowej, co przyczynia się do rozwoju badań nad biologią chrząstki.

Wprowadzenie

Chrząstka to wyspecjalizowany rodzaj tkanki łącznej, która pełni wiele kluczowych funkcji, w tym zapewnia wsparcie, amortyzację i amortyzację wstrząsów. Odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu stabilności strukturalnej i zapewnieniu mobilności w obrębie układu szkieletowego 2,3. Uszkodzenie mechaniczne, zmiany zwyrodnieniowe, stan zapalny lub zaburzenia metaboliczne mogą spowodować uszkodzenie chrząstki 4,5,6. Ze względu na wrodzony brak naczyń krwionośnych i nerwów, w połączeniu z ograniczoną zdolnością proliferacji chondrocytów, naprawa chrząstki stanowi poważne wyzwania. Choroby takie jak choroba zwyrodnieniowa stawów (wywołane zmianami zwyrodnieniowymi i urazami mechanicznymi) oraz reumatoidalne zapalenie stawów (spowodowane autoimmunologiczną reakcją zapalną) mogą powodować nieodwracalne uszkodzenia chrząstki, znacznie obniżając jakość życia pacjentów 7,8,9. Jako wyłączny typ komórek w tkance chrząstki, chondrocyty odpowiadają za kluczowe funkcje, takie jak wydzielanie i utrzymanie macierzy zewnątrzkomórkowej, wspieranie rozwoju szkieletowego, udział w amortyzowaniu i naprawie stawów oraz centralną regulację wzrostu i metabolizmu chrząstki 10,11,12.

Chondrocyty są ograniczone do luk macierzy naczyniowej, co skutkuje poważnie ograniczoną zdolnością do własnej proliferacji i naprawy tkanek13,14. Stan funkcjonalny chondrocytów bezpośrednio determinuje zdrowie tkanki chrząstki15. Dysfunkcja chondrocytów, spowodowana starzeniem, stanem zapalnym, urazem lub czynnikami genetycznymi, prowadzi do zmniejszonej syntezy macierzy i zwiększonej degradacji16,17. Ten proces patologiczny powoduje degenerację chrząstki (np. w chorobie zwyrodnieniowej stawów), co prowadzi do upośledzenia jej niezbędnych funkcji wsparcia, amortyzacji i nawilżenia. Ograniczona zdolność regeneracyjna chrząstki jest główną przyczyną poważnych trudności w jej naprawie i stanowi kluczowy obszar badań we współczesnej ortopedyce oraz medycynie regeneracyjnej. Obecne badania nad chrząstką stały się głównym obszarem zainteresowania w tej dziedzinie, a interwencje oparte na lekach, inżynieria tkankowa oraz terapia genowa wymagają izolacji chondrocytów w badaniach in vitro 18,19,20,21,22,23,24,25 . W związku z tym izolowanie i identyfikacja chondrocytów stanowi kluczowy krok w wielu podejściach eksperymentalnych. Chociaż uwiecznione linie komórkowe przypominające chondrocyty, takie jak SW1353, są używane jako wygodne zastępstwa w niektórych badaniach, brakuje im ekspresji krytycznych markerów fenotypowych, zwłaszcza kolagenu typu II, który jest niezbędny do autentycznej funkcji chondrocytów i tworzenia macierzy26. Dlatego pierwotne chondrocyty pozostają złotym standardem w badaniach wymagających istotności fizjologicznej. W porównaniu z wcześniej opublikowanymi protokołami wymagającymi wielu kombinacji enzymów lub rozległej manipulacji mechanicznej, uproszczone podejście do trawienia enzymatycznego zmniejsza złożoność i czas przetwarzania w porównaniu z metodami wymagającymi wielu kombinacji enzymów lub rozległej manipulacji mechanicznej. Ponadto wprowadzenie kompleksowych etapów walidacji zapewnia spójną identyfikację funkcjonalnych chondrocytów i zwiększa powtarzalność w różnych eksperymentach i laboratoriach.

Chondrocyty charakteryzują się wydzielaniem kolagenu typu II, podczas gdy pod wpływem czynników zapalnych intensywnie syntetyzują i uwalniają matrycowe metaloproteinazy (MMPs)27. Dlatego po izolacji chondrocytów komórki zostały zidentyfikowane za pomocą immunofluorescencji kolagenu typu II, a czystość chondrocytów oceniono za pomocą cytometrii przepływowej. Stymulowane interleukiną (IL)-1β, aby potwierdzić ich charakterystyczną syntezę i wydzielanie metaloproteinaz matrycowych. Badanie opisuje proces ekstrakcji i charakteryzacji chondrocytów u noworodkowych myszy, tworząc podstawę dla kolejnych eksperymentów związanych z chondrocytami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wykorzystanie uczestników zwierzęcych w tym badaniu zostało zatwierdzone przez komisję etyki opieki i dobrostanu zwierząt eksperymentalnych Szpitala Przyjaźni China-Japan (nr zryhyy21-21-05-16). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Zwierzęta doświadczalne i prace przygotowawcze

UWAGA: Chrząstki ze stawów szczurów, królików i ludzi po całkowitej artroplastyce kolana mogą być wykorzystywane do izolacji chondrocytów. Jednak ze względu na ich wyższą żywotność, w tym badaniu do ekstrakcji chondrocytów wykorzystano szczury ssące.

  1. Transport szczurów ssających z eksperymentalnego zakładu produkcji zwierząt do laboratorium za pomocą specjalistycznych pojemników transferowych.
  2. Uśpiaj szczury ssające przez uduszenieCO2 (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi) i płucz ich ciała sterylnym roztworem.
  3. Zanurz uśpione szczury w etanolu 75% na 10 minut, aby zdezynfekować zanieczyszczenia powierzchniowe.
  4. Przenieś zdezynfekowane szczury do szafki bioasekuracyjnej i umieść je w sterylnych miskach Petriego.
    UWAGA: Dokładne czyszczenie powierzchni i zanurzenie ssących szczurów w etanolu to kluczowe kroki, aby zapobiec zakażeniu bakteryjnym lub grzybiczym, które może negatywnie wpłynąć na kolejne eksperymenty.

2. Izolacja tkanki chrząstki stawowej

UWAGA: Chrząstka noworodkowa wygląda jako przezroczysta, niebieskawo-biała warstwa pokrywająca epifiks kostny. W tym etapie należy stosować rygorystyczne techniki aseptyczne, aby uniknąć skażenia mogącego zagrozić kolejnym eksperymentom.

  1. Odizoluj staw kolanowy ssącego szczura za pomocą skalpela i nożyczek okulistycznych, a następnie usuń leżącą tkankę skórną.
  2. Przenieś rozcięty staw kolanowy do nowej sterylnej szalki Petriego i wymień skalpel oraz nożyczki okulistyczne.
  3. Usuń chrząstkę stawową ze stawu kolanowego za pomocą skalpela, a następnie dokładnie przytnij otaczającą tkankę łączną nożyczkami okulistycznymi.

3. Trawienie tkanki chrząstki

UWAGA: Stosuj trypsinę do trawienia tkanek łącznych otaczających chrząstkę, a następnie 0,2% kolagenazy II do trawienia w macierzy chrząstki.

  1. Dodaj pobraną chrząstkę do 3 objętości 0,25% trypsyny i inkubuj w termostalicznym shakerze o temperaturze 37 °C z mieszaniem przez 30 minut.
  2. Zakończ trawienie, dodając PBS zawierający 10% surowicy bydła płodu (FBS). Usuń przylegające tkanki z chrząstki za pomocą nożyczek okulistycznych. Wirówka (4 °C, 500 × g, 5 min) i wyrzuć supernatant.
  3. Ponownie zawiesić tkankę chrząstki w PBS, wirówce (4 °C, 500 × g, 5 min) i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok prania 3 razy.
  4. Dodaj 0,2% kolagenazy II do przetworzonej tkanki chrząstki i traw w termotetycznym shakerze o temperaturze 37 °C z mieszaniem przez 4 godziny.

4. Izolacja i hodowla chondrocytów

UWAGA: Wszystkie procedury muszą być wykonywane w warunkach sterylnych w szafie biobezpieczeństwa. Sterylne rękawice powinny być noszone podczas mechanicznej dysocjacji tkanki chrząstki za pomocą tłoka strzykawkowego na sicie komórkowym, aby zapobiec eksperymentalnemu zanieczyszczeniu. W standardowych warunkach hodowli chondrocyty pierwotne zazwyczaj potrzebują około 2-3 dni, aby osiągnąć 80%-90% zbiegu podczas pierwszego przejścia.

  1. Umieść sitko komórkowe o pojemności 200 μm nad sterylną miską hodowlową i przefiltruj strawioną zawiesinę chrząstki przez siatkę.
  2. Zmiel resztki chrząstki na sicie za pomocą sterylnej tłoka strzykawki, a następnie przepłucz sitko kompletnym medium DMEM.
  3. Zbierz wszystkie filtraty, zawiruj (4 °C, 500 × g, 5 minut) i wyrzuć supernatant.
  4. Ponownie zawiesić pellet w PBS, wirówce (4 °C, 500 × g, 5 min) i wyrzuć supernatant.
  5. Ponownie zawiesijcie komórki w pełnym medium DMEM i przenieście do kolby do hodowli T25.
  6. Kolbę inkubuj w nawilżonym inkubatorze (37 °C, 5%CO2).
  7. Komórki przejściowe w tym zbiegu za pomocą trypsyny-EDTA i subkultury w stosunku 1:2.

5. Immunofluorescencyjne barwienie kolagenu typu II w celu identyfikacji chondrocytów

UWAGA: Przylegające chondrocyty charakteryzują się morfologią wrzecionowatą i wielokątną. Wszystkie analizy biomarkerów przedstawione w tym badaniu zostały przeprowadzone przy użyciu komórek w pasucie 2. Chondrocyty w przejściu 3 zaczynają wykazywać wyraźniejsze odróżnienia, charakteryzujące się przesunięciem w kierunku wrzecionowatej, fibroblastowej morfologii oraz spowolnieniem tempa proliferacji. Ta zmiana fenotypowa staje się bardziej widoczna po fragmencie 4. Do przejścia 6 zdecydowana większość komórek przyjmuje wydłużony, fibroblastowy kształt. Rozcieńczenia przeciwciał zostały określone na podstawie zaleceń producenta i zatwierdzone przez nasze wstępne eksperymenty, aby zapewnić optymalną swoistość i intensywność sygnału.

  1. Nasiaj chondrocyty w 24-dołkowej płycie i hodowla przez 24 godziny, aby umożliwić przyczepność komórek.
  2. Usuń pożywkę hodowlową i przemyj komórki 3 razy PBS (dodaj PBS do każdego dołku, inkubuj przez 5 minut, a następnie aspiruj).
  3. Skręć komórki 4% paraformaldehydem przez 10 minut, a potem przemyj 3 razy PBS.
  4. Przepuszczać komórki 0,3% Triton X-100 (przygotowany w PBS) przez 10 minut.
  5. Przemyj komórki 3 razy PBS, a następnie blokuj roztworem blokującym bez zwierząt (150 μL/dołek, rozcieńczony 5× w PBS) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  6. Usuń roztwór blokujący i inkubuj z pierwotnym przeciwciałem (anty-Col II, rozcieńczenie 1:200) przez noc w temperaturze 4 °C.
  7. Pobierz pierwotne przeciwciało i przemyj komórki 3 razy PBS.
  8. Dodaj przeciwciało przeciw IgG z konjugowanym 488 z Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:50) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny w ciemności.
  9. Usuń przeciwciało wtórne i przemyj komórki 3 razy PBS.
  10. Zamontuj na środku antyfade zawierającym DAPI i susz w ciemności przez 10 minut.
  11. Obserwuj i rejestruj obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

6. Analiza cytometryczna przepływu czystości chondrocytów

UWAGA: Chondrocyty charakteryzują się zdolnością do syntezy i wydzielania kolagenu typu II, który pełni funkcję definitywnego markera identyfikacji. Linia komórkowa chondrosarcoma SW1353, choć wykazuje pewne cechy chondrocytowe, nie posiada zdolności wydzielania kolagenu typu II i dlatego stanowi negatywną kontrolę w tym eksperymencie.

  1. Trawić zarówno chondrocyty, jak i komórki SW1353 za pomocą trypsyny wolnej od EDTA.
  2. Zneutralizuj trawienie kompletnym nośnikiem DMEM i ponownie zawiesij komórki w PBS.
  3. Inkubuj komórki roztworem fiksacyjnym/permeabilizacyjnym przez 15 minut, a następnie dodaj 1 ml buforu do płukania.
  4. Wirówka (500 × g, 5 min), wyrzuć supernatant i inkubuj z 100 μL przeciwciałem antytypu II (rozcieńczenie 1:100) przez 15 minut chronionych przed światłem, po czym dodaj 1 ml buforu płukania.
  5. Wirówka (500 × g, 5 min), odrzuć supernatant i inkubuj z przeciwciałem przeciwtorowym IgG przeciw królikom sprzężonym z Alexa Fluor 488 przez 30 minut chronionym przed światłem, a następnie dodaj 1 ml buforu płukania.
  6. Wirówka (500 × g, 5 min), odrzuć supernatant, ponownie zawiesić każdą próbkę w buforze 200 μL i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej.

7. Stymulacja chondrocytów IL-1β

UWAGA: Produkcja metaloproteinaz matrycowych (MMP) w odpowiedzi na stymulację IL-1β jest cechą charakterystyczną chondrocytów. Dlatego badanie to wykorzystuje stymulację IL-1β do potwierdzenia tej cechy fenotypowej w izolowanych chondrocytach.

  1. Trawić chondrocyty z kolb hodowlanych i zawiesić w pełnym nośniku DMEM.
  2. Policz komórki i dostosuj stężenie do 5 × 105 komórek /mL, używając kompletnego DMEM.
  3. Komórki zasiewające do płyty 6-dołkowej (łącznie 24 dołki), z czego 12 dołków oznaczonych jako grupa kontrolna pusta, a 12 dołków jako grupa stymulująca IL-1β.
  4. Inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 12 godzin.
  5. Po całkowitej adhezji komórki dodaj 10 ng/mL IL-1β do grupy stymulacyjnej.
  6. Pobierz supernatanty hodowli komórkowej po 24 godzinach do analizy Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
  7. Umyj komórki dwa razy PBS.
  8. Studnie kontrolne Lyse 6 oraz 6 studni stymulowanych IL-1β z buforem RIPA do dalszej analizy Western blot.
  9. Ekstrakt RNA z 6 dołków kontrolnych i 6 studni stymulowanych IL-1β za pomocą TRIzol do analizy qPCR.

8. Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

UWAGA: Wszystkie eksperymenty związane z RNA przeprowadzono przy użyciu materiałów zużywalnych DEPC. Krótko rurki i końcówki były moczone w 0,1% DEPC przez 12 godzin, autoklawowano (121 °C, 20 min), aby dezaktywować zarówno RNazy, jak i resztki DEPC, a następnie suszono w piekarniku przed użyciem.

  1. Dodaj 1 mL Trizolu do pelletu komórkowego i ujednolicz za pomocą homogenizatora. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  2. Dodaj 0,2 mL chloroformu i intensywnie wiruj przez 30 sekund. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
  3. Wirówka w temperaturze 4 °C, 12 000 × g przez 15 minut. Przelej bezbarwną fazę wodną do nowej rurki mikrowirówki i dodaj równą objętość izopropanolu.
  4. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wirówka w temperaturze 4 °C, 12 000 × g przez 10 minut. Usuń supernatant i zachowaj pellet RNA.
  5. Dodaj 1 ml wcześniej schłodzonego etanolu 75% do pelletu RNA. Dokładnie przeprowadź wir i wiruj w temperaturze 4 °C, 12 000 × g przez 5 minut. Usuń supernatant i zachowaj pellet RNA.
  6. Susz na powietrzu pellet RNA w szafce do zabezpieczeń biologicznych. Rozpuszcz RNA w 20 μL wody wolnej od RNazy.
  7. Zmierz stężenie i jakość RNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop.
  8. Odwrotnie przepisać całkowite RNA na cDNA za pomocą zestawu do transkrypcji odwrotnej.
  9. Przygotuj mieszaninę reakcji zawierającą 1 μg całkowitego RNA, 4 μL roztworu chlorku magnezu, 2 μL mieszaniny dNTP, 0,5 μL inhibitora RNazy, 0,6 μL transkryptozy odwróconej AMV, 1 μL zapalników losowych oraz wody wolnej od RNazy, aby dostosować końcową objętość do 20 μL.
  10. Inkubuj reakcję w 42 °C przez 15 minut, a następnie w 95 °C przez 5 minut. Schłodzić do 4 °C przez 5 minut, następnie rozcieńczyć cDNA wodą wolną od RNazy.
  11. Przygotuj mieszaninę reakcji PCR zawierającą 2 μL cDNA, 10 μL SYBR Green Real-time PCR Master Mix, sprężarki do przodu i do tyłu (Tabela 1) w końcowym stężeniu 0,2 μmol/l każda oraz wodę wolną od RNazy do końcowej objętości 20 μL.
  12. Ustaw warunki PCR następująco: predenaturacja w 95 °C przez 1 minutę, następnie 40 cykli 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 15 s i 72 °C przez 45 s. Zbieraj dane fluorescencji podczas etapu rozszerzania temperatury o 72 °C.
  13. Po reakcji zapisz wartości CT dla każdej próbki oraz wewnętrzne odniesienie. Oblicz względne poziomy ekspresji genów docelowych za pomocą metody 2-ΔΔCT .

9. Badanie ELISA

UWAGA: Przygotuj świeży roztwór roboczy przeciwciał biotynowo i enzymatyczny sprzężony roztwór roboczy przed użyciem.

  1. Wyjmij zestaw ELISA z lodówki 30 minut przed wyprzedzeniem i pozwól mu wyrównać się do temperatury pokojowej.
  2. Przygotuj wszystkie wymagane roztwory zgodnie z instrukcjami z zestawu.
  3. Dodaj 100 μL próbek lub standardowych roztworów (o różnych stężeniach) do wyznaczonych dołków (studnie zerowe zawierają tylko standardowy/próbkowy bufor rozcieńczający). Uszczelnij płytę filmem klejącym i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 90 minut (z wyłączeniem pustych dołków kontrolnych).
  4. Usuń płyn i przepłucz każdy dołek buforem 350 μL. Inkubuj przez 30 sekund, wyrzuć płyn i wysusz na grubym, chłonnym papierze. Powtórz mycie 4 razy.
  5. Do każdego dołku dodaj 100 μL biotinylowanego roztworu roboczego przeciwciał. Zamknąć płytkę i inkubować w 37 °C przez 60 minut (z wyłączeniem pustych dołków kontrolnych).
  6. Wyrzuć płyn i przepłucz każdy dołek 4 razy, jak opisano w kroku 4.
  7. Do każdego dołku dodaj 100 μL enzymatycznego sprzężonego roztworu roboczego. Zamknąć płytkę i inkubować w 37 °C przez 30 minut (z wyłączeniem pustych dołków kontrolnych).
  8. Wyrzuć płyn i przepłucz każdy dołek 4 razy, jak opisano w kroku 4.
  9. Dodaj 100 μL roztworu substratowego do każdego dołku. Chroń przed światłem i inkubuj w 37 °C przez 15 minut.
  10. Dodaj 100 μL roztworu stopowego do każdego dołka, dokładnie wymieszaj i natychmiast zmierz gęstość optyczną (OD) na 450 nm.
  11. Generuj standardową krzywą za pomocą oprogramowania CurveExpert i obliczaj stężenia próbek.

10. Analiza zachodnich plam

UWAGA: Przed eksperymentem przygotuj bufor elektroforezy, bufor transferowy, TBST, 5% odtłuszczonego mleka i przytnij membranę PVDF do odpowiedniego rozmiaru. Następnie wychwycaj sygnały chemiluminescencyjne za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego. Ustaw instrument w trybie automatycznym lub manualnym dla gradientowej ekspozycji, która zwykle wynosi od 10 s do 5 minut, aby zapewnić odbicie sygnałów w zakresie liniowej dynamiki i uniknąć nasycenia pikseli. Po przechwyceniu sygnału wybierz obraz ekspozycji, gdzie pasma docelowe są wyraźne, a tło jest niskie do dalszej analizy ilościowej.

  1. Przygotuj bufor lizy RIPA (zawierający 1% PMSF i inhibitor fosfatazy) i dodaj bufor lizowy RIPA w proporcji 250 μL na dołek w płytkach 6-dołkowa.
  2. Komórki lizujące używają ultradźwiękowego disruptora (3 cykle, 7-10 sekund każdy) i inkubują na lodzie przez 30 minut.
  3. Wiruj lizat w temperaturze 4 °C, 12 000 × g przez 10 minut, a następnie pobierz supernatant do ilościowego określenia białka.
  4. Określ stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA).
  5. Dostosuj stężenia białek do tego samego poziomu za pomocą buforu lizyzowego RIVA.
  6. Dodaj 5× Load Buffer do próbek w stosunku 4:1 (próbka: bufor).
  7. Gotuj próbki przez 10 minut, następnie wiruj w 4 °C, 12 000 × g przez 10 minut i zbieraj supernatant do elektroforezy.
  8. Złóż żel SDS-PAGE w komorze elektroforezy i napełnij buforem elektroforetycznym aż do zanurzenia grzebienia.
  9. Usuń grzebień, załaduj próbki do dołków i dodaj drabinę białek do ścieżek odniesienia.
  10. Przeprowadź elektroforezę, aż barwnik bromofenolowy dotrze do dna żelu, następnie rozłóż aparat i wyjmij żel.
  11. Złóż "kanapkę" transferową i wykonaj mokry transfer przy stałym napięciu.
  12. Zablokuj membranę PVDF 5% mlekiem odtłuszczonym w TBST na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  13. Inkubować rozcieńczonym przeciwciałem pierwotnym przez noc w temperaturze 4 °C.
  14. Odzyskaj pierwotne przeciwciało i myj błonę TBST (5 × 5 min).
  15. Inkubuj z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z HRP przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
  16. Odzyskaj przeciwciało wtórne i przemyj błonę TBST (5 × 5 min).
  17. Przygotuj roztwór podłoża ECL i przechowuj go w ochronie przed światłem.
  18. Nakładaj podłoże ECL na membranę i rejestruj sygnały chemiluminescencyjne za pomocą systemu obrazowania z gradientową ekspozycją.
  19. Analizuj intensywności pasm za pomocą oprogramowania ImageJ i obliczaj względne poziomy ekspresji białek do dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Barwienie immunofluorescencyjne dla kolagenu typu II wykazało, że izolowane chondrocyty były silnie pozytywne (Rysunek 1A). Analiza cytometryczna przepływu wykazała również, że ponad 98% komórek wykazało pozytywny udział kolagenu typu II (rysunek 1B), podczas gdy komórki SW1353 z ujemną kontrolą były ujemne (rysunek 1C). Po stymulacji 10 ng/ml IL-1β przez 24 godziny, western blotting wykazał wyraźny wzrost poziomu białek MMP3 i MMP1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół oferuje kilka kluczowych zalet w izolacji i hodowli pierwotnych chondrocytów stawowych szczurów. Stosowanie szczurów ssających jest kluczowe dla osiągnięcia optymalnej wydajności komórek i żywotności, ponieważ chrząstka młodych zwierząt zawiera więcej proliferacyjnych chondrocytów i mniej zmineralizowanej macierzy w porównaniu do chrząstki dorosłych. Ten dobór wiekowy znacząco poprawia efektywność trawienia enzymatycznego i późniejszego odtworzenia komórek.

Podejście sek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają konfliktów interesów w tej pracy.

Podziękowania

Badanie to zostało wsparte przez Krajowe Finansowanie Badań Klinicznych Szpitali Wysokiego Szczebla oraz Inicjatywę Elitarnych Profesjonalistów Medycznych Szpitala Przyjaźni Chińsko-Japońskiej (NO. ZRJY2025-QM05).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% paradehyduSolarbioP1110
5& razy; Bufor ładowaniaSolarbioP1040
IgG z Alexa Fluor 488-sprzężonym antykróliczymZhongshan Jingqiao BiotechnologyZF-0511
Rozwiązanie blokujące bez zwierzątTechnologia sygnalizacji komórkowej15019
Przeciwciało przeciwkolagenowe IIAbcamab34712
Zestaw do testowania białek kwasu bicynchoninowego (BCA)SolarbioPC0020
Kolagenaza IIYeasen Biotechnology40508ES60
Medium mocujące fluorescencyjne zawierające DAPIZhongshan Jingqiao BiotechnologyZLI-9556
Zmodyfikowany Eagle Medium firmy DulbeccoSolarbio11995
Serum bydła płodu (FBS)SolarbioS9010
IgG z nadkrzyzanową chrzanem (HRP) – sprzężony antykróliczy IgGZhongshan Jingqiao BiotechnologyZB-2301
IL-1βPeprotech400-01B
MMP13 Rabbit mAbABklonalnyA11148
MMP3 Rabbit mAbABklonalnyA11418
Mleko suche bez tłuszczuSolarbioD3840
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)SolarbioP1020
Membrana PVDFThermo Fisher Scientific88518
Zestaw ELISA Rat MMP-13NouvsNBP3-06931
Zestaw ELISA Rat MMP-3NouvsNBP3-06894
Zestaw do odwrotnej transkrypcjiPromegaA3500
Bufor lizy RIPASolarbioR0010
Woda wolna od RNazySolarbioR1600
SDS-PAGE ŻelEpizymePG112
SYBR Green Real-time PCR Master MixToyoboQPK-201
Triton X-100SolarbioT8200
TRIzolSolarbio15596026
TrypsynaSolarbioT1320
Ultraczuły zestaw podłoża chemiluminescencyjnego ECLNCM BiotechP10300
β-Aktynowy królik mAbABklonalnyAC026

Bibliografia

  1. Min, Q., et al. Strong and elastic chitosan/silk fibroin hydrogels incorporated with growth-factor-loaded microspheres for cartilage tissue engineering. Biomimetics (Basel). 7 (2), 41(2022).
  2. Kloppenburg, M., Namane, M., Cicuttini, F. Osteoarthritis. Lancet. 405 (10472), 71-85 (2025).
  3. Barisón, M. J., et al. Functionalized hydrogels for cartilage repair: The value of secretome-instructive signaling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6010(2022).
  4. Han, Y., et al. High-precision, gelatin-based, hybrid, bilayer scaffolds using melt electro-writing to repair cartilage injury. Bioact Mater. 6 (7), 2173-2186 (2021).
  5. Molnar, V., et al. Cytokines and chemokines involved in osteoarthritis pathogenesis. Int J Mol Sci. 22 (17), 9208(2021).
  6. Zhang, H., et al. Mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development through downregulating FBXW7. Ann Rheum Dis. 81 (5), 676-686 (2022).
  7. Ouyang, Z., et al. Cartilage-related collagens in osteoarthritis and rheumatoid arthritis: From pathogenesis to therapeutics. Int J Mol Sci. 24 (12), 9841(2023).
  8. Mueller, A. L., et al. Recent advances in understanding the pathogenesis of rheumatoid arthritis: new treatment strategies. Cells. 10 (11), 3017(2021).
  9. Cao, F., et al. Trends and cross-country inequalities in the global burden of osteoarthritis, 1990-2019: A population-based study. Ageing Res Rev. 99, 102382(2024).
  10. Wu, X., Fan, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. The metabolic landscape in osteoarthritis. Aging Dis. 13 (4), 1166-1182 (2022).
  11. Deng, H., et al. Altered expression of the Hedgehog pathway proteins BMP2, BMP4, SHH, and IHH involved in knee cartilage damage of patients with osteoarthritis and Kashin-Beck disease. Cartilage. 13 (1), 19476035221087706(2022).
  12. Hui, L., et al. Effects of androgen receptor overexpression on chondrogenic ability of rabbit articular chondrocytes. Tissue Eng Regen Med. 18 (4), 641-650 (2021).
  13. Drevet, S., Favier, B., Lardy, B., Gavazzi, G., Brun, E. New imaging tools for mouse models of osteoarthritis. Geroscience. 44 (2), 639-650 (2022).
  14. Wu, S., Guo, W., Li, R., Zhang, X., Qu, W. Progress of platelet derivatives for cartilage tissue engineering. Front Bioeng Biotechnol. 10, 907356(2022).
  15. Zhang, Y., et al. DL-3-N-butylphthalide promotes cartilage extracellular matrix synthesis and inhibits osteoarthritis development by regulating FoxO3a. Oxid Med Cell Longev. 2022, 9468040(2022).
  16. Krych, A. J., Saris, D. B. F., Stuart, M. J., Hacken, B. Cartilage injury in the knee: assessment and treatment options. J Am Acad Orthop Surg. 28 (22), 914-922 (2020).
  17. Muthu, S., et al. Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies. Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).
  18. Morici, L., Allémann, E., Rodríguez-Nogales, C., Jordan, O. Cartilage-targeted drug nanocarriers for osteoarthritis therapy. Int J Pharm. 666, 124843(2024).
  19. Urlić, I., Ivković, A. Cell sources for cartilage repair-biological and clinical perspective. Cells. 10 (9), 2496(2021).
  20. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipein the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022, 7858925(2022).
  21. Bai, L., et al. Engineering bone/cartilage organoids: Strategy, progress, and application. Bone Res. 12 (1), 66(2024).
  22. Dönges, L., et al. Engineered human osteoarthritic cartilage organoids. Biomaterials. 308, 122549(2024).
  23. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae treat osteoarthritis by inhibiting arachidonic acid metabolites through AMPK/NFκB pathway. J Inflamm Res. 16, 4123-4140 (2023).
  24. Barisón, M. J., et al. Functionalized hydrogels for cartilage repair: the value of secretome-instructive signaling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6010(2022).
  25. Yu, L., et al. Hyaline cartilage differentiation of fibroblasts in regeneration and regenerative medicine. Development. 149 (2), dev200249(2022).
  26. Gebauer, M., et al. Comparison of the chondrosarcoma cell line SW1353 with primary human adult articular chondrocytes with regard to their gene expression profile and reactivity to IL-1β. Osteoarthritis Cartilage. 13 (8), 697-708 (2005).
  27. Yan, W., et al. Chondrocyte-targeted delivery system of Sortase A-engineered extracellular vesicles silencing MMP13 for osteoarthritis therapy. Adv Healthc Mater. 13 (16), e2303510(2024).
  28. Goldring, M. B. Chondrogenesis, chondrocyte differentiation, and articular cartilage metabolism in health and osteoarthritis. Ther Adv Musculoskelet Dis. 4 (4), 269-285 (2012).
  29. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Des Devel Ther. 16, 1743-1766 (2022).
  30. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae treat osteoarthritis by inhibiting arachidonic acid metabolites through AMPK/NFκB pathway. J Inflamm Res. 16, 4123-4140 (2023).
  31. Dou, Y., Fang, Y., Zhao, C., Fu, W., Jiang, D. Editorial: Bioengineering and translational research for bone and joint diseases. Front Bioeng Biotechnol. 10, 969416(2022).
  32. Ye, K., et al. Bioengineering of articular cartilage: Past, present and future. Regen Med. 8 (3), 333-349 (2013).
  33. Chen, P., et al. Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration. Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja chondrocyt wHodowla chondrocyt wChrz stka kolanowa szczuraTrawienie enzymatyczneKolagenaza typu IICytometria przep ywowaKolagen typu IIAnaliza immunofluorescencyjna
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.